KR20230080399A - 절단 가능한 링커 조성물 및 방법 - Google Patents

절단 가능한 링커 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20230080399A
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cytokine
gly
polypeptide
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KR1020237008265A
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데이빗 캠벨
토마스 알 디라이몬도
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재눅스 테라퓨틱스 인크.
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Abstract

절단 가능한 링커, 이의 약학적 조성물뿐만 아니라 핵산, 및 이를 제조하고 발견하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 절단 가능한 링커는 개선된 효능 및 안전성을 갖는다.

Description

절단 가능한 링커 조성물 및 방법
상호 참조
본 출원은 2020년 8월 11일에 출원된 미국 가출원 제63/064,268호를 우선권으로 주장하며, 상기 가출원은 본원에 참조로 통합된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 통합된 서열 목록을 포함한다. 2021년 8월 5일에 작성된 상기 ASCII 카피는 명칭이 52426_720_601_SL.txt이며, 크기가 58,325 바이트이다.
특정 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 절단 가능한 링커에 대해 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 절단 가능한 링커에 대해 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조식 I: A1-L1-P1에 따른 배열(configuration)에서 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인에 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편에 펩티드를 연결시키고, 상기 식에서 A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커를 포함하고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A1은 절단 가능한 링커에 C-말단 연결된다. 일부 실시양태에서, P1은 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A1은 절단 가능한 링커에 N-말단 연결된다. 일부 실시양태에서, P1은 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층(Pi-stacking) 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A1에 결합된다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원 또는 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 사이클릭 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 반감기 연장 모이어티(moiety)에 추가로 연결된다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티는 단일 도메인 항체이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 10G를 포함한다. 일부 실시양태에서, A1은 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 낙타과(camelid) 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH), Fab, Fab', Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 종양 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, A1은 Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, A1은 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 이펙터 세포 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, A1은 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv는 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, A1은 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 야생형 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 사이토카인의 뮤테인이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 인터페론 수용체 또는 인터류킨 수용체이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, IL-21 수용체 또는 TGF-β 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGFβ를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드와 복합체화된다. 일부 실시양태에서, 제2 단리된 폴리펩티드는 구조식 II: A2-L2-P2에 따른 배열로 있으며, 상기 식에서 A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2는 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A2는 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결된다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A2는 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결된다. 일부 실시양태에서, P2는 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A2에 결합된다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원 또는 제2 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 사이클릭 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, A2는 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 낙타과 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH), Fab, Fab', Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 항원은 종양 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, A2는 Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, A2는 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 표적 항원은 이펙터 세포 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, A2는 scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv는 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, A2는 제2 사이토카인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편은 야생형 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편은 사이토카인의 뮤테인이다. 일부 실시양태에서, 제2 사이토카인 수용체는 인터페론 수용체 또는 인터류킨 수용체이다. 일부 실시양태에서, 제2 사이토카인 수용체는 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, IL-21 수용체 또는 TGF-β 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편은 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편은 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGFβ을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에 따른 절단 가능한 링커; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 개시된다.
임의의 상기 실시양태에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다.
상기 실시양태에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본원에 개시된다.
절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드의 생산 방법으로서, 세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 상기 세포는 상기 실시양태의 벡터를 포함한다.
절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제조하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 (a) 상기 실시양태의 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계 및 (b) 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함한다.
본 개시내용의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 개시내용의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 기재하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조함으로써 본 개시내용의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해가 얻어질 것이며, 첨부된 도면은 다음과 같다:
도 1a 내지 1b는 EGFR 마스킹(masking)을 포함하는 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4 및 PC-5의 결합(도 1a) 및 이어서 종양 프로테아제 MTSP1에 의한 절단(도 1b)을 예시한다.
도 2a 내지 2b는 CD3ε 마스킹을 포함하는 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4 및 PC-5(도 2a) 및 이어서 종양 프로테아제 MTSP1에 의한 절단(도 2b)을 예시한다.
도 3a 내지 3b는 ELISA에 의해 측정된, EGFR-비오틴(도 3a) 및 CD3ε-비오틴(도 3b)에 대한 폴리펩티드 복합체 PC-2, PC-3, PC-4, PC-5, PC-1, 및 PC-6의 결합을 예시한다.
도 4a 내지 4e는 폴리펩티드 복합체 PC-2, PC-3, PC-4, PC-5, PC-1 및 PC-6에 있어 종양 표적 세포 HCT116에 대한 세포독성을 예시한다.
도 5a 내지 5d는 시노몰구스 원숭이에서의 폴리펩티드 PC-1, PC-2, PC-3, PC-7, PC-4 및 PC-5의 약동학을 예시한다.
도 6a 내지 6d는 시노몰구스 원숭이에서의 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-7, PC-4 및 PC-5 분자의 사이토카인 방출을 예시한다. .
도 7a 내지 7b는 시노몰구스 원숭이에서의 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4 및 PC-5의 AST 및 ALT 수준의 그래프를 예시한다.
항체, T 세포 수용체(TCR) 및 사이토카인 요법제와 같은 단백질 기반 요법제는 다양한 질환에 효과적인 것으로 입증되었다. 다른 요법제와 마찬가지로, 질환 조직에서 단백질 기반 요법제의 활성을 유지하면서 건강한 조직에서 단백질 기반 요법제의 표적외 효과(off-target effect)를 최소화할 필요가 있다. 이러한 전략 중 하나는 단백질 기반 요법제 상의 필수 결합 부위를 단백질 기반 요법제에 연결된 펩티드로 차단함으로써 건강한 조직에 있을 때에는 이의 동족 수용체 또는 표적 항원과 결합하거나 상호작용하는 것을 방지하는 불활성 형태의 단백질 기반 요법제를 생성하는 것이다. 원하는 질환 상태 미세환경에서 단백질 기반 요법제를 활성화하기 위해, 펩티드는 질환 상태 미세환경에 특이적인 프로테아제에 의해 절단 가능한 링커를 통해 단백질 기반 요법제에 결합된다. 그 다음, 펩티드는 질환 상태 미세환경에 있을 때 단백질 기반 요법제로부터 방출된다.
따라서, 질환 조직에서 단백질 기반 요법제의 활성을 유지하면서 건강한 조직에서 단백질 기반 요법제의 표적외 효과를 감소시키는 데 사용하기 위해 다양한 단백질 기반 요법제 형식에 적용될 수 있는 절단 가능한 링커가 본원에서 개시된다. 본원에 개시된 바와 같은 절단 가능한 링커는, 예를 들어, 대조군 링커와 비교해 유사한 안전성 프로파일을 또한 가지면서 종양 프로테아제에 의한 단백질분해의 증가된 속도 또는 종양 프로테아제의 확장된 패널에 의해 절단 가능함을 포함하지만 이에 제한되지 않는 원하는 특성을 갖고 있다.
