JP2010524851A - 種間特異的結合ドメイン - Google Patents
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Abstract
Description
(a)配列番号27に示されるCDR−L1、配列番号28に示されるCDR−L2及び配列番号29に示されるCDR−L3;
(b)配列番号117に示されるCDR−L1、配列番号118に示されるCDR−L2及び配列番号119に示されるCDR−L3;
(c)配列番号153に示されるCDR−L1、配列番号154に示されるCDR−L2及び配列番号155に示されるCDR−L3。
(a)配列番号12に示されるCDR−H1、配列番号13に示されるCDR−H2及び配列番号14に示されるCDR−H3;
(b)配列番号30に示されるCDR−H1、配列番号31に示されるCDR−H2及び配列番号32に示されるCDR−H3;
(c)配列番号48に示されるCDR−H1、配列番号49に示されるCDR−H2及び配列番号50に示されるCDR−H3;
(d)配列番号66に示されるCDR−H1、配列番号67に示されるCDR−H2及び配列番号68に示されるCDR−H3;
(e)配列番号84に示されるCDR−H1、配列番号85に示されるCDR−H2及び配列番号86に示されるCDR−H3;
(f)配列番号102に示されるCDR−H1、配列番号103に示されるCDR−H2及び配列番号104に示されるCDR−H3;
(g)配列番号120に示されるCDR−H1、配列番号121に示されるCDR−H2及び配列番号122に示されるCDR−H3;
(h)配列番号138に示されるCDR−H1、配列番号139に示されるCDR−H2及び配列番号140に示されるCDR−H3;
(i)配列番号156に示されるCDR−H1、配列番号157に示されるCDR−H2及び配列番号158に示されるCDR−H3;及び
(j)配列番号174に示されるCDR−H1、配列番号175に示されるCDR−H2及び配列番号176に示されるCDR−H3。
(a)配列番号17又は21に示されるVL領域及び配列番号15又は19に示されるVH領域;
(b)配列番号35又は39に示されるVL領域及び配列番号33又は37に示されるVH領域;
(c)配列番号53又は57に示されるVL領域及び配列番号51又は55に示されるVH領域;
(d)配列番号71又は75に示されるVL領域及び配列番号69又は73に示されるVH領域;
(e)配列番号89又は93に示されるVL領域及び配列番号87又は91に示されるVH領域;
(f)配列番号107又は111に示されるVL領域及び配列番号105又は109に示されるVH領域;
(g)配列番号125又は129に示されるVL領域及び配列番号123又は127に示されるVH領域;
(h)配列番号143又は147に示されるVL領域及び配列番号141又は145に示されるVH領域;
(i)配列番号161又は165に示されるVL領域及び配列番号159又は163に示されるVH領域;及び
(j)配列番号179又は183に示されるVL領域及び配列番号177又は181に示されるVH領域。
(a)配列番号291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345若しくは347、393、395、397、411、413、415、429、431、433、447、449、451、465、467、469、483、485、487、501、503、505、519、521、523、1336、1338、1340、538、540、542、556、570、572、574、588、590、592、626、628、630、643、645、647、661、663、665、679、693、707、721、735、749、763、777、791、805、819、833、847、861、863、877、879、881、895、897、899、913、915、917、931、933、935、949、951、953、967、969、971、985、987、989、1003、1017、1031、1045、1059、1073、1087、1101、1125、1138、1152、1166、1180、1194、1208、1222、1236、1250、1264、1278、1292、1306、1320、1334、1354、1356、1358、1372、1386、1400、1414、1428、1442、1456、1470、1484、1500、1502、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1586、1588、1602、1616、1630、1647、1649、又は1663のいずれかで示されるアミノ酸配列;及び、
(b)配列番号292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346若しくは348、394、396、398、412、414、416、430、432、434、448、450、452、466、468、470、484、486、488、502、504、506、520、522、524、1337、1339、1341、539、541、543、557、571、573、575、589、591、593、627、629、631、644、646、648、662、664、666、680、694、708、722、736、750、764、778、792、806、820、834、848、862、864、878、880、882、896、898、900、914、916、918、932、934、936、950、952、954、968、970、972、986、988、990、1004、1018、1032、1046、1060、1074、1088、1102、1126、1139、1153、1167、1181、1195、1209、1223、1237、1251、1265、1279、1293、1307、1321、1335、1355、1357、1359、1373、1387、1401、1415、1429、1443、1457、1471、1485、1501、1503、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1587、1589、1603、1617、1631、1648、1650、又は1664のいずれかで示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
から選択される配列を含む。
アイテム1
ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロン(CD3ε)のエピトープに結合可能な異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチド(複数可)の同定方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)該ポリペプチド(複数可)を、アミノ酸配列Gln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Met−Gly(配列番号381)又はGln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Ile−GIy(配列番号382)を含み、そのC末端で固定相に固定されている最大27アミノ酸のCD3εの細胞外ドメインのN末端断片に接触させる工程;
(b)結合したポリペプチド(複数可)を前記断片から溶離する工程;及び
(c)該ポリペプチド(複数可)を(b)溶離液から単離する工程。
ポリペプチド(複数可)が、第1結合ドメインとして同定された結合ドメイン及び細胞表面抗原に結合可能な第2結合ドメインを含む、アイテム1の方法。
第2結合ドメインがヒト及び非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合する、アイテム2の方法。
第1結合ドメインが抗体である、アイテム1から3のいずれかの方法。
抗体が単鎖抗体である、アイテム4の方法。
第2結合ドメインが抗体である、アイテム2から5のいずれかの方法。
CD3εの細胞外ドメインの断片が、配列番号2、4、6又は8に示されるいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドの1つ以上の断片からなる、アイテム1から6のいずれかの方法。
前記断片の長さが、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27アミノ酸残基である、アイテム7の方法。
同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3εとのエピトープに結合する異種間特異性結合ドメインを含む複数のポリペプチドをスクリーニングする方法である、アイテム1から8のいずれかの方法。
同定の方法が、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3εのエピトープに結合する異種間特異性結合ドメインを含むポリペプチドを精製/単離する方法である、アイテム1から8のいずれかの方法。
異種間特異性結合ドメインの生成のための、アミノ酸配列Gln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Met−Gly(配列番号381)又はGln−Asp−Gly−Asn−Glu−Glu−Ile−Gly(配列番号382)を含む最大27アミノ酸のCD3εの細胞外ドメインのN末端断片の使用。本発明の前記使用と調和して、生成した異種間特異性結合ドメインがヒト起源であることが好ましい。
異種間特異性結合ドメインが抗体である、アイテム11による使用。
抗体が単鎖抗体である、アイテム12による使用。
抗体が二重特異性抗体である、アイテム12から13による使用。
[図2]一過性導入された293細胞の上清中で、ヒトIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域並びにC末端6ヒスチジンタグに融合した成熟ヒトCD3イプシロンのN末端アミノ酸1−27を含むコンストラクトの存在を検出するELISAアッセイで測定された4連のサンプルの平均吸収値である。「27アミノ酸ヒトCD3E」と名称を付けられた第1カラムは、コンストラクトの平均吸収値を示し、「無関係な上清」と名称を付けられた第2のカラムは、ネガティブコントロールとして無関係なコンストラクトによりトランスフェクトされた293細胞の上清の平均値である。コンストラクトで得られた値をネガティブコントロールで得られた値と比較すると、組換えコンストラクトの存在を明らかに示している。
[図3]ヒトIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域並びにC末端His6タグに融合した成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含むコンストラクトへの、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するELISAアッセイで測定された4連のサンプルの平均吸収値を示す。カラムは、左から右へ、A2J HLP、I2C HLP、E2M HLP、F7O HLP、G4H HLP、H2C HLP、E1L HLP、F12Q HLP、F6A HLP及びH1E HLPと称される特異性の平均吸収値を示す。「ネガティブコントロール」と称される一番右のカラムは、ネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物の平均吸収値を示す。抗CD3特異性で得られた値とネガティブコントロールで得られた値を比べると、成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端1−27アミノ酸への抗CD3特異性の強い結合を明らかに示している。
[図4]異種膜結合タンパク質への霊長類CD3イプシロンのN末端アミノ酸1−27の融合。
[図5]カニクイザルEpCAM並びにそれぞれ、ヒト、マーモセット、タマリン、リスザル及び家畜ブタのCD3イプシロン鎖のN末端1−27アミノ酸からなる組換え膜貫通型融合タンパク質の存在を検出するFACSアッセイで試験された異なるトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、それぞれヒト27量体、マーモセット27量体、タマリン27量体、リスザル27量体及びブタ27量体を含むコンストラクトを発現するトランスフェクタントの結果を示す。個別のオーバーレイで、細線はネガティブコントロールとして抗FlagM2の代わりに2%FCSを含むPBSでインキュベートされたサンプルを表し、太線は抗FlagM2抗体とともにインキュベートされたサンプルを表す。各コンストラクトで、ヒストグラムのオーバーレイは、トランスフェクタントへの抗FlagM2抗体の結合を示し、トランスフェクタントでの組換えコンストラクトの発現を明らかに示している。
[図6A]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたヒト27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6B]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたマーモセット27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6C]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたタマリン27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6D]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたリスザル27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図6E]カニクイザルEpCAMにそれぞれ融合したヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27への、ペリプラズム発現された単鎖抗体の粗調製物の形態である異種間特異性抗CD3結合分子の結合を検出するFACSアッセイで測定された種々のトランスフェクタントのヒストグラムオーバーレイである。
ヒストグラムオーバーレイは、左から右へ、上から下へ、H2C HLP、F12Q HLP、E2M HLP及びG4H HLPとそれぞれ称されるCD3特異的結合分子とともに試験されたブタ27量体を含む1−27CD3−EpCAMを発現するトランスフェクタントの結果を示す。
個別のオーバーレイにおいて、細線はネガティブコントロールとしてネズミ抗ヒトCD3抗体の単鎖調製物とともにインキュベートされたサンプルを表し、太線は示されているそれぞれの抗CD3結合分子とともにインキュベートされたサンプルを表す。ブタ27量体トランスフェクタントへの結合の欠如及び図5に示されるコンストラクトの発現レベルを考察すると、ヒストグラムのオーバーレイは、カニクイザルEpCAMに融合したそれぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27を含む組換え膜貫通型融合タンパク質を発現する細胞への、完全に異種間特異的なヒト二重特異性単鎖抗体の試験された抗CD3特異性の特異的で強い結合を示し、したがって、抗CD3結合分子の多種霊長類異種間特異性を示す。
[図7]トランスフェクトされたネズミEL4 T細胞上でのヒトCD3イプシロンの検出のためのFACSアッセイ。グラフ解析は、ヒストグラムのオーバーレイを示す。太線は、抗ヒトCD3抗体UCHT−1とともにインキュベートされたトランスフェクトされた細胞を示す。細線は、マウスIgG1アイソタイプコントロールとともにインキュベートされた細胞を表す。抗CD3抗体UCHT−1の結合は、トランスフェクトされたネズミEL4 T細胞の細胞表面でのヒトCD3イプシロン鎖の発現を明らかに示す。
[図8A]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラIgG分子として発現した異種間特異性抗CD3抗体A2J HLPの結果を示す。位置4(アスパラギン)、位置23(スレオニン)及び位置25(イソロイシン)でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図8B]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラIgG分子として発現した異種間特異性抗CD3抗体E2M HLPの結果を示す。位置4(アスパラギン)、位置23(スレオニン)及び位置25(イソロイシン)でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図8C]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
キメラIgG分子として発現した異種間特異性抗CD3抗体H2C HLPの結果を示す。位置4(アスパラギン)でのアラニンへの変異体では結合活性の低下が見られる。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニングルタミンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図8D]アラニンスキャニング実験でのアラニン変異体への異種間特異性抗CD3抗体の結合。個別の図で、カラムは、左から右へ、野生型トランスフェクタント(WT)及び位置1から27からの全てのアラニン変異体の対数スケールでの任意単位の計算結合値を示す。結合値は以下の式を利用して計算される:
(式)
この式において、「サンプル値」は、図に示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。個々のアラニン変異体の位置は、野生型アミノ酸の1文字のコード及び位置の数により標識づけられている。
ペリプラズム発現した単鎖抗体として試験される、異種間特異性抗CD3抗体F12Q HLPの結果を示す。位置1(グルタミン)、位置2(アスパラギン酸)及び位置3(グリシン)及び位置5(グルタミン酸)でのアラニンへの変異体では結合が完全に失われている。
[図9]N末端His6タグがある場合と無い場合のヒトCD3への、異種間特異性抗CD3結合分子H2C HLPの結合を検出するFACSアッセイ。
ヒストグラムオーバーレイは、異種間特異性結合分子H2C HLPの結合を検出するFACSアッセイで試験された、野生型ヒトCD3イプシロン鎖(左のヒストグラム)又はN末端His6タグがあるヒトCD3イプシロン鎖(右のヒストグラム)によりトランスフェクトされたEL4細胞株で実施される。サンプルは、ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールと(細線)、ポジティブコントロールとして抗ヒトCD3抗体UCHT−1と(点線)及びキメラIgG分子の形態の異種間特異性抗CD3抗体H2C HLPと(太線)ともにインキュベートされる。
ヒストグラムオーバーレイは、組換え構築体の両方の発現を示すアイソタイプコントロールに比べ、両トランスフェクタントへのUCHT−1抗体の同等な結合を示す。ヒストグラムオーバーレイは、His6ヒトCD3イプシロン鎖でなく、野生型ヒトCD3イプシロン鎖のみへの抗CD3結合分子H2C HLPの結合も示す。これらの結果は、異種間特異性抗CD3結合分子H2C HLPの結合にはフリーのN末端が必須であることを表す。
[図10]FACS分析による、細胞上でのCD3結合のKD値を測定する、ヒトCD3陽性PBMCへのEGFR−21−63 LH x H2Cの飽和結合。このアッセイは、実施例7に記載されるとおり実施される。
[図11a]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11b]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11c]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11d]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11e]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11f]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11g]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11h]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図11i]ヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は実施例12に記載のとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラムの線はネガティブコントロールを表す:細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図12]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13a]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13b]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13c]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13d]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13e]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13f]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13g]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13h]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13i]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図13j]示した標的細胞株へ向け直された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘起された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として、ヒトEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。B)マカクT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRでトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として用いられる。このアッセイは実施例13で述べるようにして実施される。
[図14]ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119 LnPxへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例17に記載されたとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す:細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図15]ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119 LnPXへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例17に記載されたとおり実施される。太線は、2μg/mlの精製タンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図16]ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB−ALL、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞及びマカクザルT細胞株4119 LnPXへの、明示された種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析。FACS染色は、実施例17に記載されたとおり実施される。太線は、2μg/mlのモノマータンパク質とともにインキュベートされ、その後抗his抗体及びPE標識検出抗体とともにインキュベートされた細胞を表す。細いヒストグラム線はネガティブコントロールを表す。細胞は、抗his抗体及び検出抗体とインキュベートされるのみである。
[図17]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。B)マカクザルT細胞株4119LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図18]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)及びB)マカクザルT細胞株4119 LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図19]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)及びB)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図20]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。B)マカクザルT細胞株4119 LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図21]示される標的細胞株に向け直された、明示された異種間特異性MCSP特異性単鎖コンストラクトにより誘起される細胞障害活性。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用され、ヒトMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。B)マカクザルT細胞株4119 LnPxがエフェクター細胞として使用され、カニクイザルMCSP D3によりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞として使用される。アッセイは実施例18に記載のとおり実施される。
[図22−1]50%ヒト血漿とともにそれぞれ37℃及び4℃で24時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に50%ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるMCSP及びCD3種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトMCSPによりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例19に記載されるとおり実施される。
[図22−2]50%ヒト血漿とともにそれぞれ37℃及び4℃で24時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に50%ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるMCSP及びCD3種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトMCSPによりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例19に記載されるとおり実施される。
[図22−3]50%ヒト血漿とともにそれぞれ37℃及び4℃で24時間インキュベートされた、或いは細胞障害性試験の直前に50%ヒト血漿が添加された、又は血漿が添加されない、明示された単鎖コンストラクトのサンプルにより誘起された、細胞障害活性の測定により試験されるMCSP及びCD3種間特異的二重特異性単鎖抗体の血漿安定性。ヒトMCSPによりトランスフェクトされたCHO細胞が標的細胞株として使用され、刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCがエフェクター細胞として使用される。アッセイは実施例19に記載されるとおり実施される。
[図23a]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23b]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23c]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23d]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23e]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図23f]従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子CD19×CD3の静脈内注入の開始フェーズの間における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たないB‐NHL患者(表4の特許番号1、7、23、30、31、及び33)の末梢血液中の絶対T細胞数(白四角)の最初の低下及び回復(すなわち、再分布)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図24](A)最初の投与量として1日目は5μg/m2/24時間とし、すぐに投与量を15μg/m2/24時間に増加して連続して行ったCD19×CD3の静脈注入の下、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を持たないB‐NHL患者番号19(表4)で繰り返し発生するT細胞再分布(白四角)、及びCNS症状の発症を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。5μg/m2/24時間で開始した治療によって引き起こされた再分布の第一のエピソードからの循環するT細胞の回復後、5から15μg/m2/24時間への段階的な投与量の増加によってT細胞再分布の第二のエピソードが引き起こされ、これは、主として錯乱及び見当識障害であるCNS症状の発症を伴った。
(B)CD19×CD3を1.5μg/m2で繰り返し静脈内ボーラス注入した場合のB‐NHL患者で繰り返し発生するT細胞再分布を示す図であり、この患者はCNS症状を発症した。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。各ボーラス投与の注入時間は2乃至4時間とした。垂直の矢印はボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の最初のデータポイントは、ボーラス注入開始直前のT細胞数を示す。各ボーラス注入は、T細胞再分布のエピソードを引き起こし、続いて次のボーラス注入の前にT細胞数は回復した。最後に、この患者では、T細胞再分布の第三のエピソードがCNS症状の発症を伴った。
