TW201609811A - 具有增強之組織分布之雙特異性單鏈抗體構築體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種經由第一結合結構域結合於標靶細胞表面抗原且經由第二結合結構域結合於T細胞表面抗原CD3的雙特異性單鏈抗體構築體，該構築體包含兩個FcRn結合肽。此外，本發明提供一種編碼該抗體構築體之核酸分子、包含該核酸分子之載體及用該載體轉型或轉染之宿主細胞。此外，本發明提供一種製備本發明之抗體構築體之方法、該抗體構築體之醫療用途及包含該抗體構築體之套組。

Description

具有增強之組織分布之雙特異性單鏈抗體構築體
本發明係關於一種經由第一結合結構域結合於標靶細胞表面抗原且經由第二結合結構域結合於T細胞表面抗原CD3的雙特異性單鏈抗體構築體，該構築體包含兩個FcRn結合肽。此外，本發明提供一種編碼該抗體構築體之核酸分子、包含該核酸分子之載體及用該載體轉型或轉染之宿主細胞。此外，本發明提供一種製備本發明之抗體構築體之方法、該抗體構築體之醫療用途及包含該抗體構築體之套組。
在開發醫藥組合物期間之決定性問題為一定數量之活性化合物是否到達其標靶以展示功效。對於例如在治療癌症、病毒或發炎性疾病中利用雙特異性T細胞接合抗體衍化之化合物的治療方法，相應問題為抗體衍化之化合物是否在標靶細胞之區室中達到足夠濃度。雙特異性分子(諸如BiTE® (雙特異性T細胞接合分子)抗體)為由兩個可撓性連接之抗體衍化之結合結構域組成的重組蛋白質構築體。BiTE® 抗體之一個結合結構域特異於標靶細胞上之所選腫瘤相關表面抗原；第二結合結構域特異於CD3，即T細胞上T細胞受體複合物之次單位。藉由其特定設計，BiTE® 抗體特別適合短暫連接具有標靶細胞之T細胞，且同時強力活化T細胞抗標靶細胞之固有細胞溶解潛力。BiTE® 抗體為小蛋白質，其分子量使得彼等類型之化合物經由旁細胞擴散滲入內 皮障壁後之區室中。然而，小蛋白質(諸如BiTE® 抗體)之不利方面為低於腎截止值之分子量，其可能使半衰期較短，此為BiTE® 抗體與多種其他抗體形式共有的特徵。
延長之半衰期通常適用於活體內應用免疫球蛋白、尤其抗體且最尤其小尺寸之抗體片段。儘管此類基於抗體片段之抗體構築體(Fv、二硫化物鍵結之Fv、Fab、scFv、dAb)能夠快速到達身體之大多數部分，但彼等抗體構築體很可能遭受自身體快速清除。此項技術中描述之用於延長抗體構築體(諸如單鏈雙功能抗體)之半衰期的策略包括結合聚乙二醇鏈(聚乙二醇化)、融合於IgG Fc區或來自鏈球菌蛋白G之白蛋白結合結構域(參見Stork 2009,JBC 284(38)，第25612頁)。所有彼等方法具有不同問題，必須分別解決。聚乙二醇化可能不可逆，或該方法可能損害抗體構築體之生物活性及/或組織分布。雙特異性抗體構築體與IgG Fc區融合可獲得三功能分子，如對於卡托莫西單抗(Catumaxomab)所述，其能夠經由Fc-FcR功能募集另一細胞類型。此外，融合細菌來源之白蛋白結合結構域可提高抗體構築體之免疫原性，且此項技術中通常認可免疫原性必須減至最小以在患者中獲得基於蛋白質之化合物的持久功效。
因此，一方面需要具有小結合分子，因為其可例如快速到達其在體內之指定位置且亦可到達身體之大多數部分，另一方面此類結合分子之小「尺寸」在尤其腎清除率方面非有利的。使抗體構築體之分子量增大至高於腎清除率之臨限值的策略的代價可為所瞭解之組織分布受損或抗體功能之空間損害。因此，其為小尺寸、腎清除率、穩定性/功能及組織分布之間的平衡作用。
定義
必須注意，如本文中所用，除非上下文另外明確指明，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個參考物。因此， 例如提及「試劑」包括此類不同試劑中之一或多者，且提及「方法」包括提及一般技術者已知的可針對本文中所述之方法修改或取代的等效步驟及方法。
除非另外指明，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為指系列中之每個元素。僅僅使用常規實驗，熟習此項技術者將認識到或能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的多個等效物。此類等效物意欲由本發明涵蓋。
本文各處所用之術語「及/或」包括含義「及」、「或」及「由該術語連接之要素之所有或任何其他組合」。
如本文中所用，術語「約(about)」或「約(approximately)」意謂在既定值或範圍之±20%內、較佳±15%內、更佳±10%內且最佳±5%內。
在本說明書及隨後之申請專利範圍全文中，除非上下文另外需要，否則詞語「包含(comprise)」及變化形式(諸如「包含(comprises)」及「包含(comprising)」)應理解為暗示包括所述整數或步驟或整數或步驟之群，但不排除任何其他整數或步驟或整數或步驟之群。當在本文中使用時，術語「包含」可經術語「含有」或「包括」取代，或有時當在本文中使用時，經術語「具有」取代。
當在本文中使用時，「由...組成」排除所主張要素中未規定之任何要素、步驟或成分。在本文中使用時，「基本上由...組成」不排除本質上不影響技術方案之基本及新穎特徵的材料或步驟。
在本文各狀況下，任何術語「包含」、「基本上由...組成」及「由...組成」可用另外兩個術語中之任一者替代。
如上文所述，提高雙特異性單鏈抗體構築體之分布量的較佳策略為連接小肽結構域，其獲得較佳組織分布特徵，而避免由於空間作 用損害分子之T細胞接合功能。在此情形下，Sockolosky(PNAS 2012,109(40)，第16095頁))針對球形螢光重組蛋白描述一種可能方法。此方法描述結合於新生兒Fc受體(FcRn)之短末端肽延伸部分之融合物。Sockolosky所用之重組蛋白(mKatc)經修飾以藉由利用FcRn介導之再循環及穿胞運輸系統延長彼等蛋白質之半衰期。然而，使用mKate，一種海葵奶嘴珊瑚(Entacmaea quadricolor )之遠紅色螢光蛋白與FcRn結合肽之組合，為極簡化模型系統。與mKate蛋白質相比，T細胞接合雙特異性抗體構築體為複雜得多的結構，為了其功能，其需要正確形成結合結構域以使得可結合於其特異性抗原決定基。此結合為接合患者自身T細胞之前提條件，其中彼等細胞帶有標靶抗原決定基(其為標靶結合結構域之抗原決定基)，從而使得標靶細胞之細胞毒性去除。當然，雙特異性T細胞接合抗體構築體之功能的另一決定性因素為是否仍可產生符合醫藥效用之行業標準之構築體的問題。鑒於上述技術領域，本發明之潛在問題為提供相較於此項技術中已知之雙特異性T細胞接合抗體構築體展示增強之組織分布的功能性雙特異性單鏈抗體構築體。
本發明提供一種經由第一結合結構域結合於標靶細胞表面抗原且經由第二結合結構域結合於T細胞表面抗原CD3的雙特異性單鏈抗體構築體，該構築體包含兩個FcRn結合肽，其中：(a)第一FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLX 1 PANG (SEQ ID NO：1)，其中X1 為Y或H；且(b)第二FcRn結合肽包含胺基酸序列TGHFGGLHP (SEQ ID NO：4)；其中該雙特異性單鏈抗體構築體不具有SEQ ID NO：132-135 中所描繪之胺基酸序列。
在本發明抗體構築體之一個實施例中，第二FcRn結合肽包含胺 基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)或QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)。
術語「抗體構築體」指如下分子，其中結構及/或功能基於抗體(例如全長或完整免疫球蛋白分子)之結構及/或功能。因此，抗體構築體能夠結合於其特異性標靶或抗原。此外，本發明之抗體構築體包含抗體之允許標靶結合之最小結構需要。此最小需要可例如藉由存在至少三個輕鏈CDR(亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)定義。本發明之構築體所基於之抗體包括例如單株、重組、嵌合、去免疫、人類化及人類抗體。
包括駱駝抗體及藉由生物技術或蛋白質工程改造方法或製程產生之其他免疫球蛋白抗體之全長或完整抗體在本發明之「抗體構築體」之定義內。此等全長抗體可為例如單株、重組、嵌合、去免疫、人類化及人類抗體。全長抗體之片段(諸如VH、VHH、VL、(s)dAb、Fv、Fd、Fab、Fab'、F(ab')2或「r IgG」(「半抗體」))亦在「抗體構築體」之定義內。本發明之抗體構築體亦可為抗體之經修飾片段，亦稱為抗體變異體，諸如scFv；di-scFv或bi(s)-scFv；scFv-Fc；scFv拉鏈；scFab；Fab2；Fab3；雙功能抗體；單鏈雙功能抗體；串聯雙功能抗體(Tandab)；串聯di-scFv；串聯tri-scFv；「微型抗體」，其由如下結構例示：(VH-VL-CH3)2、(scFv-CH3)2或(scFv-CH3-scFv)2；多功能抗體，諸如三功能抗體或四功能抗體；及單結構域抗體，諸如奈米抗體；或僅包含一個可變結構域(其可為VHH、VH或VL)之獨立於其他V區或結構域特異性結合抗原或抗原決定基的單可變結構域抗體。
此外，術語「抗體構築體」之定義包括單價、二價及多價(polyvalent/multivalent)構築體，且因此包括特異性結合於僅一種抗原結構之單特異性構築體以及經由不同結合結構域特異性結合超過一種抗原結構(例如兩種、三種或三種以上)之雙特異性及多特異性 (polyspecific/multispecific)構築體。此外，術語「抗體構築體」之定義包括僅由一個多肽鏈組成之分子以及由超過一個多肽鏈組成之分子，該等鏈可相同(均二聚體、均三聚體或均寡聚物)或不同(雜二聚體、雜三聚體或雜寡聚物)。以上鑑別之抗體及其變異體或衍生物之實例尤其描述於Harlow及Lane,Antibodies a laboratory manual,CSHL Press(1988)；及Using Antibodies：a laboratory manual,CSHL Press(1999)；Kontermann及Dübel,Antibody Engineering,Springer，第2版，2010；及Little,Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Cambridge University Press 2009中。
本發明之抗體構築體較佳為「活體外產生之抗體構築體」。此術語指根據上述定義之抗體構築體，其中所有或一部分可變區(例如至少一個CDR)在非免疫細胞選擇(例如活體外噬菌體呈現)蛋白晶片或候選序列可測試其結合於抗原之能力的任何其他方法中產生。因此，此術語較佳排除僅藉由在動物中在免疫細胞中進行基因組重排產生的序列。「重組抗體」為經由使用重組DNA技術或遺傳工程改造製備之抗體。
本發明係針對「單鏈抗體構築體」。因此，彼等單鏈抗體構築體僅包括上述由單一多肽鏈組成之抗體構築體的彼等實施例。
如本文所用，術語「單株抗體」(mAb)或單株抗體構築體係指獲自實質上均質抗體之群的抗體，亦即，構成該群之個別抗體除可少量存在之可能天然存在之突變及/或轉譯後修飾(例如異構、醯胺化)以外為相同的。與通常包括針對不同決定子(或抗原決定基)之不同抗體的習知(多株)抗體製劑相比，單株抗體對抗原上之單一抗原位點或決定子具有高度特異性。除其特異性之外，單株抗體之有利之處在於其藉由融合瘤培養合成，因此未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」表明抗體係自實質上均質之抗體群獲得之特徵，且不應理解為需要藉 由任何特定方法產生該抗體。
為製備單株抗體，可使用提供藉由藉由連續細胞株培養物製備之抗體的任何技術。舉例而言，欲使用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，Nature,256：495(1975)描述之融合瘤方法製得或可藉由重組DNA方法(參見例如美國專利第4,816,567號)製得。製備人類單株抗體之其他技術的實例包括三源雜交瘤技術、人類B細胞融合瘤技術(Kozbor,Immunology Today 4(1983),72)及EBV融合瘤技術(Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.(1985),77-96)。
融合瘤可隨後使用標準方法篩選，諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA)及表面電漿子共振(BIACORETM )分析，以鑑別一或多個產生與特定抗原特異性結合之抗體的融合瘤。相關抗原之任何形式可用作免疫原，例如重組抗原、天然存在形式、其任何變異體或片段以及其抗原肽。BIAcore系統中所用之表面電漿子共振可用於提高結合於標靶抗原(諸如標靶細胞表面抗原或CD3ε)之抗原決定基的噬菌體抗體之效率(Schier,Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105；Malmborg,J.Immunol.Methods 183(1995),7-13)。
製備單株抗體之另一例示性方法包括篩選蛋白質表現庫，例如噬菌體呈現或核糖體呈現庫。噬菌體呈現例如描述於Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Smith(1985)Science 228：1315-1317，Clackson等人，Nature,352：624-628(1991)及Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中。
除使用呈現庫以外，可使用相關抗原使非人類動物(例如嚙齒動物(諸如小鼠、倉鼠、兔或大鼠))免疫。在一個實施例中，非人類動物包括人類免疫球蛋白基因之至少一部分。舉例而言，可用人類Ig(免疫球蛋白)基因座之大片段工程改造缺乏小鼠抗體產生之小鼠品系。 使用融合瘤技術，可產生及選擇衍生自具有所要特異性之基因的抗原特異性單株抗體。參見例如XENOMOUSETM ，Green等人，(1994)Nature Genetics 7：13-21；US 2003-0070185；WO 96/34096；及WO96/33735。
單株抗體亦可獲自非人類動物，隨後使用此項技術中已知之重組DNA技術修飾，例如人類化、去免疫、使其嵌合等。經修飾之抗體構築體之實例包括非人類抗體、「親和力成熟」抗體之人類化變異體(參見例如Hawkins等人，J.Mol.Biol.254,889-896(1992)及Lowman等人，Biochemistry 30,10832-10837(1991))及具有改變之效應功能的抗體突變體(參見例如美國專利5,648,260,Kontermann及Dübel(2010)，上述引文及Little(2009)，上述引文)。
在免疫學中，親和力成熟為如下方法，藉由該方法在免疫反應過程期間B細胞產生對抗原具有增加之親和力的抗體。在重複暴露於相同抗原下，宿主將產生具有相繼增大之親和力的抗體。如天然原型，活體外親和力成熟基於突變及選擇之原理。活體外親和力成熟成功地用於最佳化抗體、抗體構築體及抗體片段。使用輻射、化學誘變劑或易錯PCR在CDR內引入隨機突變。此外，可藉由鏈改組增加遺傳多樣性。使用呈現方法(如噬菌體呈現)之兩或三輪突變及選擇通常產生親和力在低奈莫耳範圍內之抗體片段。
抗體構築體之胺基酸取代變異之較佳類型包括取代親本抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體應相對於產生其之親本抗體具有改良之生物特性。產生此類取代變異體之適宜方法包括使用噬菌體呈現之親和力成熟。簡言之，使數個高變區位點(例如6-7個位點)突變以在各位點產生所有可能之胺基酸取代。因此產生之抗體變異體以單價方式自絲狀噬菌體粒子以與包裝在各粒子內之M13的基因III產物的融合物形式呈 現。隨後如本文所揭示將噬菌體呈現之變異體針對其生物活性(例如結合親和力)進行篩選。為鑑別用於修飾之候選高變區位點，可進行丙胺酸掃描突變誘發以鑑別顯著有助於抗原結合之高變區殘基。替代地或另外，可能宜分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑別結合結構域與例如人類標靶細胞表面抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基為用於根據本文中詳述之技術取代的候選物。在產生此類變異體後，如本文所述對變異體組合進行篩選，且可選擇在一或多個相關分析中具有優良特性之抗體用於進一步研究。
本發明之單株抗體及抗體構築體尤其包括「嵌合」抗體(免疫球蛋白)，其中重鏈及/或輕鏈之一部分與衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而鏈之其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列以及此類抗體之片段(只要其展現所需生物活性即可)一致或同源(美國專利第4,816,567號；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。本文之相關嵌合抗體包括「靈長化」抗體，其包含衍生自非人類靈長類動物(例如舊世紀猴、猿等)之可變結構域抗原結合序列及人類恆定區序列。已描述多種製備嵌合抗體之方法。參見例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A.81：6851,1985；Takeda等人，Nature 314：452,1985，Cabilly等人，美國專利第4,816,567號；Boss等人，美國專利第4,816,397號；Tanaguchi等人，EP 0171496；EP 0173494；及GB 2177096。
An antibody,antibody construct or antibody fragment may also be modified by specific deletion of human T cell epitopes(a method called"deimmunization")by the methods disclosed in WO 98/52976 and WO 00/34317.簡言之，針對結合於MHC II類之肽分析抗體之重鏈及輕鏈可變結構域；此等肽代表潛在T細胞抗原決定基(如WO 98/52976及 WO 00/34317所定義)。為偵測潛在T細胞抗原決定基，可施用稱為「肽穿針引線法」之電腦模型化法，且另外，可搜索人類MHC II類結合肽之資料庫中的VH及VL序列中所存在之基元，如WO 98/52976及WO 00/34317中所述。此等基元結合於18個主要MHC II類DR異型中之任一者，因此構成潛在T細胞抗原決定基。所偵測之潛在T細胞抗原決定基可藉由取代可變結構域中之少量胺基酸殘基或較佳藉由單一胺基酸取代來消除。通常，進行保守取代。常常但並非排他地，可使用對人類生殖系抗體序列中之位置常見的胺基酸。人類生殖系序列揭示於如下文獻中，例如Tomlinson等人，(1992)J.MoI.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人，(1995)Immunol.Today第16卷(5)：237-242；及Tomlinson等人，(1995)EMBO J.14：14：4628-4638。V BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之綜合目錄(由Tomlinson,LA.等人，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK彙編)。此等序列可用作人類序列之來源，例如用於構架區及CDR。亦可使用共同人類構架區，例如如美國專利第6,300,064號中所述。
「人類化」抗體、抗體構築體或其片段(諸如Fv,Fab,Fab',F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)為主要為人類序列之抗體或免疫球蛋白，其含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列。在極大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其中來自接受者之高變區(亦為CDR)之殘基經來自非人類(例如嚙齒動物)物種(供體抗體)(諸如具有所要特異性、親和力及能力之小鼠、大鼠、倉鼠或兔)的高變區之殘基置換。在某些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基經對應非人類殘基置換。此外，如本文中所用之「人類化抗體」亦可包含未在接受者抗體抑或供體抗體中發現之殘基。進行此等修飾以進一步改進及最佳化抗體效能。人類化抗體亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分、通常人類免疫球蛋白之恆定區的至少一部 分。對於其他細節，參見Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)。
人類化抗體或其片段可藉由用人類Fv可變結構域之等效序列置換不直接參與抗原結合之Fv可變結構域之序列產生。產生人類化抗體或其片段之例示性方法由以下文獻提供：Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Oi等人，(1986)BioTechniques 4：214；及US 5,585,089；US 5,693,761；US 5,693,762；US 5,859,205；及US 6,407,213。彼等方法包括分離、操作及表現編碼來自重鏈或輕鏈中之至少一者的免疫球蛋白Fv可變結構域之所有或一部分的核酸分子。此類核酸可獲自產生針對上述預定標靶之抗體的融合瘤以及來自其他來源。可接著將編碼人類化抗體之重組DNA選殖至適當表現載體中。
人類化抗體亦可使用表現人類重鏈及輕鏈基因但不能表現內源小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因之轉殖基因動物(諸如小鼠)產生。Winter描述可用於製備本文所述之人類化抗體的例示性CDR移植法(美國專利第5,225,539號)。特定人類抗體之全部CDR可經非人類CDR之至少一部分置換，或僅一些CDR可經非人類CDR置換。僅需要置換人類化抗體結合於預定抗原所需數目的CDR。
人類化抗體可藉由引入保守取代、共同序列取代、生殖系取代及/或回復突變最佳化。此類經改變之免疫球蛋白分子可藉由此項技術中已知之數個技術中之任一者製備(例如Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80：7308-7312,1983；Kozbor等人，Immunology Today,4：7279,1983；Olsson等人，Meth.Enzymol.,92：3-16,1982及EP 239 400)。
術語「人類抗體」、「人類抗體構築體」及「人類結合結構域」包括具有實質上對應於此項技術中已知之人類生殖系免疫球蛋白序列 之抗體區(諸如可變及恆定區或結構域)的抗體、抗體構築體及結合結構域，包括例如Kabat等人，(1991)(上述引文)所述者。本發明之人類抗體、抗體構築體或結合結構域可例如在CDR及尤其在CDR3中包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變引入的突變)。人類抗體、抗體構築體或結合結構域可有至少一個、兩個、三個、四個、五個或五個以上位置經不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基置換。如本文所用之人類抗體、抗體構築體及結合結構域之定義亦涵蓋全人類抗體，其僅包括抗體之非人工及/或遺傳改變之人類序列，其可藉由使用諸如Xenomouse之技術或系統獲得。