특정 정의
본원에서 사용된 전문 용어는 단지 구체적인 사례를 설명하기 위한 것이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 형태를 또한 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 용어 "포함되는(including)", "포함된다(includes)", "갖는(having)", "갖는다(has)", "함께(with)" 또는 이들의 변형어가 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 한, 이러한 용어들은 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업계의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대해 허용가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 그 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 소정의 값에서 실시에 따라 1 또는 1보다 큰 표준 편차 내에 있다는 것을 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정한 값의 허용가능한 오차 범위를 의미하는 것으로 추정되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "단편"은 전체 길이 미만의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "펩티드", "P1", 또는 "P2"는 50개 미만의 아미노산의 아미노산 서열을 지칭하고 구체적으로 사이토카인에 결합하거나 동족 사이토카인 수용체에 결합하는, 사이토카인 리간드 결합 도메인, 이의 단편 또는 뮤테인, 사이토카인 수용체, 이의 단편 또는 뮤테인 및 임의의 항체 또는 항체 결합 단편(예를 들어, 단일 도메인 항체, Fab, 또는 scFv)을 제외한다.
일부 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드가 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 3, 4, 5, 및 6로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 1(ISSGLLSGRSDAG) 서열번호 3, 링커 2(AAGLLAPPGGLSGRSDAG) 서열번호 4, 링커 3(SPLGLSGRSDAG) 서열번호 5 또는 링커 4(LSGRSDAGSPLGLAG) 서열번호 6의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드 또는 링커 1, 링커 2, 링커 3 또는 링커 4의 아미노산 서열에 비해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 1의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 1의 아미노산 서열의 비해 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 1의 아미노산 서열의 비해 2개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 1의 아미노산 서열의 비해 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 2의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 2의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 2의 아미노산 서열에 비해 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 2의 아미노산 서열에 비해 2개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 2의 아미노산 서열에 비해 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 3의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 3의 아미노산 서열에 비해 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 3의 아미노산 서열에 비해 2개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 3의 아미노산 서열에 비해 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 4의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 4의 아미노산 서열에 비해 1개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 4의 아미노산 서열에 비해 2개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 링커 4의 아미노산 서열에 비해 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는다.
일부 실시양태에서, 아미노산 치환, 첨가 또는 결실은 본원에 기재된 임의의 단백질의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한, 예를 들어, 77%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 결과로 유도한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일반적인 아미노산 중에서, 예를 들어 "보존적 아미노산 치환"은 하기 각 군 내의 아미노산들 간의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 라이신, 아르기닌 및 히스티딘.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 변형된 아미노산 또는 비천연 아미노산, 또는 변형된 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산은 번역 후 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질로의 전달-RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함하나 이에 제한되지 않는 변형을 포함한다. 절단 가능한 링커의 변형은 펩티드 골격 또는 아미노산 측쇄를 포함하여 어디에서나 이루어진다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 질환 상태 미세환경이 아닌 건강한 조직 또는 미세환경에서의 수준에 비해 더 높은 수준으로 질환 상태 미세환경에 존재한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13, 및 MMP14로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP7을 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP13을 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제, 및 헵신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 우로키나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 헵신을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 다양한 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개, 또는 20개 초과의 상이한 프로테아제에 의해 절단된다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도와 비교하여 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 5배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 8배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 10배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 15배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 20배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 25배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 30배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 40배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 50배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 60배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 70배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 75배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 80배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 90배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 100배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 단백질분해 속도보다 적어도 120배 더 높은 증가된 단백질분해 속도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 프로테아제에 의해 절단 가능하다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없을 때의 인간 혈청에서의 안정성과 비교하여 인간 혈청에서 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 5배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 8배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 10배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 15배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 20배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 25배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 30배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 40배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 50배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 60배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 70배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 75배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 80배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 90배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 100배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 절단 가능한 링커 서열이 없는 링커에 대한 인간 혈청에서의 안정성보다 적어도 120배 더 높은 인간 혈청에서의 개선된 안정성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함한다는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열의 단리된 폴리펩티드와 비교하여 증가된 단백질분해 속도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함한다는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열의 단리된 폴리펩티드와 비교하여 개선되거나 동등한 혈청 안정성을 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함한다는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열의 단리된 폴리펩티드와 비교하여 개선되거나 동등한 시험관내 종양 세포 사멸을 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함한다는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열의 단리된 폴리펩티드와 비교하여 시노몰구스 원숭이에서 개선되거나 동등한 약동학 매개변수를 갖는다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함한다는 것을 제외하고는 시노몰구스 원숭이에서 개선되거나 동등한 간 독성 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 결합 도메인은 절단 가능한 링커에 대해 C-말단이다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 절단 가능한 링커에 대해 C-말단이다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 구조식 I에 따른 배열에서 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인에 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인에 펩티드를 연결시킨다:
A 1 -L 1 -P 1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커를 포함하고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A1은 절단 가능한 링커에 C-말단 연결된다. 일부 실시양태에서, P1은 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A1은 절단 가능한 링커에 N-말단 연결된다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드와 복합체화된다. 일부 실시양태에서, 제2 단리된 폴리펩티드는 구조식 II에 따른 배열로 있다:
A 2 -L 2 -P 2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2는 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, P2는 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A2는 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결된다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A2는 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결된다.
일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 절단 가능한 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함한다.
일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 8개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 10개 아미노산 길이이지만, 50개 아미노산 이하의 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 10개 아미노산 길이이지만, 30개 아미노산 이하의 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 18개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 26개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 30개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 40개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 적어도 50개 아미노산 길이이다.
펩티드(P 1 또는 P 2 )
일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A1에 결합된다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체 결합 부위에서 또는 그 근처에서 A1에 결합된다. 일부 실시양태에서, P1은 항원 결합 부위에서 또는 그 근처에서 A1에 결합된다. 일부 실시양태에서, P1은, L1이 종양 특이적 프로테아제에 의해 절단될 때 A1과 비결합 상태가 됨으로써 P1을 표적 항원 또는 사이토카인 수용체에 노출시킨다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1은 비입체적 차단에 의해 표적 항원 또는 사이토카인 수용체에 대한 A1의 결합을 손상시킨다. 일부 실시양태에서, P1은 공유 상호작용을 통해 표적 항원 또는 사이토카인 수용체에 대한 A1의 결합을 손상시킨다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인의 동족 수용체의 사이토카인, 사이토카인 결합 단편, 사이토카인 뮤테인, 또는 이들의 조합이 아니다. 일부 실시양태에서, A1은 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편이 아니다.
일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2는 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A2에 결합된다. 일부 실시양태에서, P2는 사이토카인 수용체 결합 부위에서 또는 그 근처에서 A2에 결합된다. 일부 실시양태에서, P2는 항원 결합 부위에서 또는 그 근처에서 A2에 결합된다. 일부 실시양태에서, P2는 L2이 종양 특이적 프로테아제에 의해 절단될 때 A2와 비결합 상태가 됨으로써 P2를 제2 표적 항원 또는 제2 사이토카인 수용체에 노출시킨다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다. 실시양태에서, P2는 비입체적 차단에 의해 제2 표적 항원 또는 제2 사이토카인 수용체에 대한 A2의 결합을 손상시킨다. 일부 실시양태에서, P2는 공유 상호작용을 통해 제2 표적 항원 또는 제2 사이토카인 수용체에 대한 A2의 결합을 손상시킨다. 일부 실시양태에서, P2는 사이토카인의 동족 수용체의 사이토카인, 사이토카인 결합 단편, 사이토카인 뮤테인, 또는 이들의 조합이 아니다. 일부 실시양태에서, A2는 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편이 아니다.
일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 75% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 80% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 85% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 90% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 95% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 98% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 표적 항원에 대해 99% 미만의 서열 상동성을 갖는다.