[図25]CD19×CD3注入のランプイニシエーション(ramp initiation)、すなわち、治療の最初の24時間はほぼ0から15μg/m2/24時間まで流量を均等に徐々に増加させるという場合における、循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を持たないB‐NHL患者番号20(表4)の複雑なT細胞再分布パターン(白四角)を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。CD19×CD3への第一の曝露によって引き起こされた最初の再分布後に循環血液中に再出現するT細胞の一部は、ランプフェーズの間のさらに増加を続けるCD19×CD3のレベルに誘発されて循環血液中から再消滅する。
[図26]著しい数の循環するCD19‐陽性標的B(リンパ腫)細胞(黒三角)を持つB‐NHL患者番号13(表4)をCD19×CD3で治療した際のT及びB細胞数を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。T細胞(白四角)はCD19×CD3の注入開始と共に循環から完全に消滅し、循環するCD19‐陽性標的B(リンパ腫)細胞(黒三角)が末梢血液から除去されるまで再出現しない。
[図27]循環するCD19‐陽性標的B細胞(黒三角)を実質的に持たず、CD19×CD3注入をこの薬剤の安定化に必要であるHSAを追加することなく開始すると共にCNS症状を発症したB‐NHL患者番号24(表4)で繰り返し発生するT細胞再分布(白四角)を示す図である(上側の図)。最初の再分布からの循環するT細胞の第一の回復後、安定化させるHSAが存在しないために不均一となった薬剤流量によってT細胞再分布の第二のエピソードが引き起こされ、これは、主として錯乱及び見当識障害であるCNS症状の発症を伴った。同一の患者にて、薬剤安定化のためのHSAを追加して含有するCD19×CD3溶液で正しく治療を再度開始すると、T細胞再分布の繰り返しは観察されず(下側の図)、この患者はいずれのCNS症状をも再度発症することはなかった。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。CD19×CD3の投与量は患者番号の横のカッコ内に示す。
[図28]コンテクスト依存性CD3エピトープへの一価の結合によって誘発される内皮細胞へのT細胞の接着のモデルを示す図である。従来のCD3結合分子は、CD3イプシロン上のそのコンテクスト依存性エピトープに対する一価の相互作用によってCD3のコンフォメーションのアロステリックな変化を、続いてCD3イプシロンの細胞質ドメインへのNck2の動員を引き起こすことができる(Gil et al. (2002) Cell 109: 901)。Nck2はPINCH及びILKを介してインテグリンと直接結合していることから(Legate et al. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol 7: 20)、従来のCD3結合分子(実施例20のCD19×CD3のような)がCD3イプシロン上のそのコンテクスト依存性エピトープに結合することによるCD3のコンフォメーションのアロステリックな変化に続いてNck2がCD3イプシロンの細胞質ドメインへ動員されると、内側からのシグナル伝達(inside‐out‐signalling)を通してT細胞表面上のインテグリンがより接着性の高いアイソフォームへと一時的に変換され、T細胞の内皮細胞への接着性を高めることができる。
[図29]実施例21で述べるようにカニクイザルのインビボでの研究に使用されたCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VL試験物質の細胞障害活性を示す図である。CD33陽性標的細胞の特異的な溶解を、CD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度を上昇させる標準的な51クロム放出アッセイによって測定した。アッセイは18時間行った。マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた。カニクイザルCD33でトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞とした。標的細胞に対するエフェクター細胞の比(E:T比)は10:1とした。標的細胞溶解の最大半減(half‐maximal target cell lysis)に要するCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、用量反応曲線より2.7ng/mlの値であると算出された。
[図30A]実施例21で述べるCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの連続する静脈注入による、カニクイザル末梢血液からの投与量依存及び時間依存のCD33陽性単球の除去を示す図である。カラム上に示した処理時間後の循環するCD33陽性単球の絶対数のベースライン(すなわち100%)に対するパーセントを、投与量レベルごと、2匹のカニクイザルの各々に対して示す。投与量レベル(すなわち、注入流量)をカラムの下に示す。30μg/m2/24時間の投与量で7日間処理した動物1及び2では、循環するCD33陽性単球の除去は観察されなかった。60μg/m2/24時間の投与量で7日間処理した動物3及び4では、循環するCD33陽性単球数がそれぞれベースラインの68%及び40%へ減少した。240μg/m2/24時間では、循環するCD33陽性単球は3日間の処理の後に末梢血液からほぼ完全に除去された(動物5及び6)。1000μg/m2/24時間では、循環するCD33陽性単球は1日の処理の後にすでに末梢血液から完全に除去されていた(動物7及び8)。
[図30B−1]120μg/m2/24時間でCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLを14日間連続注入した場合の、2匹のカニクイザルの末梢血液中のT細胞数及びCD33単球数の推移を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。注入を開始して最初の12時間のCD33単球の最初の動員後、その後の注入の過程において末梢血液中のCD33単球(黒三角)は、それぞれのベースライン数に対して3分の2(動物10)及び50%(動物9)が除去されている。循環するT細胞数(白四角)は、最初に限定的な低下を示し、続いて循環するCD33陽性単球標的細胞が依然として存在している間に回復している。
[図30B−2]120μg/m2/24時間でCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLを14日間連続注入した場合の、2匹のカニクイザルの末梢血液中のT細胞数及びCD33単球数の推移を示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。注入を開始して最初の12時間のCD33単球の最初の動員後、その後の注入の過程において末梢血液中のCD33単球(黒三角)は、それぞれのベースライン数に対して3分の2(動物10)及び50%(動物9)が除去されている。循環するT細胞数(白四角)は、最初に限定的な低下を示し、続いて循環するCD33陽性単球標的細胞が依然として存在している間に回復している。
[図31]実施例22で述べるようにカニクイザルのインビボでの研究に使用されたMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VL試験物質の細胞障害活性を示す図である。MCSP陽性標的細胞の特異的な溶解を、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度を上昇させる標準的な51クロム放出アッセイによって測定した。アッセイは18時間行った。マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた。カニクイザルMCSPでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞とした。標的細胞に対するエフェクター細胞の比(E:T比)は10:1とした。標的細胞溶解の最大半減に要するMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、用量反応曲線より1.9ng/mlの値であると算出された。
[図32−1]実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの静脈内注入の開始フェーズの間における、カニクイザル末梢血液中の絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復(すなわち、再分布)という最初のエピソードが発生していないことを示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの投与量は動物番号の横のカッコ内に示す。カニクイザルの循環血液中にMCSP陽性標的細胞が存在しないことが既知である場合、標的細胞の媒介によるCD3の架橋を通してのT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)は誘発されない。さらに、T細胞がCD3結合部位との相互作用を通すことでしか受けることができないシグナルによるT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)の誘発は、実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLのようなCD3結合分子を用いることで避けることができる。
[図32−2]実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するCD3結合分子MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの静脈内注入の開始フェーズの間における、カニクイザル末梢血液中の絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復(すなわち、再分布)という最初のエピソードが発生していないことを示す図である。絶対細胞数は、血液1マイクロリットル中1000個の細胞の単位として表される。最初のデータポイントは注入開始直前のベースライン数を示す。MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの投与量は動物番号の横のカッコ内に示す。カニクイザルの循環血液中にMCSP陽性標的細胞が存在しないことが既知である場合、標的細胞の媒介によるCD3の架橋を通してのT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)は誘発されない。さらに、T細胞がCD3結合部位との相互作用を通すことでしか受けることができないシグナルによるT細胞の再分布(すなわち、絶対T細胞数の低下及びそれに続く回復という最初のエピソード)の誘発は、実質的にコンテクスト非依存性CD3エピトープを認識するMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLのようなCD3結合分子を用いることで避けることができる。
[図33−1]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−2]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−3]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−4]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−5]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−6]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−7]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−8]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−9]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−10]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−11]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図33−12]指定の種間特異的二重特異性コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例23.4で述べるようにして実施する。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールにはトランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図34−1]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−2]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−3]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−4]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−5]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−6]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−7]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図34−8]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例23.5で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図35a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35f]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図35g]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例24.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合に対するネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCAIX並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図36a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CAIX特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例24.6で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図36b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CAIX特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例24.6で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図36c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CAIX特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例24.6で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図37]ヒトT細胞をエフェクター細胞として用いた、指定のEpCAM特異的単鎖コンストラクトによって誘発されるヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞に対する細胞障害活性を示す図である。このアッセイは実施例のセクションで述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
エフェクター細胞:刺激されたCD4/CD56除去ヒトPBMC
標的細胞:ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO
[図38a]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図38b]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図38c]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図38d]指定の二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEpCAMでトランスフェクトされたCHO細胞(2a)、EpCAM及びCD3陰性細胞株としてのトランスフェクトされていないCHO細胞(2b)、ヒトPBMC(2c)、及びマカクT細胞株4119LnPx(2d)のそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。細胞は、それぞれの二重特異性単鎖コンストラクトを含有する上清と共にインキュベートした。FACS染色は実施例のセクションで述べるようにして実施する。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒトEpCAM、並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
a:CHO‐EpCAM(ヒト)
b:CHO(トランスフェクトされていない)
c:ヒトPBMC
d:マカク4119LnPx(CD3+)
[図39a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図39f]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例26.3で述べるようにして実施する。太線は、2μg/mlの精製した単量体タンパク質と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図40a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40d]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40e]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40f]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図40g]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、カニクイザルEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例26.3で述べるようにして実施する。
[図41a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例27.2で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたCHO細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図41b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例27.2で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたCHO細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図41c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例27.2で述べるようにして実施する。太線は、指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトでトランスフェクトされたCHO細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされ、続いて抗his抗体及びPE標識検出抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。細線のヒストグラムは、ネガティブコントロール:抗his抗体及び検出抗体と共にインキュベートされただけである細胞を表す。
[図42a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42d]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42e]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42f]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図42g]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。A)刺激されたCD4−/CD56−ヒトPBMCをエフェクター細胞として、ヒトIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。B)マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞として、マカクIgEでトランスフェクトされたJ558L細胞を標的細胞として用いる。このアッセイは実施例27.2で述べるようにして実施する。
[図43]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例28.6で述べるようにして実施した。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイはヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図44]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、v6エクソンが欠損したヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞に対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例28.6で述べるようにして実施する。CD44の発現のコントロールとして、v6エクソンが欠損したヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及び完全長ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞を抗CD44抗体と共にインキュベートした。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は示した抗CD44抗体(5μg/ml)と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、v6エクソンが欠損したヒトCD44へのコンストラクトの結合の欠如を示している。v6エクソンが欠損したヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞上にCD44が存在することは、これらの細胞及び完全長ヒトCD44でトランスフェクトされた細胞に対する抗CD44抗体の結合が同等であることによって示された。FACS結合分析により、CD44のv6エクソンに対する種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの特異性が示された。
[図45]実施例28.1で述べるように、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞へ再指向された指定の種間特異的CD44特異的単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。エフェクター細胞として、刺激されCD4及びCD56が除去されたヒトPBMCを10:1のE:T比で用いた。このアッセイは実施例28.7で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞に対するヒトエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が示された。
[図46−1]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD30+B細胞株MEC‐1、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例29.5で述べるようにして実施した。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD30並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図46−1]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD30+B細胞株MEC‐1、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例29.5で述べるようにして実施した。太線は、5μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD30並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図47]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD30特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例29.6で述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD30に対して陽性である細胞それぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図48]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトHER2でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクHER2でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例30.5で述べるようにして実施した。太線は、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクトと共にインキュベートされた細胞を表す。細線はネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクHER2並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図49]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的HER2特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。示したエフェクター細胞も用いた。このアッセイは実施例30.6で述べるようにして実施した。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクHER2でトランスフェクトされたCHO細胞それぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図50]E292F3 HL×I2C HLと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするSDS PAGEゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清(SN)、及びカラムのフロースルー(FT)を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー(M)を適用した。SDS PAGEゲルにおける50及び60kDaの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例31.2で述べる1段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。さらに、この高感度な検出法においてフロースルーサンプルのシグナルが非常に弱いものであることは、この精製法によって二重特異性単鎖分子がほぼ完全に捕獲されることを示している。
[図51]V207C12 HL×H2C HLと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするSDS PAGEゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清(SN)、及びカラムのフロースルー(FT)を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー(M)を適用した。SDS PAGEゲルにおける50及び60kDaの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例31.2で述べる1段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。さらに、この高感度な検出法においてフロースルーサンプルのシグナルが非常に弱いものであることは、この精製法によって二重特異性単鎖分子がほぼ完全に捕獲されることを示している。
[図52]AF5HL×F12QHLと称する種間特異的二重特異性単鎖分子の精製をモニタリングするSDS PAGEゲル及びウエスタンブロットを示す図である。図に示すように、溶離液からのサンプル、細胞培養物の上清(SN)、及びカラムのフロースルー(FT)を分析した。サイズのレファレンスとしてタンパク質マーカー(M)を適用した。SDS PAGEゲルにおける50及び60kDaの間の分子量の強いタンパク質バンドは、実施例31.2で述べる1段階の精製法によって非常に高い純度まで種間特異的二重特異性単鎖分子が効率的に精製されていることを示す。ヒスチジン6タグを検出するウエスタンブロットにより、溶離液中のタンパク質バンドがこの種間特異的二重特異性単鎖分子であることが確認される。この高感度な検出法におけるフロースルーサンプル中のシグナルは、上清中の二重特異性単鎖分子の濃度が高いためにアフィニティカラムが飽和したことで説明される。