在一些實施例中，本發明之抗體構築體為「經分離」或「實質上純」的抗體構築體。「經分離」或「實質上純」在用於描述本文所揭示之抗體構築體時意謂抗體構築體已自其製備環境之組分鑑別、分離及/或回收。抗體構築體較佳不或實質上不與來自其製備環境的所有其他組分締合。其製備環境之污染物組分(諸如由經重組轉染細胞產生的污染物組分)為通常干擾多肽之診斷性或治療性用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。抗體構築體可例如佔既定樣品中總蛋白質之至少約5重量%或至少約50重量%。應瞭解，經分離蛋白質可視情況而定佔總蛋白質含量之5重量%至99.9重量%。多肽可經由使用誘導性啟動子或高表現啟動子以顯著較高濃度製備，以使得其以增加之濃度水準製備。定義包括在此項技術中已知之多種生物體及/或宿主細胞中製備抗體構築體。在較佳實施例中，抗體構築體(1)藉由使用轉杯式測序儀純化至一定程度以足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少15個殘基，或(2)藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍(Coomassie blue)或較佳銀染色純化至均質。通常，然而，經分離抗體構築體藉由至少一個純化步驟製備。
根據本發明，術語「結合結構域」特徵在於分別(特異性)結合於標靶分子(抗原)上之既定標靶抗原決定基或既定標靶位點及CD3/與其相互作用/識別其的結構域。第一結合結構域(識別標靶細胞表面抗原)之結構及功能及亦較佳第二結合結構域(CD3)之結構及/或功能基於抗體、例如全長或完整免疫球蛋白分子之結構及/或功能。根據本發明，第一結合結構域之特徵為存在三個輕鏈CDR(亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及三個重鏈CDR(亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。第二結合結構域較佳亦包含抗體之允許標靶結合之最小結構需要。更佳地，第二結合結構域包含至少三個輕鏈CDR(亦即VL區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR(亦即VH區之CDR1、CDR2及CDR3)。據設想，第一及/或第二結合結構域藉由噬菌體呈現或庫篩選方法產生或獲得而非藉由將來自預先存在之(單株)抗體之CDR序列移植於骨架中產生或獲得。
根據本發明，結合結構域較佳為多肽形式。此類多肽可包括蛋白質部分及非蛋白質部分(例如化學連接子或化學交聯劑，諸如戊二醛)。蛋白質(包括其片段，較佳生物活性片段及肽，通常具有少於30個胺基酸)包含兩個或兩個以上經由共價肽鍵彼此偶合之胺基酸(得到胺基酸之鏈)。如本文所用之術語「多肽」描述分子之群，其通常由超過30個胺基酸組成。多肽可進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體以及更高級寡聚物，亦即由超過一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等之多肽分子可相同或不相同。此類多聚體之相應高級結構因此稱為均二聚體或雜二聚體、均三聚體或雜三聚體等。雜多聚體之一實例為抗體分子，其在其天然存在之形式下由兩個相同多肽輕鏈及兩個相同多肽重鏈組成。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦指經天然修飾之肽/多肽/蛋白質，其中修飾例如藉由轉譯後修飾(如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾)進行。「肽」、「多肽」或「蛋白 質」在本文提及時亦可經化學修飾，諸如聚乙二醇化。此類修飾在此項技術中為吾人所熟知且描述於下文中。
如上文所提及，結合結構域通常可包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)；然而其不必包含兩者。Fd片段例如具有兩個VH區且通常保留完整抗原結合結構域之一些抗原結合功能。(經修飾之)抗原結合抗體片段的實例包括(1)Fab片段，即具有VL、VH、CL及CH1結構域之單價片段；(2)F(ab')2片段，即具有兩個在鉸鏈區由二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(3)具有兩個VH及CH1結構域之Fd片段；(4)具有抗體之單臂的VL及VH結構域的Fv片段；(5)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其具有VH結構域；(6)經分離之互補決定區(CDR)，及(7)單鏈Fv(scFv)，後者為較佳(例如衍生自scFV庫)。
包含至少一個人類結合結構域之抗體及抗體構築體避免一些與具有非人類(諸如嚙齒動物，例如鼠類、大鼠、倉鼠或兔)可變及/或恆定區之抗體或抗體構築體有關的問題。此類衍生自嚙齒動物之蛋白質的存在可引起抗體或抗體構築體之快速清除或可引起患者針對抗體或抗體構築體產生免疫反應。為避免使用衍生自嚙齒動物之抗體或抗體構築體，人類或全人類抗體/抗體構築體可經由向嚙齒動物中引入人類抗體功能以使得嚙齒動物產生全人類抗體來產生。
在YAC中選殖及重建構兆鹼基大小之人類基因座且將其引入小鼠生殖系中的能力提供一種闡明極大或粗略定位之基因座之功能組分以及產生人類疾病之適用模型的有力方法。此外，使用此類技術用人類等效物取代小鼠基因座可對開發期問人類基因產物之表現及調節、其與其他系統之聯繫及其參與疾病誘發及進展提供獨特洞察力。
此類策略之一重要實際應用為「人類化」小鼠體液免疫系統。於內源Ig基因已不活化之小鼠中引入人類免疫球蛋白(Ig)基因座提供 研究漸進式表現及組裝抗體之潛在機制以及其在B細胞產生中之作用的機會。此外，此類策略可提供產生全人類單株抗體(mAb)的理想來源，其為朝向實現人類疾病之抗體療法之前景的里程碑。全人類抗體或抗體構築體預期使小鼠mAb或衍生自小鼠之mAb固有的免疫原性及過敏反應達最小，因此提高所投與抗體/抗體構築體之功效及安全性。使用全人類抗體或抗體構築體可預期在治療需要重複化合物投藥之慢性及復發性人類疾病(諸如發炎、自體免疫及癌症)中提供實質性優點。
朝向此目標之一種方法為用人類Ig基因座之大片段工程改造缺乏小鼠抗體產生之小鼠品系以預測此類小鼠將產生大的人類抗體譜系而不存在小鼠抗體。大人類Ig片段將保持大可變基因多樣性以及適當調節抗體產生及表現。藉由採用該小鼠機構進行抗體多樣化及選擇及缺乏對人類蛋白之免疫耐受性，此等小鼠品系中再產生之人類抗體譜系應針對任何相關抗原(包括人類抗原)產生高親和力抗體。使用融合瘤技術，具有所要特異性之抗原特異性人類mAb可容易地產生且選擇。此通用策略關於產生第一XenoMouse小鼠品系展現(參見Green等人，Nature Genetics 7：13-21(1994))。用分別含有人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之245kb及190kb大小之生殖系構型片段的酵母人造染色體(YAC)工程改造XenoMouse品系，該等染色體含有核心可變及恆定區序列。含人類Ig之YAC據證明與小鼠系統相容以用於抗體重排與表現且能夠取代不活化之小鼠Ig基因。此藉由其能夠誘導B細胞產生、產生全人類抗體之成人樣人類譜系及產生抗原特異性人類mAb展現。此等結果亦表明引入含有較大量V基因之人類Ig基因座之較大部分、其他調節元件及人類Ig恆定區可實質上再現特徵為對感染及免疫之人類體液反應的完整譜系。Green等人之研究近年來延伸至經由分別引入人類重鏈基因座及κ輕鏈基因座之兆鹼基大小之生殖系構型YAC片段 來引入大於約80%人類抗體譜系。參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)及美國專利申請案第08/759,620號。
XenoMouse小鼠之產生進一步論述且敍述於以下文獻中：美國專利申請案第07/466,008號、第07/610,515號、第07/919,297號、第07/922,649號、第08/031,801號、第08/112,848號、第08/234,145號、第08/376,279號、第08/430,938號、第08/464,584號、第08/464,582號、第08/463,191號、第08/462,837號、第08/486,853號、第08/486,857號、第08/486,859號、第08/462,513號、第08/724,752及第08/759,620號；及美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見Mendez等人，Nature Genetics 15：146-156(1997)；及Green及Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)；EP 0 463 151 B1、WO 94/02602、WO 96/34096、WO 98/24893、WO 00/76310及WO 03/47336。
在替代方法中，包括GenPharm International,Inc.之其他公司利用「小基因座」方法。在小基因座方法中，經由包括來自Ig基因座之片斷(個別基因)來模擬外生Ig基因座。因此，一或多個VH基因、一或多個DH基因、一或多個JH基因、μ恆定區及第二恆定區(較佳為γ恆定區)形成用於插入動物中之構築體。此方法描述於Surani等人之美國專利第5,545,807號，及各屬於Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,625,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,661,016號、第5,770,429號、第5,789,650號、第5,814,318號、第5,877,397號、第5,874,299號及第6,255,458號，Krimpenfort及Berns之美國專利第5,591,669號及第6,023.010號，Berns等人之美國專利第5,612,205號、第5,721,367號及第5,789,215號，及Choi及Dunn之美國專利第5,643,763號，及GenPharm International美國專利申請案第07/574,748 號、第07/575,962號、第07/810,279號、第07/853,408號、第07/904,068號、第07/990,860號、第08/053,131號、第08/096,762號、第08/155,301號、第08/161,739號、第08/165,699號、第08/209,741號。亦參見EP 0 546 073 B1、WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO 97/13852及WO 98/24884及美國專利第5,981,175號。進一步參見Taylor等人，(1992)；Chen等人，(1993)；Tuaillon等人，(1993)；Choi等人，(1993)；Lonberg等人，(1994)；Taylor等人，(1994)；及Tuaillon等人，(1995)；Fishwild等人，(1996)。
Kirin亦展示由小鼠產生人類抗體，其中經由微細胞融合將染色體之大片段或完整染色體引入。參見歐洲專利申請案第773 288號及第843 961號。Xenerex Biosciences開發一種可能產生人類抗體之技術。在此技術中，SCID小鼠用人類淋巴細胞(例如B及/或T細胞)重建。隨後用抗原使小鼠免疫且該等小鼠可產生針對該抗原之免疫反應。參見美國專利第5,476,996號；第5,698,767號；及第5,958,765號。
人類抗小鼠抗體(HAMA)反應引導工業上製備嵌合或其他人類化抗體。然而，預期將觀察到特定人類抗嵌合抗體(HACA)反應，尤其在長期或多次給與抗體利用中。因此，需要提供包含針對標靶細胞表面抗原之全人類結合結構域及針對CD3之全人類結合結構域的抗體構築體以減弱HAMA或HACA反應之問題及/或作用。
術語「(特異性)結合於」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」及「(特異性)反應」根據本發明意謂結合結構域與位於標靶蛋白或抗原(標靶細胞表面抗原/CD3)上之抗原決定基的一或多個、較佳至少兩個、更佳至少三個且最佳至少四個胺基酸相互作用或特異性相互作用。
術語「抗原決定基」係指抗原上結合結構域(諸如抗體或免疫球蛋白或抗體或免疫球蛋白之衍生物或片段)特異性結合的位點。「抗原決定基」為抗原，因此術語抗原決定基有時在本文中亦稱為「抗原結構」或「抗原決定子」。因此，結合結構域為「抗原相互作用位點」。該結合/相互作用亦理解為定義「特異性識別」。
「抗原決定基」可由藉由蛋白質之三級摺疊並列之鄰接胺基酸或非鄰接胺基酸形成。「線性抗原決定基」為胺基酸一級序列包含識別之抗原決定基的抗原決定基。線性抗原決定基在獨特序列中通常包括至少3個或至少4個、且更通常至少5個或至少6個或至少7個、例如約8至約10個胺基酸。
與線性抗原決定基相比，「構形抗原決定基」為如下抗原決定基，其中構成抗原決定基之胺基酸的一級序列並非所識別抗原決定基之唯一指定組分(例如抗原決定基，其中胺基酸之一級序列並非必須由結合結構域識別)。通常，構形抗原決定基相對於線性抗原決定基包含增加數目之胺基酸。關於識別構形抗原決定基，結合結構域識別抗原、較佳肽或蛋白質或其片段之三維結構(在本發明之情形下，針對結合結構域中之一者的抗原包含在標靶細胞表面抗原蛋白內)。舉例而言，當蛋白質分子摺疊以形成三維結構時，形成構形抗原決定基之某些胺基酸及/或多肽主鏈變得毗鄰，使抗體能夠識別抗原決定基。確定抗原決定基之構形的方法包括(但不限於)x射線結晶學、二維核磁共振(2D-NMR)光譜法及定點旋轉標記及電子順磁共振(EPR)光譜法。
結合結構域與抗原決定基或抗原決定基簇之間的相互作用暗示結合結構域對特定蛋白質或抗原(此處：標靶細胞表面抗原及CD3)上之抗原決定基或抗原決定基展現可觀親和力，且通常不與除標靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原展現明顯反應性。「明顯親和 力」包括以約10-6 M(KD)或更強之親和力結合。較佳地，當結合親和力為約10-12 M至10-8 M、10-12 M至10-9 M、10-12 M至10-10 M、10-11 M至10-8 M、較佳約10-11 M至10-9 M時，結合被視為特異的。結合結構域是否與標靶特異性反應或特異性結合於標靶可尤其藉由將該結合結構域與標靶蛋白或抗原之反應與該結合結構域與除標靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原的反應比較容易地測試。較佳地，本發明之結合結構域基本上或實質上不結合於除標靶細胞表面抗原或CD3以外的蛋白質或抗原(亦即第一結合結構域不能結合於除標靶細胞表面抗原以外之蛋白質且第二結合結構域不能結合於除CD3以外之蛋白質)。
術語「基本上/實質上不結合」或「不能結合」意謂本發明之結合結構域不結合除標靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原，亦即不展示與除標靶細胞表面抗原或CD3以外之蛋白質或抗原超過30%、較佳不超過20%、更佳不超過10%、尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%之反應性，其中與標靶細胞表面抗原或CD3之結合分別設定成100%。
特異性結合認為由結合結構域之胺基酸序列中的特定基元及抗原實現。因此，結合藉由其一級、二級及/或三級結構以及該等結構之二級修飾達成。抗原-相互作用-位點與其特異性抗原之特異性相互作用可使該位點與抗原簡單結合。此外，抗原-相互作用-位點與其特異性抗原相互作用特異性相互作用可替代地或另外地使信號開始，例如由於誘導抗原之構形變化、抗原之寡聚等。
術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白結構域之部分，其序列展現變化性且其參與確定特定抗體之特異性及結合親和力(亦即「可變結構域」)。可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)一起配對形成單一抗原結合位點。CH結構域最接近稱為CH1之VH。各輕(L)鏈藉由一個共價二 硫鍵連接於重(H)鏈，而兩個H鏈視H鏈同型而定藉由一或多個二硫鍵彼此連接。
可變性並不均勻分布於抗體之整個可變結構域中；其集中於各重鏈及輕鏈可變區之次結構域中。此等次結構域稱為「高變區」或「互補決定區」(CDR)。可變結構域之較保守(亦即非高變)部分稱為「構架」區(FRM)且提供三維空間中之六個CDR之骨架以形成抗原結合表面。天然存在之重鏈及輕鏈的可變結構域各包含四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其主要採用β片構型，藉由三個高變區連接，從而形成連接β片結構且在一些情形下形成β片結構之一部分的環。各鏈中之高變區藉由FRM與另一鏈之高變區緊密結合在一起，促成抗原結合位點之形成(參見Kabat等人，上述引文)。恆定結構域不直接參與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。
術語「CDR」及其複數「CDRs」指互補決定區，其中三者構成輕鏈可變區之結合特徵(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)，且三者構成重鏈可變區之結合特徵(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。CDR含有負責抗體與抗原之特異性相互作用之殘基中的大多數，因此促成抗體分子之功能活性：其為抗原特異性之主要決定因素。
對精確定義之CDR界限及長度進行不同分類及編號系統。因此，CDR可藉由Kabat、Chothia、contact或任何其他界限定義(包括本文所述之編號系統)提及。儘管界限不同，但各此等系統在什麼構成可變序列內之所謂「高變區」方面具有一些程度之重疊。因此，根據此等系統之CDR定義的長度及相對於相鄰構架區之界限區域可不同。參見例如Kabat(基於交叉物種序列可變性之方法)，Chothia(基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法)及/或MacCallum(Kabat等人，上述引文；Chothia等人，J.MoI.Biol,1987,196：901-917；及MacCallum等 人，J.MoI.Biol,1996,262：732)。表徵抗原結合位點之另一標準為由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用的AbM定義。參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.Antibody Engineering Lab Manual(編輯：Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)。在兩種殘基鑑別技術定義重疊區域但非相同區域之程度上，其可組合以定義混合CDR。然而，根據所謂Kabat系統編號為較佳。
通常，CDR形成可歸類為標準結構的環結構。術語「標準結構」係指由抗原結合(CDR)環採用之主鏈構形。由比較結構研究發現六個抗原結合環中有五個僅具有有限譜系之可用構形。各標準結構之特徵可為多肽主鏈之扭轉角。因此，抗體之間的相應環可具有極類似三維結構，但環之大多數部分中具有高胺基酸序列可變性(Chothia及Lesk,J.MoI.Biol.,1987,196：901；Chothia等人，Nature,1989,342：877；Martin及Thornton,J.MoI.Biol,1996,263：800)。此外，在所採用之環結構與其周圍之胺基酸序列之間存在關係。特定標準類別之構形由環之長度及位於環內以及保守構架(亦即環外)內關鍵位置之胺基酸殘基確定。可因此基於此等關鍵胺基酸殘基之存在進行分配至特定標準類別。
術語「標準結構」亦可包括關於例如Kabat(Kabat等人，上述引文)所編錄之抗體之線性序列的考慮因素。Kabat編號方案(系統)為廣泛採用之以一致方式對抗體可變結構域之胺基酸殘基編號的標準且亦如本文他處所提及為本發明中所用之較佳方案。其他結構考慮因素亦可用於確定抗體之標準結構。舉例而言，Kabat編號不能完全反映之彼等差異可由Chothia等人之編號系統描述及/或由其他技術(例如結晶學及二維或三維電腦模型化)揭示。因此，既定抗體序列可歸於標準類別，其尤其允許鑑別適當框架序列(例如基於在庫中包括多種標準 結構的需要)。Chothia等人，上述引文所述的抗體胺基酸序列之Kabat編號及結構考慮因素及其對於抗體結構之構築標準態樣的推論描述於該文獻中。不同類別之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型在此項技術中為吾人所熟知。對於抗體結構之評述，參見Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow等人編，1988。
輕鏈之CDR3及尤其重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合的最重要決定子。在一些抗體構築體中，重鏈CDR3似乎構成抗原與抗體之間之接觸部分的主要區域。可使用僅CDR3變化之活體外選擇方案來改變抗體之結合特性或判定促成抗原結合之殘基。因此，CDR3通常為抗體結合位點內分子多樣性之最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或大於26個胺基酸。
組裝及體細胞突變後之抗體基因之序列高度變化，且此等變化之基因估計編碼1010 個不同抗體分子(Immunoglobulin Genes，第2版，Jonio等人編，Academic Press,San Diego,CA,1995)。因此，該免疫系統提供免疫球蛋白之譜系。術語「譜系」係指至少一個完全或部分衍生自至少一個編碼至少一種免疫球蛋白之序列的核苷酸序列。該(該等)序列可藉由重鏈之V、D及J區段及輕鏈之V及J區段之活體內重排產生。或者，該(該等)序列可響應於重排發生之因素(例如活體外刺激)自細胞產生。或者，部分或所有序列可藉由DNA拼接、核苷酸合成、突變誘發及其他方法獲得，參見例如美國專利5,565,332。譜系可僅包括一個序列或可包括複數個序列，包括遺傳性多樣之集合中的序列。
如本文所用之術語「雙特異性」係指「至少雙特異性」之抗體構築體，亦即其包含至少一個第一結合結構域及第二結合結構域，其中第一結合結構域結合於一種抗原或標靶，且第二結合結構域結合於 另一抗原或標靶(此處：CD3)。因此，本發明之抗體構築體包含針對至少兩種不同抗原或標靶之特異性。本發明之術語「雙特異性抗體構築體」亦涵蓋多特異性抗體構築體，諸如三特異性抗體構築體，後者包括三個結合結構域，或具有超過三個(例如四個、五個...)特異性之構築體。