일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 75% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 80% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 85% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 90% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 95% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 98% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P1은 사이토카인 수용체에 대해 99% 미만의 서열 상동성을 갖는다.
일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 75% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 80% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 85% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 90% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 95% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 98% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 표적 항원에 대해 99% 미만의 서열 상동성을 갖는다.
일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 75% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 80% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 85% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 90% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 95% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 98% 미만의 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, P2는 제2 사이토카인 수용체에 대해 99% 미만의 서열 상동성을 갖는다.
일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 또는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 50% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보(de novo) 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 또는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 40% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 또는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 30% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 또는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 20% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이토카인, 사이토카인 수용체, 또는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 항체 또는 이의 단편과 10% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 무작위 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 라이브러리로부터 식별된다.
일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 표적 항원과 50% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 표적 항원과 40% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 표적 항원과 30% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 표적 항원과 20% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 표적 항원과 10% 미만의 서열 상동성을 공유하는 드노보 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 무작위 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 라이브러리로부터 식별된다.
일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 적어도 5개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 적어도 6개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 적어도 2개의 시스테인 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 사이클릭 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 선형 펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 변형된 아미노산 또는 비천연 아미노산, 또는 변형된 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산은 번역 후 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서 P1 또는 P2는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질로의 전달-RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함하나 이에 제한되지 않는 변형을 포함한다. P1 또는 P2의 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 말단을 포함하여 어디에서나 이루어진다.
일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 알부민 또는 알부민 단편을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, P1 또는 P2는 알부민 결합 도메인을 포함하지 않는다.
A 1 및 A 2
일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 항원 인식 분자이다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 분자는 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편, 단일 도메인 항체, Fab, Fab'을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 또는 낙타과 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 인간화 또는 인간의 것이다.
일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 Fab이다. 일부 실시양태에서, Fab는 (a) Fab 경쇄 폴리펩티드; 및 (b) Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 Fab 경쇄 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서 L1 또는 L2는 Fab 중쇄 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 Fab 경쇄 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 Fab 중쇄 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다.
일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 단일 사슬 가변 단편(scFv)이다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 scFv의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 scFv의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, scFv는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 경쇄 가변 도메인의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 단일 사슬 가변 단편(scFv)의 중쇄 가변 도메인의 N-말단에 결합된다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 분화 클러스터 3(CD3) 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 이의 항체 단편은 분화 클러스터 3 엡실론(CD3) 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 EGFR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 CD3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 CD3ε을 포함한다.
일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 효과기 세포 상의 TCR-CD3 복합체의 일부인 폴리펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 표적 항원은 항-CD3 이펙터 세포 항원이다. 일부 실시양태에서, TCR-CD3 복합체의 일부인 폴리펩티드는 인간 CD3ε이다. 일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 CD3 발현 세포 상의 CD3에 대해 1 μM 이하의 KD 결합을 갖는 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 각각 인간 CD3에 특이적으로 결합할 수 있는 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 무로모납-CD3(OKT3), 오텔릭시주맙(TRX4), 테플리주맙(MGA031), 비실리주맙(누비온), SP34, X35, VIT3, BMA030 (BW264/56), CLB-T3/3, CRIS7, YTH12.5, F111-409, CLB-T3.4.2, TR-66, WT32, SPv-T3b, 11D8, XIII-141, XIII-46, XIII-87, 12F6, T3/RW2-8C8, T3/RW2-4B6, OKT3D, M-T301, SMC2, F101.01, UCHT-1, WT-31, 15865, 15865v12, 15865v16, 및 15865v19로 이루어진 군으로부터 선택된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 가용성 T 세포 수용체(TCR)이다. 천연 TCR은 주요 조직적합성 복합 분자(MHC)에 결합된 항원을 인식하는 T 세포의 표면에서 발현되는 막관통 수용체이다. 천연 TCR은 이종이량체이며 디설파이드 결합을 통해 연결된 알파 폴리펩티드 사슬과 베타 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 알파 폴리펩티드 사슬 및 베타 폴리펩티드 사슬은 예를 들어 2개의 CD3 엡실론 폴리펩티드, 1개의 CD3 감마 폴리펩티드, 1개의 CD3 델타 폴리펩티드 및 2개의 CD3 제타 폴리펩티드를 포함하는 부속 단백질과의 복합체의 일부로서 발현된다. TCR이 표적 항원 및 MHC와 결속(engage)될 때, T 세포가 활성화되어 관련 효소, 공동수용체, 어댑터 분자 및 활성화되거나 방출된 전사 인자에 의해 매개되는 일련의 신호전달 사건이 초래된다.
천연 TCR에서, 알파 폴리펩티드 사슬 및 베타 폴리펩티드 사슬은 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다. 각 세포외 도메인은 가변 영역(V), 연결 영역(J) 및 불변 영역(C)을 포함한다. 불변 영역은 막관통 도메인에 대해 N-말단이고, 막관통 도메인은 세포질 도메인에 대해 N-말단이다. 알파 폴리펩티드 사슬과 베타 폴리펩티드 사슬 둘 다의 가변 영역은 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 베타 폴리펩티드 사슬은 일반적으로 가변 영역과 연결 영역 사이에 짧은 다양성 영역을 포함한다. 3개의 CDR은 프레임워크 서열에 매립되어 있으며, 하나의 CDR은 CDR3이라 명명된 초가변 영역이다. 알파 사슬 가변 영역(Vα) 및 베타 사슬 가변 영역(Vβ)은 이들의 프레임워크 서열, CDR1 및 CDR2 서열 및 부분적으로 정의된 CDR3 서열에 의해 구별되는 여러 유형의 것이다.
TCR은 국제 면역유전학(IMGT) TCR 명명법을 사용하여 기재된다. IMGT 명명법의 Vα는 고유한 "TRAV" 번호로 지칭된다. 동일한 방식으로, Vβ는 고유한 "TRBV" 번호로 지칭된다. 상응하는 연결 및 불변 영역은 각각 α 연결 및 불변 영역에 대해 TRAJ 및 TRAC로 지칭되며, 각각 β 연결 및 불변 영역에 대해 TRBJ 및 TRBC로 지칭된다. IMGT 명명법에 의해 정의된 서열은 당업계에 공지되어 있으며 온라인 IMGT 공개 데이터베이스 내에 포함되어 있다.