[図53]50%マカクザル血清中のAF5HL×I2CHLの標準曲線である。上側の図は実施例32.2で述べるアッセイに対して作成された標準曲線を示す。
下側の図は、50%マカクザル血清中のAF5HL×I2CHLの品質管理サンプルに対する結果を示す。高QC及び中QCサンプルに対する回収率は90%超であり、低QCサンプルに対しては80%超である。
従って、このアッセイにより、血清サンプル中のAF5HL×I2CHLに対して10ng/ml乃至200ng/mlの範囲(希釈前)の検出が可能である。
[図54]50%マカクザル血清中のMCSP‐G4 HL×I2C HLの標準曲線である。上側の図は実施例32.2で述べるアッセイに対して作成された標準曲線を示す。
下側のグラフは、50%マカクザル血清中のMCSP‐G4 HL×I2C HLの品質管理サンプルに対する結果を示す。高QC及び中QCサンプルに対する回収率は98%超であり、低QCサンプルに対しては85%超である。
従って、このアッセイにより、血清サンプル中のMCSP‐G4 HL×I2C HLに対して10ng/ml乃至200ng/mlの範囲(希釈前)の検出が可能である。
[図55]カニクイザルEpCAMに融合した指定の種のCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27でトランスフェクトされたCHO細胞に対する抗Flag抗体のFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例33.1で述べるようにして実施した。太線は、抗Flag抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、2%FCSを含むPBSを用いた。ヒストグラムより、すべてのトランスフェクタントに対して抗Flag抗体の結合が強く同等であることが示され、このことは、トランスフェクトされたコンストラクトの発現が強く同等であることを示している。
[図56]カニクイザルEpCAMに融合した指定の種のCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27を発現するCHO細胞に対するI2C IgG1コンストラクトのFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例33.3で述べるようにして実施する。太線は、I2C IgG1コンストラクトを発現する細胞の細胞培養物の上清50μlと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、カニクイザルEpCAMに融合したブタのCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27を発現する細胞を用いた。ネガティブコントロールと比較して、ヒストグラムは、ヒト、マーモセット、タマリン、及びリスザルのCD3イプシロンのN末端アミノ酸1‐27に対してI2C IgG1コンストラクトが結合することを明らかに示している。
[図57]実施例6.1及び5.1でそれぞれ述べるN末端His6タグ付き及びタグ無しのヒトCD3に対する実施例33.2で述べるI2C IgG1コンストラクトのFACS結合分析を示す図である。太線は、図に示すように、抗ヒトCD3抗体UCHT‐1、ペンタ‐His抗体(Qiagen)、及びI2C IgG1コンストラクトを発現する細胞の細胞培養物の上清のそれぞれと共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムは、ネガティブコントロールとして関連性のないマウスIgG1抗体と共にインキュベートされた細胞を表す。
上段の2つのヒストグラムのオーバーレイは、アイソタイプコントロールと比較して、両方のトランスフェクタントに対するUCHT‐1抗体の結合が同等であることを表しており、両組み換えコンストラクトの発現を示している。中段の2つのヒストグラムのオーバーレイは、ペンタhis抗体が、His6‐ヒトCD3イプシロン鎖(His6‐CD3)を発現する細胞とは結合するが、野生型CD3イプシロン鎖(WT‐CD3)を発現する細胞とは結合しないことを示す。下段のヒストグラムのオーバーレイは、I2C IgG1コンストラクトが、野生型ヒトCD3イプシロン鎖とは結合するが、His6‐ヒトCD3イプシロン鎖とは結合しないことを示す。これらの結果から、種間特異的抗CD3結合分子I2CのCD3イプシロン鎖への結合には遊離のN末端が不可欠であることが示される。
[図58a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58f]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58g]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58h]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58i]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58j]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58k]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図58l]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例17で述べるようにして実施した。太線は、それぞれ、2μg/mlの精製した二重特異性単鎖コンストラクト、又は二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。MCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクMCSP D3並びにヒト及びマカクCD3へのコンストラクトの特異的な結合を示している。
[図59a]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図59b]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図59c]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図59d]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的MCSP D3特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例18で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトによる細胞障害活性の強力な種間特異的な増加が明らかに示される。
[図60a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例36.2で述べるようにして実施した。太線は、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。
[図60b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクPBMCのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。FACS染色は実施例36.2で述べるようにして実施した。太線は、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。ネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD33並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。
[図61]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD33特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を測定するクロム放出アッセイの結果を示す図である。エフェクター細胞も示したものを用いた。このアッセイは実施例36.3で述べるようにして実施する。この図より、各コンストラクトについて、ヒト及びマカクCD33でトランスフェクトされたCHO細胞のそれぞれに対するヒト及びマカクエフェクター細胞の細胞障害活性の強力な増加が明らかに示される。
[図62]PBS/5% HSA、及びPBS/5% HSAプラス単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトを、1.6、2.0、3.0、及び4.5μg/kgの投与量で週1回の静脈内ボーラス注入を行った場合のチンパンジーのT細胞再分布を示す図である。各ボーラス投与の注入時間は2時間とした。垂直の矢印はボーラス注入の開始を示す。各ボーラス投与の最初のデータポイントは、ボーラス注入開始直前のT細胞数を示す。従来のコンテクスト依存性CD3エピトープを認識する単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトの各ボーラス注入によってT細胞再分布のエピソードが引き起こされ、続いて次のボーラス注入の前にT細胞はベースライン値へ回復した。
[図63]選択されたクローンからのFlagタグscFvタンパク質断片を含む周辺質製剤のCD3特異的ELISA分析を示す図である。可溶性scFvタンパク質断片の周辺質製剤を、可溶性ヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質でコーティングしてPBS3%BSAでさらにブロックしておいたELISAプレートのウェルに添加した。検出は、モノクローナル抗Flag‐ビオチン標識抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで行った。ELISAの発色はABTS基質溶液で行った。OD値(y軸)は、ELISAリーダーにより405nmで測定した。x軸にクローン名を示す。
[図64]選択されたクローンからのFlagタグscFvタンパク質断片を含む周辺質製剤のCD3特異的ELISA分析を示す図である。図63と同じ可溶性scFvタンパク質断片の周辺質製剤を、可溶性ヒトCD3イプシロン(aa1‐27)‐Fc融合タンパク質ではなくhuIgG1(Sigma)でコーティングしてPBS中の3%BSAでブロックしておいたELISAプレートのウェルに添加した。
検出は、モノクローナル抗Flag‐ビオチン標識抗体、続いてペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンで行った。ELISAの発色はABTS基質溶液で行った。OD値(y軸)は、ELISAリーダーにより405nmで測定した。x軸にクローン名を示す。
[図65a]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65b]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65c]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65d]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図65e]指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3+T細胞株HPB‐ALL、マカクCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びマカクT細胞株4119LnPxのそれぞれに対するFACS結合分析を示す図である。指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのCD44に対する特異性を強調するために、コントロールとしてヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞を用いた。FACS染色は実施例39.3で述べるようにして実施する。太線は、二重特異性単鎖コンストラクトを含む細胞上清と共にインキュベートされた細胞を表す。黒塗りのヒストグラムはネガティブコントロールを表す。T細胞株への結合についてのネガティブコントロールには、トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を用いた。CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合についてのネガティブコントロールには、関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを用いた。種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトの各々について、ヒストグラムのオーバーレイは、ヒト及びマカクCD44並びにヒト及びマカクCD3へコンストラクトが特異的に結合していることを示している。各コンストラクトについてのヒストグラムのオーバーレイは、ヒトCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞に対して特異的に結合していないことを示している。
[図66]示した標的細胞株へ再指向された指定の種間特異的CD44特異性単鎖コンストラクトによって誘発された細胞障害活性を示す図である。エフェクター細胞、及び標的に対するエフェクターの比も示したものを用いた。このアッセイは実施例39.4で述べるようにして実施する。この図より、各々の二重特異性コンストラクトによる細胞障害活性を媒介する効力が明らかに示される。
[図67]実施例41で述べる指定の種間特異的二重特異性単鎖コンストラクトのFACS結合分析を示す図である。
[図68]実施例41で述べる指定の種間特異的結合分子によって誘発された細胞障害活性を示す図である。
以下の非ヒト霊長類、カリスリクス・ジャカス、サグイヌス・オイディプス及びサイミリ・シウレウスの血液サンプルを、CD3イプシロン同定に使用した。新鮮なヘパリン処理全血サンプルを、製造業者のプロトコルに従い(QIAamp RNA Blood Mini Kit、Qiagen)トータル細胞RNAの単離のために調製した。抽出したmRNAは、発表されているプロトコルに従いcDNAに転写した。簡単に言うと、10μlの沈殿したRNAを、1.2μlの10×ヘキサヌクレオチドミックス(Roche)と70℃で10分間インキュベートし、氷上で保存した。4μlの5×superscript IIバッファ、0.2μlの0.1Mジチオスレイトール、0.8μlのsuperscript II(Invitrogen)、1.2μlのデソキシリボヌクレオシド三リン酸(25μM)、0.8μlのRNase Inhibitor(Roche)及び1.8μlのDNase・RNaseフリーウォーター(Roche)からなる反応ミックスを加えた。反応ミックスを、室温で10分間インキュベートし、次いで42℃で50分間、90℃で5分間インキュベートした。反応を氷上で冷却してから、0.8μlのRNaseH(1U/μl、Roche)を加え、37℃で20分間インキュベートした。
ヌクレオチド
CAGGACGGTAATGAAGAAATGGGTGATACTACACAGAACCCATATAAAGTTTCCATCTCAGGAACCACAGTAACACTGACATGCCCTCGGTATGATGGACATGAAATAAAATGGCTCGTAAATAGTCAAAACAAAGAAGGTCATGAGGACCACCTGTTACTGGAGGACTTTTCGGAAATGGAGCAAAGTGGTTATTATGCCTGCCTCTCCAAAGAGACTCCCGCAGAAGAGGCGAGCCATTATCTCTACCTGAAGGCAAGAGTGTGTGAGAACTGCGTGGAGGTGGAT
QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
ヌクレオチド
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QDGNEEMGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGHEIKWLVNSQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPAEEASHYLYLKARVCENCVEVD
ヌクレオチド
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QDGNEEIGDTTQNPYKVSISGTTVTLTCPRYDGQEIKWLVNDQNKEGHEDHLLLEDFSEMEQSGYYACLSKETPTEEASHYLYLKARVCENCVEVD
2.1 異種可溶性タンパク質への融合による、そのナイーブCD3コンテクストから分離されるCD3イプシロンのN末端を利用するマウスの免疫
balb/c x c57黒交配の10週齢のF1マウスを、ヒト及び/又はサイミリ・シウレウスの成熟CD3イプシロン鎖の最もN末端アミノ酸1−27を持つCD3イプシロンFc融合タンパク質(1−27CD3−Fc)で免疫した。このために、マウスあたり300μlのPBS中の40μgの1−27CD3Fc融合タンパク質を、10nmolのチオアート修飾CpG−オリゴヌクレオチド(5’−tccatgacgttcctgatgct−3’)とともに腹腔内に注射した。マウスには、21日後、42日後、任意に63日後に追加免疫を同様に与えた。最初の追加免疫の10日後に、血液サンプルをとり、1−27CD3Fc融合タンパク質に対する抗体血清力価をELISAにより試験した。追加的に、CD3陽性ヒトT細胞株HPBallに対する力価も、標準プロトコルによりフローサイトメトリーで試験した。血清力価は、非免疫動物よりも免疫動物で著しく高かった。
最後の注射の3日後、マウスの脾臓細胞を、標準プロトコルによりトータルRNAの調製のために摘出した。
クローニングされたscFvレパートリーを持つファージライブラリーを、PEG8000/NaCl沈殿及び遠心分離によりそれぞれの培養上清から採取した。およそ1011から1012のscFvファージ粒子を、0.4mlのPBS/0.1%BSAに再懸濁し、105から107のJurkat細胞(CD3陽性ヒトT細胞株)と共に氷上で1時間ゆっくりと攪拌しながらインキュベートした。これらのJurkat細胞は、事前に、ウシ胎児血清(10%)、グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンを富化したRPMI培地中で生育し、遠心分離により採取し、PBSで洗浄して、PBS/1%FCS(アジ化ナトリウム含有)に再懸濁した。Jurkat細胞に特異的に結合しないscFvファージは、最大5回のPBS/1%FCS(アジ化ナトリウム含有)による洗浄工程により除去した。洗浄の後、細胞をHCl−グリシン pH2.2(10分間インキュベート、その後ボルテックス処理)に再懸濁して結合体を細胞から溶出し、2MのTris pH12で中和の後、溶出液を、新鮮な未感染大腸菌XL1 Blue培養液(OD600>0.5)の感染に使用した。ヒトscFv断片をコードする、ファージミドコピーによりうまくトランスフェクトされた大腸菌細胞を含む大腸菌培養液を、再びカルベニシリン耐性で選択し、次いでVCMS 13ヘルパーファージに感染させて、抗体ディスプレイ及びインビトロ選択の第2ラウンドを開始した。通常、4から5ラウンドの選択を実施した。
4から5ラウンドのパニングに相当するプラスミドDNAを、選択の後大腸菌培養液から単離した。可溶性scFvタンパク質の産生のため、VH−VL−DNA断片をプラスミドから切除した(Xhol−Spel)。これらの断片を、元々のpComb3H5BHisとは、発現コンストラクト(例えばscFv)がscFvとHis6−タグの間にFlagタグ(TGD YKDDDDK)を含む点で異なるプラスミドpComb3H5BFlag/His中で、同じ制限部位によりクローニングし、追加のファージタンパク質を排除した。ライゲーションの後、プラスミドDNAの各プール(異なるパニングのラウンド)を、100μlヒートショックコンピテント大腸菌TG1又はXL1−Blue中に形質転換し、カルベニシリンLBアガーに播種した。単一のコロニーを100μlのLB carb(50ug/ml)に選び入れた。
単離したscFvの結合を、真核細胞上でフローサイトメトリーにより試験したが、真核細胞は、その表面で、そのN末端でCD3イプシロンの最初の27N末端アミノ酸を提示する異種タンパク質を発現する。
マウス抗CD3scFvのVH領域を、ヒト抗体生殖細胞株アミノ酸配列に対して整列させた。非ヒトVHに最も近い相同性を有する、ヒト抗体生殖細胞株VH配列を選び、2つのアミノ酸配列の直接整列を実施した。ヒトVHフレームワーク領域とは異なる、非ヒトVHのフレームワーク残基が多くあった(「異なるフレームワーク位置」)。これらの残基のいくつかは、標的への抗体の結合及び活性に寄与しているかも知れない。
3.1 1−27CD−3Fcのクローニング及び発現
ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域並びに6ヒスチジンタグに融合したヒトCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸のコード配列は、標準プロトコルによる遺伝子合成により得た(組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号350及び349に記されている)。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位をまず含み、次いで19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド、次いでフレームを合わせて成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外部分の最初の27アミノ酸のコード配列、次いでフレームを合わせてヒトIgG1のヒンジ領域及びFcガンマ部分のコード配列、次いでフレームを合わせて6ヒスチジンタグのコード配列及び終止コドンを含むように設計した(図1)。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするcDNAの最初及び最後に制限部位を導入するようにも設計した。導入された制限部位、5’末端でのEcoRI及び3’末端でのSallは、以下のクローニング手順で利用する。遺伝子合成断片を、標準プロトコルに従い、EcoRI及びSallによりpEF−DHFRと称されるプラスミド中にクローニングした(pEF−DHFRは、Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、FreeStyle 293 Expression System(Invitrogen GmbH、カールスルーエ、ドイツ)でのトランスフェクションに使用した。3日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、ELISAアッセイで組換えコンストラクトの存在を試験した。ヤギ抗ヒトIgG、Fcガンマ断片特異性抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.ニューマーケット、サフォーク、英国から入手)をPBS中に希釈し5μg/mlとし、MaxiSorp 96ウェルELISAプレート(Nunc GmbH & Co.KG、ヴィースバーデン、ドイツ)にウェルあたり100μlで、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、0.05%Tween20を含むPBS(PBS/Tween)で洗浄し、室温(RT)で60分間PBS中3%BSA(ウシアルブミン、V分画、Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)でブロックした。その後、ウェルをPBS/Tweenで再び洗浄し、次いで60分間RTで細胞培養上清とともにインキュベートした。洗浄の後、ウェルを、1%BSAを含むPBSに1:500で希釈したペルオキシダーゼ結合抗His6抗体(Roche Diagnostics GmbH,Roche Applied Science、マンハイム、ドイツ)とともに60分間RTでインキュベートした。その後、ウェルを200μlのPBS/Tweenで洗浄し、100μlのSIGMAFAST OPD(SIGMAFAST OPD(o−フェニレンジアミンジヒドロクロライド)基質溶液(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)を、製造業者のプロトコルに従い加えた。100μlの1M H2SO4を加えて反応を停止した。呈色反応を、PowerWaveXマイクロプレート分光光度計(BioTek Instruments,Inc、ウィヌースキ、バーモント州、米国)で、490nmで測定し、620nmでのバックグラウンド吸収を差し引いた。図2に示されるとおり、ネガティブコントロールとして使用した模擬トランスフェクションHEK293細胞の無関係な上清に比べ、コンストラクトの存在がはっきりと検出できた。
1−27CD3−Fcへの、CD3イプシロンに特異的なペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物の結合を、ELISAアッセイで試験した。ヤギ抗ヒトIgG、Fc−ガンマ断片特異性抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.ニューマーケット、サフォーク、英国)をPBS中に希釈し5μg/mlとし、MaxiSorp 96ウェルELISAプレート(Nunc GmbH & Co.KG、ヴィースバーデン、ドイツ)にウェルあたり100μlで、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、0.05%Tween20を含むPBS(PBS/Tween)で洗浄し、RTで60分間PBS中3%BSA(ウシアルブミン、V分画、Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)でブロックした。その後、ウェルをPBS/Tweenで洗浄し、次いで60分間RTで1−27CD3−Fcコンストラクトを発現する細胞の上清とともにインキュベートした。ウェルを、PBS/Tweenで洗浄し、ペリプラズム発現した異種間特異性単鎖抗体の粗調製物とともに室温で60分間インキュベートした。PBS/Tweenで洗浄した後、ウェルを1%BSAを含むPBSに1:10000で希釈したペルオキシダーゼ結合抗Flag M2抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)とともに60分間RTでインキュベートした。その後、ウェルをPBS/Tweenで洗浄し、100μlのSIGMAFAST OPD(OPD(o−フェニレンジアミンジヒドロクロライド))基質溶液(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)とともに、製造業者のプロトコルに従いインキュベートした。100μlの1M H2SO4を加えて呈色反応を停止し、PowerWaveXマイクロプレート分光光度計(BioTek Instruments,Inc、ウィヌースキ、バーモント州、米国)で、490nmで測定し、620nmでのバックグラウンド吸収を差し引いた。マウス抗CD3単鎖抗体に比べ、1−27CD3−Fcコンストラクトへの、CD3イプシロンに特異的な異種間特異性ヒト単鎖抗体の強い結合を観察した(図3)。
4.1 1−27CD3−EpCAMのクローニング及び発現
異なる非チンパンジー霊長類(マーモセット、タマリン、リスザル)及びブタから、CD3イプシロンを単離した。Flagタグ付きカニクイザルEpCAMのN末端に融合した、成熟ヒト、コモンマーモセット(カリスリックス・ジャカス)、ワタボウシタマリン(サグイヌス・オイディプス)、コモンリスザル(サイミリ・シウレウス)及び家畜ブタ(サス・スクローファ、Sus Scrofa;ネガティブコントロールとして使用)のCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸のコード配列を、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号351から360に示されている。遺伝子合成断片は、第1に、標的発現ベクターにすでに存在する19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列と正しいリーディングフレームでの融合を可能にするBsrGI部位を含むように、次いで、フレームを合わせて成熟CD3イプシロン鎖の細胞外部分のN末端1−27アミノ酸のコード配列を、次いで、フレームを合わせてFlagタグのコード配列を、次いで、フレームを合わせて、成熟カニクイザルEpCAM膜貫通型融合タンパク質のコード配列を含むように設計した(図4)。遺伝子合成断片を、融合タンパク質をコードするcDNAの末端に制限部位を導入するように設計した。導入された制限部位、5’末端でのBsrGI及び3’末端でのSallを、以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片を、BsrGI及びSallにより、標準プロトコルに従い、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含む、pEF−DHFRと称されるプラスミドの誘導体中にクローニングした(pEF−DHFRは、Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)。
カニクイザルEpCAMに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルCD3イプシロン鎖の1−27N末端アミノ酸への、ペリプラズム発現した異種間特異性抗CD3単鎖抗体の粗調製物の結合を、標準プロトコルに従いFACSアッセイで試験した。その目的のため、2.5×105の細胞を、ペリプラズム発現した異種間特異性抗CD3単鎖抗体(上述のとおり、標準プロトコルに従い調製した)の粗調製物及びネガティブコントロールとしての単鎖マウス抗ヒトCD3抗体とともにインキュベートした。二次抗体として、Penta−His抗体(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)を、2%FCSを含む50μlPBS中で5μg/mlで使用した。抗体の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BD biosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。図6(AからE)に示されるとおり、カニクイザルEpCAMに融合した、それぞれヒト、マーモセット、タマリン及びリスザルのCD3イプシロンの1−27N末端アミノ酸からなる組換え膜貫通型タンパク質を発現するトランスフェクタントへの、単鎖抗体の結合が観察された。異種間特異性単鎖抗体の、ネガティブコントロールとして使用したカニクイザルEpCAMに融合したブタの1−27N末端CD3イプシロンからなる融合タンパク質への結合は全く見られなかった。抗CD3単鎖抗体の多霊長類異種間特異性が示された。抗Flag M2抗体と異種間特異性単鎖抗体で得られたシグナルは同等であり、異種間特異性単鎖抗体のCD3イプシロンのN末端アミノ酸1−27への強い結合活性を示している。