倘若本發明之抗體構築體為(至少)雙特異性的，則其不會天然存在且其顯著不同於天然存在之產物。因此，「雙特異性」抗體構築體或免疫球蛋白為具有至少兩個具有不同特異性之不同結合位點的人造混合抗體或免疫球蛋白。雙特異性抗體可通過包括融合瘤融合或Fab'片段連接的多種方法產生。參見例如Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)。
本發明抗體構築體之至少兩個結合結構域及可變結構域可包含或可不包含肽連接子(間隔肽)。根據本發明，術語「肽連接子」定義如下胺基酸序列，由此本發明抗體構築體之一個(可變及/或結合)結構域與另一(可變及/或結合)結構域之胺基酸序列彼此連接。此類肽連接子之必需技術特徵為該肽連接子不包含任何聚合活性。適合肽連接子描述於美國專利第4,751,180號及第4,935,233號或WO 88/09344中。
在使用連接子之情況下，此連接子較佳具有一定長度及序列以足以確保第一及第二結構域各自可彼此獨立地保留其不同結合特異性。對於連接本發明抗體構築體中之至少兩個結合結構域(或兩個可變結構域)的肽連接子，僅包含少量胺基酸殘基(例如12個或12個以下胺基酸殘基)之彼等肽連接子較佳。因此，12、11、10、9、8、7、6或5個胺基酸殘基之肽連接子為較佳。設想之具有少於5個胺基酸之肽連接子包含4、3、2或1個胺基酸，其中富含Gly之連接子為較佳。該「肽連接子」之情形下的尤其較佳「單一」胺基酸為Gly。因此，該肽連接子可由單一胺基酸Gly組成。肽連接子另一較佳具體實例另一 較佳實施例之特徵為胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，亦即(Gly4 Ser)，或其聚合物，亦即(Gly4 Ser)x，其中x為1或大於1之整數。該肽連接子之特徵(其包含促進二級結構之不存在)此項技術中已知且例如描述於Dall'Acqua等人，(Biochem.(1998)37,9266-9273)，Cheadle等人，(Mol Immunol(1992)29,21-30)及Raag及Whitlow(FASEB(1995)9(1),73-80)中。亦不促進任何二級結構之肽連接子為較佳。該等結構域彼此之連接可由例如遺傳工程改造提供，如實例中所述。製備融合及操作連接之雙特異性單鏈構築體及在哺乳動物細胞或細菌中表現其之方法為此項技術中熟知的(例如WO 99/54440或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,2001)。
雙特異性單鏈分子為此項技術中已知且描述於如下文獻中：WO 99/54440，Mack,J.Immunol.(1997),158,3965-3970，Mack,PNAS,(1995),92,7021-7025，Kufer,Cancer Immunol.Immunother.,(1997),45,193-197，Löffler,Blood,(2000),95,6,2098-2103，Brühl,Immunol.,(2001),166,2420-2426，Kipriyanov,J.Mol.Biol.,(1999),293,41-56。針對產生單鏈抗體所描述之技術(參見尤其美國專利第4,946,778號，Kontermann及Dübel(2010)，上述引文及Little(2009)，上述引文)可適合於產生特異性識別所選標靶之單鏈抗體構築體。
二價或雙特異性單鏈可變片段(具有形式(scFv)2 之bi-scFv或di-scFv)可藉由連接兩個scFv分子工程改造。若此兩個scFv分子具有相同結合特異性，則所得(scFv)2 分子較佳稱為二價(亦即其對於相同標靶抗原決定基具有兩個價數)。若兩個scFv分子具有不同結合特異性，則所得(scFv)2 分子較佳稱為雙特異性的。連接可藉由產生具有兩個VH區及兩個VL區之單一肽鏈進行，得到串聯scFv(參見例如Kufer P.等人，(2004)Trends in Biotechnology 22(5)：238-244)。另一可能性為 產生具有連接肽之scFv分子，該等連接肽對於兩個可變區摺疊在一起過短(例如約五個胺基酸)，從而迫使scFv二聚。此類型稱為雙功能抗體(參見例如Hollinger,Philipp等人，(1993年7月)Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(14)：6444-8.)。
單結構域抗體僅包含一個(單體)抗體可變結構域，其能夠獨立於其他V區或結構域選擇性結合於特異性抗原。第一單結構域抗體自駱駝中發現之重鏈抗體工程改造，且其稱為VH H片段。軟骨魚亦具有重鏈抗體(IgNAR)，可自該等重鏈抗體獲得稱為VNAR 片段之單結構域抗體。替代性方法為將來自常見免疫球蛋白(例如來自人類或嚙齒動物)之二聚可變結構域分裂為單體，從而獲得單結構域Ab形式之VH或VL。儘管目前對獲得單結構域抗體之大多數研究基於重鏈可變結構域，但衍生自輕鏈之奈米抗體亦展示特異性結合於標靶抗原決定基。單結構域抗體之實例稱為sdAb、奈米抗體或單一可變結構域抗體。
因此，(單結構域mAb)2 為由(至少)兩個單結構域單株抗體構成之單株抗體構築體，該等單結構域單株抗體個別地選自包含VH、VL、VH H及VNAR 之群。連接子較佳為肽連接子形式。類似地，「scFv單結構域mAb」為由至少一個上述單結構域抗體及一個上述scFv分子構成之單株抗體構築體。再次，連接子較佳為肽連接子形式。
亦設想本發明之抗體構築體除其結合於標靶抗原及CD3之功能以外亦具有另一功能。以此形式，抗體構築體為藉由經由結合於標靶抗原而靶向標靶細胞、經由CD3結合而調節細胞毒性T細胞活性、及提供諸如標記物(螢光等)、治療劑(諸如毒素或放射性核素)等其他功能的三功能或多功能抗體構築體。
抗體構築體之共價修飾亦包括在本發明之範疇內，且通常但不一定在轉譯後進行。舉例而言，將抗體構築體之數種類型之共價修飾 藉由使抗體構築體之特定胺基酸殘基與能夠與所選側鏈或N或C端殘基反應的有機衍化劑反應而引入分子中。
最常使半胱胺醯基殘基與α-鹵基乙酸酯(及相應胺)(諸如氯乙酸、氯乙醯胺)反應，得到羧甲基或羧醯胺基甲基衍生物。半胱胺醯基殘基亦可藉由與溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙醯基磷酸酯、N-烷基順丁烯二醯亞胺、二硫化3-硝基-2-吡啶基、二硫化甲基2-吡啶基、對氯汞苯甲酸鹽、2-氯汞-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑反應來衍化。
組胺醯基殘基係藉由在pH 5.5-7.0下與焦碳酸二乙酯反應而衍化，因為此試劑對組胺醯基側鏈具相對特異性。對溴苯甲醯甲基溴亦適用；反應較佳在pH 6.0之0.1M二甲胂酸鈉中進行。使離胺醯基及胺基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。用此等試劑進行之衍化作用具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的效用。其他用於衍化含有α-胺基之殘基之適合試劑包括亞胺基酯，諸如吡啶甲醯亞胺酸甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氫化物、三硝基苯磺酸、O-甲基異脲、2,4-戊二酮及轉胺酶催化之與乙醛酸酯的反應。
精胺醯基殘基藉由與一種或數種習知試劑(尤其苯基乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-環己二酮及茚滿三酮)反應而進行修飾。由於胍官能基具有高pKa，因此精胺酸殘基之衍化需要在鹼性條件下進行該反應。此外，此等試劑可與離胺酸之基團以及精胺酸ε-胺基反應。
可對酪胺醯基殘基進行特定修飾，其中尤其關注藉由與芳族重氮鎓化合物或四硝基甲烷反應而將光譜標記物引入酪胺醯基殘基中。最常分別使用N-乙醯基咪唑及四硝基甲烷來形成O-乙醯基酪胺醯基物質及3-硝基衍生物。酪胺醯基殘基使用125 I或131 I碘化以製備用於放射免疫分析之經標記蛋白質，上述氯胺T方法為適合的。
羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)藉由與碳化二亞胺(R'-N=C=N- -R')反應而選擇性地修飾，其中R及R'視情況為不同烷基，諸如1-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳化二亞胺。此外，天冬胺醯基及麩胺醯基殘基藉由與銨離子反應而轉化成天冬醯胺醯基及麩醯胺醯基殘基。
用雙官能試劑衍化適用於使本發明之抗體構築體交聯至多種方法所用的不溶於水的支撐基質或表面。常用交聯劑包括例如1,1-雙(重氮乙醯基)-2-苯基乙烷、戊二醛、N-羥基丁二醯亞胺酯(例如與4-疊氮水楊酸之酯)、同雙官能亞胺基酯(包括二丁二醯亞胺基酯，諸如3,3'-二硫雙(丁二醯亞胺基丙酸酯)及雙官能順丁烯二醯亞胺(諸如雙-N-順丁烯二醯亞胺-1,8-辛烷)。諸如3-[(對疊氮苯基)二硫]丙醯亞胺甲酯之衍化劑產生能夠在光存在下形成交聯之可光活化中間物。或者，不溶於水之活性基質(諸如溴化氰活化之碳水化合物及美國專利第3,969,287號；第3,691,016號；第4,195,128號；第4,247,642號；第4,229,537號；及第4,330,440號中所述之活性基質)用於蛋白質固定。
常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基去醯胺基以分別形成相應麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。或者，在適度酸性條件下將此等殘基去醯胺化。此等殘基之任一形式均屬於本發明範疇。
其他修飾包括：脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基或酥胺醯基殘基之羥基的磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之α-胺基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins：Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983，第79-86頁)；N端胺之乙醯化及任何C端羧基之醯胺化。
本發明範疇內包括的抗體構築體之另一類共價修飾包含改變蛋白質之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可取決於蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促結合至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，此等三肽序列中之任一者在多肽中的存在產生潛在糖基化位點。O連接之糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥基胺基酸連接，該羥基胺基酸最常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗體構築體添加糖基化位點藉由改變胺基酸序列以使得其含有上述三肽序列中之一或多者而便利地實現(對於N連接之糖基化位點)。亦可藉由向起始序列添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來進行改變(對於O連接之糖基化位點)。出於簡易性，抗體構築體之胺基酸序列較佳經由DNA水準改變，尤其藉由突變預選鹼基處編碼多肽之DNA以使得產生將轉譯為所要胺基酸之密碼子而改變。
增加抗體構築體上碳水化合物部分之數目的另一方式為藉由醣苷與蛋白質之化學或酶促偶合。此等程序之有利之處在於其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N連接及O連接之糖基化。視所用偶合模式而定，可將糖連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基(諸如半胱胺酸之巰基)、(d)游離羥基(諸如絲胺酸、蘇胺酸、或羥基脯胺酸之羥基)、(e)芳族殘基(諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基)、或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於WO 87/05330及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev.Biochem.,第259-306頁中。
存在於起始抗體構築體上之碳水化合物部分之移除可以化學或酶促方式實現。化學去糖基化需要將使抗體暴露於化合物三氟甲烷磺 酸或等效化合物。此處理使除連接糖(N-乙醯基葡糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)之外的大多數或所有糖裂解，而保持抗體完整。化學去糖基化由以下文獻描述：Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys .259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem .118：131。多肽上碳水化合物部分之酶促裂解可藉由使用如由Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350所述之各種內醣苷酶及外醣苷酶來達成。在潛在糖基化位點處之糖基化可藉由使用如由Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105所述之化合物衣黴素(tunicamycin)阻止。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷鍵形成。
抗體構築體之其他修飾涵蓋於本文中。，舉例而言，抗體構築體之另一類共價修飾包含將抗體構築體以美國專利第4,640,835號；第4,496,689號；第4,301,144號；第4,670,417號；第4,791,192號或第4,179,337號中所闡述之方式連接於各種非蛋白質聚合物，包括(但不限於)各種多元醇，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇與聚丙二醇之共聚物。此外，如此項技術中已知，可在抗體構築體內之各種位置中進行胺基酸取代，例如以促進聚合物(諸如PEG)添加。
在一些實施例中，本發明抗體構築體之共價修飾包含添加一或多個標記物。標記基團可經由各種長度之間隔臂與抗體構築體偶合以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法為此項技術中已知且可用於執行本發明。術語「標記物」或「標記基團」係指任何可偵測標記物。一般而言，視偵測標記物之分析而定，其屬於多種類別-以下實例包括(但不限於)：
a)同位素標記物，其可為放射性或重同位素，諸如放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、15 N、35 S、89 Zr、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I)
b)磁性標記物(例如磁性粒子)
c)氧化還原活性部分
d)光學染料(包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團)，諸如螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、欄系磷光體)、化學發光基團及可為「小分子」螢光或蛋白質螢光之螢光團
e)酶學基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖、螢光素酶、鹼磷酸酶)
f)生物素標記基團
g)由二級報導子識別的預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合結構域、抗原決定基標籤等)。
「螢光標記物」意謂可經由固有螢光特性偵測之任何分子。適合螢光標記物包括(但不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、伊紅、赤藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、馬拉賽特綠(Malacite green)、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、卡斯凱德藍J(Cascade BlueJ)、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC紅(LC Red)640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、阿萊克薩螢光染料(Alexa-Fluor dye)(阿萊克薩螢光350、阿萊克薩螢光430、阿萊克薩螢光488、阿萊克薩螢光546、阿萊克薩螢光568、阿萊克薩螢光594、阿萊克薩螢光633、阿萊克薩螢光660、阿萊克薩螢光680)、卡斯凱德藍(Cascade Blue)、卡斯凱德黃(Cascade Yellow)及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及德克薩斯紅(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。適合光學染料(包括螢光團)描述於Richard P.Haugland之Molecular Probes Handbook中。
適合蛋白質螢光標記物包括(但不限於)綠色螢光蛋白，包括Renilla、Ptilosarcus或Aequorea類型之GFP(Chalfie等人，1994,Science 263：802-805)、EGFP(Clontech Laboratories,Inc.，基因庫登錄號U55762)；藍色螢光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies,Inc.1801 de Maisonneuve Blvd.West,8樓，Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24：462-471；Heim等人，1996,Curr.Biol .6：178-182)；增強型黃色螢光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories,Inc.)；螢光素酶(Ichiki等人，1993,J.Immunol .150：5408-5417)；β半乳糖(Nolan等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .85：2603-2607)及Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號、第5925558號)。
白胺酸拉鏈結構域為促進其所存在之蛋白質寡聚的肽。白胺酸拉鏈最初在數種DNA結合蛋白中鑑別出(Landschulz等人，1988,Science 240：1759)，且隨後在多種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈為天然存在之肽及其二聚或三聚之衍生物。適用於產生可溶性寡聚蛋白之白胺酸拉鏈結構域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且衍生自肺界面活性劑蛋白D(SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191中。允許融合於其上之異源蛋白質穩定三聚的經修飾白胺酸拉鏈之用途描述於Fanslow等人，1994,Semin.Immunol .6：267-78中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之標靶抗原抗體片段或衍生物的重組融合蛋白在適合宿主細胞中表現，且所形成之可溶性寡聚標靶抗原抗體片段或衍生物自培養物上清液中回收。
本發明之抗體構築體亦可包含其他結構域，其例如有助於分離分子或與分子之經調適藥物動力學概況有關。有助於分離抗體構築體之結構域可選自肽基元或二次引入之部分，其可在分離方法(例如分 離管柱)中捕捉。此類其他結構域之非限制性實施例包含如下肽基元，其稱為Myc標籤、HAT標籤、HA標籤、TAP標籤、GST標籤、甲殼素結合結構域(CBD標籤)、麥芽糖結合蛋白(MBP標籤)、Flag標籤、Strep標籤及其變異體(例如StrepII標籤)及His標籤。所有本文中所揭示之特徵為所鑑別之CDR的抗體構築體較佳包含His標籤結構域，其通常稱為分子之胺基酸序列中連續His殘基、較佳六個His殘基之重複序列。
T細胞或T淋巴細胞為一種淋巴細胞(本身為一種白血球)，其在細胞介導之免疫性中起主要作用。存在數種T細胞亞群，各具有不同功能。T細胞可藉由細胞表面上T細胞受體(TCR)之存在而區別於其他淋巴細胞，諸如B細胞及NK細胞。TCR負責識別結合於主要組織相容性複合體(MHC)分子之抗原且由兩個不同蛋白鏈構成。在95% T細胞中，TCR由α及β鏈組成。在TCR與抗原肽及MHC(肽/MHC複合物)接合時，T淋巴細胞經由相關酶、共受體、特定接附分子及活化或釋放之轉錄因子介導之一系列生物化學事件活化。
CD3受體複合物為一種蛋白複合物且由四個鏈構成。在哺乳動物中，複合物含有CD3γ鏈、CD3δ鏈及兩個CD3ε鏈。此等鏈與T細胞受體(TCR)及所謂ζ鏈結合以形成T細胞受體CD3複合物且在T淋巴細胞中產生活化信號。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈為含有單一胞外免疫球蛋白結構域之免疫球蛋白超家族之高度相關細胞表面蛋白。CD3分子之胞內尾部含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或簡稱為ITAM的單一保守基元，其對TCR之信號傳導能力為至關重要的。CD3ε分子為如下多肽，其在人類中由位於染色體11上之CD3E 基因編碼。較佳人類CD3ε細胞外結構域之序列以SEQ ID NO：610 展示，且對應於人類CD3ε細胞外結構域之胺基酸殘基1-27的最佳結合抗原決定基以SEQ ID NO：7 表示。
經由多特異性、至少雙特異性抗體構築體募集T細胞再導引標靶細胞之溶解參與細胞溶解突觸形成及傳遞穿孔素及顆粒酶。接合之T細胞能夠進行連續標靶細胞溶解，且不受干擾肽抗原加工及呈現或選殖之T細胞分化的免疫逃逸機制影響；參見例如WO 2007/042261。
雙特異性抗體構築體介導之細胞毒性可以各種方式量測。效應細胞可為例如經刺激增濃之(人類)CD8陽性T細胞或未刺激(人類)周邊血液單核細胞(PBMC)。若標靶細胞具有獼猴來源或表現獼猴標靶細胞抗原或經獼猴標靶細胞抗原轉染，則效應細胞應亦具有獼猴來源，諸如獼猴T細胞株，例如4119LnPx。標靶細胞應表現標靶細胞抗原(例如人類或獼猴標靶細胞抗原)(之至少細胞外結構域)。標靶細胞可為經標靶細胞抗原(例如人類或獼猴標靶細胞抗原)穩定或短暫轉染之細胞株(諸如CHO)。或者，標靶細胞可為標靶細胞抗原陽性天然表現細胞株，諸如人類癌細胞株。通常，預期細胞表面上表現較高水準之標靶細胞抗原的標靶細胞株的EC50值較低。效應子與標靶細胞(E：T)比率通常為約10：1，但亦可變化。雙特異性抗體構築體之細胞毒性活性可在51 鉻釋放分析(培育時間為約18小時)或基於FACS之細胞毒性分析(培育時間為約48小時)中量測。分析培育時間(細胞毒性反應)亦可變化量測細胞毒性之其他方法為熟習此項技術者熟知且包含MTT或MTS分析、基於ATP之分析，包括生物發光分析、磺醯若丹明B(SRB)分析、WST分析、細胞群落分析及ECIS技術。