일부 실시양태에서, 가용성 TCR은 TCR 알파 세포외 도메인의 가변 영역 또는 이의 단편, 및 TCR 베타 세포외 도메인의 가변 영역 또는 이의 단편을 포함하는 단일 사슬 TCR이다. 일부 실시양태에서, 가용성 TCR은 TCR 알파 세포외 도메인을 포함하는 알파 TCR 폴리펩티드 및 TCR 베타 세포외 도메인을 포함하는 베타 TCR 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 가용성 TCR은 TCR 알파 세포외 도메인의 가변 영역 또는 이의 단편, 및 TCR 베타 세포외 도메인의 가변 영역 또는 이의 단편을 포함하는 단일 사슬 TCR이다. 일부 실시양태에서, 가용성 TCR은 TCR 알파 세포외 도메인을 포함하는 알파 TCR 폴리펩티드 및 TCR 베타 세포외 도메인을 포함하는 베타 TCR 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, L1은 알파 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 베타 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, A2는 알파 TCR 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, A2는 알파 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, A2는 베타 TCR 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, A2는 베타 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 알파 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합되고 A2는 베타 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 알파 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합되고 A2는 베타 TCR 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 알파 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합되고 A2는 알파 TCR 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 베타 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합되고 A2는 알파 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 베타 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합되고 A2는 베타 TCR 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다. 일부 실시양태에서, L1은 베타 TCR 폴리펩티드의 N-말단에 결합되고 A2는 알파 TCR 폴리펩티드의 C-말단에 결합된다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도와 비교하여 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대해 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 5배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 8배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 10배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 20배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 25배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 30배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 40배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 50배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 60배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 70배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 75배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 80배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 90배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 100배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 표적 항원에 대한 친화도보다 적어도 120배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도와 비교하여 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 5배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 8배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 10배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 20배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 25배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 30배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 40배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 50배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 60배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 70배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 75배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 80배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 90배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 100배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 120배 더 높은 표적 항원 또는 제2 표적 항원에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다.
일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 사이토카인 또는 사이토카인 단편이다. 일부 실시양태에서, A1 또는 A2는 사이토카인 또는 사이토카인 단편의 뮤테인이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 사이토카인 또는 사이토카인 단편의 뮤테인이다.
사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 아디포카인, 중간엽 성장 인자 및 종양 괴사 인자를 포함하는 다양한 소형 펩티드 군이며, 다양한 생물학적 경로에서 세포간 신호전달에 관여한다. 이들은 면역 및 염증 반응에서 특히 중요하다. 신호전달은 리간드 결합을 위한 세포외 도메인 및 신호전달을 허용하는 세포내 도메인을 포함하는 막관통 수용체인 상응하는 사이토카인 수용체에 의한 사이토카인 인식 후에 발생한다.
사이토카인의 다양성은 단일 사슬 또는 서브유닛 또는 이량체/다량체 도메인을 포함할 수 있는 사이토카인 수용체의 상응하는 다양성을 수반한다. 사이토카인 수용체는 인터류킨 수용체로 예시되는 I형 사이토카인 수용체 및 인터페론 수용체로 예시되는 II형 사이토카인 수용체를 포함하며, 이들 둘 다는 사이토카인 수용체 상동성 도메인(CHD)을 포함한다. I형 사이토카인 수용체의 CHD는 공통 아미노산 모티프(WSXWS(서열번호 27))를 공유하는 반면, II형 사이토카인 수용체에는 이 모티프가 결여되어 있다. 사이토카인 수용체는 알파 서브유닛, 베타 서브유닛, 감마 서브유닛, 또는 이들의 이량체 또는 삼량체 조합을 포함할 수 있다. 일례에서, IL-2에 대한 고친화도 수용체는 IL-2Rα 서브유닛, IL-2Rβ 서브유닛 및 IL-2Rγ 서브유닛을 포함하고, IL-2에 대한 중간 친화도 수용체는 IL-2Rβ 서브유닛 및 IL-2Rγ 서브유닛만을 포함하고, IL-2에 대한 저친화도 수용체는 IL-2Rα 서브유닛만을 포함한다.
일부 실시양태에서, 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 아디포카인, 성장 인자 또는 종양 괴사 인자이다. 일부 실시양태에서, 인터페론(IFN)은 IFNα, IFNβ, IFNγ 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 인터류킨(IL)은 IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 성장 인자는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 이의 단편이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인은 TGF-β이다.
일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 야생형 사이토카인의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 야생형 사이토카인의 돌연변이체이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 야생형 사이토카인에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개, 또는 50개 초과의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 야생형 사이토카인에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개 이하, 또는 50개 초과의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 비천연 발생 사이토카인이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 천연 발생 사이토카인에 비해 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개, 또는 50개 초과의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 뮤테인은 천연 발생 사이토카인에 비해 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50개 이하, 또는 50개 초과의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 사이토카인 수용체에 결합한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 아디포카인, 성장 인자 또는 종양 괴사 인자에 대한 수용체이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 I형 사이토카인 수용체 또는 II형 사이토카인 수용체이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 이량체 또는 삼량체이다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 알파 서브유닛, 베타 서브유닛, 감마 서브유닛, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 알파 서브유닛, 베타 서브유닛, 및 감마 서브유닛을 포함한다. 다른 예에서, 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 베타 서브유닛 및 감마 서브유닛을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도와 비교하여 이의 사이토킨 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 5배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 8배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 10배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 20배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 25배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 30배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 40배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 50배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 60배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 70배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 75배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 80배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 90배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 100배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 120배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 P1 또는 P2 또는 L1 또는 L2를 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 형태의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 150배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGF-β를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 IL-2 수용체, IL-12 수용체, IL-6 수용체, IL-4 수용체, IL-10 수용체, 또는 TGF-β 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도와 비교하여 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 5배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 8배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 10배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 15배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 20배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 25배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 30배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 40배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 50배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 60배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 70배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 75배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 80배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 90배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 L1 또는 L2가 절단된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체의 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도보다 적어도 100배 더 약한 이의 사이토카인 수용체에 대한 더 약한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편은 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 수용체는 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-7 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, 또는 IL-21 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, L1 또는 L2는 프로테아제에 의해 절단된다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 종양 특이적 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테아제는 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세린 프로테아제는 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함한다.
반감기 연장 모이어티
일부 실시양태에서, P1은 반감기 연장 모이어티에 추가로 연결된다. 일부 실시양태에서, P1은 구조식 Ia에 따른 배열에서 반감기 연장 모이어티에 추가로 연결된다:
A 1 -L 1 -P 1 -L 3 -H 1
(구조식 Ia)
상기 식에서, H1은 반감기 연장 모이어티이고 L3은 H1을 P1에 연결시키는 링커이다. 일부 실시양태에서, L3은 절단 불가능한 링커이다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 표적 항원에 대한 A1 결합을 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 A1에 대한 결합 친화도를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 표적 항원에 대한 결합 친화도를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 표적 항원으로부터 A1을 차폐(shield)하지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 A1에 직접 연결되지 않는다.
일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 사이토카인 수용체에 대한 A1 결합을 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 대한 결합 친화도를 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 사이토카인 수용체로부터 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 차폐하지 않는다. 일부 실시양태에서, 반감기 연장 모이어티(H1)는 사이토카인 또는 사이토카인 단편에 직접 연결되지 않는다.
일부 실시양태에서, H1은 반복적인 서열 모티프를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, H1은 고도로 정렬된 2차 구조를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 문맥에서 사용된 바와 같이, "고도로 정렬된 2차 구조"는 분광광도법(예를 들어, "원자외선" 스펙트럼 영역(190 내지 250 nm)에서의 원형 이색성 분광법 및 컴퓨터 프로그램 또는 알고리즘, 예컨대 초우-파스만(Chou-Fasman) 알고리즘 및 가르니에-오스구토르페-롭슨(Garnier-Osguthorpe-Robson: "GOR") 알고리즘에 의해)을 포함하나 이에 제한되지 않는 수단에 의해 측정 또는 결정 시 H1의 아미노산 잔기의 적어도 약 50% 또는 약 70% 또는 약 80% 또는 약 90%가 2차 구조에 기여한다는 것을 의미한다.