5.1 ヒト野生型CD3イプシロンのクローニング及び発現
ヒトCD3イプシロン鎖のコード配列は、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た(ヒトCD3イプシロン鎖のcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号362及び361に記す)。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位及びヒトCD3イプシロンをコードするcDNAの最初と最後に制限部位を含むように設計した。導入された制限部位、5’末端でのEcoRI及び3’末端でのSallを以下のクローニング手順で利用した。次いで、以下の標準プロトコルに従い、pEF NEOと称されるプラスミド中で、EcoRI及びSallにより、遺伝子合成断片をクローニングした。pEF NEOは、pEF−DHFR(Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025)から、従来の分子クローニングにより、DHFRのcDNAをネオマイシン耐性のcDNAに置換することにより誘導した。配列実証済みプラスミドを使用して、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%HEPES、1%ピルビン酸、1%非必須アミノ酸(全て、Biochrom AG、ベルリン、ドイツ)を補った安定化Lグルタミンを含むRPMI中で、37℃、湿度95%、CO27%で培養したマウスT細胞株EL4(ATCC No.TIB−39)にトランスフェクトした。トランスフェクションは、SuperFect Transfection Reagent(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)及び2μgのプラスミドDNAにより、製造業者のプロトコルに従って実施した。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、再び上述の細胞培養培地で、選択のために600μg/mlのG418(PAA Laboratories GmbH、パッシング、オーストリア)とともに培養した。トランスフェクションの16から20日後に、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7から14日後、標準プロトコルに従い、ヒトCD3イプシロンの発現に関して、FACS分析により細胞を試験した。2.5×105の細胞を、2%FCSを含むPBS中で5μg/mlで、抗ヒトCD3抗体UCHT−1(BD biosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)と共にインキュベートした。抗体の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BD biosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。トランスフェクトされたEL4細胞上での、ヒト野生型CD3イプシロンの発現が図7に示されている。
異種間特異性抗CD3単鎖抗体の結合を検出する改善された手段を提供するために、H2C HLP、A2J HLP及びE2M HLPを、マウスIgG1及びヒトラムダ定常部とともにIgG1抗体中に変換した。それぞれのIgG抗体の重鎖及び軽鎖をコードするcDNA配列は、標準プロトコルに従い、遺伝子合成により得た。各特異性の遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位を含むように、次いで、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチド(配列番号364及び363)を、次いで、フレームを合わせて、それぞれの重鎖可変領域又はそれぞれの軽鎖可変領域のコード配列を、次いで、フレームを合わせて、それぞれ、マウスIgG1の重鎖定常領域のコード配列(配列番号366及び365)又はヒトラムダ軽鎖定常領域のコード配列(配列番号368及び367)を含むように設計した。制限部位は、融合タンパク質をコードするcDNAの最初と最後に導入した。制限部位、5’末端でのEcoRI及び3’末端でのSallを以下のクローニング手順に利用した。遺伝子合成断片は、標準プロトコルに従い、EcoRI及びSallにより、重鎖コンストラクト用にpEF DHFR(Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025)と称されるプラスミド中に、軽鎖コンストラクト用にはpEF ADA(pEF ADAは、Raum et al., Cancer Immunol Immunother., 50(3), (2001), 141−150に記載されている)と称されるプラスミド中にクローニングした。配列実証済みプラスミドを、製造業者のプロトコルに従い、FreeStyle 293 Expression System(Invitrogen GmbH、カールスルーエ、ドイツ)中で、それぞれの軽鎖及び重鎖コンストラクトの同時導入に使用した。3日後、トランスフェクタントの細胞培養上清を採取し、アラニンスキャニング実験に使用した。
ヒトCD3イプシロン鎖をコードする27cDNA断片であって、ヒトCD3イプシロンの野生型配列の1つのコドンを、成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外領域のアミノ酸1−27の各アミノ酸のアラニン(GCC)をコードするコドンに置換した断片を、遺伝子合成により得た。置換したコドンの他は、cDNA断片は、上述のヒト野生型CD3cDNA断片と同一であった。各コンストラクト中で、上述のヒト野生型CD3cDNA断片に比べ、1つのコドンのみを置換した。制限部位、EcoRI及びSallを、野生型コンストラクトに比べて同一の部位でcDNA断片中に導入した。全てのアラニンスキャニングコンストラクトを、pEF NEO中にクローニングし、配列実証済みプラスミドを、EL4細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。その結果、発現したコンストラクトのパネルが得られ、ヒトCD3イプシロン鎖の第1アミノ酸、位置1でのグルタミン(Q、Gln)をアラニンに置換した。アラニンに置換された最後のアミノ酸は、成熟ヒト野生型CD3イプシロンの位置27でのスレオニン(T、Thr)である。グルタミン1からスレオニン27の間の各アミノ酸で、野生型アミノ酸をアラニンに置換した、それぞれのトランスフェクタントを生成した。
2)に記載されたキメラIgG抗体及びCD3イプシロンに特異的な異種間特異性単鎖抗体を、アラニンスキャニング実験で試験した。3)に記載されたヒトCD3イプシロンのアラニン変異体コンストラクトでトランスフェクトされたEL4細胞株への抗体の結合は、標準プロトコルに従い、FACSアッセイにより試験した。2.5×105のそれぞれのトランスフェクタントの細胞を、キメラIgG抗体を含む細胞培養上清50μl又はペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物50μlとともにインキュベートした。ペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物と共にインキュベートしたサンプルでは、抗Flag M2抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)を、二次抗体として、2%FCSを含む50μlPBS中で5μg/mlで使用した。キメラIgG抗体と共にインキュベートしたサンプルでは、二次抗体は必要なかった。全てのサンプルで、抗体分子の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BD biosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。ヒトCD3イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたEL4細胞株への、キメラIgG分子又は異種間特異性単鎖抗体の異なる結合が検出された。ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール又は関係ない特異性のペリプラズム発現した単鎖抗体の粗調製物をそれぞれ使用した。UCHT−1抗体を、ヒトCD3イプシロンのアラニン変異体の発現レベルのポジティブコントロールとして使用した。成熟CD3イプシロン鎖のアミノ酸、位置15でのチロシン、位置17でのバリン、位置19でのイソロイシン、位置24でのバリン又は位置26でのロイシンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたEL4細胞株は、非常に低い発現レベルのため(データ示さず)評価しなかった。異種間特異性単鎖抗体及びキメラIgGフォーマットの単鎖抗体の、ヒトCD3イプシロンのアラニン変異体によりトランスフェクトされたEL4細胞株への結合を、任意単位での相対結合と、全てのそれぞれの幾何平均蛍光サンプル値からそれぞれのネガティブコントロールの幾何平均蛍光値を引いた値とともに、図8A−8Dに示す。発現レベルの違いを補償するため、あるトランスフェクタントの全サンプル値を、それぞれのトランスフェクタントのUCHT−1抗体の幾何平均蛍光値で割った。ある特異性の野生型サンプル値の比較のため、それぞれの特異性の全サンプル値を、野生型サンプル値で最終的に割り、野生型サンプル値を結合の任意単位1に設定した。利用した計算は、以下の式に詳細に示される。
この式において、「サンプル値」は、図8Aから8Dに示される特定のアラニン変異体に対する特定の抗CD3抗体の結合の程度を示す任意単位の結合の値を意味し、「サンプル」は、特定のアラニンスキャニングトランスフェクタントにアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「ネガティブコントロール」は、特定のアラニン変異体にアッセイされたネガティブコントロールで得られた幾何平均蛍光値を意味し、UCHT−1は、特定のアラニン変異体にアッセイされたUCHT−1抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、「野生型」は、野生型トランスフェクタントでアッセイされた特定の抗CD3抗体で得られた幾何平均蛍光値を意味し、xはそれぞれのトランスフェクタントを明示し、yはそれぞれの抗CD3抗体を明示し、wtはそれぞれのトランスフェクタントが野生型であることを明示する。
6.1 N末端6ヒスチジンタグ(His6タグ)の付いたヒトCD3イプシロン鎖のクローニング及び発現
N末端His6タグの付いたヒトCD3イプシロン鎖をコードするcDNA断片を遺伝子合成により得た。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現のためのコザック部位、次いで、フレームを合わせて、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、His6タグのコード配列、次いで、フレームを合わせて、成熟ヒトCD3イプシロン鎖のコード配列を含むように設計した(コンストラクトのcDNA配列及びアミノ酸配列は、配列番号380及び379に記す)。遺伝子合成断片は、cDNAの最初及び最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位、5’末端でのEcoRI及び3’末端でのSallを、以下のクローニング手順で利用した。次いで、遺伝子合成断片を、EcoRI及びSallにより、標準プロトコルに従い、pEF−NEO(上述)と称されるプラスミド内にクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用して、ネズミT細胞株EL4にトランスフェクトした。トランスフェクション及びトランスフェクタントの選択は、上述のとおり実施した。細胞培養の34日後、トランスフェクタントを、以下に記載されるアッセイに使用した。
CD3イプシロンに特異的な結合特異性H2C HLPを持つ、キメラIgG抗体を、N末端His6タグの付いた、又は付いていないヒトCD3イプシロンへの結合に関して試験した。それぞれ、His6ヒトCD3イプシロン及び野生型ヒトCD3イプシロンによりトランスフェクトされたEL4細胞株への抗体の結合を、標準プロトコルに従いFACSアッセイにより試験した。2.5×105のトランスフェクタントの細胞を、キメラIgG抗体を含む細胞培養上清50μl又は2%FCSを含むPBS中の5μg/mlのそれぞれの対照抗体50μlとともにインキュベートした。ネガティブコントロールとして適当なアイソタイプコントロールを、又はコンストラクトの発現のポジティブコントロールとしてCD3特異性抗体UCHT−1をそれぞれ使用した。抗体の結合は、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BD biosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。野生型ヒトCD3イプシロンにトランスフェクトされたEL4細胞株に比べ、N末端His6タグの付いたヒトCD3イプシロンへの、結合特異性H2C HLPを持つキメラIgGの結合の明らかな低下が検出された。これらの結果は、CD3イプシロンのフリーのN末端が、ヒトCD3イプシロン鎖への、異種間特異性抗CD3結合特異性H2C HLPの結合に必須であることを示した(図9)。
7.1 表面プラズモン共鳴測定
ヒトCD3イプシロン鎖のN末端のアミノ酸1−27への、完全に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体EGFR−21−63 LH x H2C HLPの結合親和性を測定するため、ヒトIgG1のFc部に融合した成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27からなる組換え融合タンパク質(1−27CD3−Fc)で、表面プラズモン共鳴測定を実施した。このために、Biacore Carboxymethyl−Dextran CM5チップ(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)を、Biacore 2000(登録商標)システム(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)に取り付けた。1フローセルを、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩/N−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質1−27CD3−Fcの溶液をその後加えると、Biacoreチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存NHS活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルにより、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
ナイーブヒトCD3への結合強度に関して種間特異的二重特異性抗体分子の親和性を試験するため、追加の飽和FACS結合分析を実施した。選択した二重特異性抗体分子EGFR−21−63 LH x H2C HLPを使用し、1:1.5の係数及び出発濃度63.3μg/mlで希釈列を設定した。二重特異性抗体分子を、これらの異なる濃度で、それぞれ1.25×105のヒトPBMCとともに4℃で1時間インキュベートし、次いで、4℃でPBS中で2回洗浄した。結合した二重特異性抗体分子の検出は、Penta−His抗体(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)を、2%FCSを含む50μlPBS中で5μg/mlで使用して実施した。4℃で45分間インキュベーション及び2回の洗浄工程の後、Penta−His抗体の結合を、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異性(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。フローサイトメトリーは、FACS−Canto II装置で実施し、FACS Divaソフトウェアを利用して、データを取得し分析した(Becton Dickinson biosciences、ハイデルベルグ)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober,Wiley−lnterscience,2002)に記載のとおり実施した。取得した蛍光強度平均値を、使用した二重特異性抗体分子濃度の関数としてプロットし、生物数学ソフトウェアPrismにより、片側結合分析(双曲線)で分析した。ソフトウェアは、質量作用の法則に従う、リガンド(二重特異性抗体分子)のレセプター(CD3陽性PBMCサブフラクション)への結合を記載する、対応するKD値を計算した。基礎となる式は以下のとおりである:Y=Bmax x X/(Kd+X)、ここでBmaxは最大結合である。KDは、半最大結合に達するのに要するリガンドの濃度である。FACS染色は2連で実施し、R2値は0.95より高かった。
ヒトEGFRに陽性の細胞株、A431(表皮ガン細胞株、CRL−1555、アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、メリーランド州)を使用し、キットマニュアル(Qiagen RNeasy Mini Kit、ヒルデン、ドイツ)の説明書に従い単離されたトータルRNAを得た。得られたRNAを、ランダムプライムド逆転写によりcDNA合成に使用した。ヒトEGFR抗原の全長配列のクローニングには、以下のオリゴヌクレオチドを使用した:
5’EGFR AG Xbal 5’−GGTCTAGAGCATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGG−3’
3’EGFR AG Sall 5’−TTTTAAGTCGACTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT−3’
カニクイザルEGFRの細胞外ドメインのcDNA配列を、以下の反応条件を利用し、カニクイザル結腸cDNA(カタログ番号C1534090−Cy−BC;BioCat GmbH、ハイデルベルグ、ドイツから入手)への1組の2つのPCRにより得た:94℃で3分間で1サイクル、次いで94℃で1分間で35サイクル、53℃で1分間及び72℃で2分間、次いで72℃で3分間で停止サイクル。以下のプライマーを使用した:
1.フォワードプライマー;5’−CGCTCTGCCCGGCGAGTCGGGC−3’
リバースプライマー;5’−CCGTCTTCCTCCATCTCATAGC−3’
2.フォワードプライマー;5’−ACATCCGGAGGTGACAGATCACGGCTCGTGC−3’
リバースプライマー;5’−CAGGATATCCGAACGATGTGGCGCCTTCGC−3’
10.1 異種間特異性結合分子のクローニング
一般的に、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類EGFRに対して異種間特異的な結合特異性を有するドメインをそれぞれ含む、二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表1に記載のとおり設計した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現した。DHFR欠損CHO細胞での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537−566に記載されているとおり実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、MTXの最終濃度を20nMまで上昇させて誘導した。静置培養の2回の継代後、細胞を、ヌクレオシドを含まないHyQ PH CHO液体大豆培地により(4.0mMのL−グルタミン及び0.1%のプルロニックF−68、HyCloneを含む)回転瓶中で7日間生育してから、採取した。細胞を遠心分離により除去し、発現したタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。或いは、コンストラクトを、HEK293細胞中で一過性発現させた。トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従い、293fectin試薬(Invitrogen、12347−019番)により実施した。
工程1:6カラム容積の20%バッファB
工程2:6カラム容積の100%バッファB
成熟ヒトCD3イプシロン鎖のN末端のアミノ酸1−27への、霊長類EGFR及び霊長類CD3に異種間特異的な二重特異性単鎖抗体分子の結合親和性を測定するため、表面プラズモン共鳴測定を、ヒトIgG1のFc部に融合したヒトCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1−27からなる組換え融合タンパク質で実施した(1−27CD3−Fc)。このために、Biacore Carboxymethyl−Dextran CM5チップ(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)を、Biacore 2000(登録商標)システム(Biacore、ウプサラ、スウェーデン)に取り付けた。フローセルを、N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド塩酸塩/N−ヒドロキシスクシンイミド溶液で、標準プロトコルに従い活性化した。融合タンパク質1−27CD3−Fcの溶液をその後加えると、Boacoreチップのデキストラン層へのタンパク質の安定な共有結合が生じた。結合していないタンパク質を徹底的な洗浄により除去し、次いで、エタノールアミン溶液の添加により、未反応の残存NHS活性化カルボキシ基をブロックした。カップリングの前のシグナルに比べ、応答単位として測定されるより高いシグナルの検出により、タンパク質カップリングの成功を確認した。対照セルを、タンパク質溶液を加えずに上述のとおり調製した。
それぞれ、ヒト及びカニクイザルのEGFR及びCD3へ結合能に関して、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のため、実施例8に記載したヒトEGFRによりトランスフェクトされたCHO細胞及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB−ALL(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ACC483)を使用し、ヒト抗原への結合を試験した。カニクイザル抗原の結合反応性は、実施例9に記載された生成したカニクイザルEGFRトランスフェクタント及びマカクザルT細胞株4119LnPx(Fickenscher教授による提供に感謝、Hygiene Institute, Virology, Erlangen−Nuernberg;Knappe A, et al., and Fickenscher H.,Blood 2000,95,3256−61に発表)を使用して試験した。それぞれの細胞集団の20万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μlとともに氷上で30分間インキュベートした。或いは、一過的に産生したタンパク質の細胞培養上清を使用した。細胞をPBSで2回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウスPenta His抗体(Qiagen;2%FCSを含む50μlPBSで1:20に希釈)により検出した。洗浄の後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSに1:100で希釈された、フィコエリスリンに結合したFcガンマ特異性抗体(Dianova)により検出した。新鮮な培地をネガティブコントロールとして使用した。
生成した二重特異性単鎖抗体の生理活性を、実施例8及び9に記載されたEGFR陽性細胞株を利用して、インビトロ細胞障害アッセイにおいてクロム51(51Cr)の放出により分析した。エフェクター細胞として、刺激を受けたヒトCD8陽性T細胞又はマカクT細胞株4119LnPxをそれぞれ使用した。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、市販の抗CD3特異性抗体により、最終濃度1μg/mlで1時間37℃でプレコートした。未結合のタンパク質を、PBSでの1洗浄工程で除去した。新鮮なPBMCを、標準プロトコルに従い、Ficoll勾配遠心分離により末梢血(30〜50ml、ヒトの血液)から単離した。3〜5×107PBMCを、プレコートされたペトリ皿に、120mlのRPMI 1640/10% FCS/IL−2 20U/ml(Proleukin、Chiron)に加え、2日間刺激した。3日目に、細胞を回収し、RPMI 1640で1回洗浄した。IL−2を20 U/mlの最終濃度で加え、1日間再び培養した。CD4+T細胞及びCD56+NK細胞の除去により、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)を単離した。
ヒトMCSPのC末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメイン(アミノ酸1538〜2322)のコード配列を、標準プロトコルに従い遺伝子合成により得た(ヒトMCSP(ヒトD3と称される)のC末端の、膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインの発現のための組換えコンストラクトのcDNA配列及びアミノ酸配列は配列番号374及び373に記す)。遺伝子合成断片は、まず、コンストラクトの真核細胞発現を可能にするコザック部位、次いで、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列、次いで、フレームを合わせて、FLAGタグ、次いで、フレームを合わせて、クローニング目的のいくつかの制限部位を含み9アミノ酸人工リンカー(SRTRSGSQL)をコードする配列、次いで、フレームを合わせて、ヒトMCSPのC末端膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのコード配列及び終止コドンを含むように設計した。DNA断片の最初と最後に制限部位を導入した。制限部位、5’末端でのEcoRI及び3’末端でのSallを以下のクローニング手順で使用した。断片をEcoRI及びSallにより消化し、pEF−DHFR(pEF−DHFRはMack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021−7025に記載されている)に以下の標準プロトコルでクローニングした。配列実証済みプラスミドを使用し、CHO/dhfr−細胞(ATCC No.CRL9096)にトランスフェクトした。細胞を、10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(全て、Biochrom AG、ベルリン、ドイツから入手)及び細胞培養グレード試薬(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)のストック溶液から10μg/mlのアデノシン、10μg/mlのデオキシアデノシン及び10μg/mlのチミジンの最終濃度にヌクレオシドを補い安定化グルタミンを含むRPMI 1640中で、37℃、湿度95%、CO27%でインキュベーター中で培養した。トランスフェクションは、PolyFect Transfecton Reagent(Qiagen GmbH、ヒルデン、ドイツ)及び5μgのプラスミドDNAを製造業者のプロトコルに従い使用して実施した。24時間培養の後、細胞をPBSで1回洗浄し、安定化グルタミン及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640中で再び培養した。このように、細胞培地はヌクレオシドを含んでおらず、選択はトランスフェクトされた細胞に行われた。トランスフェクションのおよそ14日後、耐性細胞の増殖が観察された。さらに7から14日後、トランスフェクタントを、FACSによりコンストラクトの発現に関して試験した。2.5×105の細胞を、2%FCSを含むPBS中で5μg/mlに希釈された抗Flag M2抗体(Sigma−Aldrich Chemie GmbH、タウフキルヒェン、ドイツ)50μlとともにインキュベートした。抗体の結合を、2%FCSを含むPBS中に1:100で希釈されたR−フィコエリスリン結合アフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−ガンマ断片特異的(ImmunoResearch Europe Ltd.、ニューマーケット、サフォーク、英国)により検出した。サンプルを、FACSCalibur(BD biosciences、ハイデルベルグ、ドイツ)で測定した。
マカクザルMCSP(マカクD3と称される)C末端の膜貫通及び先端切断型細胞外ドメインのcDNA配列を、以下の反応条件により、マカクザル皮膚cDNA(カタログ番号C1534218−Cy−BC;BioCat GmbH、ハイデルベルグ、ドイツ)への1組の3つのPCRにより得た:94℃で3分間で1サイクル、40サイクルを94℃で0.5分間、52℃で0.5分間、そして72℃で1.75分間、72℃で3分間の停止サイクル。以下のプライマーを使用した:
フォワードプライマー:5’−GATCTGGTCTACACCATCGAGC−3’
リバースプライマー:5’−GGAGCTGCTGCTGGCTCAGTGAGG−3’
フォワードプライマー:5’−TTCCAGCTGAGCATGTCTGATGG−3’
リバースプライマー:5’−CGATCAGCATCTGGGCCCAGG−3’
フォワードプライマー:5’−GTGGAGCAGTTCACTCAGCAGGACC−3’
リバースプライマー:5’−GCCTTCACACCCAGTACTGGCC−3’
フォワードプライマー:5’−tcccgtacgagatctggatcccaattggatggcggactcgtgctgttctcacacagagg−3’
リバースプライマー:5’−agtgggtcgactcacacccagtactggccattcttaagggcaggg−3’
ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに異種間特異的な結合ドメイン並びにヒト及び非チンパンジー霊長類MCSPに異種間特異的な結合ドメインをそれぞれ含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表2に記載のとおり設計する。