本發明之雙特異性抗體構築體介導之細胞毒性活性較佳在基於細胞之細胞毒性分析中量測。其由EC50 值表示，該值對應於一半最大有效濃度(誘導為基線與最大值之間的一半的細胞毒性反應的抗體構築體之濃度)。較佳地，雙特異性抗體構築體之EC50 值為20.000pg/ml，更佳5000pg/ml，甚至更佳1000pg/ml，甚至更佳500pg/ml，甚至更佳350pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100 pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。
以上所給之EC50 值中之任一者可與基於細胞之細胞毒性分析的制定情形中之任一者組合，例如根據隨附實例中所述之方法。舉例而言，在(人類)CD8陽性T細胞或獼猴T細胞株用作效應細胞時，標靶細胞抗原/CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳為1000pg/ml，更佳500pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。若在此分析中標靶細胞為經細胞(諸如CHO細胞)轉染之(人類或獼猴)標靶細胞抗原，則標靶細胞抗原/CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳為150pg/ml，更佳100pg/ml，甚至更佳50pg/ml，甚至更佳30pg/ml，甚至更佳10pg/ml且最佳5pg/ml。若標靶細胞為標靶細胞抗原陽性天然表現細胞株，則EC50 值較佳為350pg/ml，更佳250pg/ml，甚至更佳200pg/ml，甚至更佳100pg/ml，甚至更佳150pg/ml，甚至更佳100pg/ml，且最佳50pg/ml，或更低。在(人類用作效應細胞時，標靶細胞抗原/CD3雙特異性抗體構築體之EC50 值較佳為1000pg/ml，更佳750pg/ml，更佳500pg/ml，甚至更佳350pg/ml，甚至更佳250pg/ml，甚至更佳100pg/ml，且最佳50pg/ml或更低。
較佳地，本發明之雙特異性抗體構築體不誘導/介導標靶細胞抗原陰性細胞(諸如CHO細胞)之溶解或基本上不誘導/介導其溶解。術語「不誘導溶解」、「基本上不誘導溶解」、「不介導溶解」或「基本上不介導溶解」意謂本發明之抗體構築體不誘導或介導超過30%、較佳不超過20%、更佳不超過10%、尤其較佳不超過9%、8%、7%、6%或5%標靶細胞抗原陰性細胞之溶解，其中將標靶細胞抗原陽性細胞株之溶解設定成100%。此通常適用於高達500nM之抗體構築體濃度。熟習此項技術者已知如何在無需其他忙亂的情況下量測細胞溶解。此外，本發明教示如何量測細胞溶解之特別說明。
個別雙特異性抗體構築體之單體與二聚同功異型物之間的細胞毒性活性差異稱為「效能差」。此效能差可例如以分子之單體與二聚形式之EC50 值之間的比率形式計算。本發明之雙特異性抗體構築體之效能差較佳為5，更佳4，甚至更佳3，甚至更佳2且最佳1。
本發明之抗體構築體之第一及/或第二(或任何其他)結合結構域較佳為特異於靈長類動物之哺乳動物綱之成員的種間交叉結合結構域。種間交叉特異性CD3結合結構域例如描述於WO 2008/119567中。根據一個實施例，第一及/或第二結合結構域除分別結合於標靶細胞抗原及人類CD3以外亦結合於靈長類動物之標靶細胞抗原/CD3，該等靈長類動物包括(但不限於)新世界靈長類動物(諸如白鬢狨(Callithrix jacchus )、棉頂狨(Saguinus Oedipus )或松鼠猴(Saimiri sciureus ))、舊世界靈長類動物(如狒狒及短尾猿)、長臂猿及非人類人亞科。
在本發明之一個態樣中，第一結合結構域結合於人類CDH19(SEQ ID NO：611 )且另外結合於獼猴CDH19，諸如食蟹獼猴(Macaca fascicularis)之CDH19(SEQ ID NO：612 )。獼猴CDH19之第一結合結構域之親和力較佳為15nM，更佳10nM，甚至更佳5nM，甚至更佳1nM，甚至更佳0.5nM，甚至更佳0.1nM，且最佳0.05nM或甚至0.01nM。
較佳地，本發明抗體構築體關於結合於其特異性獼猴與人類標靶抗原(例如獼猴CDH19與人類CDH19)之親和力差[maCDH19：huCDH19]為0.1至10，更佳0.2至5，甚至更佳0.3至2.5，甚至更佳0.4至2，且最佳0.5至1。
在本發明抗體構築體之另一實施例中，抗體構築體包含選自由以下組成之群的N端之FcRn結合肽及C端之FcRn結合肽：(a)N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLYPANG (SEQ ID NO：2)，且C端之FcRn結合肽包含 胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)；(b)N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLYPANG (SEQ ID NO：2)，且C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)；(c)N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)，且C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)；(d)N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)，且C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)；(e)N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)，且C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLYPANG (SEQ ID NO：2)；及(f)N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)，且C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)。
如由實例1中所呈現之資料顯而易見，已意外地發現環肽(亦即包含cys環之肽)一方面對於雙特異性單鏈構築體例如於細胞培養物中之產生(上游製備標準)及其分離(下游製備標準)很關鍵。另一方面，實例展示此類環肽在蛋白鏈內之位置對於雙特異性單鏈構築體之產生及分離為決定性的。在構築體之N端及C端包含FcRn結合肽之所鑑別組合的本發明雙特異性單鏈抗體構築體使得可向抗體構築體提供較佳組織分布特徵，同時保持其工業上可接受之上游及下游製備標準。
在本發明抗體構築體之另一實施例中，FcRn結合肽經由肽連接子連接於抗體構築體。肽連接子較佳具有胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO：6)n ，其中「n」為在1至5範圍內之整數。更佳為在1至3範圍內 之整數「n」，且最佳「n」為1或2。
在本發明的一個實施例中，構築體包含結合於血清白蛋白之另一結構域。
尤其較佳白蛋白結合結構域為例如具有序列RDWDFDVFGGGTPVGG(SEQ ID NO：609)之肽。然而，具有線性結構且不包含如cys環之結構的結合於白蛋白的結構域為較佳，因為假定本發明之抗體構築體中此類另一cys環結構與製備問題關聯。
此外，在本發明抗體構築體之一個實施例中，標靶細胞表面抗原為腫瘤抗原。較佳地，此腫瘤抗原選自由以下組成之群：CDH19(鈣黏素19)、MSLN(間皮素，亦描述為巨核細胞增強因子[MPE])、DLL3、FLT3(FMS相關之酪胺酸激酶3，亦描述為幹細胞酪胺酸激酶1[STK1]或FLK2)、CD33(亦稱為唾液酸結合性免疫球蛋白樣凝集素3[SIGLEC3])、CD20(亦稱為B淋巴細胞表面抗原B1[B1]或MS4A1)及EGFRvIII。
在本發明抗體構築體之一個實施例中，第二結合結構域結合於人類及白鬢狨、棉頂狨或松鼠猴CD3ε鏈之抗原決定基，其中該抗原決定基為包含於由以下組成之群中之胺基酸序列之一部分：SEQ ID NO：7(人類)、SEQ ID NO：8(白鬢狨)、SEQ ID NO：9(棉頂狨)及SEQ ID NO：10(松鼠猴)，且包含至少胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO：11)。白鬢狨及棉頂狨均為屬於狨猴科的新世界靈長類動物，而松鼠猴為屬於卷尾猴科之新世界靈長類動物。
在一個實施例中，第二結合結構域包含具有CDR-L1-L3之VL區及具有CDR-H1-H3之VH區，該CDR-L1-L3及CDR-H1-H3選自由以下組成之群：(a)SEQ ID NO：12-14中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：15-17中所描繪之CDR-H1-H3； (b)SEQ ID NO：24-26中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：27-29中所描繪之CDR-H1-H3；(c)SEQ ID NO：36-38中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：39-41中所描繪之CDR-H1-H3；(d)SEQ ID NO：48-50中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：51-53中所描繪之CDR-H1-H3；(e)SEQ ID NO：60-62中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：63-65中所描繪之CDR-H1-H3；(f)SEQ ID NO：72-74中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：75-77中所描繪之CDR-H1-H3；(g)SEQ ID NO：84-86中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：87-89中所描繪之CDR-H1-H3；(h)SEQ ID NO：96-98中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：99-101中所描繪之CDR-H1-H3；(i)SEQ ID NO：108-110中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：111-113中所描繪之CDR-H1-H3；(j)SEQ ID NO：120-122中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：123-125中所描繪之CDR-H1-H3；(k)SEQ ID NO：616-618中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：613-615中所描繪之CDR-H1-H3；(l)SEQ ID NO：626-628中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：623-625中所描繪之CDR-H1-H3；(m)SEQ ID NO：636-638中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：633-635中所描繪之CDR-H1-H3；(n)SEQ ID NO：646-648中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：643-645中所描繪之CDR-H1-H3； (o)SEQ ID NO：656-658中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：653-655中所描繪之CDR-H1-H3；(p)SEQ ID NO：666-668中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：663-665中所描繪之CDR-H1-H3；(q)SEQ ID NO：676-678中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：673-675中所描繪之CDR-H1-H3；及(r)SEQ ID NO：686-688中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：683-685中所描繪之CDR-H1-H3。
在一個實施例中，第二結合結構域包含選自由以下組成之群之成對VH及VL鏈：(a)SEQ ID NO：18中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：20中所描繪之VL鏈；(b)SEQ ID NO：30中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：32中所描繪之VL鏈；(c)SEQ ID NO：42中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：44中所描繪之VL鏈；(d)SEQ ID NO：54中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：56中所描繪之VL鏈；(e)SEQ ID NO：66中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：68中所描繪之VL鏈；(f)SEQ ID NO：78中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：80中所描繪之VL鏈；(g)SEQ ID NO：90中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：92中所描繪之VL鏈；(h)SEQ ID NO：102中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：104中所描繪之VL鏈； (i)SEQ ID NO：114中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：116中所描繪之VL鏈；(j)SEQ ID NO：126中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：128中所描繪之VL鏈；(k)SEQ ID NO：619中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：620中所描繪之VL鏈；(l)SEQ ID NO：629中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：630中所描繪之VL鏈；(m)SEQ ID NO：639中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：640中所描繪之VL鏈；(n)SEQ ID NO：649中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：650中所描繪之VL鏈；(o)SEQ ID NO：659中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：660中所描繪之VL鏈；(p)SEQ ID NO：669中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：670中所描繪之VL鏈；(q)SEQ ID NO：679中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：680中所描繪之VL鏈；及(r)SEQ ID NO：689中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：690中所描繪之VL鏈。
此外，在本發明抗體構築體之一個實施例中，第二結合結構域包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：681或SEQ ID NO：691中所描繪之胺基酸序 列。
在本發明抗體構築體之一較佳實施例中，結構域自N端至C端排列如下：(包含SEQ ID NO：1之FcRn結合肽)-(第一結合結構域之VH鏈)-(第一結合結構域之VL鏈)-(第二結合結構域之VH鏈)-(第二結合結構域之VL鏈)-(包含SEQ ID NO：4之FcRn結合肽)或(包含SEQ ID NO：4之FcRn結合肽)-(第一結合結構域之VH鏈)-(第一結合結構域之VL鏈)-(第二結合結構域之VH鏈)-(第二結合結構域之VL鏈)-(包含SEQ ID NO：1之FcRn結合肽)。
亦涵蓋本文所述之抗體構築體的胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改良抗體構築體之結合親和力及/或其他生物學特性。抗體構築體之胺基酸序列變異體藉由向抗體構築體核酸中引入適當核苷酸變化或藉由肽合成來製備。所有下述胺基序列修飾應得到抗體構築體，其仍保留未經修飾親本分子之所要生物活性(結合於標靶細胞抗原及結合於CD3)。
術語「胺基酸」或「胺基酸殘基」通常指具有此項技術中認可之定義的胺基酸，諸如選自由以下組成之群的胺基酸：丙胺酸(Ala或A)；精胺酸(Arg或R)；天冬醯胺(Asn或N)；天冬胺酸(Asp或D)；半胱胺酸(Cys或C)；麩醯胺酸(Gln或Q)；麩胺酸(Glu或E)；甘胺酸(Gly或G)；組胺酸(His或H)；異白胺酸(He或I)；白胺酸(Leu或L)；離胺酸(Lys或K)；甲硫胺酸(Met或M)；苯丙胺酸(Phe或F)；脯胺酸(Pro或P)；絲胺酸(Ser或S)；蘇胺酸(Thr或T)；色胺酸(Trp或W)；酪胺酸(Tyr或Y)；及纈胺酸(Val或V)，但經修飾、合成或稀有胺基酸可視需要使用。一般而言，胺基酸可分組為具有非極性側鏈之胺基酸(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；具有帶負電側鏈之胺基酸(例 如Asp、Glu)；具有帶正電側鏈之胺基酸(例如Arg、His、Lys)；或具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp及Tyr)。
胺基酸修飾包括例如缺失抗體構築體之胺基酸序列內的殘基及/或插入該等殘基中及/或取代該等殘基。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為該最終構築體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變抗體構築體之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之編號或位置。
舉例而言，1、2、3、4、5或6個胺基酸可插入各CDR中或在各CDR中缺失(當然，取決於其長度)，而1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸可插入各FR中或在各FR中缺失。較佳地，胺基酸序列插入物包括長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之內部序列插入物。本發明抗體構築體之插入變異體包括與針對酶之抗體構築體之N端或C端之融合物或與延長抗體構築體之血清半衰期的多肽的融合物。
取代突變誘發之最受關注位點包括重鏈及/或輕鏈之CDR，尤其高變區，但亦涵蓋重鏈及/或輕鏈之FR改變。取代較佳為如本文所述之保守取代。較佳地，視CDR或FR之長度而定，可取代CDR中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸，而可取代構架區(FR)中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸。舉例而言，若CDR序列涵蓋6個胺基酸，則可設想取代此等胺基酸中之一者、兩者或三者。類似地，若CDR序列涵蓋15功胺基酸，則可設想取代此等胺基酸中之一者、兩者、三者、四者、五者或六者。
鑑別抗體構築體中作為突變誘發之較佳位置的特定殘基或區域之適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，其如Cunningham及Wells,Science,244：1081-1085(1989)所述。在本文中，鑑別抗體構築體內之標靶殘基之殘基或基團(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且經中性或帶負電胺基酸(最佳丙胺酸或聚丙胺酸)置換以影響胺基酸與抗原決定基之相互作用。
隨後，藉由在取代位點處或為取代位點引入其他變異體以改進彼等證明對取代具有功能敏感性之胺基酸部位。因此，在預先確定引入胺基酸序列變化之位點或區域時，突變本身之性質無需預先確定。舉例而言，為分析或最佳化既定位點之突變的效能，可在標靶密碼子或區域進行丙胺酸掃描或隨機突變誘發，且針對所要活性之最佳組合篩選所表現之抗體構築體變異體。在具有已知序列之DNA的預定位點中進行取代突變之技術為吾人所熟知，例如M13引子突變誘發及PCR突變誘發。使用抗原結合活性之分析(諸如CDH19結合)進行突變體之篩選。
一般而言，若取代重鏈及/或輕鏈之CDR中之一或多者或所有的胺基酸，則較佳隨後所得之「經取代之」序列與「原始」CDR序列至少60%、更佳65%、甚至更佳70%、尤其較佳75%、更尤其較佳80%一致。此意謂其取決於CDR之達到與「經取代之」序列一致之程度的長度。舉例而言，具有5個胺基酸之CDR與其經取代之序列較佳80%一致以有至少一個胺基酸經取代。因此，抗體構築體之CDR可與其經取代之序列具有不同程度之一致性，例如CDRL1可具有80%，而CDRL3可具有90%。
較佳取代(或置換)為保守取代。然而，可設想任何取代基(包括非保守取代或下表1中所列之「例示性取代」中之一或多者)，只要抗體構築體保留其經由第一結合結構域結合於標靶細胞抗原且經由第二 結合結構域結合於CD3ε之能力及/或其CDR與隨後經取代之序列具有一致性(與「原始」CDR序列至少60%、更佳65%、甚至更佳70%、尤其較佳75%、更尤其較佳80%一致)即可。
保守性取代以標題「較佳取代」展示於表1中。若此類取代引起生物活性變化，則可引入表A中稱為「例示性取代」或如下文提及胺基酸類別時之進一步描述的更實質變化且針對所要特徵篩選產物。