일부 실시양태에서, H1은 중합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 일부 실시양태에서, H1은 알부민을 포함한다. 일부 실시양태에서, H1은 Fc 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 알부민은 혈청 알부민이다. 일부 실시양태에서, 알부민은 인간 혈청 알부민이다. 일부 실시양태에서, H1은 폴리펩티드, 리간드 또는 소분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드, 리간드 또는 소분자는 혈청 단백질 또는 이의 단편, 순환 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 CD35/CR1에 결합한다. 일부 실시양태에서, 혈청 단백질은 티록신 결합 단백질, 트랜스티레틴(transthyretin), 1-산 당단백질, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체 또는 이의 트랜스페린 결합 부분, 피브리노겐 또는 알부민을 포함한다. 일부 실시양태에서, 순환 면역글로불린 분자는 IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, slgA, IgM 또는 IgD를 포함한다. 일부 실시양태에서, 혈청 단백질은 알부민이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일 도메인 항체, 단일 사슬 가변 단편 또는 Fab를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 645gH1gL1, 645dsgH5gL4, 23-13-A01 -sc02, A10m3 또는 이의 단편, DOM7r-31, DOM7h-11-15, Alb-1, Alb-8, Alb-23, 10G, 10GE 및 SA21로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, H1은 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, H1은 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, H1은 인간 혈청 알부민에 결합하는 단일 도메인 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, H1은 변형된 아미노산 또는 비천연 아미노산, 또는 변형된 비천연 아미노산, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 아미노산 또는 변형된 비천연 아미노산은 번역 후 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, H1은 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교결합, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해성 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 아미노산의 단백질로의 전달-RNA 매개 첨가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함하나 이에 제한되지 않는 변형을 포함한다. H1의 변형은 펩티드 골격, 아미노산 측쇄 및 말단을 포함하여 어디에서나 이루어진다.
폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 기재된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커 1(ISSGLLSGRSDAG)(서열번호 3, 링커 2(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(서열번호 4), 링커 3(SPLGLSGRSDAG)(서열번호 5), 또는 링커 4(LSGRSDAGSPLGLAG)(서열번호 6)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드 또는 링커 1, 링커 2, 링커 3 또는 링커 4의 아미노산 서열에 비해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 링커 1(ISSGLLSGRSDAG)(서열번호 3)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 링커 2(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(서열번호 4)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 링커 3(SPLGLSGRSDAG)(서열번호 5)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 링커 4(LSGRSDAGSPLGLAG)(서열번호 6)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 아미노산 서열 LSGRSDAG(서열번호 1)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 구조식 I에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커를 포함하고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조식 I을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커를 포함하고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조식 I에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커이고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 구조식 I을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인이고; L1은 절단 가능한 링커이고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드가 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드와 복합체화되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 구조식 II에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2는 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조식 II를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2는 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 구조식 II에 따른 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인이고; L2는 제2 절단 가능한 링커이고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 구조식 II를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자가 본원에 개시된다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인이고; L2는 제2 절단 가능한 링커이고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드이다.
약학적 조성물
일부 실시양태에서, (a) 본원에 개시된 바와 같은 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 링커 1(ISSGLLSGRSDAG)(서열번호 3, 링커 2(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(서열번호 4), 링커 3(SPLGLSGRSDAG)(서열번호 5), 또는 링커 4(LSGRSDAGSPLGLAG)(서열번호 6)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체, 또는 링커 1, 링커 2, 링커 3 또는 링커 4의 아미노산 서열에 비해 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환, 첨가 또는 결실을 갖는 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 링커 1(ISSGLLSGRSDAG)(서열번호 3)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 링커 2(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(서열번호 4)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a 링커 3(SPLGLSGRSDAG)(서열번호 5)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 링커 4(LSGRSDAGSPLGLAG)(서열번호 6)의 아미노산 서열에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 아미노산 서열 LSGRSDAG(서열번호 1)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 I에 따른 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커를 포함하고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 I을 포함하는 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인을 포함하고; L1은 절단 가능한 링커를 포함하고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 I에 따른 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인이고; L1은 절단 가능한 링커이고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 I을 포함하는 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A1-L1-P1
(구조식 I)
상기 식에서, A1은 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인이고; L1은 절단 가능한 링커이고; P1은 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드가 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드와 복합체화되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체가 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 II에 따른 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2는 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 II를 포함하는 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2는 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 II에 따른 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인이고; L2는 제2 절단 가능한 링커이고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 (a) 구조식 II를 포함하는 단리된 폴리펩티드 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다:
A2-L2-P2
(구조식 II)
상기 식에서, A2는 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인이고; L2는 제2 절단 가능한 링커이고; P2는 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인의 결합을 손상시키는 제2 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 검출 가능한 표지, 치료제 또는 약동학적 변형 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 표지는 형광 표지, 방사성 표지, 효소, 핵산 프로브 또는 조영제를 포함한다.
대상체에게 투여하기 위해, 본원에 개시된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 약학적 조성물로 제공될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고 이것이 투여되는 환자에게 독성이 없는 임의의 담체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에 잘 알려져 있고 포스페이트 완충 식염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 오일/물 에멀젼, 다양한 유형의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 이러한 담체는 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있고 적합한 용량에서 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 멸균된 것이다. 이들 조성물은 또한 보존제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 다양한 항세균제 및 항진균제를 포함함으로써 미생물 작용의 방지가 보장될 수 있다.
약학적 조성물은 (원하는 투여 방법에 따라) 임의의 적합한 형태일 수 있다. 이는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고 밀봉된 용기에 제공될 수 있으며 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 사용 지침서를 포함할 수 있다. 이는 복수의 상기 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 비경구(예를 들어, 피하, 근육내 또는 정맥내) 경로를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의한 투여에 적합할 수 있다. 이러한 조성물은 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 활성 성분을 멸균 조건 하에 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조할 수 있다.
본 개시내용의 물질의 투여량은 치료될 질환 또는 장애, 치료될 개체의 연령 및 상태 등에 따라 넓은 한계치 사이에서 다양할 수 있고, 의사는 최종적으로 사용될 적절한 투여량을 결정할 것이다.
표 1은 본원에 기재된 작제물의 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 표 1에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 포함한다. 일부 예에서, 서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 또는 약 95% 상동성을 포함한다. 일부 예에서, 서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 또는 약 97% 상동성을 포함한다. 일부 예에서, 서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 또는 약 99% 상동성을 포함한다. 일부 예에서, 서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25에 대해 적어도 또는 약 100% 상동성을 포함한다. 일부 예에서, 서열은 서열번호 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25의 적어도 또는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은, 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 퍼센트 서열 동일성 달성을 위해 갭을 도입한 후의, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 달성할 수 있다. 비교할 전체 길이 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc. 소유이며, 소스 코드는 미국 저작권청(20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 Genentech, Inc.(캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에의, 그와의 또는 그에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성 (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에의, 그와의 또는 그에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다: 100×X/Y의 분율, 여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 채점된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 인지할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에 기재한 바와 같이 수득한다.
절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드의 생산
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들어, 항체 및 이의 결합 단편)는, 특히 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의한 폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 합성에 유용한 것으로 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성되며, 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의해 생성된다.