工程1:6カラム容積の20%バッファB
工程2:6カラム容積の100%バッファB
それぞれヒト及びマカクザルMCSP D3及びCD3に結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能性を試験するため、FACS分析を実施した。この目的のため、ヒトMCSP D3でトランスフェクトされたCHO細胞(実施例14に記載のとおり)及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB−ALL(DSMZ、ブラウンシュヴァイク、ACC483)を使用して、ヒト抗原への結合を試験した。マカクザル抗原への結合反応性は、生成したマカクザルMCSP D3トランスフェクタント(実施例15に記載のとおり)及びマカクザルT細胞株4119LnPx(Fickenscher教授による提供に感謝、Hygiene Institute, Virology, Erlangen−Nuernberg;Knappe A, et al., and Fickenscher H.,Blood 2000,95,3256−61に発表)を使用して試験した。それぞれの細胞株の20万の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μl又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養上清とともに氷上で30分間インキュベートした。細胞を、2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、コンストラクトの結合を、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen,2%FCSを含む50μlPBSで1:20に希釈)により検出した。洗浄の後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSに1:100で希釈された、フィコエリスリンに結合したFcガンマ特異性抗体(Dianova)により検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合のネガティブコントロールとして使用した。無関係な標的特異性を持つ単鎖コンストラクトを、MCSP−D3にトランスフェクトされたCHO細胞への結合のネガティブコントロールとして使用した。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例14及び15で述べるMCSP D3陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、刺激されたヒトPBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いる。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio‐one GmbH,クレムスミュンスター)のコーティングを、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間行った。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCをあらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。標準的なプロトコルに従ってCD4+T細胞及びCD56+NK細胞を除去することにより、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLs)を濃縮した。
作製された二重特異性単鎖抗体のヒト血漿中での安定性を、50%ヒト血漿中、37℃及び4℃にて24時間の二重特異性単鎖抗体のインキュベーション、及びこれに続く生物活性の試験を行うことによって分析した。生物活性は、MCSP陽性CHO細胞株(実施例14又は15に従い、クローンとしてMCSPを発現)を標的として、刺激されたヒトCD8陽性T細胞をエフェクター細胞として用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。
従来のCD3結合分子による治療開始に続くB細胞非ホジキンリンパ腫(B‐NHL)の患者のT細胞再分布
従来のCD19×CD3結合分子は、二重特異性タンデムscFv型(bispecific tandem scFv format)のCD3結合分子である(Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6)、又は国際公開第99/54440号)。これは、(i)正常及び悪性ヒトB細胞の表面上のCD19、並びに(ii)ヒトT細胞上のCD3に指向される2つの異なる結合部分から成る。T細胞上のCD3をB細胞上のCD19と架橋させることにより、このコンストラクトは、T細胞の細胞障害活性によって正常及び悪性B細胞の再指向された溶解を誘発する。そのような従来のCD3結合分子によって認識されるCD3エピトープは、CD3イプシロン鎖上に局在化しており、そこでは、イプシロン鎖の残りの部分内に埋め込まれてCD3ガンマ鎖又はデルタ鎖のいずれかとのイプシロン鎖のヘテロ二量体化によって正しい位置に保持される場合は、正しいコンフォメーションしか取れない。この非常にコンテクスト依存性であるエピトープと従来のCD3結合分子(例えば、Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6)、又は国際公開第99/54440号を参照)との相互作用は、完全に一価の形態で架橋をまったく伴わずに発生する場合であっても、CD3のコンフォメーションにアロステリックな変化を誘発し、CD3イプシロンの細胞質ドメイン内に通常は隠れているプロリンリッチ領域の露出を引き起こし得る。一旦露出されると、このプロリンリッチ領域はシグナル伝達分子Nck2を動員することができ、この分子はさらなる細胞内シグナルを誘発する能力を有する。これは、T細胞表面上のいくつかのCD3分子の架橋、例えば、B細胞の表面上のいくつかのCD19分子によるT細胞上のいくつかのCD3分子と結合したいくつかの抗CD3分子の架橋、を必ず必要とする完全なT細胞活性化には不十分ではあるが、それでも、従来のCD3結合分子とそのCD3イプシロン上のコンテクスト依存性エピトープとの完全に一価である相互作用は、シグナル伝達という点でT細胞に対して不活性ではない。理論に束縛されるものではないが、一価の従来のCD3結合分子(本技術分野で公知である)は、CD3架橋のための循環する標的細胞が存在しない場合であっても、ヒトに注入されるとある程度のT細胞の反応を誘発する場合がある。一価の従来のCD19×CD3結合分子を、実質的に循環するCD19陽性B細胞を持たないB‐NHL患者へ静脈内注入した場合のこれに対する重要なT細胞の反応は、治療開始後のT細胞の再分布である。フェーズI臨床試験では、CD19×CD3結合分子の静脈内注入の開始フェーズの間に、循環するCD19陽性標的B細胞を持たないすべての個人にこのT細胞の反応が発生し、これは実質的にCD19×CD3結合分子の投与量に依存しないことが分かった(図23)。しかし、CD19×CD3結合分子への曝露の急な増加が、治療開始時におけるCD19×CD3結合分子へのT細胞の最初の曝露とほぼ同一のT細胞の再分布反応をこれらの患者に引き起こすことが分かり(図24A)、そしてCD19×CD3結合分子への曝露のゆるやかな増加でさえも循環するT細胞への再分布効果を持ち得る(図25)。さらに、循環する標的細胞の非存在下におけるこの実質的に投与量に依存しないT細胞の再分布反応は、CD19×CD3結合分子(例:国際公開第99/54440号に開示のもの)のような従来のCD3結合分子により、治療を受けた全個人のうちの100%で引き起こされるため、治療の開始と関連する有害なイベントに対する主たるリスク因子であることが分かった。
患者コホート15‐ランプ、15‐フラット、30‐ランプ、30‐フラット、及び60‐フラットでは、血液サンプル(6ml)は、CD19×CD3結合分子(国際公開第99/54440号に開示)の注入前、及び注入開始後0.75、2、6、12、24、30、48時間、さらには治療の第8、15、17、22、24、29、36、43、50、57日、並びに従来のCD19×CD3結合分子注入終了の4週間後に、EDTA含有Vacutainer(商標)チューブ(Becton Dickinson)を用いて採取し、4℃で分析へ送った。患者コホート15‐ステップでは、血液サンプル(6ml)は、CD19×CD3結合分子の注入前、及び注入開始後6、24、30、48時間、さらには治療の第8、15、22、29、36、43、50、57日、並びにCD19×CD3結合分子注入終了の4週間後に採取した。投与量レベル0.5、1.5、及び5μg/m2/24時間では、血液サンプル(6ml)は、CD19×CD3結合分子の注入前、及び注入開始後6、24、48時間、さらには治療の第8、15、22、29、36、43、50、57日、並びにCD19×CD3結合分子注入終了の4週間後に採取した。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のFACS分析は、血液サンプル採取後24乃至48時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、CoulterCounter(商標)(Coulter)上での分画血液分析(differential blood analysis)によって測定した。
PBMC(末梢血液単核細胞)の単離は、Ficoll(商標)勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめBiocoll(商標)溶液(Biochrom)3mlを充填した10mlのLeucosep(商標)チューブ(Greiner)へ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローター(swing‐out rotor)により、1700×g及び22℃で15分間、減速なしで行った。Biocoll(商標)層の上にあるPBMCを単離し、FACSバッファー(PBS/2% FBS[ウシ胎仔血清;Biochrom])で1回洗浄し、遠心分離し、FACSバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、800×g及び4℃で4分間行った。必要に応じて、単離したPBMCを3mlの赤血球溶解バッファー(8.29g NH4Cl、1.00g KHCO3、0.037g EDTA、ad 1.0l H2Obidest、pH7.5)中にて5分間室温でインキュベートし、続いてFACSバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
モノクローナル抗体をInvitrogen(1カタログ番号MHCD1301、2カタログ番号MHCD1401)、Dako(5カタログ番号C7224)、又はBecton Dickinson(3カタログ番号555516、4カタログ番号345766)より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。5×105‐1×106個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した:抗CD131/抗CD142(FITC)×抗CD563(PE)×抗CD34(PerCP)×抗CD195(APC)。細胞をV字型96ウェルマルチタイタープレート(Greiner)中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、FACSバッファーで希釈した特異的な抗体を含む全量100μl中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて4℃で30分間行った。続いて、FACSバッファーでサンプルを2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをFACSバッファー中へ再懸濁した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の1×104個の細胞を得た。プログラムCellQuest Pro(商標)(Becton Dickinson)を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、FACSによって測定された全リンパ球(すなわち、CD13/14染色によるいずれの骨髄系細胞も除いたBプラスTプラスNK細胞)に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、T細胞(CD3+、CD56−、CD13/14−)及びB細胞(CD19+、CD13/14−)の絶対細胞数を算出した。
*太字は、中央で確認されたチェソン基準(Cheson criteria)による完全寛解(CR)及び部分寛解(PR);MR、最小応答(≧25乃至<50%);SD、安定疾患;PD、進行性疾患;カッコ内は最初の応答の記録からの期間;+は進行中の応答を表す。
aコホート4は、3種類の異なる治療開始スケジュールの研究のために拡大した。
b8週間の治療後はPRであるが、治療を行わない7週間の間隔を空けた後、同一の投与量での4週間の追加の治療サイクル後にCRとなった。
n.e.:治療期間が7日未満のため評価不可。
n.d.:測定せず(浸潤していたが、治療の最後に第二の生検を実施せず)。
n.i.:治療開始時に浸潤していなかった。
標的抗原としてCD33を認識する本発明の二重特異性CD3結合分子は、カニクイザルの末梢血液から循環するCD33陽性単球を除去する。
CD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VL(アミノ酸配列:配列番号415)を、配列番号416のコードヌクレオチド配列を用いたCHO細胞内での発現によって産生させた。(i)コザック(Kozak)コンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むN末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び(ii)停止コドンが続くC末端His6タグのコード配列の両方を、配列番号416のヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFRのマルチクローニング部位へ挿入した(Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150)。DHFR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、CD3結合分子CD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLを培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェクタントの選択、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021‐7025)に従って実施した。カニクイザルの処理のための試験物質は、20リットルの発酵槽中で作製した。3回の作製工程の回収物からのタンパク質精製は、CD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLのC末端His6タグを標的とするIMACアフィニティクロマトグラフィ、及びこれに続く分取用分子ふるいクロマトグラフィ(SEC)に基づいて行った。最終的な内毒素を含まない試験物質の総収量は60mgであった。カニクイザルに使用するためのCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの分析用SECプロファイルより、この試験物質がほとんど単量体のみから構成されていることが分かった。この試験物質の効力は、カニクイザルCD33でトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として、マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた実施例23.5で述べる細胞障害性アッセイにより測定した(図29)。エフェクターT細胞による標的細胞溶解の最大半減に要するCD33‐AF5 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、2.7ng/mlであると測定された。
血液サンプル(1ml)は、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの連続注入前、及び注入開始後0.75、2、6、12、24、30、48、72時間、並びに7及び14日間の処理の後(及び、120μg/m2/24時間の投与量レベルでは9日間の処理の後)に、EDTA含有Vacutainer(商標)チューブ(Becton Dickinson)を用いて採取し、4℃で分析へ送った。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のFACS分析は、血液サンプル採取後24乃至48時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、通常の獣医学研究室にて分画血液分析によって測定した。
PBMC(末梢血液単核細胞)の単離は、Ficoll(商標)勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめBiocoll(商標)溶液(Biochrom)1mlを充填した5mlのFalcon(商標)チューブへ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローターにより、1700×g及び22℃で15分間、減速なしで行った。Biocoll(商標)層の上にあるPBMCを単離し、FACSバッファー(PBS/2% FBS[ウシ胎仔血清;Biochrom])で1回洗浄し、遠心分離し、FACSバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、800×g及び4℃で4分間行った。必要に応じて、単離したPBMCを3mlの赤血球溶解バッファー(8.29g NH4Cl、1.00g KHCO3、0.037g EDTA、ad 1.0l H2Obidest、pH7.5)中にて5分間室温でインキュベートし、続いてFACSバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
カニクイザル抗原と反応性を持つモノクローナル抗体をBecton Dickinson(1カタログ番号345784、2カタログ番号556647、3カタログ番号552851、6カタログ番号557710)、Beckman Coulter(4カタログ番号IM2470)、及びMiltenyi(5カタログ番号130‐091‐732)より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。5×105‐1×106個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した:抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)、及び抗CD141(FITC)×抗CD335(PE)×抗CD166(Alexa Fluor 647(商標))。細胞をV字型96ウェルマルチタイタープレート(Greiner)中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、FACSバッファーで希釈した特異的な抗体を含む全量100μl中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて4℃で30分間行った。続いて、FACSバッファーでサンプルを2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをFACSバッファー中へ再懸濁した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の1×104個の細胞を得た。プログラムCellQuest Pro(商標)(Becton Dickinson)を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、FACSによって測定された全リンパ球(すなわち、CD14染色による骨髄系細胞を除いたBプラスTプラスNK細胞)に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、T細胞(CD3+、CD56−、CD14−)の絶対細胞数を算出した。CD33陽性単球の絶対数は、分画血液分析からの単球数を、FACSによって測定された全単球(CD14+)に対するCD33陽性単球(CD33+、CD14+)の対応する比と掛け合わせることによって算出した。
本発明の代表的な種間特異的CD3結合分子による処理の開始に続くカニクイザルにおけるT細胞再分布の低減
MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VL(アミノ酸配列:配列番号313)を、配列番号314のコードヌクレオチド配列を用いたCHO細胞内での発現によって産生させた。(i)コザックコンセンサス配列内に埋め込まれた開始コドンを含むN末端免疫グロブリン重鎖リーダーのコード配列、及び(ii)停止コドンが続くC末端His6タグのコード配列の両方を、配列番号314のヌクレオチド配列へフレームを揃えて結合し、その後、遺伝子合成によって得られたこのDNA断片を発現ベクターpEF‐DHFRのマルチクローニング部位へ挿入した(Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150)。DHFR欠失CHO細胞の安定なトランスフェクション、CD3結合分子MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLを培養物の上清中へ分泌するDHFR陽性トランスフェクタントの選択、及び発現レベルを高めるためのメトトレキサートによる遺伝子増幅は記述(Mack et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021‐7025)に従って実施した。カニクイザルの処理のための試験物質は、200リットルの発酵槽中で作製した。回収物からのタンパク質精製は、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLのC末端His6タグを標的とするIMACアフィニティクロマトグラフィ、及びこれに続く分取用分子ふるいクロマトグラフィ(SEC)に基づいて行った。最終的な内毒素を含まない試験物質の総収量は40mgであった。この試験物質は、70%の単量体、30%の二量体、及び少量混入したこれより高い多量体から構成されていた。この試験物質の効力は、カニクイザルMCSPでトランスフェクトされたCHO細胞を標的細胞として、マカクT細胞株4119LnPxをエフェクター細胞源として用いた実施例18で述べる細胞障害性アッセイにより測定した(図31)。エフェクターT細胞による標的細胞溶解の最大半減に要するMCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの濃度(EC50)は、1.9ng/mlであると測定された。
血液サンプル(1ml)は、MCSP‐G4 VH‐VL×I2C VH‐VLの連続注入前、及び注入開始後0.75、2、6、12、24、30、48、72時間、並びに7日間の処理の後に、EDTA含有Vacutainer(商標)チューブ(Becton Dickinson)を用いて採取し、4℃で分析へ送った。作業上の理由からこれらの時間点が僅かに変更される場合もあった。リンパ球亜集団のFACS分析は、血液サンプル採取後24乃至48時間以内に実施した。血液サンプル中の白血球亜集団の絶対数は、通常の獣医学研究室にて分画血液分析によって測定した。
PBMC(末梢血液単核細胞)の単離は、Ficoll(商標)勾配分離プロトコルを適合させることで実施した。あらかじめBiocoll(商標)溶液(Biochrom)1mlを充填した5mlのFalcon(商標)チューブへ血液を室温で移した。遠心分離は、スイングアウトローターにより、1700×g及び22℃で15分間、減速なしで行った。Biocoll(商標)層の上にあるPBMCを単離し、FACSバッファー(PBS/2% FBS[ウシ胎仔血清;Biochrom])で1回洗浄し、遠心分離し、FACSバッファー中へ再懸濁した。すべての洗浄工程における遠心分離は、スイングアウトローターにより、800×g及び4℃で4分間行った。必要に応じて、単離したPBMCを3mlの赤血球溶解バッファー(8.29g NH4Cl、1.00g KHCO3、0.037g EDTA、ad 1.0l H2Obidest、pH7.5)中にて5分間室温でインキュベートし、続いてFACSバッファーで洗浄することにより赤血球の溶解を行った。
カニクイザル抗原との反応性を持つモノクローナル抗体をBecton Dickinson(1カタログ番号345784、2カタログ番号556647、3カタログ番号552851)、及びBeckman Coulter(4カタログ番号IM2470)より入手し、製造元の推奨事項に従って使用した。5×105‐1×106個の細胞を以下の抗体の組み合わせによって染色した:抗CD141(FITC)×抗CD562(PE)×抗CD33(PerCP)×抗CD194(APC)。細胞をV字型96ウェルマルチタイタープレート(Greiner)中でペレット化し、上清を除去した。細胞のペレットを、FACSバッファーで希釈した特異的抗体を含む全量100μl中に再懸濁した。インキュベーションを暗所にて4℃で30分間行った。続いて、FACSバッファーでサンプルを2回洗浄し、フローサイトメトリー分析のために細胞ペレットをFACSバッファー中へ再懸濁した。
4色BD FACSCalibur(商標)(Becton Dickinson)を用いてデータの収集を行った。各測定について、同定されたリンパ球亜集団の1×104個の細胞を得た。プログラムCellQuest Pro(商標)(Becton Dickinson)を用いて統計的解析を実施することにより、リンパ球亜集団のパーセントを得ると共に、細胞表面分子の発現強度を分類した。続いて、FACSによって測定された全リンパ球(すなわち、CD14染色による骨髄系細胞を除いたBプラスTプラスNK細胞)に対する単一のリンパ球のサブセットのパーセントを分画血液分析からのリンパ球数と相関させることにより、T細胞(CD3+、CD56−、CD14−)の絶対細胞数を算出した。
23.1 ヒトCD33を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号NM_001772)で公開されているヒトCD33のコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位(Kozak site)を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトCD33タンパク質のコード配列を、続いてフレームを揃えてセリングリシンジペプチドのコード配列、ヒスチジン6‐タグ、及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号525及び526に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
マカクCD33のcDNA配列は、標準的なプロトコルに従って調製したマカクザル骨髄からのcDNAに3回のPCRをセットで施すことによって得た。以下の反応条件:94℃で3分間の1サイクル、続いて94℃で1分間、53℃で1分間、及び72℃で2分間の35サイクル、続いて72℃で3分間の最終サイクル、を用い、並びに以下のプライマー:
3.フォワードプライマー:5’‐gaggaattcaccatgccgctgctgctactgctgcccctgctgtgggcaggggccctggctatgg‐3’
リバースプライマー:5’‐gatttgtaactgtatttggtacttcc‐3’
4.フォワードプライマー:5’‐attccgcctccttggggatcc‐3’
リバースプライマー:5’‐gcataggagacattgagctggatgg‐3’
5.フォワードプライマー:5’‐gcaccaacctgacctgtcagg‐3’
リバースプライマー:5’‐agtgggtcgactcactgggtcctgacctctgagtattcg‐3’
を用いた。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CD33に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性抗体分子を、以下の表6に挙げるように設計した。
二重特異性抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させる。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ヒト及びマカクCD33並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例23.1で述べるようにヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例23.2で述べる作製されたマカクCD33トランスフェクタント、及びマカクPBMC(マカクPBMCの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のFicoll勾配遠心分離によって行った)を用いて試験した。PBMCのそれぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(5μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性抗体の生物活性を、実施例23.1及び23.2で述べるCD33陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
ペトリ皿(直径85mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む50mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
24.1 ヒトCAIXを発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号NM_001216)で公開されているヒトCAIXのコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むヒトCAIXタンパク質のコード配列を含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号604及び605に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはXbaI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