本發明抗體構築體之生物特性的實質改變藉由選擇取代實現，該等取代在其對維持(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如片或螺旋構形，(b)標靶位點處分子之電荷或疏水性或(c)側鏈之體積的作用上顯著不同。可基於共同側鏈特性將天然存在之殘基分組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：asn、gin、his、lys、arg；(5) 影響鏈定向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。
非保守性取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。可取代(一般以絲胺酸)不參與維持抗體構築體之適當構形的任何半胱胺酸殘基以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。反之，可向抗體添加半胱胺酸鍵以改良其穩定性(尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段的情況下)。
對於胺基酸序列，藉由使用此項技術中已知之標準技術測定序列一致性及/或類似性，包括(但不限於)Smith及Waterman,1981,Adv.Appl.Math .2：482之局部序列一致性算法；Needleman及Wunsch,1970,J.Mol.Biol .48：443之序列一致性比對算法；Pearson及Lipman,1988,Proc.NatAcad.Sci.U.S.A .85：2444之類似性方法之檢索；此等算法之電腦化具體實例(Wisconsin Genetics軟體套件，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res .12：387-395所述之最佳擬合序列程式，較佳使用預設設定或藉由測試達成。較佳地，百分比一致性藉由FastDB基於以下參數計算：錯配罰分1；空隙罰分1；空隙尺寸罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,」Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988),Alan R.Liss,Inc。
適用算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進成對比對由一組相關序列產生多個序列比對。其亦可繪製展示用於產生比對之叢集關係的樹。PILEUP使用Feng及Doolittle,1987,J.Mol.Evol .35：351-360之漸進比對方法之簡化方法；該方法類似於Higgins及Sharp,1989,CABIOS 5：151-153所述。適用參數包括預設間隙權重3.00、預設空隙長度權重0.10及經加權末端空隙。
適用算法之另一實例為BLAST算法，描述於以下文獻中：Altschul等人，1990,J.Mol.Biol .215：403-410；Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res .25：3389-3402；及Karin等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A .90：5873-5787。尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人，1996,Methods in Enzymology 266：460-480。WU-BLAST-2使用數個檢索參數，其中之大多數設定成預設值。使用以下值設定可調節的參數：重疊間隔=1、重疊分數=0.125、詞臨限值(T)=II。HSP S及HSP S2參數為動態值且藉由本身程式視特定序列之組成及相關序列檢索之特定資料庫之組成而確立；然而可調節該等值以提高敏感性。
其他適用算法為Altschul等人，1993,Nucl.Acids Res .25：3389-3402報導之空隙BLAST。空隙BLAST使用BLOSUM-62取代計分；臨限值T參數設定為9；兩點碰撞法(two-hit method)用於觸發無空隙延伸部分，電荷空隙長度k，代價為10+k；Xu設定為16，且Xg對於資料庫檢索階段設定為40，且對於算法之輸出階段設定為67。空隙比對藉由對應於約22比特之分值觸發。
一般而言，個別變異體CDR與本文所描繪之序列之間的胺基酸同源性、類似性或一致性為至少60%，且更通常具有至少65%或70%之較佳增加之同源性或一致性，更佳至少75%或80%，甚至更佳至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，且幾乎100%。以類似方式，相對於本文所鑑別之結合蛋白的核酸序列的「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗體構築體之編碼序列中之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基之百分比。特定方法使用設定為預設參數之WU-BLAST-2的BLASTN模組，其中重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。
一般而言，編碼個別變異體CDR之核苷酸序列與本文所描繪之核 苷酸序列之間的核酸序列同源性、類似性或一致性為至少60%，且更通常具有至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的較佳增加之同源性或一致性，且幾乎100%。因此，「變異體CDR」為相對於本發明之親本CDR具有特定同源性、類似性或一致性的CDR，且具有包括(但不限於)親本CDR之特異性及/或活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的生物功能。
此外，可設想本發明之雙特異性抗體構築體展現治療功效或抗腫瘤活性。此可例如在以下晚期人類腫瘤異種移植模型之實例中所述的研究中評定：
在研究之第1天，將5×106 個人類標靶細胞抗原陽性癌細胞株細胞皮下注射於雌性NOD/SCID小鼠之右背側中。當平均腫瘤體積達到約100mm3 時，將活體外擴增之人類CD3陽性T細胞移植於小鼠中，其藉由將約2×107 個細胞注射於動物之腹膜腔中達成。媒劑對照組1之小鼠不接受效應細胞且用作未移植對照來與媒劑對照組2(接受效應細胞)比較以監測單獨的T細胞對腫瘤生長之影響。抗體處理在平均腫瘤體積達到約200mm3 時開始。處理開始之日各處理組之平均腫瘤尺寸不應在統計學上不同於任何其他組(變異數分析)。藉由靜脈內快速注射約15至20天用0.5毫克/公斤/天標靶細胞抗原/CD3雙特異性抗體構築體處理小鼠。在研究期間藉由測徑規量測腫瘤且藉由組間比較腫瘤體積(TV)評估進展。藉由以T/C%=100×(分析組之中值TV)/(對照組2之中值TV)形式計算TV確定腫瘤生長抑制T/C[%]。
熟習此項技術者已知如何修改或調整此研究之特定參數，諸如所注射腫瘤細胞之數目、注射位點、所移植人類T細胞之數目、欲投 與之雙特異性抗體構築體之量及時刻表，而仍達成有意義且可複製之結果。較佳地，腫瘤生長抑制T/C[%]為70或60，更佳50或40，甚至更佳30或20且最佳10或5或甚至2.5。
在一個實施例中，本發明之雙特異性抗體構築體在標準研究規模條件下(例如在標準兩步純化方法中)展現高單體產量。較佳地，本發明抗體構築體之單體產量0.25mg/L上清液，更佳0.5mg/L，甚至更佳1mg/L，且最佳3mg/L上清液。
同樣，可測定二聚抗體構築體同功異型物之產量及抗體構築體之單體百分比(亦即單體：(單體+二聚體))。單體及二聚抗體構築體之生產力及所計算之單體百分比可例如在來自滾瓶中之標準化研究規模製備之培養物上清液的SEC純化步驟中獲得。在一個實施例中，抗體構築體之單體百分比為80%，更佳85%，甚至更佳90%，且最佳95%。
在另一實施例中，與本發明抗體構築體之人類生殖系之一致性百分比為70%或75%，更佳80%或85%，甚至更佳90%，且最佳95%。認為與人類抗體生殖系基因產物之一致性為降低治療期間治療蛋白之引發患者中針對藥物之免疫反應之風險的重要特徵。Hwang & Foote(「Immunogenicity of engineered antibodies」；Methods 36(2005)3-10)展示減少藥物抗體構築體之非人類部分使治療期間患者中誘導抗藥物抗體之風險降低。藉由比較大量臨床上評估之抗體藥物及各別免疫原性資料，展示人類化抗體之V區使蛋白質之免疫原性(平均5.1%患者)低於帶有未改變之非人類V區之抗體(平均23.59%患者)的趨勢。因此，對於抗體構築體形式的基於V區之蛋白質療法，需要與人類序列具有較高一致性程度。出於確定生殖系一致性之此目的，可使用載體NTI軟體將VL之V區與人類生殖系V區及J區之胺基酸序列比對(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，且胺基酸序列藉由將一致胺基酸 殘基除以VL之胺基酸殘基之總數計算(%)。其可用於VH區段(http：//vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，除了可能由於VH CDR3之高多樣性及缺乏現有人類生殖系VH CDR3比對搭配物而不包括VH CDR3。可隨後使用重組技術提高與人類抗體生殖系基因之序列一致性。
在一個實施例中，抗體構築體具有較佳血漿穩定性(有血漿之情況下的EC50與無血漿之情況下的EC50之比率)，其為5，更佳4，甚至更佳3，且最佳2。抗體構築體之血漿穩定性可藉由將構築體在37℃下在人類血漿中培育24小時，繼而在51鉻釋放細胞毒性分析中測定EC50來測試。細胞毒性分析中之效應細胞可為經刺激增濃之人類CD8陽性T細胞。標靶細胞可例如為經人類標靶細胞抗原轉染之CHO細胞。效應子與標靶細胞(E：T)比率可選擇為10：1。用於此目的之人類血漿庫獲自藉由塗佈EDTA之注射器收集的健康供體之血液。藉由離心移除細胞組分，收集上部血漿相且隨後彙集。作為對照，稀釋抗體構築體，隨後立即在RPMI-1640培養基中進行細胞毒性分析。血漿穩定性以EC50(血漿培育後)與EC50(對照)之比率的形式計算。
本發明抗體構築體之單體至二聚體之轉化率較佳為低的。轉化率可在不同條件下量測且藉由高效尺寸排阻層析分析。舉例而言，培育抗體構築體之單體同功異型物可在37℃下執行7天且在培育箱中達到例如100μg/ml或250μg/ml之濃度。在此等條件下，較佳地，本發明之抗體構築體展示5%之二聚體百分比，更佳4%，甚至更佳3%，甚至更佳2.5%，甚至更佳2%，甚至更佳1.5%，且最佳1%。
本發明之雙特異性抗體構築體亦較佳在多個凍/融循環後呈現極低二聚體轉化率。舉例而言，將抗體構築體單體例如在SEC操作緩衝液中調節至250μg/ml之濃度且進行三個凍/融循環(在-80℃下冷凍30分鐘繼而在室溫下融化30分鐘)，繼而高效SEC以測定已轉化成二聚 抗體構築體之最初單體抗體構築體之百分比。舉例而言，在三個凍/融循環後，雙特異性抗體構築體之二聚體百分比較佳為5%，更佳4%，甚至更佳3%，甚至更佳2.5%，甚至更佳2%，甚至更佳1.5%，且最佳1%。
本發明之雙特異性抗體構築體較佳展示有利熱穩定性，熔融溫度高於60℃。此參數可如下確定：溫度熔融曲線藉由差示掃描熱量測定(DSC)確定以測定抗體構築體之固有生物物理學蛋白質穩定性。此等實驗使用MicroCal LLC(Northampton,MA,U.S.A)VP-DSC器件執行。與僅含有調配緩衝液之樣品相比，自20℃至90℃記錄含有抗體構築體之樣品的能量吸收。將抗體構築體例如在SEC操作緩衝液中調節至250μg/ml之最終濃度。為記錄各別熔融曲線，逐步提高整個樣品溫度。在各溫度T下，記錄樣品及調配緩衝液參考物之能量吸收。相對於各別溫度繪製樣品減去參考物之能量吸收Cp(kcal/mole/℃)之差值的圖。熔融溫度定義為能量吸收之第一最大值之溫度。
在另一實施例中，本發明之抗體構築體在酸性pH值下穩定。在非生理pH值(諸如pH 5.5，例如操作陽離子交換層析所需之pH值)下，抗體構築體表現得愈具有耐受性，相對於所負載之蛋白質之總量自離子交換管柱溶離之抗體構築體之回收率愈高。pH 5.5下來自離子(例如陽離子)交換管柱之抗體構築體之回收率較佳為30%，更佳40%，更佳50%，甚至更佳60%，甚至更佳70%，甚至更佳80%，且最佳90%。
在一替代性實施例中，本發明提供一種編碼本發明之抗體構築體的聚核苷酸。
聚核苷酸為由13個或13個以上共價鍵結於鏈中之核苷酸單體構成的生物聚合物。DNA(諸如cDNA)及RNA(諸如mRNA)為具有不同生物功能之聚核苷酸的實例。核苷酸為充當核酸分子(如DNA或RNA) 之單體或次單位的有機分子。核酸分子或聚核苷酸可為雙股及單股、線性及環形的。其較佳包含於載體中，該載體較佳包含於宿主細胞中。該宿主細胞例如在用本發明之載體或聚核苷酸轉型或轉染後能夠表現抗體構築體。出於該目的，聚核苷酸或核酸分子與控制序列可操作地連接。
遺傳密碼為遺傳物質(核酸)內編碼之資訊轉譯成蛋白質所用之規則之組。活細胞中之生物學解碼藉由核糖體實現，核糖體使用tRNA分子運載胺基酸且同時讀取mRNA之三個核苷酸而以由mRNA規定之次序連接胺基酸。該密碼定義此等核苷酸三聯體(稱為密碼子)之序列如何規定在蛋白質合成期間隨後添加哪個胺基酸。核酸序列中三個核苷酸之密碼子規定單一胺基酸，但有一些例外情形。因為絕大部分基因用完全相同之密碼編碼，故此特定密碼通常稱為標準遺傳密碼。遺傳密碼決定既定編碼區之蛋白質序列，而其他基因組區可影響此等蛋白質產生之時間及位置。
此外，本發明提供一種載體，其包含本發明之聚核苷酸/核酸分子。
載體為用作將(外來)遺傳物質轉移至細胞中之運載工具的核酸分子。術語「載體」涵蓋(但不限於)質體、病毒、黏質體及人造染色體。。一般而言，工程改造載體包含複製起點、多選殖位點及可選標記物。載體本身通常為核苷酸序列，通常DNA序列，其包含插入序列(轉殖基因)及充當載體之「主鏈」的較大序列。現今載體可包涵除轉殖基因插入序列及主鏈以外之其他特徵：啟動子、遺傳標記物、抗生素抗性序列、報導基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。稱為表現載體(表現構築體)之載體特異於在標靶細胞中表現轉殖基因，且通常具有控制序列。
術語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作連接之 編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
核酸在其置放至與另一核酸序列具有功能關係時「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌性前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA可操作地連接；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列可操作地連接；或若核糖體結合位點經定位以便有助於轉譯，則其與編碼序列可操作地連接。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列相鄰且在分泌性前導序列之情況下，相鄰且在閱讀相中。然而，增強子不必為相鄰的。連接係藉由在適宜限制位點處連接來實現。若此類位點不存在，則根據慣例使用合成寡核苷酸接附子或連接子。
「轉染」為向標靶細胞中故意引入核酸分子或聚核苷酸(包括載體)的過程。該術語主要用於真核細胞中之非病毒方法。轉導通常用於描述病毒介導之核酸分子或聚核苷酸之轉移。動物細胞之轉染通常涉及在細胞膜中打開短暫的孔或「洞」，以使得可吸收物質。轉染可使用磷酸鈣、藉由電穿孔、藉由細胞擠壓或藉由混合陽離子脂質與產生脂質體(其與細胞膜融合且使其內部之負載沈積)之物質來執行。
術語「轉型」用於描述核酸分子或聚核苷酸(包括載體)向細菌以及非動物真核細胞(包括植物細胞)中之非病毒轉移。因此，轉型為細菌或非動物真核細胞透過細胞膜自其環境直接吸收且隨後併入外源遺傳物質(核酸分子)所造成之基因改變。轉型可由人工方式執行。為了使轉型發生，細胞或細菌必須處於感受態，其可隨時間限制而對環境條件(諸如饑餓及細胞密度)發生反應。
此外，本發明提供一種用聚核苷酸/核酸分子或用本發明之載體轉型或轉染之宿主細胞。
如本文所用，術語「宿主細胞」或「接受者細胞」意欲包括可作為或已成為載體、外源核酸分子及編碼本發明抗體構築體之聚核苷酸之接受者；及/或抗體構築體本身之接受者的任何個別細胞或細胞培養物。可藉助於轉型、轉染及其類似方法將各別物質引入細胞中。術語「宿主細胞」亦意欲包括單個細胞之後代或可能後代。因為隨後之續代中可能由於天然、偶然或故意突變或由於環境影響而發生特定修飾，故實際上此類後代可能不與親本細胞完全相同(形態或基因組或總DNA互補序列)，但仍包括在如本文所用之術語之範疇內。適合之宿主細胞包括原核或真核細胞，而且包括(但不限於)細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞及動物細胞，諸如昆蟲細胞及哺乳動物細胞，例如鼠類、大鼠、獼猴或人類。
本發明之抗體構築體可在細菌中產生。表現後，本發明之抗體構築體以可溶性溶離份自大腸桿菌細胞漿料分離且可經由例如親和層析及/或尺寸排阻純化。可類似於純化例如CHO細胞中表現之抗體之方法來進行最終純化。
除原核生物以外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)為本發明之抗體構築體的適合選殖或表現宿主。在低級真核宿主微生物中最常使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通麵包酵母(baker's yeast)。然而，多種其他屬、種及菌株通常可用且適用於本文，諸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母宿主(Kluyveromyces)，諸如乳酸克魯維酵母(K.lactis )、脆壁克魯維酵母(K.fragilis )(ATCC 12424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus )(ATCC 16045)，威克克魯維酵母(K.wickeramii )(ATCC 24178)，克魯維雄酵母(K.waltii )(ATCC 56500)、果妮克魯維酵母(K.drosophilarum )(ATCC 36906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K.marxianus )；耶氏酵母屬(yarrowia)(EP 402 226)；甲醇酵母(Pichia pastoris )(EP 183 070)；假絲酵母(Candida)；里氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244 234)；粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa )；許旺酵母(Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；及絲狀真菌，諸如紅黴菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、彎頸黴屬(Tolypocladium)及麴菌屬(Aspergillus)宿主，諸如構巢麯黴(A.nidulans )及黑麯黴(A.niger )。
用於表現本發明之糖基化抗體構築體之適合宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別多種桿狀病毒株及變異體以及來自諸如草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Droso-phila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )之宿主的相應許可昆蟲宿主細胞。用於轉染之多種病毒株公開可得，例如苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica )NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5病毒株，且根據本發明此類病毒可用作本文中之病毒，尤其用於轉染草地黏蟲細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄、芥菜及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。適用於在植物細胞培養物中產生蛋白質之選殖及表現載體為熟習此項技術者已知。參見例如Hiatt等人，Nature(1989)342：76-78，Owen等人，(1992)Bio/Technology 10：790-794，Artsaenko等人，(1995)The Plant J 8：745-750，及Fecker等人，(1996)Plant Mol Biol 32：979-986。
然而，脊椎動物細胞最受關注，且脊椎動物細胞於培養物(組織培養物)中之繁殖已成為一種常規程序。適用哺乳動物宿主細胞株之實例為由SV40轉型之猴腎臟CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚腎株(次選殖以用於在懸浮培養物中生長之293或293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cell，TM4，Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴腎臟細胞(CVI ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝臟細胞(buffalo rat liver cell，BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，1413 8065)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL5 1)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.(1982)383：44-68)；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝癌株(Hep G2)。
本發明亦提供一種製備本發明抗體構築體之方法，該方法包含在使得本發明之抗體構築體表現之條件下培養本發明之宿主細胞，及回收自培養物產生之抗體構築體。
如本文所用，術語「培養」係指在適合條件下在培養基中活體外維持細胞、使其分化、生長、增殖及/或繁殖。術語「表現」包括參與制備本發明抗體構築體之任何步驟，包括(但不限於)轉錄、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後修飾及分泌。
當使用重組技術時，抗體構築體可於細胞內、周質空間中產生或直接分泌於培養基中。若抗體構築體於細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾移除宿主細胞或已溶解片段之顆粒碎片。Carter等人，Bio/Technology 10：163-167(1992)描述分離分泌至大腸桿菌之周質空間的抗體的程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯基氟(PMSF)存在下經約30分鐘融化細胞漿料。可藉由離心移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情形下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白 酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。