일부 예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 재조합으로 발현되고, 항체 또는 이의 결합 단편을 코딩하는 핵산은 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립되며(예를 들어, 문헌[Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242]에 기재된 바와 같음), 이는 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드 함유 부분의 합성, 이들 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게션 및 이어서 라이게이션된 올리고뉴클레오티드의 PCR에 의한 증폭을 포함한다.
대안적으로, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 임의로 서열의 3' 말단 및 5' 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 적합한 공급원(예를 들어, 면역글로불린을 발현하는 임의의 조직 또는 세포로부터 생성된 cDNA 라이브러리 또는 항체 cDNA 라이브러리)으로부터 생성된다.
일부 예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은, 예를 들어, Kohler 및 Milstein(1975, Nature 256:495-497)에 의해 설명된 바와 같이 또는 Kozbor 등(1983, Immunology Today 4:72) 또는 Cole 등(1985 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)에 의해 설명된 바와 같이, 마우스와 같은 동물을 면역화하여 다클론 항체를 생성하거나, 보다 바람직하게는 단클론 항체를 생성함으로써 임의로 생성된다. 대안적으로, 항체의 적어도 Fab 부분을 코딩하는 클론은 특정 항원에 결합하는 Fab 단편의 클론에 대한 Fab 발현 라이브러리를 스크리닝하거나(예를 들어, 문헌[Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281]에 설명된 바와 같이) 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써(예를 들어, 문헌[Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937] 참조) 임의로 얻어진다.
일부 실시양태에서, 적절한 생물학적 활성의 인간 항체 분자로부터의 유전자와 함께 적절한 항원 특이성의 마우스 항체 분자로부터의 유전자를 스플라이싱하여 "키메라 항체"를 생성하기 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)이 이용된다. 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자, 예컨대 뮤린 단클론 항체로부터 유래된 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것들이다.
일부 실시양태에서, 단일 사슬 항체의 생산용으로 설명된 기술(미국 특허 제4,694,778호; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; 및 Ward et al., 1989, Nature 334:544-54)은 단일 사슬 항체를 생성하는 데 적합하다. 단일 사슬 항체는 아미노산 가교를 통해 Fv 영역의 중쇄 단편과 경쇄 단편을 연결시켜 단일 사슬 폴리펩티드를 생성함으로써 형성된다. 이. 콜라이(E. coli)에서의 기능성 Fv 단편의 조립을 위한 기술도 임의로 사용된다(Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
일부 실시양태에서, 항체의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터 또는 항체의 뉴클레오티드 서열은 통상적인 기술(예를 들어, 전기천공, 리포좀 형질감염 및 인산칼슘 침전)에 의해 숙주 세포로 이전되고, 이어서 형질감염된 세포는 항체를 생성하는 통상적인 기술에 의해 배양된다. 구체적인 실시양태에서, 항체의 발현은 구성적, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
일부 실시양태에서, 다양한 숙주 발현 벡터 시스템이 본원에 기재된 항체 또는 이의 결합 단편을 발현시키기 위해 이용된다. 이러한 숙주 발현 시스템은 항체의 코딩 서열이 생성되고 후속적으로 정제되도록 하는 비히클을 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염되는 경우에 항체 또는 이의 결합 단편을 인 시츄(in situ)에서 발현하는 세포를 나타낸다. 이들은 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예를 들어, 이. 콜라이 및 비. 섭틸리스(B. subtilis))와 같은 미생물; 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV)로 감염되거나, 항체 또는 이의 결합 단편 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 75K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 작제물을 보유하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BH, 293, 293T, 3T3 세포)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
재조합 단백질의 장기간의 고수율 생성을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 일부 예에서, 항체를 안정하게 발현하는 세포주는 임의로 조작된다. 바이러스 복제 기점을 함유하는 발현 벡터를 사용하기보다는, 숙주 세포를 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환시킨다. 그 다음, 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포를 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 한 다음, 선택적 배지로 교체한다. 재조합 플라스미드에서 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 이의 염색체 내로 안정적으로 통합하고 성장하여 병소를 형성할 수 있게 하고, 결국 이것이 클로닝되고 세포주로 증대(expand)되도록 한다. 이러한 방법은 항체 또는 이의 결합 단편을 발현하는 세포주를 조작하는 데 유리하게는 사용될 수 있다.
일부 예에서, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제(Wigler et al., 1977, Cell 11:223), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, 192, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy et al., 1980, Cell 22:817) 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 선택 시스템이 각각 tk-, hgprt-, 또는 aprt- 세포에서 사용된다. 또한, 하기 유전자들에 대한 선택의 기준으로서 대사길항물질 내성이 사용된다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932; and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May 1993, TIB TECH 11(5):155-215) 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre et al., 1984, Gene 30:147). 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 흔히 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds., 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; 및 in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY.; Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)]에 설명되어 있다.
일부 예에서, 항체의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가된다(검토를 위해, 문헌[Bebbington and Hentschel, the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조]. 항체를 발현하는 벡터 시스템에서 마커가 증폭가능할 때, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역은 항체의 뉴클레오티드 서열과 관련되기 때문에, 항체의 생성이 또한 증가할 것이다(Crouse et al., 1983, Mol Cell Biol 3:257).
일부 예에서, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화도에 의한 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등적 용해성에 의한 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 항체의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법이 사용된다.
발현 벡터
일부 실시양태에서, 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물 공급원으로부터 유래된 임의의 적합한 벡터를 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 세균(예를 들어, 이. 콜라이), 곤충, 효모(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 조류 또는 포유동물 공급원으로부터 얻어진다. 예시적인 세균 벡터는 pACYC177, pASK75, pBAD 벡터 시리즈, pBADM 벡터 시리즈, pET 벡터 시리즈, pETM 벡터 시리즈, pGEX 벡터 시리즈, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, pQE 벡터 시리즈, pRSET A, pRSET B, pRSET C, pTrcHis2 시리즈, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC, 또는 pTAC-MAT-2를 포함한다.
예시적인 곤충 벡터는 pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, FLAG 벡터, 예컨대 pPolh-FLAG1 또는 pPolh-MAT 2, 또는 MAT 벡터, 예컨대 pPolh-MAT1, 또는 pPolh-MAT2를 포함한다.
일부 경우에서, 효모 벡터는 Gateway® pDESTTM 14 벡터, Gateway® pDESTTM 15 벡터, Gateway® pDESTTM 17 벡터, Gateway® pDESTTM 24 벡터, Gateway® pYES-DEST52 벡터, pBAD-DEST49 Gateway® 목적(destination) 벡터, pAO815 피키아 벡터, pFLD1 피키 파스토리스(Pichi pastoris) 벡터, pGAPZA,B, & C 피키아 파스토리스 벡터, pPIC3.5K 피키아 벡터, pPIC6 A, B, & C 피키아 벡터, pPIC9K 피키아 벡터, pTEF1/Zeo, pYES2 효모 벡터, pYES2/CT 효모 벡터, pYES2/NT A, B, & C 효모 벡터, 또는 pYES3/CT 효모 벡터를 포함한다.
예시적인 조류 벡터는 pChlamy-4 벡터 또는 MCS 벡터를 포함한다.