GenBank(受託番号XM_001088481)で公開されているマカクCAIXのコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むマカクCAIXタンパク質のコード配列を含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号606及び607に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはXbaI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CAIXに対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表7に挙げるように設計した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ヒト及びマカクCAIX並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例24.1で述べるようにヒトCAIXでトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例24.2で述べる作製されたマカクCAIXトランスフェクタント、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuernberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、又は種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清と共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを、CAIXでトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例24.1及び24.2で述べるCAIX陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、刺激されたヒトPBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。CD4+T細胞及びCD56+NK細胞を標準的なプロトコルに従って除去することにより、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLs)を濃縮した。
EpCAM特異的二重特異性抗体の構築
EpCAM特異的二重特異性抗体の構築のための基礎は、完全ヒトEpCAM特異的抗体HD69とした(Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50: 141以降)。VH及びVLは、標準的な方法に従ってHD69 DNAからPCR増幅した。VH及びVLは、標準的なプロトコルに従って順にプラスミドへクローン化され、それによって機能的scFv(配向 VH‐リンカー‐VL)を形成した。このscFvコンストラクトは、次に、二重特異性抗体フォーマットへの機能的なクローン化に有用であるN末端BsrG1及びC末端BspE1制限部位を導入するプライマーを用いてPCR増幅した(5’‐HD69‐BsrG1:5’‐gacaggtgtacactccgaggtgcagctgctcgagtctgg‐3’;3’‐HD69‐BspE1:5’‐tgatagtccggatttgatctccagcttggtcc‐3’)。次にこのPCR生成物を、ヒト及びマカクCD3に対して種間特異的であるCD3特異的VH及びVLの組み合わせを各々が1つ含む3種類の適切な発現ベクターへクローン化し(それぞれ、H2C HL、F12Q HL、及びI2C)、それによって、3種類の機能的二重特異性コンストラクト、HD69 HL×H2C HL、HD69 HL×F12Q HL、及びHD69 HL×I2C HLがコードされた。続いてこれらのコンストラクトを、標準的な手順に従い安定なトランスフェクションのためにエレクトロポレーションによってDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトし、結果として各々が3種類の二重特異性産物のうちの1つを発現するプールである3種類のトランスフェクトされた細胞のプールを得た。
26.1 ヒトEGFRvIIIでトランスフェクトされたCHO細胞の作製及び発現
細胞外ドメインの267個のアミノ酸が欠失した変異上皮成長因子受容体(デルタEGFR、de2‐7EGFR、又はEGFRvIIIは同義で用いる)のC末端、膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列(Kuan CT, Wikstrand CJ, Bigner DD: EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy; Endocr Relat Cancer. 2001 Jun;8(2):83‐96)を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて24アミノ酸リーダーペプチドのコード配列を、続いてフレームを揃えてヒトC末端細胞外ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメインのコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、DNA断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。クローン化の目的のために、XbaI及びSalI制限酵素認識部位を、それぞれ5’末端及び3’末端に付加した。合成遺伝子DNAは続いてXbaI及びSalIによって消化され、適切に消化された発現ベクターpEF‐DHFRへ連結され、大腸菌へ形質転換される。確認されたヌクレオチド配列を有するクローン(組換えコンストラクトのcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号599及び598に挙げる)を、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は上記で述べるようにして実施した。
実施例26.1と同様に、カニクイザルEGFRvIII変異体を、細胞外ドメインの267個のアミノ酸の欠失及び融合部位への新規なアミノ酸グリシンの挿入(アミノ酸番号6)によって作製した。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて24アミノ酸リーダーペプチドのコード配列を、続いてフレームを揃えてカニクイザルC末端細胞外ドメイン、膜貫通及び細胞質ドメイン(いずれもヒト)のコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、DNA断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位、5’末端のXbaI及び3’末端のSalIは、以下のクローン化の手順に利用した。標準的なプロトコルに従い、断片をXbaI/SalIで消化し、pEF‐DHFRへクローン化した。配列が確認されているプラスミドを用いてCHO/dhfr−細胞(ATCC No.CRL9096;いずれもBiochrom AG,ベルリン,ドイツから入手した10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、及びSigma‐Aldrich Chemie GmbH,タウフキルヘン(Taufkirchen),ドイツから入手した細胞培養グレード試薬のストック液からのヌクレオシドを補充して最終濃度を10μg/mlアデノシン、10μg/mlデオキシアデノシン、及び10μg/mlチミジンとした、Biochrom AG,ベルリン,ドイツから入手した安定化グルタミンを含むRPMI1640中、インキュベーター内で37℃、湿度95%、及び7%CO2にて培養)をトランスフェクトした。トランスフェクションは、PolyFectトランスフェクション試薬(Qiagen GmbH,ヒルデン,ドイツ)及び5μgのプラスミドDNAを用い、製造元のプロトコルに従って実施した。24時間の培養後、細胞をPBSで1回洗浄し、ヌクレオシド及び透析FCS(Biochrom AG,ベルリン,ドイツより入手)を補充しないこと以外は前述と同様の細胞培地で再度培養した。従って、細胞培地はヌクレオシドを含有せず、それによって選別はトランスフェクトされた細胞に適用された。トランスフェクションからおよそ14日の後、耐性細胞の成長が観察された。さらに7乃至14日後、トランスフェクタントはFACSの試験によりコンストラクトの発現について陽性を示した。
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3抗原に対して結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類EGFRvIII抗原に対して結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表9に挙げるように設計した。
27.1 ヒト及びマカク膜結合型IgEのクローン化及び発現
ラムダ軽鎖を合成、分泌する自然重鎖欠損変異骨髄腫細胞株であるマウス細胞株J558L(Interlab Project, Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro,ジェノバ,イタリア、より入手、ECACC 88032902)を用い、ヒト及びマカクIgEのそれぞれの膜結合型重鎖変異体で補完した。そのようなコンストラクトを作製するために、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって合成分子を得た(コンストラクトのヌクレオチド配列を配列番号595及び594に挙げる)。これらのコンストラクトでは、ヒト及びマカクCD3イプシロン鎖に対するコード配列が、それぞれIgEのヒト膜貫通領域と融合していた。VH鎖の組み込まれた特異性は、ハプテン(4‐ヒドロキシ‐3‐ニトロ‐フェニル)アセチル)(NP)に対して指向されている。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び免疫グロブリンリーダー、及びDNAの最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にEcoRI及び3’末端にSalIであり、pEF‐DHFRと称する発現プラスミドへのクローン化工程に利用した。配列の確認後(マカク:XM_001116734 アカゲザル(macaca mulatta)IgイプシロンC領域、mRNA;ヒト:NC_000014 ヒト(Homo sapiens)第14番染色体、全配列、National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)、このプラスミドを用いて上述のようにしてCHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施する。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発する。
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3抗原に対して結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類IgE抗原に対して結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表10に挙げるように設計した。
28.1 ヒトCD44を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号AJ251595)で公開されているヒトCD44のコード配列で、CD44v6エクソンも含むものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてヒトCD44タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号608及び609に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載された)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
GenBank(受託番号AJ251595)で公開されているヒトCD44のコード配列で、v6エクソンをコードする配列が欠失したものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてv6エクソンを持たないヒトCD44タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号610及び611に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
GenBank(受託番号XM_001115359)で公開されているマカクCD44のコード配列で、CD44v6エクソンも含むものを、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号612及び613に挙げる)。用いたコンストラクトにおいて、コード配列は、CD44タンパク質のシグナルペプチドの5番目のアミノ酸のコドンの第1位での点変異以外はマカクCD44に対応しており、その結果、ヒト配列に対応するアルギニンからトリプトファンへの変異が得られる。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、次に、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへクローン化した。このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、上述のようにCHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CD44v6に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表11に挙げるように設計する。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ヒト及びマカクCD44並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例28.1で述べるようにヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例28.3で述べる作製されたマカクCD44トランスフェクタント、及びマカクPBMC(マカクPBMCの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のFicoll勾配遠心分離によって行った)を用いて試験した。CD44のv6エクソンに対する特異性は、実施例28.2で述べるようにして作製されたv6エクソンを持たないヒトCD44を発現するトランスフェクトされたCHO細胞を用いて試験した。それぞれの細胞株又はマカクPBMCの200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(5μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、又は市販の抗CD44抗体(Becton Dickinson biosciences,ハイデルベルク;同じく5μg/ml)の50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。市販の抗CD44抗体と共にインキュベートしたサンプルについては抗His抗体を省略した。洗浄後、結合した抗His抗体又は抗CD44抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。2%FCSを含むPBSをネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例28.1で述べるCD44陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMCを用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
29.1 ヒトCD30を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号M83554)で公開されているヒトCD30のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトCD30タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1103及び1104に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。内部制限部位を遺伝子合成断片のコード配列のサイレント変異によって除去した(BsrGI:ヌクレオチド243 TからCへ;SalI:ヌクレオチド327 AからGへ;SalI:ヌクレオチド852 AからGへ;EcoRI:ヌクレオチド1248 TからCへ)。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
マカクCD30のcDNA配列を、標準的なプロトコルに従って調製したマカクザル骨髄からのcDNAに4回のPCRをセットで施すことによって得た。以下の反応条件:94℃で2分間の1サイクル、続いて94℃で1分間、55℃で1分間、及び72℃で1分間の35サイクル、続いて72℃で3分間の最終サイクル、を用い、並びに以下のプライマー:
6.フォワードプライマー:5’‐cctcgccgcgctgggactgc‐3’
リバースプライマー:5’‐ggtgccactggagggttccttgc‐3’
7.フォワードプライマー:5’‐gcttcttccattctgtctgcccagcagg‐3’
リバースプライマー:5’‐ggtaggggacacagcgggcacaggagttgg‐3’
8.フォワードプライマー:5’‐cctggcatgatctgtgccacatcagcc‐3’
リバースプライマー:5’‐gcgttgagctcctcctgggtctgg‐3’
9.フォワードプライマー:5’‐cctcccrgcccaagctagagcttgtgg‐3’
リバースプライマー:5’‐cgactctagagcggccgctcactttccagaggcagctgtgggcaaggggtcttctttcccttcc‐3’
を用いた。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及び非チンパンジー霊長類CD30に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表12に挙げるように設計した。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ヒト及びマカクCD30並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例29.1で述べるようにヒトCD30でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD30陽性B細胞株MEC‐1(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC497)、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例29.2で述べる作製されたマカクCD30トランスフェクタント、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuernberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(5μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウスPenta His抗体(Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。2%FCSを含むPBSをネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例29.2で述べたヒトCD30陽性B細胞株MEC‐1(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC497)及びマカクCD30でトランスフェクトされたCHO細胞を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxをそれぞれ用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio‐one GmbH,クレムスミュンスター)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
30.1 ヒトHER2を発現するCHO細胞の作製
GenBank(受託番号X03363)で公開されているヒトHER2のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、そのリーダーペプチドを含むヒトHER2タンパク質のコード配列が含まれるように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1107及び1108に挙げる)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはXbaI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
上述のヒトHER2のコード配列を、GenBank(受託番号XP_001090430)で公開されているようにマカクHER2タンパク質のアミノ酸123乃至1038をコードするように修飾した。このキメラタンパク質に対するコード配列は、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1109及び1110に挙げる)。遺伝子合成断片は、コンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位、及び断片の最初と最後に制限部位を含むようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはXbaI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、XbaI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへクローン化した。このプラスミドの配列が確認されたクローンを用いて、上述のようにCHO/dhfr−細胞をトランスフェクトした。
種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクHER2に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表13に挙げるように設計する。
二重特異性単鎖抗体分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させる。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−80℃で保存した。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施した。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ヒト及びマカクHER2並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例30.1で述べるようにヒトHER2でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験する。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例30.2で述べる作製されたマカクHER2トランスフェクタント、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuernberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクト(2μg/ml)の精製タンパク質50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。2%FCSを含むPBSを、T細胞株並びにHER2でトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例30.1及び30.2で述べるHER2陽性B細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、それぞれの図に示すように、刺激されていないヒトCD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。CD56+NK細胞の除去は標準的なプロトコルに従って実施した。
31.1 単離されたN末端アミノ酸1‐27に対応するコンテクスト非依存性ヒトCD3イプシロンエピトープを提示するアフィニティカラムの作製
上述のヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域と融合したヒトCD3イプシロン鎖の1‐27N末端アミノ酸から成るコンストラクト1‐27CD3‐Fc(実施例3;組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号350及び349に挙げる)の発現のためのプラスミドを、このコンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。融合タンパク質の単離のために、ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質との交差反応が最小限である市販のアフィニティ精製ヤギ抗ヒトIgGfc断片特異的抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)を用いて、ヤギ抗ヒトfcアフィニティカラムを標準的なプロトコルに従って調製した。このアフィニティカラムを用いて、Akta Explorer System(GE アマーシャム)上にて細胞培養物の上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸で溶離した。溶離液を中和し、濃縮した。アミンを含まないカップリングバッファーに対する透析の後、精製された融合タンパク質を、N‐ヒドロキシスクシンイミドNHS活性化1ml HiTrapカラム(GE アマーシャム)へカップリングさせた。
種間特異的二重特異性単鎖分子を発現する細胞の細胞培養物の上清200mlに0.2μmの滅菌ろ過を施し、Akta Explorer System(GE アマーシャム)を用いてCD3ペプチドアフィニティカラムへ適用した。
32.1 薬物動態アッセイに用いる1‐27CD3‐Fcの作製
ヒト免疫グロブリンIgG1のヒンジ及びFcガンマ領域と融合したヒトCD3イプシロン鎖の1‐27N末端アミノ酸のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た(組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号1111及び1112に挙げる)。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて成熟ヒトCD3イプシロン鎖の細胞外部分の最初の27個のアミノ酸のコード配列を、続いてフレームを揃えてヒトIgG1のヒンジ領域及びFcガンマ部分のコード配列、並びに停止コドンを含むように設計した。遺伝子合成断片は、この融合タンパク質をコードするcDNAの最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。融合タンパク質の単離のために、ウシ、ウマ、及びマウス血清タンパク質との交差反応が最小限である市販のアフィニティ精製ヤギ抗ヒトIgGfc断片特異的抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)を用いて、ヤギ抗ヒトfcアフィニティカラムを標準的なプロトコルに従って調製した。このアフィニティカラムを用いて、Akta Explorer System(GE アマーシャム)上にて細胞培養物の上清から融合タンパク質を単離し、クエン酸で溶離した。溶離液を中和し、濃縮した。
このアッセイは、Sektor Imagerデバイス(MSD)上で測定するカーボンプレート上のルテニウム標識検出を用いるECL‐ELISA法に基づくものである。第一の工程では、カーボンプレート(MSD High Bind Plate 96ウェル Cat:L15xB‐3)を、50ng/mlの実施例32.1で述べる精製した1‐27CD3‐Fcにより5μl/ウェルでコーティングした。次に、プレートを25℃で一晩乾燥した。続いて、PBS中の5%BSA(Paesel&Lorei #100568)150μl/ウェルにより、25℃で1時間、攪拌しながら(700rpm)インキュベーター中にてプレートをブロックした。次の工程では、PBS中の0.05%Tweenによりプレートを3回洗浄した。PBS中50%のマカク血清中での検量線を、このアッセイで検出すべきそれぞれの種間特異的二重特異性単鎖分子100ng/mlから始めて段階的な1:4希釈によって作成した。品質管理(QC)サンプルを、PBS中50%のマカク血清中にて、予想されるサンプル血清濃度に応じて、それぞれの種間特異的二重特異性単鎖分子の1ng/mlから50ng/mlまでの範囲で調製した。スタンダード、QC、又は未知サンプルを10μl/ウェルでカーボンプレートへ移し、25℃で90分間、振とうしながら(700rpm)インキュベーター中でインキュベートした。続いてPBS中の0.05%Tweenによりプレートを3回洗浄した。検出には、25μl/ウェルのペンタ‐His‐ビオチン抗体(Qiagen、PBS中の0.05%Tween中200μg/ml)を添加し、25℃で1時間、振とうしながら(700rpm)インキュベーター中でインキュベートした。第二の検出工程では、ストレプトアビジン‐スルホタグ溶液(Streptavidin‐SulfoTag solution)(MSD;Cat:R32AD‐1;Lot:W0010903)を添加し、25℃で1時間、振とうしながら(700rpm)インキュベーター中でインキュベートした。続いてPBS中の0.05%Tweenによりプレートを3回洗浄した。最後に、150μl/ウェルのMSD Reading Buffer(MSD、Cat:R9ZC‐1)を添加し、プレートをSektor Imagerデバイスで読み取った。
33.1 1‐27CD3‐EpCAMのクローン化及び発現