自宿主細胞製備之本發明之抗體構築體可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和層析回收或純化。亦可視欲回收抗體而利用其他用於蛋白質純化之技術，諸如離子交換管柱分餾、乙醇沈澱、逆相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSETM 層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸管柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。若本發明之抗體構築體包含CH3結構域，則Bakerbond ABX樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)適用於純化。
親和層析為較佳純化技術。儘管親和配體所連接之基質最常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。與用瓊脂糖可達成相比，機械穩定性基質(諸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)使流動速率較快且處理時間較短。
親和層析為較佳純化技術。儘管親和配體所連接之基質最常為瓊脂糖，但亦可利用其他基質。與用瓊脂糖可達成相比，機械穩定性基質(諸如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)使流動速率較快且處理時間較短。
在一替代性實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之抗體構築體或根據本發明方法製備之抗體構築體。
一個實施例係關於一種本發明抗體構築體或根據本發明方法製備之抗體構築體，其用於預防、治療或改善選自增生性疾病、腫瘤性疾病、病毒性疾病或免疫病症之疾病。
本文所述之調配物適用作治療、改善及/或預防有需要之患者之如本文所述之病理性醫學病狀的醫藥組合物。術語「治療」係指治療性處理與防護性或預防性措施。治療包括將調配物施用或投與來自患有疾病/病症、具有疾病/病症之症狀或易患疾病/病症之患者之身體、分離組織或細胞，以治癒、治療、減輕、降低、改變、補救、改善、 改良或影響疾病、疾病症狀或疾病之傾向。
如本文所用之術語「改善」係指藉由向有需要之個體投與本發明之抗體構築體達成的對患者之疾病病況的任何改良。此類改良亦可視為使患者疾病之進展減緩或停止。如本文所用之術語「預防」意謂藉由向有需要之個體投與本發明之抗體構築體避免患者發生或再發生罹患本文規定之疾病。
術語「疾病」係指受益於用本文所述之抗體構築體或醫藥組合物處理之任何病狀。其包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所述疾病之彼等病理病狀。
此外，本發明提供一種用於治療或改善增生性疾病、腫瘤性病、病毒性疾病或免疫病症之方法，其包含為有需要之個體投與本發明之抗體構築體或根據本發明方法製備之抗體構築體的步驟。
術語「有需要之個體」或「需要治療之個體」包括已患病症之個體以及預防病症之個體。有需要之個體或「患者」包括接受預防性或治療性處理之人類及其他哺乳動物個體。
本發明之抗體構築體通常經設計而尤其具有一定範圍之生物可用性及持久性以用於特定投藥途徑及方法、特定投藥劑量及頻率、特定疾病之特定治療。組合物之材料較佳以投藥位點可接受之濃度調配。
因此，調配物及組合物可根據本發明設計以用於藉由任何適合投藥路徑傳遞。在本發明之情形下，投藥途徑包括(但不限於)
●局部途徑(諸如經上表皮、吸入、經鼻、經眼、經耳、經陰道、經黏膜)；●腸內途徑(諸如經口、經胃腸、舌下、唇下、經頰、經直腸)；及●非經腸途徑(諸如靜脈內、動脈內、骨內、肌肉內、腦內、腦 室內、硬膜外、鞘內、皮下、腹膜內、羊膜外、關節內、心內、皮內、病灶內、子宮內、膀胱內、玻璃體內、經皮、鼻內、經黏膜、滑膜內、邊緣內)。
本發明之醫藥組合物及抗體構築體尤其適用於非經腸投藥，例如皮下或靜脈內傳遞，例如藉由注射(諸如快速注射)，或藉由輸注(諸如連續輸注)。醫藥組合物可使用醫學器件投與。用於投與醫藥組合物之醫學器件之實例描述於美國專利第4,475,196號；第4,439,196號；第4,447,224號；第4,447,233號；第4,486,194號；第4,487,603號；第4,596,556號；第4,790,824號；第4,941,880號；第5,064,413號；第5,312,335號；第5,312,335號；第5,383,851號；及第5,399,163號中。
詳言之，本發明提供不間斷投與適合組合物。作為非限制性實例，不間斷或實質上不間斷，亦即連續投與，可藉由患者所穿戴之用於計量治療劑向患者身體中之流入的小泵系統實現。包含本發明抗體構築體之醫藥組合物可藉由使用該等泵系統投與。此類泵系統通常為此項技術中已知，且通常依賴於定期更換容納欲輸注治療劑之濾筒。在更換此類泵系統中之濾筒時，可繼而暫時中斷治療劑向患者身體之流動，否則該流動為不間斷的。在此情況下，在本發明之醫藥手段及方法之含義內，濾筒更換前之投藥階段及濾筒更換後之投藥階段仍認為一起構成此類治療劑之一次「不間斷投與」。
連續或不間斷投與本發明之抗體構築體可為靜脈內或皮下投與，其借助於包括用於驅使流體離開儲集器之流體驅動機構及用於致動驅動機構之致動機構的流體傳遞器件或小泵系統。用於皮下投與之泵系統可包括用於穿過患者皮膚且向患者身體傳遞適合組合物之針或導管。該等泵系統可直接獨立於靜脈、動脈或血管固定或連接於患者之皮膚，從而使得泵系統與患者之皮膚之間可直接接觸。泵系統可連 接於患者之皮膚24小時至數天。在小體積儲集器之情況下，泵系統可具有小尺寸。作為一非限制性實例，用於投與適合醫藥組合物之儲集器之體積可為0.1ml至50ml。
連續投藥亦可為借助於皮膚上穿戴之貼片經皮投與且以一定時間間隔更換。熟習此項技術者已知適用於此目的之用於藥物傳遞之貼片系統。值得注意地，經皮投藥尤其適於不間斷投藥，因為更換第一耗盡貼片可藉由例如在緊鄰第一耗盡貼片之皮膚之表面上放置新第二貼片且隨後立即移除第一耗盡貼片而同時有利地實現。不會發生流動中斷或電源電池故障之問題。
若醫藥組合物已凍乾，則經凍乾物質首先在適當液體中復原，隨後投與。經凍乾物質可在例如注射用抑菌水(BWFI)、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)或蛋白質在凍乾之前所處之相同調配物中復原。
本發明之組合物可以適合劑量投與個體，該適合劑量可例如藉由劑量遞增研究藉由投與非黑猩猩靈長類動物(例如短尾猿)增加劑量之展現本文所述之種間交叉特異性之本發明抗體構築體來確定。如上所述，展現本文所述之種間交叉特異性之本發明抗體構築體可有利地以相同形式用於非黑猩猩靈長類動物之臨床前測試及人類之藥物。給藥方案將由主治醫師及臨床因素確定。如醫藥技術中所熟知，對於任一患者之劑量取決於諸多因素，包括患者體型、體表面積、年齡、欲投與之特定化合物、性別、投藥時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。
術語「有效劑量(effective dose/effective dosage)」定義為足以達成或至少部分達成所要作用之量。術語「治療有效劑量」定義為足以治癒或至少部分遏止已患有疾病之患者之疾病及其併發症之量。有效用於此用途之量或劑量取決於欲治療之病狀(適應症)、傳遞之抗體構 築體、治療情形及目標、疾病之嚴重性、先前療法、患者之臨床病史及對治療劑之反應、投藥路徑、患者之體型(體重、身體表面或器官尺寸)及/或狀況(年齡及一般健康)及患者自身免疫系統之一般狀態。適當劑量可根據主治醫師之判斷調節以使得其可投與患者一次或經一系列投藥投與患者，且以獲得最佳治療作用。
典型劑量視上文所提及之因素而定可在約0.1μg/kg至約30mg/kg或更大之範圍內。在特定實施例中，劑量可在1.0μg/kg至約20mg/kg、視情況10μg/kg至約10mg/kg或100μg/kg至約5mg/kg範圍內。
治療性有效量之本發明抗體構築體較佳使疾病症狀之嚴重性降低，無疾病症狀期之頻率或持續時間提高或預防疾病病痛所致之損傷或失能。為治療表現標靶細胞抗原之腫瘤，治療有效量之本發明抗體構築體(例如抗標靶細胞抗原/抗CD3抗體構築體)較佳相對於未治療患者抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。可在預測在人類腫瘤中之功效的動物模型中評估化合物抑制腫瘤生長的能力。
醫藥組合物可作為唯一治療劑投與或與其他療法(諸如視需要抗癌療法，例如其他蛋白質及非蛋白質藥物)組合投與。此等藥物可以適時定義之時間間隔及劑量與包含如本文所定義之本發明抗體構築體之組合物同時投與，或分別在投與該抗體構築體之前或之後投與。
如本文中所用之術語「有效且無毒劑量」係指本發明抗體構築體之可耐受劑量，其足夠高以引起病理性細胞消除、腫瘤去除、腫瘤縮小或疾病穩定而無或基本上無大的毒性作用。此類有效且無毒劑量可例如藉由此項技術中描述之劑量遞增研究確定且應低於誘導嚴重不良副事件(劑量限制性毒性，DLT)之劑量。
如本文中所用之術語「毒性」係指表現在不良事件或嚴重不良 事件中之藥物的毒性作用。此等副事件可指一般缺乏藥物耐受性及/或投藥之後缺乏局部耐受性。毒性亦可包括由藥物引起之致畸或致癌作用。
如本文中所用之術語「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」定義投與藥物而不會在投與後立即誘導嚴重不良事件(局部耐受性)及在藥物之較長期施用期間誘導嚴重不良事件。「安全性」、「活體內安全性」或「耐受性」可在治療及追蹤階段期間例如以規則時間間隔進行評估。量測包括臨床評估，例如器官表現，及實驗室異常之篩檢。臨床評估可進行且偏向根據NCI-CTC及/或MedDRA標準所記錄/編碼之正常研究結果。器官表現可包括諸如過敏/免疫學、血液/骨髓、心律不整、凝血及其類似者之標準，如闡述於例如不良事件之通用術語標準v3.0(Common Terminology Criteria for adverse events v3.0；CTCAE)中。可測試之實驗室參數包括例如血液學、臨床化學、凝血概況及尿液分析及諸如血清、血漿、淋巴或脊髓液、液體及其類似物之其他體液的檢查。因此，安全性可例如藉由身體檢查、成像技術(亦即超音波、x射線、CT掃描、磁共振成像(MRI)、利用技術器件之其他措施(亦即心電圖)、生命徵象藉由量測實驗室參數及記錄不良事件來評定。舉例而言，在本發明之用途及方法中，非黑猩猩靈長類動物中之不良事件可藉由組織病理學及/或組織化學方法檢驗。
以上術語亦例如在1997年7月16日之Preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals S6；ICH Harmonised Tripartite Guideline；ICH Steering Committee meeting中提到。
最後，本發明提供一種套組，其包含本發明抗體構築體或根據本發明方法製備之抗體構築體、本發明之載體及/或本發明之宿主細胞。
在本發明之情形下，術語「套組」意謂一起包裝於盒子、容器 中或以其他方式包裝的兩種或兩種以上組分，其中之一對應於本發明之抗體構築體、醫藥組合物、載體或宿主細胞。因此，套組可描述為足以達成特定目標之產品及/或用具之組，其可作為單個單元出售。
套組可包含一或多個具有任何適當形狀、尺寸及材料(較佳防水，例如塑膠或玻璃)的容器(諸如小瓶、安瓿、容器、盒子、注射器、瓶子、袋)，其含有適用於投藥之劑量(參見上文)的本發明之抗體構築體或醫藥組合物。套組可另外含有使用說明(例如小冊或說明手冊形式)、投與本發明之抗體構築體的構件(諸如注射器、泵、輸注器或其類似物)、復原本發明之抗體構築體的構件及/或稀釋本發明之抗體構築體的構件。
本發明亦提供用於單次劑量投藥單位的套組。本發明之套組亦可含有包含經乾燥/凍乾之抗體構築體的第一容器及包含水性調配物之第二容器。在本發明之某些實施例中，提供含有單室及多室預填充注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)的套組。
圖1 ：
相較於n端具有線性FcRnBP且c端具有環狀FcRnBP之BiTE抗體構築體，陽離子交換管柱純化/分離蛋白質之兩個位點上均具有環狀FcRnBP之BiTE抗體構築體(A圖)的溶離曲線。
圖2 ：
指定細胞株上CDH19/CD3雙特異性抗體之FACS分析：1)經人類CDH19穩定轉染之CHO細胞，2)人類CD3陽性人類T細胞株HBP-ALL，3)經獼猴CDH19穩定轉染之CHO細胞，4)獼猴T細胞株4119LnPx，5)表現天然人類CDH19之人類黑色素瘤細胞株CHL-1，6)未轉染之CHO細胞。陰性對照[1)至6)]：無先前CDH19/CD3雙特異性抗體之偵測抗體。
圖3 ：
在48小時基於FACS之細胞毒性分析中量測的CDH19/CD3雙特異性抗體之細胞毒性活性。效應細胞：表現CD3之獼猴T細胞株4119LnPx。標靶細胞：經獼猴CDH19轉染之CHO細胞。效應子與標靶細胞(E：T)比率：10：1。該圖展示CDH19 2G6 302xI2C HALB、CDH19 2G6 302xI2C 156、CDH19 2G6 302xI2C LFcBY、CDH19 2G6 302xI2C LFcBY 156、CDH19 2G6 302xI2C D3 HALB及陰性對照之結果。
圖4 ：
新生兒Fc受體(FcRn)由人類肺微血管內皮細胞(HPMEC)表現。
藉由凝膠電泳分離HPMEC及Jurkat E6.1細胞之全細胞溶解物。抗FcRn西方墨點法在HPMEC溶解物(泳道1)中約40kDa處展示條帶，在Jurkat E6.1溶解物(泳道2)中其不太明顯。作為對照，抗肌動蛋白西方墨點法在HPMEC與Jurkat E6.1全細胞溶解物(泳道1及2)中約42kDa處均展示條帶，從而證實等量蛋白質產生墨點。
圖5 ：
活體外兩室系統之示意圖。
將人類肺微血管內皮細胞(HPMEC)塗佈於傳斯維爾插入膜(transwell insert membrane)上且生長直至匯合為止。實驗之前，藉由跨內皮電阻(TEER)量測確定內皮細胞單層之完整性。在t=0小時時，在傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上提供分析物(BiTE抗體構築體或聚葡萄糖)。隨後兩室系統在37℃下培育4小時。將穿過內皮細胞單層進入下部腔室之分析物之量定量。實驗後，將內皮細胞單層染色且用顯微鏡檢驗其完整性。
圖6 ：
匯合之內皮細胞單層展現增加之跨內皮電阻(TEER)且提供針對 葡聚糖之有效障壁。
一式三份塗佈用單獨的分析培養基(空白)或HPMEC填充之傳斯維爾插入件(n=3)。A .細胞生長24-30小時後，空白及HPMEC單層之耐受性(平均值±SD)分別為199±2Ω及249±5Ω，得到16.67±2.08Ω*cm2 之HPMEC TEER值(平均值±SD)。B .細胞生長48小時後，向傳斯維爾插入件中提供FITC-聚葡萄糖40(2mg/ml，於含有597μM HSA之分析培養基中)。在37℃下培育4小時後，穿過單獨之膜(空白)或HPMEC單層進入下部腔室的FITC-聚葡萄糖40之平均螢光強度(FI)±SD分別為4256±361及93±15。C .實驗後，將HPMEC單層染色且用顯微鏡(10倍放大倍數)檢驗匯合程度(下部泳道)。使用不成對t -檢驗藉由GraphPad Prism 6軟體分析資料之統計顯著性(****：P 0.0001)。
圖7 ：
半衰期延長之BiTE抗體構築體CDH19-LfcBY在生理HSA濃度下跨越HPMEC單層有效穿胞運輸。
對於各測試之條件，將HPMEC一式三份塗佈於傳斯維爾插入膜上(n=3)。細胞生長24-30小時後，HPMEC TEER值介於12與17Ω*cm2 之間(資料未示)。細胞生長48小時後，於傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上提供100μl各別半衰期延長之BiTE抗體構築體(1nM，於含有597μM HSA之分析培養基中)，同時用HSA填充600μl分析培養基，但下部腔室中無BiTE抗體構築體。在37℃下培育4小時後，穿過內皮細胞單層之BiTE抗體構築體之量藉由基於電化學發光(ECL)之配體結合分析定量。所回收BiTE抗體CDH19-156(CDH19 2G6 302 x I2C-156-H6)、CDH19-HALB(CDH19 2G6 302 x I2C-HALB-DY-H6)及CDH19-LfcBY(CDH19 2G6 302 x I2C-LfcBY-H6)之平均濃度±SD分別為0.424±0.051pM、0.248±0.026pM及0.781±0.069pM。實驗後， 將HPMEC單層染色且用顯微鏡(10倍放大倍數)檢驗匯合程度(資料未示)。藉由使用單因子ANOVA與圖基事後檢驗(Tukey post-test)之組合藉由Microsoft Excel 2010及GraphPad Prism 6軟體分析資料之統計顯著性(****：P 0.0001；***：P 0.001；*：P 0.05)。
圖8 ：
半衰期延長之BiTE抗體構築體CDH19-LfcBY在2%人類血清存在下跨越HPMEC單層有效穿胞運輸。
對於各測試之條件，將HPMEC一式三份塗佈於傳斯維爾插入膜上(n=3)。細胞生長24-30小時後，HPMEC TEER值介於19與31Ω*cm2 之間(資料未示)。細胞生長48小時後，於傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上提供100μl各別半衰期延長之BiTE抗體構築體(1nM，於含有2%彙集之人類血清之分析培養基中)，同時用2%彙集之人類血清填充600μl分析培養基，但下部腔室中無BiTE抗體構築體。在37℃下培育4小時後，穿過內皮細胞單層之BiTE抗體構築體之量藉由基於電化學發光(ECL)之配體結合分析定量。所回收BiTE抗體CDH19-156(CDH19 2G6 302 x I2C-156-H6)、CDH19-HALB(CDH19 2G6 302 x I2C-HALB-DY-H6)及CDH19-LfcBY(CDH19 2G6 302 x I2C-LfcBY-H6)之平均濃度±SD分別為0.849±0.130pM、0.658±0.047pM及1.751±0.212pM。實驗後，將HPMEC單層染色且用顯微鏡(10倍放大倍數)檢驗匯合程度(資料未示)。藉由使用單因子ANOVA與圖基事後檢驗之組合藉由Microsoft Excel 2010及GraphPad Prism 6軟體分析資料之統計顯著性(***：P 0.001；ns：P >0.05)。
圖9 ：
半衰期延長之BiTE抗體構築體CDH19-LfcBY在20%人類血清存在下跨越HPMEC單層有效穿胞運輸。
對於各測試之條件，將HPMEC一式三份塗佈於傳斯維爾插入膜 上(n=3)。細胞生長24-30小時後，HPMEC TEER值介於19與31Ω*cm2 之間(資料未示)。細胞生長48小時後，於傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上提供100μl各別半衰期延長之BiTE抗體構築體(1nM，於含有20%彙集之人類血清之分析培養基中)，同時用20%彙集之人類血清填充600μl分析培養基，但下部腔室中無BiTE抗體構築體。在37℃下培育4小時後，穿過內皮細胞單層之BiTE抗體構築體之量藉由基於電化學發光(ECL)之配體結合分析定量。所回收BiTE抗體CDH19-156(CDH19 2G6 302 x I2C-156-H6)、CDH19-HALB(CDH19 2G6 302 x I2C-HALB-DY-H6)及CDH19-LfcBY(CDH19 2G6 302 x I2C-LfcBY-H6)之平均濃度±SD分別為0.758±0.027pM、0.761±0.027pM及1.976±0.355pM。實驗後，將HPMEC單層染色且用顯微鏡(10倍放大倍數)檢驗匯合程度(資料未示)。藉由使用單因子ANOVA與圖基事後檢驗(Tukey post-test)之組合藉由Microsoft Excel 2010及GraphPad Prism 6軟體分析資料之統計顯著性(***：P 0.001；ns：P >0.05)。
圖10 ：
BiTE抗體構築體之藥物動力學
在藥物動力學(PK)研究之情形下在食蟹獼猴中測試四個分子，其名為：1)2G6-156；2)2G6-LFcBy；3)2G6-LFcBy-156；4)2G6-D3HSA。該圖展示與實例5有關之結果。
圖11 ：
半衰期延長之BiTE-LfcBY之有效穿胞運輸與標靶無關
A )將HPMEC塗佈於傳斯維爾插入膜上。細胞生長24小時後，HPMEC TEER值介於13至23Ω*cm2 之間。細胞生長48小時後，將100μl各別半衰期延長之BiTE抗體構築體(1nM，於含有20%彙集之人類血清的分析培養基中)塗佈於傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上(n=4至n=10)。將具有20%彙集之人類血清且無BiTE抗體構築體之600 μl分析培養基置於下部腔室中。在37℃下培育4小時後，穿過內皮細胞單層之BiTE抗體構築體之量藉由基於電化學發光(ECL)之配體結合分析定量。將含有-LfcBY標籤之BiTE抗體構築體標準化為其各別BiTE-156對應物且條形圖呈現所回收BiTE-LfcBY抗體之倍數變化±SD。CD33-LfcBY之穿胞運輸比CD33-156有效2.9±0.7倍。CHD19-LfcBY之穿胞運輸比CDH19-156有效3.1±0.4倍。鈣黏素-LfcBY BiTE構築體之穿胞運輸比鈣黏素-156 BiTE有效2.4±0.5倍。藉由不成對t-檢驗藉由Microsoft Excel 2010及GraphPad Prism 6軟體分析資料之統計顯著性(****：P0.0001)。B )條形圖呈現標準化為BiTE-156對應物的BiTE-LfcBY在三個獨立標靶上穿胞運輸的平均值。BiTE-LfcBY構築體之穿胞運輸比BiTE-156構築體有效2.8±0.3倍(***：P0.001)。
圖12 ：
不同的半衰期延長之BiTE-LfcBY置換物有效穿胞運輸
將HPMEC塗佈於傳斯維爾插入膜上。細胞生長24小時後，HPMEC TEER值介於13至23Ω*cm2 之間。細胞生長48小時後，將100μl各別半衰期延長之BiTE抗體構築體(1nM，於含有20%彙集之人類血清之分析培養基中)塗佈於傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上(n=4至n=10)。將600μl具有20%彙集之人類血清且無BiTE抗體構築體的分析培養基置放於下部腔室中。在37℃下培育4小時後，穿過內皮細胞單層之BiTE抗體構築體之量藉由基於電化學發光(ECL)之配體結合分析定量。將含有-LfcBY置換之BiTE抗體構築體標準化其各別BiTE-156對應物且條形圖呈現所回收BiTE-LfcBY置換抗體之倍數變化±SD。相較於CH19-156，CH19-LH-FcB-CH之穿胞運輸有效1.8±0.4倍，CH19-LH-FcB-LH 2.0±0.1倍，CH19-CH-FcB-LH 2.8±0.4倍，CH19-LY-FcB-LH 2.9±0.6倍，CH19-CH-FcB-LY 2.6±0.4倍，且CH19-LY-FcB-CH 3.1±0.4倍。使用ANOVA ONE-WAY及鄧奈特氏多重比較 檢驗(Dunnett's multiple comparisons test)藉由Microsoft Excel 2010及GraphPad Prism 6軟體分析資料(****：P0.0001；***：P0.001；**：P0.01)。