포유동물 벡터의 예는 일시적 발현 벡터 또는 안정한 발현 벡터를 포함한다. 포유동물 일시적 발현 벡터는 pRK5, p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a,b,c, pFLAG-CMV 5.1, pFLAG-CMV 5a,b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3, 또는 pBICEP-CMV 4를 포함할 수 있다. 포유동물 안정한 발현 벡터는 pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1, 또는 pBICEP-CMV 2를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 무세포 시스템은 세포로부터의 세포질 및/또는 핵 성분의 혼합물이며 시험관내 핵산 합성을 위해 사용된다. 일부 경우에, 무세포 시스템은 원핵 세포 성분 또는 진핵 세포 성분을 사용한다. 때때로, 핵산 합성은 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 세포, 제노푸스(Xenopus) 난자, 또는 HeLa 세포에 기반한 무세포 시스템에서 얻어진다. 예시적인 무세포 시스템은 이. 콜라이 S30 추출물 시스템, 이. 콜라이 T7 S30 시스템, 또는 PURExpress®를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포
일부 실시양태에서, 숙주 세포는 천연 유래 세포 또는 유전자 변형된 세포와 같은 임의의 적합한 세포를 포함한다. 일부 예에서, 숙주 세포는 생산 숙주 세포이다. 일부 예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다른 예에서 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 경우에서, 진핵 세포는 진균(예를 들어, 효모 세포), 동물 세포, 또는 식물 세포를 포함한다. 일부 경우에, 원핵 세포는 세균 세포이다. 세균 세포의 예는 그람 양성 세균 또는 그람 음성 세균을 포함한다. 때때로 그람 음성 세균은 혐기성, 막대형, 또는 둘 다이다.
일부 예에서, 그람 양성 세균은 악티노박테리아(Actinobacteria), 피르미쿠테스(Firmicutes), 또는 테네리쿠테스(Tenericutes)를 포함한다. 일부 경우에, 그람 음성 세균은 아퀴피카에(Aquificae), 데이노코쿠스-테르무스(Deinococcus-Thermus), 피브로박테레스-클로로비/박테로이데테스(Fibrobacteres-Chlorobi/Bacteroidetes)(FCB군), 푸소박테리아(Fusobacteria), 겜마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 니트로스피라에(Nitrospirae), 플란크토미세테스-베루코미크로비아/클라미디아에(Planctomycetes-Verrucomicrobia/Chlamydiae)(PVC군), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes) 또는 시네르기스테테스(Synergistetes)를 포함한다. 다른 세균은 아시도박테리아(Acidobacteria), 클로로플렉시(Chloroflexi), 크리시오게네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 딕티오글로미(Dictyoglomi), 써모데술포박테리아(Thermodesulfobacteria) 또는 써모토가에(Thermotogae)일 수 있다. 세균 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 콜라이 바실리(Coli bacilli)일 수 있다.
예시적인 원핵 숙주 세포는 BL21, Mach1TM, DH10BTM, TOP10, DH5α, DH10BacTM, OmniMaxTM, MegaXTM, DH12STM, INV110, TOP10F', INVαF, TOP10/P3, ccdB 서바이벌(Survival), PIR1, PIR2, Stbl2TM, Stbl3TM, 또는 Stbl4TM을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 동물 세포는 척추동물 또는 무척추동물로부터의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 동물 세포는 해양 무척추동물, 어류, 곤충, 양서류, 파충류 또는 포유동물로부터의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 진균 세포는 맥주 효모, 빵 효모 또는 와인 효모와 같은 효모 세포를 포함한다.
진균은 효모, 몰드(mold), 사상균, 담자균 또는 접합균과 같은 자낭균을 포함한다. 일부 예에서, 효모는 아스코미코타(Ascomycota) 또는 바시디오미코타(Basidiomycota)를 포함한다. 일부 경우에, 아스코미코타는 사카로미코티나(Saccharomycotina)(진정 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)(빵 효모)) 또는 타프리노미코티나(Taphrinomycotina)(예를 들어, 쉬조사카로미세테스(Schizosaccharomycetes)(분열 효모))를 포함한다. 일부 경우에, 바시디오미코타(Basidiomycota)는 아가리코미코티나(Agaricomycotina)(예를 들어, 트레멜로미세테스(Tremellomycetes)) 또는 푸시니오미코티나(Pucciniomycotina)(예를 들어, 미크로보트리요미세테스(Microbotryomycetes))를 포함한다.
예시적인 효모 또는 사상균은 예를 들어 사카로마이세스, 쉬조사카로마이세스, 칸디다, 피키아, 한세눌라(Hansenula), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 지고사카로마이세스(Zygosaccharomyces), 야로위아(Yarrowia), 트리코스포론(Trichosporon), 로도스포리디(Rhodosporidi), 아스페르길루스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 또는 트리코데르마(Trichoderma) 속을 포함한다. 예시적인 효모 또는 사상균은, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아에, 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 우틸리스(Candida utilis), 칸디다 보이디니(Candida boidini), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 칸디다 스텔라토이데아(Candida stellatoidea), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 구일리에르몬디이(Candida guilliermondii), 칸디다 비스와나티이(Candida viswanathii), 칸디다 루시타니아에(Candida lusitaniae), 로도토룰라 무실라기노사(Rhodotorula mucilaginosa), 피키아 메타놀리카(Pichia metanolica), 피키아 안구스타(Pnichia angusta), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 아노말라(Pichia anomala), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 지고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 트리코스포론 풀루란스(Trichosporon pullulans), 로도스로리디움 토루-아스페르길루스 니거(Rhodosporidium toru-Aspergillus niger), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코데르마 레세이(Trichoderma reesei), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 브레타노미세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 칸디다 스텔라타(Candida stellata), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 토룰라스포라 델브루엑키이(Torulaspora delbrueckii), 지고사카로마이세스 바일리이(Zygosaccharomyces bailii), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토코쿠스 가티이(Cryptococcus gattii), 또는 사카로마이세스 보울라르디이(Saccharomyces boulardii) 종을 포함한다.
예시적인 효모 숙주 세포는 GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H 및 X-33과 같은 피키아 파스토리스 효모 균주; 및 INVSc1과 같은 사카로마이세스 세레비시아에 효모 균주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 추가적인 동물 세포는 연체동물, 절지동물, 환형동물 또는 해면동물로부터 얻어지는 세포를 포함한다. 일부 경우에, 추가적인 동물 세포는 예를 들어 영장류, 유인원, 말, 소, 돼지, 개, 고양이 또는 설치류로부터의 포유동물 세포이다. 일부 경우에, 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 저빌쥐, 햄스터, 친칠라, 팬시 래트 또는 기니피그를 포함한다.
예시적인 포유동물 숙주 세포는 293A 세포주, 293FT 세포주, 293F 세포, 293 H 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, FUT8 KO CHOK1, Expi293F™ 세포, Flp-In™ T-REx™ 293 세포주, Flp-In™-293 세포주, Flp-In™-3T3 세포주, Flp-In™-BHK 세포주, Flp-In™-CHO 세포주, Flp-In™-CV-1 세포주, Flp-In™ -Jurkat 세포주, FreeStyle™ 293-F 세포, FreeStyle™ CHO-S 세포, GripTite™ 293 MSR 세포주, GS-CHO 세포주, HepaRG™ 세포, T-REx™ Jurkat 세포주, Per.C6 세포, T-REx™-293 세포주, T-REx™-CHO 세포주, 및 T-REx™-HeLa 세포주를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 포유동물 숙주 세포는 안정한 세포주, 또는 관심대상의 유전 물질을 자체 게놈에 혼입시키고 여러 세대의 세포 분열 후에 유전 물질의 산물을 발현할 수 있는 능력을 가진 세포주이다. 일부 경우에, 포유동물 숙주 세포는 일시적 세포주, 또는 관심대상의 유전 물질을 자체 게놈에 혼입시키지 않고 여러 세대의 세포 분열 후에 유전 물질의 산물을 발현할 능력이 없는 세포주이다.