種々の非チンパンジー霊長類(マーモセット、タマリン、リスザル)及びブタからCD3イプシロンを単離した。ヒト成体、コモンマーモセット(Callithrix jacchus)、ワタボウシタマリン(Saguinus oedipus)、コモンリスザル(Saimiri sciureus)、及び家畜ブタ(Sus scrofa;ネガティブコントロールとして用いた)のCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1‐27がFlagタグカニクイザルEpCAMのN末端へ融合したもののコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た(組換え融合タンパク質のcDNA配列及びアミノ酸配列を配列番号351乃至360に挙げる)。遺伝子合成断片は、標的発現ベクターに既に存在する19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列との正しいリーディングフレーム内での融合を可能とするためのBsrGI部位をまず含み、続いてフレームを揃えて成熟CD3イプシロン鎖の細胞外部分のN末端1‐27アミノ酸のコード配列を、続いてフレームを揃えてFlagタグのコード配列を、続いてフレームを揃えて成熟カニクイザルEpCAM膜貫通タンパク質のコード配列を含むように設計した。遺伝子合成断片は、融合タンパク質をコードするcDNAの最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはBsrGI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、次にBsrGI及びSalIを介して、19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドのコード配列をすでに含んでいるpEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドの誘導体へ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。配列が確認されたプラスミドを用いて、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞をトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
種間特異的単鎖抗CD3抗体の結合の検出法を改良するために、I2C VHVL特異性を、マウスIgG1及びマウスカッパ定常領域を有するIgG1抗体へ転換する。IgG抗体の重鎖をコードするcDNA配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて19アミノ酸免疫グロブリンリーダーペプチドを、続いてフレームを揃えて重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のコード配列を、続いてフレームを揃えてGenBank(受託番号AB097849)で公開されているマウスIgG1の重鎖定常領域のコード配列又はGenBank(受託番号D14630)で公開されているマウスカッパ軽鎖定常領域のコード配列をそれぞれ含むように設計した。
実施例33.1で述べるカニクイザルEp‐CAMに融合したヒト、マーモセット、タマリン、及びリスザルのCD3イプシロン鎖のN末端アミノ酸1‐27のそれぞれに対する作製したI2C IgG1コンストラクトの結合を、標準的なプロトコルに従ってFACSアッセイで試験した。この目的のために、2.5×105個の細胞を、実施例33.2で述べるI2C IgG1コンストラクトを含む細胞培養物の上清50μl共に数多くインキュベートした。抗体の結合は、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc‐ガンマ断片特異的、を2%FCSを含むPBS中1:100に希釈したもの(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,ニューマーケット,サフォーク,英国)で検出した。フローサイトメトリーはFACS‐Calibur装置上で実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(Becton Dickinson biosciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
CD3イプシロンに特異的である実施例33.2で述べる結合特異性I2Cを持つキメラIgG1抗体を、N末端His6タグを持つ及び持たないヒトCD3イプシロンに対する結合について試験した。実施例6.1で述べるHis6‐ヒトCD3イプシロンで、及び実施例5.1で述べる野生型ヒトCD3イプシロンでそれぞれトランスフェクトされたEL4細胞株に対する抗体の結合を、FACSアッセイにより標準的なプロトコルに従って試験した。トランスフェクタントの2.5×105個の細胞を、I2C IgG1コンストラクトを含む細胞培養物の上清50μl共に、又は2%FCSを含むPBS中5μg/mlのそれぞれのコントロール抗体50μlと共にインキュベートした。ネガティブコントロールとしては適切なアイソタイプコントロールを、コンストラクトの発現に対するポジティブコントロールとしてはCD3特異的抗体UCHT‐1をそれぞれ用いた。His6タグの検出は、ペンタHis抗体(Qiagen)で行った。抗体の結合は、R‐フィコエリトリンと結合したアフィニティ精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc‐ガンマ断片特異的、を2%FCSを含むPBS中1:100に希釈したもの(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.,ニューマーケット,サフォーク,英国)で検出した。フローサイトメトリーはFACS‐Calibur装置上で実施し、CellQuestソフトウェアを用いてデータの取得及び解析を行った(Becton Dickinson biosciences,ハイデルベルク)。FACS染色及び蛍光強度の測定は、Current Protocols in Immunology(Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley‐Interscience, 2002)に記載のようにして実施した。
ヒト抗体生殖系列VH配列VH3 3‐72(http://vbase.mrc‐cpe.cam.ac.uk/)を、CDRH1(配列番号1486)、CDRH2(配列番号1487)、及びCDRH3(配列番号1488)に対するフレームワークコンテクストとして選択した。同様に、ヒト抗体生殖系列VH配列VH3 3‐73(http://vbase.mrc‐cpe.cam.ac.uk/)を、CDRH1(配列番号1492)、CDRH2(配列番号1493)、及びCDRH3(配列番号1494)に対するフレームワークコンテクストとして選択した。各々のヒトVHについて、およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間でオーバーラップするいくつかの縮重オリゴヌクレオチドを合成する必要があった。このために、第二のプライマーはすべてアンチセンスプライマーであった。VH3 3‐72に対しては以下のオリゴヌクレオチドを用いた:
5’VH72‐A‐XhoI
GAAGTGAAGCTTCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCCMTGARACTCTCTTGTGCTGCT
3’VH72‐B
CTGGCGGACCCAGTCCATCCAGGCATCACTAAAAGTGAATCCAGAAGCAGCACAAGAGAG
5’VH72‐C
GACTGGGTCCGCCAGKCTCCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAGAAACAAAGCCAAT
3’VH72‐D
TTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCATCATAATATGTTGCATGATTATTGGCTTTGTTTCT
5’VH72‐E
AGAGATGATTCCAAAARTAGMSTGTACCTGCAAATGAWMAGCTTAARARCTGAAGACACTGSCSTTTATTACTGTACTGGG
3’VH72‐F‐BstEII
GACCGTGGTGACCAGAGTCCCCTGGCCCCAGTTAGCAAACTCCCCAGTACAGTAATA
5’VH73‐A‐XhoI
CAAGTTCAGCTGCTCGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGAGGATCC
3’VH73‐B
CCAGTTCATCCAGTAGTTACTGAAAGTGAATCCAGAGGCARCACAGGAGAGTTTCAKGGATCCTCCAGGTTG
5’VH73‐C
TACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGKCTYCAGRGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGSTGAAATTAGATTGAAATCTAAT
3’VH73‐D
TTTGGAATCATCTCTTGAGATGGTGAACCTCCCTTTCACAGACTCCGCATAATGTGTTGCATAATTATTAGATTTCAATCT
5’VH73‐E
AGAGATGATTCCAAAARTASTGYCTACCTGCAAATGAACARCTTAARARCTGAAGACACTGSCRTTTATTACTGTACGGGA
3’VH73‐F‐BstEII
GACCGTGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAGTAAGCAAATTGTCCCACTCCCGTACAGTAATA
各セット内では、同量のプライマー(例:20μlPCR反応に対して1μlの各プライマー(プライマーストック20乃至100μM))を混合し、PCRバッファー、ヌクレオチド、及びTaqポリメラーゼから成るPCR混合物へ添加した。この混合物をPCRサイクラー中にて94℃で3分間、65℃で1分間、62℃で1分間、59℃で1分間、56℃で1分間、52℃で1分間、50℃で1分間、及び72℃で10分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って200乃至400のサイズの生成物をゲルから単離した。
5’Vk2A18‐A‐SacI
CCTGATGAGCTCGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGYCTGTCASTCYTGGASAKCMAGCTTCCATCTCTTGC
3’Vk2A18‐B
CCAATATAAATAGGTGTTTCCATTGTTGTGTACCAGGTTCTGACTAGATCTGCAAGAGATGGAAGC
5’Vk2A18‐C
ACCTATTTATATTGGTWCCTGCAGAAGYCAGGCCAGTCTCCAMAGCTCCTGATTTATAGGGCTTCCATC
3’Vk2A18‐D
CTTGAGTGTGAAATCTGTCYCTGATCCACTGCCACTGAACCTGTCTGGGACCCCAGAAAATCGGATGGAAGCCCTATA
5’Vk2A18‐E
ACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATSTGGGAGTTTATTWCTGCTTTCAAGGTACACAT
3’Vk2A18‐F‐BsiWI/SpeI
CCCGATACTAGTCGTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTTGACCGAACGTCCACGGAACATGTGTACCTTGAAAGCA
5’Vlam7a‐A‐SacI
CCTGCAGAGCTCGTTGTGACTCAGGAAYCTKCACTCACCRYATCACCTGGTGRAACAGTCACACTCACTTGT
3’Vlam7a‐B
CCAGTTGGCATAGTTACTTGTTGTAACAGCCCCAGTACTTGAGCGACAAGTGAGTGTGACTGT
5’Vlam7a‐C
AACTATGCCAACTGGKTCCAASAAAAACCAGRTCAKKYAYYCMSTGSTCTAATAKRTGGTACCAACAACCGA
3’Vlam7a‐D
GGTGAGGGCAGCCTTGYCTCCAAKCAGGGAGCCTGAGAATCTGGCAGGARYMCMTGGTGCTCGGTTGTTGGTACC
5’Vlam7a‐E
AAGGCTGCCCTCACCMTCWCAGGGGYACAGMCTGAGGATGAGGCARWATATTWCTGTGCTCTATGGTACAGC
3’Vlam7a‐F‐BsiWI/SpeI
CCAGTAACTAGTCGTACGTAGGACAGTCAGTTTGGTTCCTCCACCGAACACCCAATGGTTGCTGTACCATAGAGCACA
各セット内では、同量のプライマー(例:20μlPCR反応に対して1μlの各プライマー(プライマーストック20乃至100μM))を混合し、PCRバッファー、ヌクレオチド、及びTaqポリメラーゼから成るPCR混合物へ添加した。この混合物をPCRサイクラー中にて94℃で3分間、65℃で1分間、62℃で1分間、59℃で1分間、56℃で1分間、52℃で1分間、50℃で1分間、及び72℃で10分間インキュベートした。続いて生成物をアガロースゲル電気泳動に掛け、標準的な方法に従って200乃至400のサイズの生成物をゲルから単離した。
軽鎖断片(SacI‐SpeIで消化)450ngをファージミドpComb3H5Bhis(SacI‐SpeIで消化;長断片)1400ngとライゲートさせた。次に、得られたコンビナトリアル抗体ライブラリーを、300μlのエレクトロコンピテント大腸菌XL1 Blue細胞へエレクトロポレーションによって形質転換し(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25μFD、200オーム、Biorad gene‐pulser)、独立したクローンが107を超えるライブラリーサイズを得た。1時間の表現型の発現の後、pComb3H5Bhisベクターによってコードされたカルベニシリン耐性に対して陽性である形質転換体を100mlの液体スーパーブロス(SB)培地中で一晩選別した。次に、細胞を遠心分離によって回収し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミドの調製を行った。
GenBank(受託番号J05581)で公開されているヒトMUC‐1のコード配列を、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いてヒトMUC‐1タンパク質のコード配列及び停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を配列番号1498及び1499に挙げる)。この遺伝子合成断片には、GenBankに受託されているバージョンでは1回分しか含まれないMUC‐1の内部反復配列(ヌクレオチド382から441)が16回分含まれており、生理的に発現されるMUC‐1の複数の反復を反映している。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。内部XmaI制限部位を遺伝子合成断片中のコード配列のサイレント変異によって除去した(ヌクレオチド441 CからTへ;これは第一の反復の最後のヌクレオチドであり、従って続く15の反復配列において全く同様に変異された;並びに、ヌクレオチド2160 GからCへ)。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。
scFvsのMuc‐1に対する結合を、Muc‐1でトランスフェクトされたCHO細胞上でのフローサイトメトリーで試験し;ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないCHO細胞を用いた。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
ペトリ皿(直径145mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃で1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
36.1 CD33及びCD3種間特異的二重特異性単鎖分子の作製
全般的には、ヒト及びマカクCD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクCD33に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表14に挙げるように設計した。
ヒト及びマカクCD33並びにCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施する。この目的のために、実施例23.1で述べるようにヒトCD33でトランスフェクトされたCHO細胞、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、実施例23.2で述べる作製されたマカクCD33トランスフェクタント、及びマカクPBMC(マカクPBMCの調製は、標準的なプロトコルに従い、マカクザルからの末梢血液のFicoll勾配遠心分離によって行った)を用いて試験した。それぞれの細胞株又はPBMCの200000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清をネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例23.1及び23.2で述べるCD33陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、又はマカクT細胞株4119LnPxを用いた。
雄のチンパンジー一匹に、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクト(Schlereth (2005) Cancer Res 65: 2882)の静脈内注入による用量増加試験を施した。従来の単鎖CD19/CD3二重特異性抗体コンストラクト(Loffler (2000, Blood, Volume 95, Number 6)、又は国際公開第99/54440号)と同様に、該EpCAM/CD3コンストラクトのCD3アームも、従来のヒト及びチンパンジーCD3のコンテクスト依存性エピトープに対して指向されている。第0日には、この動物は試験物質を含まない50mlのPBS/5%HSAを受け、続いて、PBS/5%HSAプラス1.6、2.0、3.0、及び4.5μg/kg単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトの50mlをそれぞれ第7、14、21、及び28日に受けた。注入時間は各投与につき2時間とした。各週の注入では、チンパンジーを2乃至3mg/kgのTelazolの筋肉内投与によって鎮静化させ、挿管し、平均血圧が安定したイソフルラン/O2による麻酔状態とした。第二の静脈内カテーテルを逆側の肢に配置し、循環する血液細胞のFACS分析のために図62に示す時間点で(ヘパリン処理)全血サンプルを採取した。標準的な赤血球溶解の後、チンパンジーCD2(Becton Dickinson)と反応するFITC標識抗体でT細胞を染色し、全リンパ球に対するT細胞のパーセントをフローサイトメトリーで測定した。図62に示すように、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトの投与すべてにおいて循環するT細胞の急激な低下が誘発されており、これは、実質的に循環する標的B(リンパ腫)細胞を持たないB‐NHL患者内において単鎖CD19/CD3二重特異性抗体コンストラクトで観察されたものと同様であった。ヒト及びチンパンジーの循環血液中にはEpCAM‐陽性標的細胞が存在しないことから、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトへの曝露による循環するT細胞の低下は、標的細胞を介しての架橋の非存在下でのコンストラクトのCD3アームと従来のコンテクスト依存性CD3エピトープとの純粋な相互作用を通してT細胞が受けるシグナルのみに起因し得る。実質的に循環する標的B(リンパ腫)細胞を持たないB‐NHL患者において単鎖CD19/CD3二重特異性抗体コンストラクトへの曝露を通して誘発されるT細胞の再分布と同様に、単鎖EpCAM/CD3二重特異性抗体コンストラクトへの曝露によるチンパンジーでのT細胞の再分布は、コンテクスト依存性CD3エピトープへの結合イベントに続くCD3のコンフォメーションの変化、そしてさらにその結果としての一時的な血管内皮へのT細胞の接着性の上昇によって説明することができる(実施例20参照)。この発見により、コンテクスト依存性CD3エピトープへ指向された従来のCD3結合分子は、この相互作用のみを通して、末梢血液T細胞の再分布パターン引き起こすことができ、このことが実施例20で述べるようにヒトのCNS有害イベントのリスクと関連していることが確認される。
38.1 大腸菌XL1 Blue内でのscFvコンストラクトの細菌発現
前述のように、VL及びVHセグメントを含むpComb3H5Bhis/Flagで形質転換された大腸菌XL1 Blueは、遺伝子III断片の切除及び1mM IPTGによる誘発の後、十分な量の可溶性scFvを産生する。scFv鎖は周辺質へ放出され、そこで機能的コンフォメーションへフォールドする。
i)国際公開第2004/106380号に記載の、ScFvs 4‐10、3‐106、3‐114、3‐148、4‐48、3‐190、及び3‐271
ii)本明細書で述べる、ヒト抗CD3イプシロン結合クローンH2C、F12Q、及びI2CからのScFvs
ELISA実験を、96ウェルプラスチックプレート(Nunc,maxisorb)のウェルへヒトCD3イプシロン(aa 1‐27)‐Fc融合タンパク質を通常は4℃にて一晩コーティングすることによって行った。次に抗原コーティング溶液を除去し、ウェルをPBS/0.05%Tween20で1回洗浄し、続いてPBS/3%BSAで少なくとも1時間ブロックした。ブロッキング溶液の除去後、PPP及びコントロール溶液をウェルに添加し、室温にて通常は1時間インキュベートした。次にウェルをPBS/0.05%Tween20で3回洗浄した。固定化抗原に結合したscFvsの検出は、ビオチン標識抗FLAGタグ抗体(M2抗Flag‐Bio,Sigma、通常は最終濃度1μg/ml PBS)を用いて行い、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(Dianova、1μg/ml PBS)で検出した。ABTS基質溶液を添加することでシグナルを発色させ、405nmの波長で測定した。ブロッキング剤及び/又はヒトCD3イプシロン(aa 1‐27)‐Fc融合タンパク質のヒトIgG1部分に対する試験サンプルの非特異的結合は、ヒトIgG1(Sigma)でコーティングしたELISAプレート上にて同一の試薬及び同一のタイミングによる同一のアッセイを実施することによって分析した。ネガティブコントロールとしてPBSを用いた。
39.1 種間特異的結合分子のクローン化
全般的には、ヒト及びマカクCD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにヒト及びマカクCD44に対して種間特異的である結合特異性を持つドメインを各々が含む二重特異性単鎖抗体分子を、以下の表15に挙げるように設計する。
二重特異性コンストラクトは、DHFR欠失CHO細胞中で一過性に発現させた。簡潔に述べると、コンストラクトあたり4×105個の細胞を、10%ウシ胎仔血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、及び細胞培養グレード試薬のストック液からのヌクレオシド(Sigma‐Aldrich Chemie GmbH,タウフキルヘン,ドイツ)を補充して最終濃度を10μg/mlアデノシン、10μg/mlデオキシアデノシン、及び10μg/mlチミジンとした安定化グルタミンを含む3mlのRPMI1640全培地(all medium)中、インキュベーター内で37℃、湿度95%、及び7%CO2にてトランスフェクションの一日前に培養した。トランスフェクションは、Fugene HDトランスフェクション試薬(Roche,#04709691001)を用いて製造元のプロトコルに従って行った。94μlのOptiMEM培地(Invitrogen)及び6μlのFugene HDを混合し、室温で5分間インキュベートした。続いて、コンストラクトあたり1.5μgのDNAを添加し、混合し、室温で15分間インキュベートした。その間、DHFR欠失CHO細胞を1×PBSで洗浄し、1.5mlのRPMI1640全培地に再懸濁した。トランスフェクション混合物を600μlのRPMI1640全培地で希釈し、細胞へ添加し、37℃、湿度95%、及び7%CO2にて一晩インキュベートした。トランスフェクションの翌日、各手法のインキュベーション容量をRPMI1640全培地5mlへ拡張した。3日間のインキュベーションの後、上清を回収した。
ヒト及びマカクCD44並びにCD3のそれぞれへ結合する能力に関して種間特異的二重特異性抗体コンストラクトの機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、ヒトCD44でトランスフェクトされたCHO細胞(実施例28.1で述べるように)、及びヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)を用いてヒト抗原への結合について試験した。マカク抗原に対する結合反応性は、作製されたマカクCD44トランスフェクタント(実施例28.3で述べる)、及びマカクT細胞株4119LnPx(Prof.Fickenscher, Hygiene Institute, Virology, Erlangen‐Nuernberg、よりご提供頂いた;Knappe A, et al., and Fickenscher H., Blood 2000, 95, 3256‐61、にて発表)を用いて試験した。種間特異的二重特異性抗体コンストラクトのCD44に対する特異性を示すために、ヒトCD44delv6(v6エクソンを欠失させたCD44)に対する結合を、ヒトCD44delv6(作製法は実施例28.2で述べる)でトランスフェクトしたCHO細胞を用いて試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞上清50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。2%FCSを含むPBSで細胞を2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)でコンストラクトの結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。トランスフェクトされていないCHO細胞の上清を、T細胞株への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。関連性のない標的特異性を有する単鎖コンストラクトを、CD44及びCD44delv6でトランスフェクトされたCHO細胞への結合に対するネガティブコントロールとして用いた。
作製された二重特異性単鎖抗体の生物活性を、実施例28.1で述べるヒトCD44陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。それぞれの図に示すように、エフェクター細胞としては、刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMC、刺激されたヒトPBMCを用いた。
ペトリ皿(直径145mm、Greiner bio‐one GmbH,クレムスミュンスター)のコーティングは、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃にて1時間行った。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む120mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。標準的なプロトコルに従ってCD4+T細胞及びCD56+NK細胞を除去することにより、CD8+細胞障害性Tリンパ球(CTLs)を濃縮した。
40.1 HCVエンベロープ糖タンパク質E2(HCV遺伝子型1a及び1b)を発現するCHO細胞の作製
C型肝炎ウイルス(HCV)エンベロープ糖タンパク質E2(HCV遺伝子型1a及び1b、それぞれのサブタイプのHCV単離物;標準的なプロトコルに従って配列を決定)のコード配列を、各々ヒトCD4膜貫通及び細胞内ドメインとの翻訳融合タンパク質として、標準的なプロトコルに従う遺伝子合成によって得た。遺伝子合成断片は、まずコンストラクトの真核生物発現のためのコザック部位を含み、続いて14アミノ酸シグナルペプチドのコード配列を、続いてHCV E2エンベロープ糖タンパク質の最初の278個(遺伝子型1a)又は279個(遺伝子型1b)のアミノ酸のコード配列、2倍のmycエピトープ配列、及び成熟タンパク質の372乃至433のアミノ酸に対応するヒトCD4膜貫通及び細胞内ドメインのコード配列(GenBank受託番号M12807で公開)、並びに停止コドンを含むように設計した(コンストラクトのcDNA及びアミノ酸配列を、それぞれ遺伝子型1a及び1bである配列番号HCV‐1乃至HCV‐4に挙げた)。遺伝子合成断片は、断片の最初と最後に制限部位が導入されるようにも設計した。導入された制限部位は、5’末端にはEcoRI及び3’末端にはSalIであり、以下のクローン化の手順に利用した。遺伝子合成断片は、EcoRI及びSalIを介して、pEF‐DHFR(pEF‐DHFRについては、Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141‐150、に記載されている)と称するプラスミドへ標準的なプロトコルに従ってクローン化した。前記の手順は標準的なプロトコルに従って実施した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001))。配列が確認されたヌクレオチド配列を有するクローンを、コンストラクトの真核生物発現のためにDHFR欠失CHO細胞へトランスフェクトした。DHFR欠失CHO細胞中での真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、メトトレキサート(MTX)の濃度を最大20nM MTXまでの最終濃度へ上昇させることによって誘発した。最終的に、表面に発現されたHCV E2ドメイン遺伝子型1aを有するCHO細胞株、及び表面に発現されたHCV E2ドメイン遺伝子型1bを有するCHO細胞株、の2種類の細胞株が作製された。
全般的には、ヒト及びマカクCD3イプシロンに対して種間特異的である結合特異性を持つドメイン、並びにHCVに対しての結合特異性を持つドメインを含む二重特異性タンデム単鎖抗体断片を、以下の表16に挙げるように設計した。