圖13 ：
不同的半衰期延長之BiTE-LfcBY置換物有效穿胞運輸
將HPMEC塗佈於傳斯維爾插入膜上。細胞生長24小時後，HPMEC TEER值介於13至23Ω*cm2 之間。細胞生長48小時後，將100μl各別半衰期延長之BiTE抗體BiTE抗體構築體(1nM，於含有20%彙集之人類血清之分析培養基中)塗佈於傳斯維爾插入件內之內皮細胞單層上(n=4至n=10)。將600μl具有20%彙集之人類血清且無BiTE抗體BiTE抗體構築體的分析培養基置放於下部腔室中。在37℃下培育4小時後，穿過內皮細胞單層之BiTE抗體BiTE抗體構築體之量藉由基於電化學發光(ECL)之配體結合分析定量。將含有-LfcBY置換之BiTE抗體構築體標準化其各別BiTE-156對應物且條形圖呈現所回收BiTE-LfcBY置換抗體之倍數變化±SD。相較於Cad-156，Cad-LH-FcB-CH之穿胞運輸有效3.1±0.4倍，Cad-LH-FcB-LH 3.2±1倍，Cad-CH-FcB-LH 2.9±0.4倍，Cad-LY-FcB-LH 1.8±0.1倍，Cad-CH-FcB-LY 2.4±0.2倍，且Cad-LY-FcB-CH 2.4±0.5倍。使用ANOVA ONE-WAY及鄧奈特氏多重比較檢驗藉由Microsoft Excel 2010及GraphPad Prism 6軟體分析資料(****：P0.0001；*：P0.05)。
應瞭解，本發明不限於特定方法、方案或試劑，因此可變化。本文所提供之論述及實例僅出於描述特定實施例之目的呈現且並不欲限制本發明之範疇，本發明範疇僅由申請專利範圍限定。
本說明書之文本中所引用之所有出版物及專利(包括所有專利、專利申請案、科學出版物、製造商之說明書、說明等)，無論前述或下述，特此以全文引用之方式併入。不應認為本文中承認本發明無權 先於先前發明之此類揭示內容。以引用的方式併入之材料達到與本說明書矛盾或不一致之程度時，本說明書將替代任何此類材料。
提供以下實例以說明本發明之特定實施例或特徵。此等實例不應理解為限制本發明之範疇。包括實例以用於說明，且本發明僅受申請專利範圍限制。
實例1 ：
1雙特異性單鏈抗體構築體之製備及純化
在滾瓶中執行CDH19BiTE抗體構築體之標準化研究規模製備。使所收集之培養物上清液在過濾後經受基於固定金屬親和層析(IMAC)捕捉及隨後尺寸排阻層析(SEC)的兩步BiTE抗體構築體純化。
1.1 BiTE抗體構築體之IMAC捕捉步驟
將由Unicorn®軟體控制之Äkta®Explorer系統(GE Healthcare)用於層析。使用負載有ZnCl2 之Fractogel EMDchelate®(Merck,Darmstadt)根據由製造商提供之方案執行固定金屬親和層析(IMAC)。用以4ml/min之流速施加於管柱(10ml填充體積)的緩衝液A(20mM磷酸鈉緩衝液、0.1M NaCl、10mM咪唑，pH 7.2)及細胞培養物上清液(1000ml)平衡管柱。用緩衝液A洗滌管柱以移除未結合之樣品。使用緩衝液B(20mM磷酸鈉緩衝液、0.1M NaCl、0.5M咪唑，pH 7.2)之二步梯度根據以下程序溶離結合之蛋白質：
步驟1：5個管柱體積之10%緩衝液B
步驟2：5個管柱體積之100%緩衝液B。
將步驟2之經溶離蛋白質溶離份彙集以使用具有聚醚碸PES膜且分子量截止為10kDa之Vivaspin(Sartorius-Stedim,Göttingen-Germany)離心單元進一步純化且濃縮至3ml最終體積。所有化學品均 為研究級且購自Merck(Darmstadt,Germany)。
1.2尺寸排阻層析SEC
在用流速為1ml/min之緩衝液(20mM NaCl、30mM NaH2 PO4 、100mM L-精胺酸，pH 7.0)平衡的HiLoad 16/60 Superdex 200製備級管柱(GE Healthcare)上執行尺寸排阻層析。彙集BiTE抗體構築體單體及二聚體溶離份且添加24%海藻糖儲備溶液以達到4%之最終海藻糖濃度。
在280nm下於具有1cm光路之聚碳酸酯比色管(Eppendorf,Hamburg-Germany)中量測蛋白質彙集物且基於載體NTI序列分析軟體計算之各蛋白質之因素來計算蛋白質濃度。
用另一BiTE調配緩衝液(20mM NaCl，30mM NaH2 PO4 ，100mM L-精胺酸，4%海藻糖，pH 7.0)將BiTE單體彙集物調節至250μg/ml。
1.3由研究規模製備比較FcRn BiTE單體產量
如由表1顯而易見，相較於BiTE蛋白質之n端具有線性FcRnBP且c端具有環狀FcRnBP的BiTE(SEQ ID NO：132)，BiTE抗體構築體之兩側具有環狀FcRn結合肽FcRnBP之BiTE(n及c端，參見SEQ ID NO：145)的BiTE單體產量展示生產率低於1/3。
相較於n端具有線性FcRnBP且c端具有環狀FcRnBP之BiTE型式，兩側具有環狀FcRnBP之BiTE型式的BiTE單體產量低得多。
1.4自陽離子交換管柱回收FcRn BiTE單體
將1ml由YMC(YMC Europe GmbH,Dinslaken-Germany)製造之 磺丙基偶合於固體珠粒的BioPro SP管柱連接於Äkta Micro FPLC(GE Healthcare)器件。
為進行管柱平衡、樣品稀釋及洗滌，使用以氫氧化鈉調節至pH 5.5的由20mM磷酸二氫鈉及30mM氯化鈉組成之緩衝液。
為進行溶離，使用以氫氧化鈉調節至pH 5.5的由20mM NaH2 PO4 及1000mM NaCl組成之緩衝液。
用稀釋緩衝液將50μg BiTE抗體構築體單體稀釋至50ml最終體積。
管柱平衡後，將40ml經稀釋蛋白溶液施加於管柱，繼而使用管柱平衡緩衝液進行洗滌步驟。
藉由不斷增加之梯度執行溶離，其中溶離緩衝液為零至100%，總體積對應於200個管柱體積。整個操作在280nm光學吸收下監測。
相較於BiTE蛋白質之兩側具有環狀FcRnBP之BiTE抗體構築體，n端具有線性FcRnBP且c端具有環狀FcRnBP之BiTE抗體構築體展示自陽離子交換管柱溶離。如圖1，此現象表明，BiTE抗體構築體之按比例擴大製備中純化性能及產物產量優良得多。
實例2 ：
雙特異性結合及種間交叉反應性 ：
為確認結合於人類及獼猴CDH19及人類及獼猴CD3，藉由流式細胞術使用指定細胞株測試雙特異性抗體。將經人類CDH19、獼猴CDH19轉染之CHO細胞、表現天然人類CDH19之人類黑色素瘤細胞株CHL-1、表現CD3之人類T細胞白血病細胞株HPB-ALL(DSMZ,Braunschweig,ACC483)及表現CD3之獼猴T細胞株4119LnPx(Knappe A等人，Blood,2000,95,3256-3261)用作抗原陽性細胞株。此外，使用未轉染之CHO細胞作為陰性對照。
為進行流式細胞術，將各別細胞株之200,000個細胞與50μl濃度 為5μg/ml之經純化雙特異性抗體一起在冰上培育30分鐘。用PBS/10% FCS洗滌細胞兩次且用鼠類抗His抗體(AbD Serotec；用50μl PBS/10% FCS 1：1000稀釋)偵測構築體之結合。洗滌後，用結合於藻紅素之Fcγ特異性抗體(Dianova)(用PBS/10% FCS 1：100稀釋)偵測結合之抗His抗體。藉由流式細胞術在FACSCanto II儀器上量測樣品且藉由FACSDiva軟體(均來自Becton Dickinson)分析。
將經人類CDH19、獼猴CDH19轉染之CHO細胞、表現人類CDH19之黑色素瘤細胞株CHL-1以及人類及獼猴T細胞用CDH19/CD3雙特異性抗體染色。此外，未轉染之CHO細胞未染色(參見圖2)。
實例3 ：
細胞毒性活性
標靶細胞標記
為於流式細胞術分析中分析細胞溶解，使用螢光膜染料DiOC18 (DiO)(Molecular Probes,#V22886)標記作為標靶細胞之獼猴CDH19陽性CHO細胞且將其與效應細胞區分。簡言之，收集細胞，用PBS洗滌一次且於含有2%(v/v)FBS及膜染料DiO(5微升/106 個細胞)之PBS中調節至106 個細胞/毫升。在37℃下培育3分鐘後，用完全RPMI培養基洗滌細胞兩次且將細胞數調節至1.25×105 個細胞/毫升。使用0.5%(v/v)等張EosinG溶液(Roth,#45380)測定細胞活力。
基於流式細胞術之分析
此分析經設計以定量在CDH19雙特異性抗體之連續稀釋液存在下經獼猴CDH19轉染之CHO細胞的溶解。
混合等體積之經DiO標記之標靶細胞及效應細胞(亦即表現CD3之獼猴T細胞株4119LnPx)，得到10：1之E：T細胞比率。將160μL此懸浮液轉移至96孔盤之各孔。添加40μL CDH19雙特異性抗體之連續稀釋液及雙特異性陰性對照(識別不相關標靶抗原之基於CD3之雙特異性 抗體)或作為另一陰性對照之RPMI完全培養基。雙特異性抗體介導之細胞毒性反應在7% CO2 含濕氣培育箱中進行48小時。隨後將細胞轉移至新96孔盤，且藉由添加最終濃度為1μg/mL之碘化丙錠(PI)監測標靶細胞膜完整性之損失。PI為膜不可滲透性染料，其通常為活細胞所排斥，而死細胞將其吸收且變得可由螢光發射鑑別。
藉由流式細胞術在FACSCanto II儀器上量測樣品且藉由FACSDiva軟體(均來自Becton Dickinson)分析。
標靶細胞鑑別為DiO陽性細胞。將PI陰性標靶細胞分類為活標靶細胞。根據下式計算細胞毒性之百分比： n=事件數。
使用GraphPad Prism 6軟體(Graph Pad Software,San Diego)，相對於相應雙特異性抗體濃度繪製細胞毒性百分比之圖。用四參數邏輯回歸模型分析劑量反應曲線以評估具有固定之希爾斜率(hill slope)之S型劑量反應曲線且計算EC50 值。
使用上述系統獲得之CDH19 2G6 302xI2C HALB、CDH19 2G6 302xI2C 156、CDH19 2G6 302xI2C LFcBY、CDH19 2G6 302xI2C LFcBY 156、CDH19 2G6 302xI2C D3 HALB及陰性對照的細胞毒性結果展示於圖3中。
實例4 ：
模擬半衰期延長之BiTE抗體穿過人類內皮細胞層之穿胞運輸的活體外兩腔室系統
內皮細胞之培養及收集
使用人類肺微血管內皮細胞(HPMEC)(PromoCell,#C-12281)作為內皮細胞模型。在37℃及5% CO2 下於Heraeus Cytoperm 2(Thermo Scientific)中在細胞培養燒瓶(Sarstedt,#831.810.302)中之補充有內皮細胞生長補充劑(ECGS，1：100)(ScienCell,#1052)、5-7.5%彙集之人類血清(AMGEN，內部批號：140625DrM01)及5-10mg/ml人類白蛋白(HSA)(Behring,#C66444411B)之MV2基礎培養基(PromoCell,#C-22221)(另外稱為生長培養基)中培養冷凍保存之第2代HPMEC(>5×105 個細胞/小瓶)。用剝落套組(PromoCell,#C-41200)執行HPMEC之次培養，該剝落套組由HEPES緩衝平衡鹽溶液(PromoCell,#C-40000)、胰蛋白酶-EDTA溶液(0.04%/0.03%)(PromoCell,#C-41000)及胰蛋白酶中和溶液(TNS)(PromoCell,#C-41100)組成。簡言之，自HPMEC層抽吸培養基且用3ml HEPES緩衝之平衡鹽溶液洗滌細胞。在室溫下添加3ml用PBS 1：1稀釋之胰蛋白酶-EDTA溶液歷時1-3分鐘，使得HPMEC自燒瓶底部剝落。藉由向細胞懸浮液添加3ml TNS執行胰蛋白酶-EDTA溶液之不活化。將細胞於Heraeus Megafuge 40(Thermo Scientific)中以300g離心3分鐘，且以約10,000個細胞/平方公分之細胞密度接種於細胞培養燒瓶(Sarstedt,#831.810.302,#833.911.302)中。
藉由西方墨點法偵測HPMEC中之新生兒Fc受體(FcRn)
用EDTA(Biochrom,#L2113)剝落HPMEC(PromoCell,#C-12282，批號：1071302.1,P7)且用PBS(Biochrom,#L1820)洗滌。收集Jurkat細胞E6.1(ECCC,#88042803)且用PBS洗滌。使3×106 個細胞在冰上各溶解於100μl溶解緩衝液(20mM Trizma鹼(Sigma Aldrich,#T1503)pH=8、137mM NaCl(Sigma-Aldrich,#S6546-1L)、10%甘油(Sigma-Aldrich,#G5516)、2mM EDTA(Sigma-Aldrich,#03620)、1% Triton X100(Sigma-Aldrich,#X100)、1×蛋白酶抑制劑混合物(Sigma-Aldrich,#13911-1BO)、100mM NaF(Sigma-Aldrich,#919)、500μM Na3 VO4 (Sigma-Aldrich,#S6508))中歷時15分鐘。藉由在4℃下在 13,200g下離心15分鐘(Sigma Laborzentrifugen,#1K15)粒化全細胞溶解物之不可溶部分，且將上清液轉移於新鮮1.5ml Eppendorf反應管中。用2μl NuPAGE LDS樣品緩衝液(life technologies,#NP0007)稀釋7.5μl溶解物且在70℃下變性10分鐘。將9.5μl溶解物及10μl預染色蛋白質標準物(life technologies,#LC5800)裝載於4-12% BisTris Gel(life technologies,#NP0336BOX)上，且於1×NuPAGE MES操作緩衝液(life technologies,#NP0002-02)中藉由施加200V 35分鐘執行蛋白質分離。根據XCell II墨點模組說明(life technologies)將蛋白質轉移於硝化纖維膜(PALL BioTrace NT,#66485)上。在室溫下在攪拌下使用阻斷溶液(Thermo Scientific,#37542)阻斷膜1小時。在4℃下在攪拌下於抗FcRn抗體溶液(Novus Biologicals,#NBP1-89128，用阻斷緩衝液1：100稀釋，補充有0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich,#P1379))中培育膜隔夜。在室溫下用PBS-Tween(Biochrom,#L1820以及0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich,#P1379))洗滌膜3次歷時5分鐘。在室溫下在攪拌下於經HRP標記之二次抗體溶液(抗兔IgG HRP抗體(Thermo Scientific,#31460)，用PBS-Tween及3-5%奶(Fluka,#70166)1：5000稀釋)中培育膜1小時。在室溫下用PBS-Tween洗滌膜2次歷時5分鐘且用PBS洗滌1次歷時5分鐘。根據製造商之說明於SuperSignalWest Pico受質(Thermo Scientific,#1856135)中培育膜。使光敏感性膜(CL-XPosureTM Film,Thermo Scientific,#34088)暴露於膜且在顯影劑(VELPEX,EXTRA-X)中顯影。隨後，在4℃下於抗β肌動蛋白抗體(Thermo Scientific，#MA1-91399，用阻斷緩衝液1：1000稀釋，補充有0.05% Tween-20(Sigma-Aldrich,#P1379))中培育膜隔夜。在室溫下用PBS-Tween洗滌膜3次歷時5分鐘。在室溫下在攪拌下於經HRP標記之二次抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch,#415-035-100，用PBS-Tween及3-5%奶1：5000稀釋)中培育膜1小時。如上文詳細描述使膜顯 影。
活體外兩室系統
塗佈HPMEC
在室溫下用含10μg/cm2 纖維結合蛋白(Sigma,#F2006)之PBS塗佈聚酯(PET)膜傳斯維爾透明插入件(Corning,#3470)6小時，該等插入件之孔徑為0.4μm且有效生長表面積為0.33cm2 。抽吸剩餘纖維結合蛋白溶液且用PBS洗滌插入件一次。將600μl生長培養基添加至24孔傳斯維爾系統(Corning,#3470)之外部腔室中，且在37℃下平衡培養盤30分鐘。如上所述使用剝落套組(PromoCell,#C-41200)收集HPMEC。將細胞以8×104 /cm2 之密度塗佈於塗有纖維結合蛋白之經平衡傳斯維爾插入件上的200μl預升溫之生長培養基中。僅用生長培養基填充4個孔且用作空白值。24小時後，將100μl生長培養基添加至傳斯維爾系統之內部孔與外部腔室中。藉由跨內皮電阻(TEER)量測確定細胞層匯合。
內皮細胞單層之跨內皮電阻(TEER)量測
使用具有STX03可調節電極(Millipore,#MERSSTX03)之Millicell ERS-2系統(Millipore,#MERS00002)根據製造商之說明量測各內皮細胞單層之電阻。簡言之，藉由將STX04測試電極連接於輸入端口且接通電源來測試Millicell ERS-2之功能；MODE開關設定為Ohm，且必要時顯示器調節為1000Ω，且螺絲刀為「R Adj」螺絲。STX03可調節電極藉由將電極浸沒於80%乙醇中5分鐘滅菌。為進行電阻量測，將STX03電極經由輸入端口連接於ERS-2，MODE開關設定為Ohm且電源開關打開。將電極端部以90度角度浸沒於傳斯維爾插入件中；較短之端部在傳斯維爾插入件內，不接觸內皮細胞單層；較長之端部在傳斯維爾插入件外部，且恰好接觸外部孔(Corning,#3470)之底部。量測無細胞但含有相同培養基之空白傳斯維爾插入件以確定背景電阻。 在電阻量測前，使培養盤冷卻至室溫；在所有孔量測一次時，再次由起點開始量測且將值平均((Ω量測1 +Ω量測2 )/2=Ω樣品 .)。隨後藉由減去空白傳斯維爾插入件之平均電阻計算個別細胞單層之實際電阻(電阻Ω=Ω樣品 -Ω空白 )。為測定單位面積電阻(TEER)，考慮24孔傳斯維爾系統(Corning,#3470)之有效膜面積(0.33cm2 )(TEER=電阻Ω *有效膜面積)。認為特徵為大於10Ω*cm2 之TEER值的HPMEC細胞單層已匯合。
內皮細胞單層之FITC-聚葡萄糖滲透性
細胞生長48小時後，將含有匯合HPMEC單層之傳斯維爾插入件轉移於24孔洗滌盤(FALCON,#353047)中，其中各孔預裝載有700μl經預升溫之MV基礎培養基(PromoCell,#C-22220)以洗滌傳斯維爾插入件之外部。將600μl分析培養基(MV2無酚紅培養基(PromoCell,#C-22226)、ECGS(1：100)(ScienCell,#1052)及597μM HSA(Behring,#C66444411B))填充至阻斷液(在37℃下隔夜的700微升/孔起始阻斷(TBS)緩衝液(Thermo Scientific,#37542)於PBS/10% FBS中的1：1稀釋液)接納盤(具有超低連接表面之24孔培養盤(Corning,#3473))中。將含有匯合HPMEC單層之傳斯維爾插入件自洗滌盤轉移於經預升溫之接納盤中。同時，自內部孔移除生長培養基且用100μl FITC-聚葡萄糖40(2mg/ml，於分析培養基中)(Sigma,#FD40)洗滌細胞單層一次。隨後，將100μl FITC-聚葡萄糖40(2mg/ml，於分析培養基中)置放於HPMEC單層上，且在37℃及5% CO2 下培育兩室分析物4小時。藉由在激發波長485nm及發射波長535nm下使用SPECTRAFluor Plus(序列號：94493；韌體：V 6.00 06_07_2003譜；XFLUOR4版本：V 4.40)量測定量自兩室系統之外部孔回收的FITC-聚葡萄糖40螢光。為進行兩室分析，將所有培養盤在加熱盤(minitube,#12055/0010)上在37℃下處理。
內皮細胞單層之染色
兩室分析後，用無FITC-聚葡萄糖40之分析培養基洗滌細胞單層一次。隨後，將100μl分析培養基置放於細胞單層上且添加100μl多聚甲醛(PFA)(4%，於PBS中)。將細胞單層在37℃下固定1小時或在室溫下隔夜，最終PFA濃度為2%。移除PFA溶液且在室溫下用100μl細胞染色溶液(結晶紫溶液(Sigma-Aldrich,#HT90132-1L)，用4% PFA之PBS溶液1：20稀釋)將細胞單層染色10分鐘。隨後，用200μl ddH2 O洗滌細胞單層兩次。使用具有10×物鏡之Nikon Eclipse E800顯微鏡拍攝HPMEC單層之圖片。
半衰期延長之BiTE抗體穿過內皮細胞單層之穿胞運輸
如上文對於FITC-聚葡萄糖40滲透性詳細描述用各種半衰期延長之BiTE抗體執行兩室分析。如所示，分析培養基由MV2無酚紅培養基(PromoCell,#C-22226)、ECGS(1：100)(ScienCell,#1052)及HSA(Behring,#C66444411B)或彙集之人類血清(在56℃下不活化30分鐘，AMGEN)組成。上述分析培養基中BiTE抗體之稀釋於蛋白質低結合管(Sarstedt,#72.706.600)中執行。將相同分析培養基用於BiTE稀釋(亦即於上部傳斯維爾插入件中)及兩室系統之下部腔室中。將培養盤在37℃下於加熱盤(minitube,#12055/0010)上處理。在45分鐘時間變化中分析不同的半衰期延長之BiTE抗體以使對於盤表面之時間依賴性非特異性黏著達最小。如下文詳細描述定量自兩室系統之較低孔回收的BiTE抗體。
半衰期延長之BiTE抗體之定量
使用基於電化學發光(ECL)之高敏感性配體結合分析進行來自穿胞運輸實驗之BiTE抗體的定量。
藉由於各別測試基質(分析培養基)中注射已知濃度之不同BiTE抗體，繼而10個稀釋步驟(1：2稀釋，得到總共11個校正樣品，其跨越 0.0048至5.0ng/ml之濃度範圍)來製備建立標準參考曲線之校正樣品。將校正樣品之調配物與未知樣品之各別調配物匹配。對於各BiTE抗體構築體，將相同材料(構築體及批料)用於製備校正樣品與穿胞運輸分析。在定量前，將未知樣品之各別測試基質調節至等量HSA(597μM(Behring,#C66444411B))/Tween-80(0.05%(J.T.Baker,#4117-04))或彙集之人類血清(20%在56℃下不活化30分鐘，AMGEN)。
在第一步驟中，將捕捉抗體3E5A5(特異於BiTE抗體之抗CD3結合部分，AMGEN)固定於具有兩個電極之碳微量滴定盤(標準盤，MSD，#L15XA)上。為此目的，在5±3℃下用25微升/孔的1μg/ml抗體溶液塗佈培養盤隔夜，隨後用150微升/孔的5% BSA溶液阻斷至少1小時。