二重特異性タンデム単鎖抗体断片は、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)中で発現させた。DHFR欠失CHO細胞中の真核生物タンパク質発現は、Kaufmann R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537‐566、の記載に従って実施した。コンストラクトの遺伝子増幅は、20nM MTXの最終濃度まで増加する濃度のMTXを添加することによって誘発した。2継代の静置培養後、ヌクレオシドを含まないHyQ PF CHO液体大豆培地(0.1% Pluronic F‐68含有L‐グルタミン 4.0mMを含む;HyClone)により、ローラーボトル中、回収まで7日間細胞を増殖させた。細胞を遠心分離で除去し、発現されたタンパク質を含む上清を−20℃で保存した。別の選択肢として、コンストラクトを一過性にHEK293細胞中で発現させた。トランスフェクションは、293fectin試薬(Invitrogen,#12347‐019)を用い、製造元のプロトコルに従って実施する。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入した。
HCV抗原並びにヒト及びマカクCD3のそれぞれに結合する能力に関して種間特異的二重特異性タンデム単鎖抗体断片の機能を試験するために、FACS分析を実施した。この目的のために、実施例40.1で述べる2種類の異なるHCV遺伝子型(1a及び1b)からのHCV抗原E2でトランスフェクトされたCHO細胞、ヒトCD3陽性T細胞白血病細胞株HPB‐ALL(DSMZ,ブラウンシュバイク,ACC483)、及びマカクT細胞株4119LnPxを用いてそれぞれの抗原への結合について試験した。それぞれの細胞株の200,000個の細胞を、種間特異的二重特異性抗体コンストラクトを発現するトランスフェクトされた細胞の細胞培養物の上清50μlと共に、30分間氷上にてインキュベートした。細胞を2%FCSを含むPBSで2回洗浄し、マウス抗His抗体(Penta His抗体;Qiagen;2%FCSを含むPBS50μl中にて1:20に希釈)で二重特異性タンデム単鎖抗体断片の結合を検出した。洗浄後、結合した抗His抗体を、2%FCSを含むPBSで1:100に希釈したフィコエリトリンに結合したFcガンマ特異的抗体(Dianova)で検出した。
二重特異性タンデム単鎖抗体断片の生物活性を、実施例40.1で述べるHCV抗原陽性細胞株を用いるクロム51(51Cr)放出インビトロ細胞障害性アッセイによって分析した。エフェクター細胞としては、異なるドナー2人から採取した刺激されたヒトCD4/CD56除去PBMCを用いた。
41.1 B型肝炎ウイルス(HBV)
およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、CDRH1(配列番号1634)、CDRH2(配列番号1635)、及びCDRH3(配列番号1636)に対するヒトVH配列コンテクストを得た:
5’C8‐VH‐A‐XhoI
CCACTTCTCGAGTCTGGCGSCGRASTGMWGMAGCCTGGCGSCTCCSTGMRGSTGTCCTGCRMGGCCTCCGGC
3’C8‐VH‐B
CCCTGGAGCCTGCCGCACCCAGGACATGGCGTAGCCGGWGAAGGTGWAGCCGGAGGCCKYGCAGGA
5’C8‐VH‐C
CGGCAGGCTCCAGGGMAGGGACTGGAATGGRTGRGCTCCATCTCCGGCTCCGGCGGCTCCACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGG
3’C8‐VH‐D
CTTGGCGCAGTAGTACASGGCGGTGTCCTCGGMCCGCAGGGAGYTCAKCTSCAKGTACASGGTGYTCKTGGAGKTGTCCCGGSTSATTGTGAMCCGGCCCTTCACGGA
3’C8‐VH‐E‐BstEII
GACCGTGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTTGCCCAGAGGGAAGTAGTAGATGGAGGAGCCGTAGTATTCCTGCCGGCCAGGAGGCTTGGCGCAGTAGTA
5’C8‐Vl‐A‐SacI
CCTCAAGAGCTCGCCCTGAYGCAGCCTSCCTCCGTGTCCGTGKCCCYTGGCMAGACCGCCMGCATCACCTGCGGCGGCAAC
3’C8‐Vl‐B
CAGCACAGGGGMCTGTCCTGGCTTCTGCTGATACCAGTGCACGGACTTGGAGCCGATGTTGTTGCCGCCGCAGGTGAT
5’C8‐Vl‐C
CAGAAGCCAGGACAGKCCCCTGTGCTGGTCRTATACGACGACTCCGACCGCCCTTCCGGCATCCCTGAGCGGTTCTCCGGCTCC
3’C8‐Vl‐D
GACCTGGCAGTAGTAGTCGGCCTCGTCCMYGGCCTSCRCCCSGGAGATGGTCAGGGTGRCGGTGKTGCCGGAGYTGGAGCCGGAGAACCG
3’C8‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI
CCCGATACTAGTCGTACGCAGCACGGTCAGCTTTGTTCCGCCGCCAAACACCACCAGGTCGGAGGAGGAGTCCCAGACCTGGCAGTAGTAGTCGGC
5’C9‐VH‐A‐XhoI
CCACTTCTCGAGTCTGGGGSAGRGGTGRWGMAGCCTGGGRSGTCCSTGARASTCTCCTGTGCAGCCTCTGGA
3’C9‐VH‐B
CCACTCCAGCCCCTKGCCTGGAGCCTGGCGGACCCAGTGTATGCCATAATTACTGAAGGTGWATCCAGAGGCTGCACAGGA
5’C9‐VH‐C
GCTCCAGGCMAGGGGCTGGAGTGGRTGGSACTTATATCATATGATGGAAATAAGAAATTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGA
3’C9‐VH‐D
GTAATATACAGCCGTGTCCTCAGRTCTCAGGCTGCTCAKTTSCAKATMCACCGTGYTCKTAGAAGTGTCTCTGGTSATGGYGAMTCGGCCCTTCACGGAGTC
3’C9‐VH‐E‐BstEII
GACCGTGGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAATTCCCCCCAGTACAAGGCAATACCCCCAGATTTCGCACAGTAATATACAGCCGTGTC
5’C9‐Vl‐A‐SacI
CCTCAAGAGCTCGWACTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGYGGCCCCAGGACAGAMGGYCAYGATTTCCTGTGGGGGAAAC
3’C9‐Vl‐B
GCCTGGCWKCTGCTGATACCAGTGCACGGTTGTACTTCCAATGTTGTTTCCCCCACAGGAAAT
5’C9‐Vl‐C
TGGTATCAGCAGMWGCCAGGCMMGGCCCCTRWGCTGSTCRTCTATGATGATAACGAGCGACCCTCAGGGATCCCTGASCGATTCTCTGGCTCC
3’C9‐Vl‐D
CACTTGACAATAATAGTCGGCCTCATCCCCGGYTTSGASCCYGKTGATGSYCAGGGTGGCCGAGGTCCCAGASTTGGAGCCAGAGAATCG
3’C9‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI
CCCGATACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTTCGTCCCTCCGCCGAATACCACATGATCACTACCACTATCCCACACTTGACAATAATAGTC
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入する。
ペトリ皿(直径85mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃で1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む50mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
およそ15乃至20ヌクレオチドの末端区間で互いにオーバーラップし、第二のプライマーがすべてアンチセンスプライマーである以下の縮重オリゴヌクレオチドを用いて、CDRH1(配列番号1652)、CDRH2(配列番号1653)、及びCDRH3(配列番号1654)に対するヒトVH配列コンテクストを得る:
5’HC1‐VH‐A‐XhoI
CAGCTACTCGAGTSGGGCGSAGGACTGKTGMAGCCTKSGGRGTCCCTGAGWCTCTCCTGCGCTG
3’HC1‐VH‐B
CCACTCCAGCCCCTTCCCAGGGGMCTGGCGGAYCCAGGTCCAGAAGTAACCACTWAAGGTAMMACCAKAGRCAGCGCAGGAGAGWCTCAGGGAC
5’HC1‐VH‐C
CTGGGAAGGGGCTGGAGTGGRTTRGTGAAAGCAATTATAGTGGAAGTACCAGGTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAKTCACCATATCA
3’HC1‐VH‐D
ATACAGCCGTGTCCKCGGCTSTCASAGAAYTCAKCTKCAGGKAGARCKKGTTCTKGGAGKTGTCTMYTGATATGGTGAMTCGACTCTTG
5’HC1‐VH‐E
AGCCGMGGACACGGCTGTATATTACTGTGCGAGAGGTTGGGCGGTGGACGGTATGGACGTCTGGGGCCGAGGGACCTTGGTCACCGTC
3’HC1‐VH‐F‐BstEII
GAGACGGTGACCAAGGTCCCTCGGCCCCAGACGTCCATACC
5’HC1‐Vl‐A‐SacI
ACTAGCGAGCTCGWGCTGACACAGCCACCCTCG
5’HC1‐Vl‐B
GCTGACACAGCCACCCTCGGYGTCAGKGACCCCAGGACAGASGGYCASGATCTCCTGCTCTGGAGATGCATTGCCAAAGCAATATGC
3’HC1‐Vl‐C
CCCTGAGGGCCTCTCATTATCTTTATATATCASCAACWYAGGGGCCKKGCCTGGCWKCTGCTGATACCAGTAAGCATATTGCTTTGGCAATGC
5’HC1‐Vl‐D
GATAATGAGAGGCCCTCAGGGRTCCCTGASCGATTCTCTGGCTCCARGTCAGGGACATCAGYCTCGTTGRCCATCAGTGGASTCMRGKCAGAAGACGAGGCTGACTA
3’HC1‐Vl‐E‐BsiWI/SpeI
GCTACTACTAGTCGTACGTAGGACGGTCAGCTGGGTCCCTCCGCCGAACACCCAGGAAGAACCACTGCTGTCTGCTGATTGACAGTAATAGTCAGCCTCGTCTTCTG
scFv抗体断片のHCVに対する結合を、HCV抗原でトランスフェクトされたCHO細胞上でのフローサイトメトリーで試験し(実施例40.1参照);ネガティブコントロールとしてトランスフェクトされていないCHO細胞を用いた。
段階1:6カラム分の容量の20%バッファーB
段階2:6カラム分の容量の100%バッファーB
を用いて溶離させた。段階2からの溶離したタンパク質画分をさらなる精製のためにプールした。化学薬品はすべて研究グレードであり、Sigma(ダイゼンホッフェン)又はMerck(ダルムシュタット)より購入する。
ペトリ皿(直径85mm、Nunc)を、最終濃度1μg/mlの市販の抗CD3特異的抗体(例:OKT3,Othoclone)により37℃で1時間コーティングした。非結合タンパク質をPBSによる1段階の洗浄によって除去した。新鮮なPBMCを、Ficoll勾配遠心分離により標準的なプロトコルに従って末梢血液(30乃至50mlのヒト血液)から単離した。安定化グルタミン/10%FCS/IL‐2 20U/ml(Proleukin,Chiron)を含む50mlのRPMI1640中、3‐5×107個のPBMCを、あらかじめコーティングしたペトリ皿に添加し、2日間刺激した。3日目に細胞を回収し、RPMI1640で1回洗浄した。IL‐2を添加して最終濃度を20U/mlとし、上記と同じ細胞培地中にて細胞を再度1日培養した。
Claims (40)
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(イプシロン)鎖のエピトープと結合する能力を有する結合ドメインを含むポリペプチドであって、該エピトープが、配列番号2、4、6、又は8から成る群に含まれるアミノ酸配列の一部である、ポリペプチド。
- 前記のヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(イプシロン)鎖のエピトープと結合する能力を有する結合ドメインが、ヒト由来である、請求項1に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する第一の結合ドメイン、並びに細胞表面抗原と結合する能力を有する第二の結合ドメインを含む、請求項1乃至2のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の第二の結合ドメインが、ヒト及び非チンパンジー霊長類の細胞表面抗原と結合する、請求項3に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが:
(a)配列番号27に示すCDR‐L1、配列番号28に示すCDR‐L2、及び配列番号29に示すCDR‐L3;
(b)配列番号117に示すCDR‐L1、配列番号118に示すCDR‐L2、及び配列番号119に示すCDR‐L3;並びに、
(c)配列番号153に示すCDR‐L1、配列番号154に示すCDR‐L2、及び配列番号155に示すCDR‐L3、
より選択されるCDR‐L1、CDR‐L2、及びCDR‐L3を有するVL領域を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが:
(a)配列番号12に示すCDR‐H1、配列番号13に示すCDR‐H2、及び配列番号14に示すCDR‐H3;
(b)配列番号30に示すCDR‐H1、配列番号31に示すCDR‐H2、及び配列番号32に示すCDR‐H3;
(c)配列番号48に示すCDR‐H1、配列番号49に示すCDR‐H2、及び配列番号50に示すCDR‐H3;
(d)配列番号66に示すCDR‐H1、配列番号67に示すCDR‐H2、及び配列番号68に示すCDR‐H3;
(e)配列番号84に示すCDR‐H1、配列番号85に示すCDR‐H2、及び配列番号86に示すCDR‐H3;
(f)配列番号102に示すCDR‐H1、配列番号103に示すCDR‐H2、及び配列番号104に示すCDR‐H3;
(g)配列番号120に示すCDR‐H1、配列番号121に示すCDR‐H2、及び配列番号122に示すCDR‐H3;
(h)配列番号138に示すCDR‐H1、配列番号139に示すCDR‐H2、及び配列番号140に示すCDR‐H3;
(i)配列番号156に示すCDR‐H1、配列番号157に示すCDR‐H2、及び配列番号158に示すCDR‐H3;
(j)配列番号174に示すCDR‐H1、配列番号175に示すCDR‐H2、及び配列番号176に示すCDR‐H3、
より選択されるCDR‐H1、CDR‐H2、及びCDR‐H3を有するVH領域を含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが、配列番号35、39、125、129、161、又は165で示されるVL領域から成る群より選択されるVL領域を含む、請求項1乃至5のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の結合ドメインが、配列番号15、19、33、37、51、55、69、73、87、91、105、109、123、127、141、145、159、163、177、又は181で示されるVH領域から成る群より選択されるVH領域を含む、請求項1乃至4及び6のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが:
(a)配列番号17又は21に示すVL領域、及び配列番号15又は19に示すVH領域;
(b)配列番号35又は39に示すVL領域、及び配列番号33又は37に示すVH領域;
(c)配列番号53又は57に示すVL領域、及び配列番号51又は55に示すVH領域;
(d)配列番号71又は75に示すVL領域、及び配列番号69又は73に示すVH領域;
(e)配列番号89又は93に示すVL領域、及び配列番号87又は91に示すVH領域;
(f)配列番号107又は111に示すVL領域、及び配列番号105又は109に示すVH領域;
(g)配列番号125又は129に示すVL領域、及び配列番号123又は127に示すVH領域;
(h)配列番号143又は147に示すVL領域、及び配列番号141又は145に示すVH領域;
(i)配列番号161又は165に示すVL領域、及び配列番号159又は163に示すVH領域;
(j)配列番号179又は183に示すVL領域、及び配列番号177又は181に示すVH領域、
から成る群より選択されるVL領域及びVH領域を含む、請求項1乃至8のいずれか1項に記載のポリペプチド。 - ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε鎖のエピトープと結合する能力を有する前記の第一の結合ドメインが、配列番号23、25、41、43、59、61、77、79、95、97、113、115、131、133、149、151、167、169、185、又は187から成る群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載のポリペプチド。
- 前記の細胞表面抗原が、腫瘍抗原である、請求項3乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の細胞表面抗原が、EGFR、EGFRvIII、MCSP、カルボニックアンヒドラーゼIX、CD30、CD33、CD44v6、EpCAM、Her2/neu、MUC1、IgE、HBV、及びHCVより選択される、請求項3乃至10のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記のポリペプチドが二重特異性単鎖抗体分子である、請求項3乃至12のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記の二重特異性単鎖抗体分子が、第二の結合ドメイン中のCDR H1、CDR H2、CDR H3、CDR L1、CDR L2、及びCDR L3として、以下に示す配列の一群:
配列番号:189‐194、配列番号:201‐206、配列番号:219‐224、配列番号:237‐242、配列番号:255‐260、配列番号:273‐279、配列番号:382‐384及び387‐389、配列番号:400‐402及び405‐407、配列番号:418‐420及び423‐425、配列番号:436‐438及び441‐443、配列番号:454‐456及び459‐461、配列番号:472‐474及び477‐479、配列番号:490‐492及び495‐497、配列番号:及び508‐510及び513‐515、配列番号:530‐532及び1568乃至1570、配列番号:545‐547及び550‐552、配列番号:559‐561及び564‐566、配列番号:577‐579及び582‐584、配列番号:615‐617及び620‐622、配列番号:633‐635、638、639、及び1571、配列番号:650‐652及び655‐657、配列番号:668‐670及び673‐675、配列番号:682‐684及び687‐689、配列番号:696‐698及び701‐703、配列番号:710‐712及び715‐717、配列番号:724‐726及び729‐731、配列番号:738‐740及び743‐745、配列番号:752‐754及び757‐759、配列番号:766‐768及び771‐773、配列番号:780‐782及び785‐787、配列番号:794‐796及び799‐801、配列番号:808‐810及び813‐815、配列番号:822‐824及び827‐829、配列番号:836‐838及び841‐843、配列番号:850‐852及び855‐857、配列番号:866‐868及び871‐873、配列番号:884‐886及び889‐891、配列番号:902‐904及び907‐909、配列番号:920‐922及び925‐927、配列番号:938‐940及び943‐945、配列番号:956‐958及び961‐963、配列番号:974‐976及び979‐981、配列番号:992‐994及び997‐999、配列番号:1006‐1008及び1011‐1013、配列番号:1020‐1022及び1025‐1027、配列番号:1034‐1036及び1039‐1041、配列番号:1048‐1050及び1053‐1055、配列番号:1062‐1064及び1067‐1069、配列番号:1076‐1078及び1081‐1083、配列番号:1090‐1092及び1095‐1097、配列番号:1114‐1116及び1119‐1121、配列番号:1128‐1130及び1133‐1135、配列番号:1141‐1143及び1146‐1148、配列番号:1155‐1157及び1160‐1162、配列番号:1169‐1171及び1174‐1176、配列番号:1183‐1185及び1188‐1190、配列番号:1197‐1199及び1202‐1204、配列番号:1211‐1213及び1216‐1218、配列番号:1125‐1227及び1230‐1232、配列番号:1239‐1241及び1244‐1246、配列番号:1253‐1255及び1258‐1260、配列番号:1267‐1269及び1272‐1274、配列番号:1281‐1283及び1286‐1288、配列番号:1295‐1297及び1300‐1302、配列番号:1309‐1311及び1314‐1316、配列番号:1323‐1325及び1328‐1330、配列番号:1343‐1345及び1348‐1350、配列番号:1361‐1363及び1366‐1368、配列番号:1375‐1377及び1380‐1382、配列番号:1389‐1391及び1394‐1396、配列番号:1403‐1405及び1408‐1410、配列番号:1417‐1419及び1422‐1424、配列番号:1431‐1433及び1436‐1438、配列番号:1445‐1447及び1450‐1452、配列番号:1459‐1461及び1464‐1466、配列番号:1473‐1475及び1478‐1480、配列番号:1486‐1491、配列番号:1492‐1497、配列番号:1505‐1507及び1510‐1512、配列番号:1531‐1533及び1536‐1538、配列番号:1573‐1575及び1578‐1580、配列番号:1591‐1593及び1596‐1598、配列番号:1605‐1607及び1610‐1612、配列番号:1619‐1621及び1624‐1626、配列番号:1634‐1636及び1639‐1641、及び配列番号:1652‐1654、配列番号:1657‐1659、並びに配列番号:1669‐1674、
から成る群より選択される一群を含む、請求項13に記載のポリペプチド。 - 前記の二重特異性単鎖抗体分子が:
(a)配列番号291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、337、339、341、343、345、347、393、395、397、411、413、415、429、431、433、447、449、451、465、467、469、483、485、487、501、503、505、519、521、523、1336、1338、1340、538、540、542、556、570、572、574、588、590、592、626、628、630、643、645、647、661、663、665、679、693、707、721、735、749、763、777、791、805、819、833、847、861、863、877、879、881、895、897、899、913、915、917、931、933、935、949、951、953、967、969、971、985、987、989、1003、1017、1031、1045、1059、1073、1087、1101、1125、1138、1152、1166、1180、1194、1208、1222、1236、1250、1264、1278、1292、1306、1320、1334、1354、1356、1358、1372、1386、1400、1414、1428、1442、1456、1470、1484、1500、1502、1518、1520、1522、1524、1526、1528、1544、1546、1548、1550、1552、1554、1556、1558、1560、1562、1564、1566、1586、1588、1602、1616、1630、1647、1649、又は1663のいずれかで示されるアミノ酸配列;及び、
(b)配列番号292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、394、396、398、412、414、416、430、432、434、448、450、452、466、468、470、484、486、488、502、504、506、520、522、524、1337、1339、1341、539、541、543、557、571、573、575、589、591、593、627、629、631、644、646、648、662、664、666、680、694、708、722、736、750、764、778、792、806、820、834、848、862、864、878、880、882、896、898、900、914、916、918、932、934、936、950、952、954、968、970、972、986、988、990、1004、1018、1032、1046、1060、1074、1088、1102、1126、1139、1153、1167、1181、1195、1209、1223、1237、1251、1265、1279、1293、1307、1321、1335、1355、1357、1359、1373、1387、1401、1415、1429、1443、1457、1471、1485、1501、1503、1519、1521、1523、1525、1527、1529、1545、1547、1549、1551、1553、1555、1557、1559、1561、1563、1565、1567、1587、1589、1603、1617、1631、1648、1650、又は1664のいずれかで示される核酸配列によってコードされるアミノ酸配列、
から選択される配列を含む、請求項13に記載のポリペプチド。 - 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列。
- 請求項16に記載の核酸配列を含むベクター。
- 前記のベクターが、請求項16に記載の前記の核酸配列と操作可能に連結される制御配列をさらに含む、請求項17に記載のベクター。
- 前記のベクターが発現ベクターである、請求項18に記載のベクター。
- 請求項17乃至19のいずれか1項に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクトされたホスト。
- 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチドを作製するためのプロセスであって、該プロセスが、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチドの発現を可能とする条件下にて請求項20に記載のホストを培養すること、及び作製されたポリペプチドを該培養物から回収すること、を含む、プロセス。
- 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項21のプロセスに従って作製されたポリペプチドを含む医薬組成物。
- 担体、安定化剤、及び/又は賦形剤の適切な製剤をさらに含む、請求項22に記載の医薬組成物。
- 増殖性疾患、腫瘍性疾患、若しくは免疫障害から選択される疾患の予防、治療、又は寛解のための、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項21のプロセスに従って作製されたポリペプチドを含む医薬組成物。
- 担体、安定化剤、及び/又は賦形剤の適切な製剤をさらに含む、請求項24に記載の医薬組成物。
- 増殖性疾患、腫瘍性疾患、若しくは免疫障害から選択される疾患の予防、治療、又は寛解のための医薬組成物を作製するための、請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、又は請求項21に従って作製されたポリペプチドの使用。
- 前記の腫瘍性疾患が悪性疾患である、請求項26に記載の使用。
- 前記の医薬組成物が、追加の薬剤と組み合わせての投与に適している、請求項26又は27に記載の使用。
- 前記の薬剤が、非タンパク質化合物又はタンパク質化合物である、請求項28に記載の使用。
- 前記のタンパク質化合物又は非タンパク質化合物が、請求項22若しくは23に記載の医薬組成物と同時に又は非同時に投与される、請求項29に記載の使用。
- 疾患の予防、治療、又は寛解をそれを必要とする対象において行うための方法であって、該方法が、請求項22又は23の医薬組成物の効果量を投与する工程を含む、方法。
- 前記の疾患が、増殖性疾患、腫瘍性疾患、又は免疫障害である、請求項31に記載の方法。
- 前記の腫瘍性疾患が悪性疾患である、請求項32に記載の方法。
- 前記の医薬組成物が、追加の薬剤と組み合わせて投与される、請求項31乃至33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の薬剤が、非タンパク質化合物又はタンパク質化合物である、請求項34に記載の方法。
- 前記のタンパク質化合物又は非タンパク質化合物が、請求項22若しくは23に記載の医薬組成物と同時に又は非同時に投与される、請求項35に記載の方法。
- 前記の対象がヒトである、請求項31乃至36のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至15のいずれか1項に記載のポリペプチド、請求項16に記載の核酸分子、請求項17乃至19のいずれか1項に記載のベクター、又は請求項20に記載のホストを含むキット。
- ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3ε(CD3イプシロン)のエピトープと結合する能力を有する種間特異的結合ドメインを含むポリペプチドを同定するための方法であって、該方法は:
(a)該ポリペプチドを、アミノ酸配列Gln‐Asp‐Gly‐Asn‐Glu‐Glu‐Met‐Gly(配列番号381)又はGln‐Asp‐ Gly‐Asn‐Glu‐Glu‐Ile‐Gly(配列番号382)を含む最大27アミノ酸であり、そのC末端を介して固相に固定されている、CD3εの細胞外ドメインのN末端断片と接触させる工程と:
(b)該結合したポリペプチドを該断片から溶離させる工程と:
(c)該ポリペプチドを(b)の溶離液から単離する工程と、
を含む、方法。 - 前記のポリペプチドが、第一の結合ドメインとして同定された結合ドメインを、及び細胞表面抗原と結合する第二の結合ドメインを含む、請求項39に記載の方法。
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