如上所述製備樣品。將25μl各校正樣品或未知樣品添加至個別孔中且在25±2℃下於震盪器上培育1小時。隨後用PBS-Tween(0.05% Tween-80)使用自動盤洗滌器洗滌培養盤3次。依序經由經生物素標記之抗Penta-His抗體(Qiagen，#34440；1μg/ml，25微升/孔，在25±2℃下在震盪器上30分鐘)及抗生蛋白鏈菌素-SulfoTag(MSD，#R32AD-1；1μg/ml，25微升/孔，在25±2℃下在震盪器上30分鐘)偵測結合於捕捉抗體之BiTE抗體構築體，其中在培育之間不進行洗滌。在第二培育後，用PBS-Tween(0.05% Tween-80)使用自動盤洗滌器洗滌培養盤3次。隨後，添加150微升/孔1×MSD讀取緩衝液(MSD,#R92TC-1)且使用Sektor成像儀2400器件(MSD)量測培養盤。
相對於已知BiTE抗體構築體濃度繪製標準參考曲線校正樣品之ECL信號的圖，且藉由5-PL擬合法(權重1/y2；軟體：SoftMaxPro GxP 5.4)擬合。未知樣品濃度由此回歸曲線反算。用所報導之各別方式重複三次分析所有未知樣品。由此等結果計算莫耳濃度。
兩室分析後，如上文詳細描述將內皮細胞單層染色且藉由光顯 微法檢驗其完整性。
如上所述執行CDH19-及CD33-BiTE抗體構築體之偵測。如下執行鈣黏素-BiTE之偵測。在第一步驟中，將BiTE標靶抗原(AMGEN)之重組可溶形式固定於具有兩個電極之碳微量滴定盤(標準盤，MSD，#L15XA)上。為此目的，在5±3℃下用25微升/孔的1μg/ml抗體溶液塗佈培養盤隔夜，隨後用150微升/孔的5% BSA溶液阻斷至少1小時。
如上文所述製備樣品。將25μl各校正樣品或未知樣品添加至個別孔中且在25±2℃下於震盪器上培育1小時。隨後用PBS-Tween(0.05% Tween-80)使用自動盤洗滌器洗滌培養盤3次。經由特異於BiTE抗體之抗CD3結合部分的與SulfoTag結合之抗體(3E5.E1-Rut,AMGEN)偵測結合於標靶抗原之BiTE抗體構築體。將抗體稀釋至1μg/mL之最終濃度。每孔添加25μL且在25±2℃下於震盪器上培育30分鐘。
實例5
BiTE抗體構築體之藥物動力學
在藥物動力學(PK)研究之情形下在食蟹獼猴中測試四個分子，其名為：1)2G6-156；2)2G6-LFcBy；3)2G6-LFcBy-156；4)2G6-D3HSA。在此PK研究中，以單次靜脈內快速注射方式投與6μg/kg劑量。對於各上述化合物，使用具有2個動物之組。收集血液樣品且製備血清以測定兩個動物中各藥物之血清濃度。使用免疫分析量測血清藥物含量。使用血清濃度-時間資料測定PK參數。在以下時間點收集血液樣品：給藥前、給藥後0.05、0.25、0.5、1、4、8、24、48、72、168、240及336小時。使用標準非間隔分析(NCA)法確定PK參數。
對於所有測試藥物，可定量藥物投與後所有動物中絕大部分時間點之血清含量。PK曲線展示所有測試藥物均雙相指數遞減。使用 NCA方法，估計以下參數：AUCinf (血清濃度-時間曲線下面積)、Vss (穩定狀態下之分布體積)、CL(全身性清除率)、MRT(平均滯留時間)及終末t1/2 (自末期估計之半衰期)。各測試化合物之PK參數(n=2之平均值)如下概括：
對於化合物1、2、3及4，AUCinf 分別為568hr*ng/mL、366hr*ng/mL、1796hr*ng/mL及1383hr*ng/mL。對於化合物1、2、3及4，Vss 分別為446mL/kg、594mL/kg、193mL/kg及80.7mL/kg。對於化合物1、2、3及4，全身性清除率分別為11.3mL/hr/kg、16.1mL/hr/kg、4.3mL/hr/kg及4.9mL/hr/kg。化合物1、2、3及4之MRT值分別為42.3小時、39.8小時、48.7小時及18.1小時，且對於化合物1、2、3及4，終末半衰期分別為44.3小時、31.2小時、40.3小時及13.5小時。
化合物1、2及3各自之終末半衰期及MRT比化合物4高得多(>2倍)。化合物1、2及3代表BiTE抗體構築體型式較長半衰期型式。
結果參見圖10。
<110> 美商安美基公司
<120> 具有增強之組織分佈之雙特異性單鏈抗體構築體
<130> A-1914
<150> US62/031,777
<151> 2014-07-31
<160> 692
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 1
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 4
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽連接子
<400> 6
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 絨猴
<400> 8
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 棉冠狨
<400> 9
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 松鼠猴
<400> 10
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 609
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 610
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 611
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<211> 772
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<213> 食蟹猴
<400> 612
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<211> 5
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<211> 250
<212> PRT
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<220>
<223> 人工
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<220>
<223> 人工
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<211> 5
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<223> 人工
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<220>
<223> 人工
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<223> 人工
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工
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<213> 人工
<220>
<223> 人工
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<220>
<223> 人工
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
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<210> 685
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 685
<210> 686
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
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<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 687
<210> 688
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 688
<210> 689
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 689
<210> 690
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 690
<210> 691
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 691
<210> 692
<211> 578
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人工
<400> 692

Claims (21)

  1. 一種雙特異性單鏈抗體構築體，其經由第一結合結構域結合於標靶細胞表面抗原且經由第二結合結構域結合於T細胞表面抗原CD3，該構築體包含兩個FcRn結合肽，其中：(a)第一FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLX 1 PANG (SEQ ID NO：1)，其中X1 為Y或H；且(b)第二FcRn結合肽包含胺基酸序列TGHFGGLHP (SEQ ID NO：4)；其中該雙特異性單鏈抗體構築體不具有SEQ ID NO：132-135 中所描繪之胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體構築體，其中該第二FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)或QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)。
  3. 如請求項1或2之抗體構築體，其包含選自由以下組成之群的N端之FcRn結合肽及C端之FcRn結合肽：(a)該N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLYPANG (SEQ ID NO：2)，且該C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)；(b)該N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLYPANG (SEQ ID NO：2)，且該C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)；(c)該N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)，且該C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)；(d)該N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)，且該C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)；(e)該N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)，且該C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLYPANG (SEQ ID NO：2)；且(f)該N端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO：5)，且該C端之FcRn結合肽包含胺基酸序列QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO：3)。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體構築體，其中該等FcRn結合肽經由一或多個肽連接子連接於該抗體構築體。
  5. 如請求項4之抗體構築體，其中該肽連接子具有胺基酸序列(GGGGS)n (SEQ ID NO：6)n ，其中n為在1至5範圍內之整數。
  6. 如前述請求項中任一項之抗體構築體，其中該構築體包含結合於血清白蛋白之另一結構域。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體構築體，其中該標靶細胞表面抗原為腫瘤抗原。
  8. 如請求項7之抗體構築體，其中該腫瘤抗原選自由CDH19、間皮素(MSLN)、DLL3、FLT3、CD33、CD20及EGFRvIII組成之群。
  9. 如前述請求項中任一項之抗體構築體，其中該第二結合結構域結合於人類及白鬢狨(Callithrix jacchus)、棉頂狨(Saguinus oedipus)或松鼠猴(Saimiri sciureus)CD3ε鏈之抗原決定基，其中該抗原決定基為包含於由以下組成之群中的胺基酸序列之一部分：SEQ ID NO：7、8、9及10，且包含至少胺基酸序列Gln-Asp-Gly-Asn-Glu(SEQ ID NO：11)。
  10. 如請求項9之抗體構築體，其中該第二結合結構域包含具有CDR-L1-L3之VL區及具有CDR-H1-H3的VH區，該CDR-L1-L3及CDR- H1-H3選自由以下組成之群：(a)SEQ ID NO：12-14中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：15-17中所描繪之CDR-H1-H3；(b)SEQ ID NO：24-26中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：27-29中所描繪之CDR-H1-H3；(c)SEQ ID NO：36-38中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：39-41中所描繪之CDR-H1-H3；(d)SEQ ID NO：48-50中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：51-53中所描繪之CDR-H1-H3；(e)SEQ ID NO：60-62中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：63-65中所描繪之CDR-H1-H3；(f)SEQ ID NO：72-74中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：75-77中所描繪之CDR-H1-H3；(g)SEQ ID NO：84-86中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：87-89中所描繪之CDR-H1-H3；(h)SEQ ID NO：96-98中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：99-101中所描繪之CDR-H1-H3；(i)SEQ ID NO：108-110中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：111-113中所描繪之CDR-H1-H3；(j)SEQ ID NO：120-122中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：123-125中所描繪之CDR-H1-H3；(k)SEQ ID NO：616-618中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：613-615中所描繪之CDR-H1-H3；(l)SEQ ID NO：626-628中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：623-625中所描繪之CDR-H1-H3；(m)SEQ ID NO：636-638中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO： 633-635中所描繪之CDR-H1-H3；(n)SEQ ID NO：646-648中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：643-645中所描繪之CDR-H1-H3；(o)SEQ ID NO：656-658中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：653-655中所描繪之CDR-H1-H3；(p)SEQ ID NO：666-668中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：663-665中所描繪之CDR-H1-H3；(q)SEQ ID NO：676-678中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：673-675中所描繪之CDR-H1-H3；及(r)SEQ ID NO：686-688中所描繪之CDR-L1-L3及SEQ ID NO：683-685中所描繪之CDR-H1-H3。
  11. 如請求項9或10之抗體構築體，其中該第二結合結構域包含選自由以下組成之群的成對VH及VL鏈：(a)SEQ ID NO：18中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：20中所描繪之VL鏈；(b)SEQ ID NO：30中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：32中所描繪之VL鏈；(c)SEQ ID NO：42中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：44中所描繪之VL鏈；(d)SEQ ID NO：54中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：56中所描繪之VL鏈；(e)SEQ ID NO：66中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：68中所描繪之VL鏈；(f)SEQ ID NO：78中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：80中所描繪之VL鏈；(g)SEQ ID NO：90中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：92中所描繪 之VL鏈；(h)SEQ ID NO：102中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：104中所描繪之VL鏈；(i)SEQ ID NO：114中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：116中所描繪之VL鏈；(j)SEQ ID NO：126中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：128中所描繪之VL鏈；(k)SEQ ID NO：619中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：620中所描繪之VL鏈；(l)SEQ ID NO：629中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：630中所描繪之VL鏈；(m)SEQ ID NO：639中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：640中所描繪之VL鏈；(n)SEQ ID NO：649中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：650中所描繪之VL鏈；(o)SEQ ID NO：659中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：660中所描繪之VL鏈；(p)SEQ ID NO：669中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：670中所描繪之VL鏈；(q)SEQ ID NO：679中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：680中所描繪之VL鏈；及(r)SEQ ID NO：689中所描繪之VH鏈及SEQ ID NO：690中所描繪之VL鏈。
  12. 如請求項9至11中任一項之抗體構築體，其中該第二結合結構域包含SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：94、 SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：621、SEQ ID NO：631、SEQ ID NO：641、SEQ ID NO：651、SEQ ID NO：661、SEQ ID NO：671、SEQ ID NO：681或SEQ ID NO：691中所描繪之胺基酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體構築體，其中該等結構域自N端至C端排列如下：(包含SEQ ID NO：1之FcRn結合肽)-(該第一結合結構域之VH鏈)-(該第一結合結構域之VL鏈)-(該第二結合結構域之VH鏈)-(該第二結合結構域之VL鏈)-(包含SEQ ID NO：4之FcRn結合肽)或(包含SEQ ID NO：4之FcRn結合肽)-(該第一結合結構域之VH鏈)-(該第一結合結構域之VL鏈)-(該第二結合結構域之VH鏈)-(該第二結合結構域之VL鏈)-(包含SEQ ID NO：1之FcRn結合肽)。
  14. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至13中任一項所定義之抗體構築體。
  15. 一種載體，其包含如請求項14所定義之聚核苷酸。
  16. 一種宿主細胞，其使用如請求項14所定義之聚核苷酸或使用如請求項15所定義之載體轉型或轉染。
  17. 一種製備如請求項1至13中任一項之抗體構築體的方法，該方法包含在可以讓如請求項1至13中任一項所定義之抗體構築體表現的條件下培養如請求項16所定義之宿主細胞，及自培養物回收所產生之抗體構築體。
  18. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之抗體構築體或根據如請求項17之方法製備的抗體構築體。
  19. 如請求項1至13中任一項之抗體構築體，或根據如請求項17之方法製備之抗體構築體，其係用於預防、治療或改善選自增生性 疾病、腫瘤性疾病、病毒性疾病或免疫病症的疾病。
  20. 一種用於治療或改善增生性疾病、腫瘤性疾病、病毒性疾病或免疫病症之方法，其包含為有需要之個體投與如請求項1至13中任一項之抗體構築體或根據如請求項17之方法製備的抗體構築體的步驟。
  21. 一種套組，其包含如請求項1至13中任一項之抗體構築體或根據如請求項17之方法製備的抗體構築體、如請求項15所定義之載體及/或如請求項16所定義之宿主細胞。
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