예시적인 곤충 숙주 세포는 드로소필라 S2 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, High Five™ 세포 및 expresSF+® 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 식물 세포는 조류로부터의 세포를 포함한다. 예시적인 곤충 세포주는 클라미도모나스 레이하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii) 137c, 또는 시네코코쿠스 엘론가투스(Synechococcus elongatus) PPC 7942로부터의 스트레인(strain)을 포함한다.
제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질이 담긴 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로 수용하거나 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 CD3에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 종양 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 항체이다.
라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택된 병태의 치료를 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품은 (a) 내부에 조성물로서 본 발명의 이중특어직 항체를 포함하는 조성물이 담긴 제1 용기; 및 (b) 내부에 조성물로서 추가의 세포독성제 또는 그 밖의 치료제를 포함하는 조성물이 담긴 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서 제조 물품은 조성물이 특정한 병태를 치료하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 제조 물품은 약학적으로-허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수(bacteriostatic water for injection: BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
치료 방법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드는 암의 치료 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 암은 EGFR을 발현하는 세포를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 결장직장암(CRC), 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN), 비소세포 폐암(NSCLC), 전립선암, 유방암, 결장/직장암, 두경부암, 위식도암, 간암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 신장암 또는 췌장암의 치료 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 EGFR 억제제 치료에 내성인 대상체를 치료하는 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 KRAS 돌연변이를 보유하는 대상체를 치료하는 방법에서 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 EGFR 억제제 치료에 내성이고 KRAS 돌연변이를 보유하는 대상체를 치료하는 방법에서 사용된다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자는 본 발명에서 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변경 및 치환을 고안해 낼 것이다. 본원에 설명된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법과 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
실시양태
실시양태 1은 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 2는 절단 가능한 링커가 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 1의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 3은 절단 가능한 링커가 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 1 내지 2 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 4는 절단 가능한 링커가 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 5는 절단 가능한 링커가 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 1 내지 4 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 6은 절단 가능한 링커가 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함하는, 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 7은 절단 가능한 링커가 프로테아제에 의해 절단 가능한 것인, 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 8은 프로테아제가 종양 특이적 프로테아제를 포함하는, 실시양태 7의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 9는 프로테아제가 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함하는, 실시양태 7 내지 8 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 10은 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함하는, 실시양태 9의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 11은 세린 프로테아제가 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함하는, 실시양태 9의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 12는 단리된 폴리펩티드가 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 13은 항원 결합 도메인이 절단 가능한 링커에 대해 C-말단인, 실시양태 12의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 14는 단리된 폴리펩티드가 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 추가로 포함하는, 실시양태 1 내지 11 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 15는 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 절단 가능한 링커에 대해 C-말단인, 실시양태 14의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 16은 절단 가능한 링커가 구조식 I: A1-L1-P1에 따른 배열에서 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인에 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편에 펩티드를 연결시키고, 상기 식에서 A1이 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 포함하고; L1이 절단 가능한 링커를 포함하고; P1이 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함하는, 실시양태 1 내지 15 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 17은 P1이 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A1이 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되는, 실시양태 16의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 18은 P1이 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A1이 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되는, 실시양태 16의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 19는 P1이 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A1에 결합되는, 실시양태 16 내지 18 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 20은 P1이 표적 항원 또는 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는, 실시양태 16 내지 19 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 21은 P1이 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 16 내지 20 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 22는 P1이 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 16 내지 21 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 23은 P1이 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 16 내지 22 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 24는 P1이 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 16 내지 23 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 25는 P1이 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함하는, 실시양태 16 내지 23 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 26은 P1이 사이클릭 펩티드를 포함하는, 실시양태 16 내지 25 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 27은 P1이 반감기 연장 모이어티에 추가로 연결되는, 실시양태 16 내지 26 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 28은 반감기 연장 모이어티가 단일 도메인 항체인, 실시양태 27의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 29는 단일 도메인 항체가 10G를 포함하는, 실시양태 28의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 30은 A1이 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 낙타과 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH), Fab, Fab', Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 16 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 31은 표적 항원이 종양 항원을 포함하는, 실시양태 16 내지 30 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 32는 A1이 Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 30 내지 31 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 33은 A1이 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함하는, 실시양태 16 내지 32 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 34는 표적 항원이 이펙터 세포 항원을 포함하는, 실시양태 16 내지 30 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 35는 A1이 scFv를 포함하는, 실시양태 34의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 36은 scFv가 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함하는, 실시양태 35의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 37은 A1이 사이토카인을 포함하는, 실시양태 16 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 38은 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 야생형 사이토카인인, 실시양태 37의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 39는 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 사이토카인의 뮤테인인, 실시양태 37의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 40은 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체 또는 인터류킨 수용체인, 실시양태 37 내지 39 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 41은 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, IL-21 수용체 또는 TGF-β 수용체를 포함하는, 실시양태 37 내지 40 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다
실시양태 42는 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함하는, 실시양태 37 내지 41 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 43은 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGFβ를 포함하는, 실시양태 37 내지 42 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 44는 단리된 폴리펩티드가 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드와 복합체화되는, 실시양태 1 내지 43 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 45는 제2 단리된 폴리펩티드가 구조식 II: A2-L2-P2에 따른 배열로 있으며, 상기 식에서 A2가 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2가 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2가 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함하는, 실시양태 44의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 46은 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 45의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 47은 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 45 내지 46 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 48은 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 45 내지 47 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 49는 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 45 내지 48 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 50은 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함하는, 실시양태 45 내지 49 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 51은 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 6의 아미노산 서열(LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함하는, 실시양태 45 내지 50 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 52는 P2가 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A2가 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되는, 실시양태 45 내지 51 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 53은 P2가 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A2가 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되는, 실시양태 45 내지 51 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 54는 P2가 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A2에 결합되는, 실시양태 45 내지 53 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 55는 P2가 제2 표적 항원 또는 제2 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는, 실시양태 45 내지 54 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 56은 P2가 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 45 내지 55 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 57은 P2가 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 45 내지 56 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 58은 P2가 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 45 내지 57 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 59는 P2가 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는, 실시양태 45 내지 56 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 60은 P2가 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함하는, 실시양태 45 내지 59 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 61은 P2가 사이클릭 펩티드를 포함하는, 실시양태 45 내지 60 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 62는 A2가 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 낙타과 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH), Fab, Fab', Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 45 내지 61 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 63은 제2 표적 항원이 종양 항원을 포함하는, 실시양태 45 내지 62 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 64는 A2가 Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는, 실시양태 62의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 65는 A2가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함하는, 실시양태 45 내지 64 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 66은 제2 표적 항원이 이펙터 세포 항원을 포함하는, 실시양태 45 내지 62 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 67은 A2가 scFv를 포함하는, 실시양태 62의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 68은 scFv가 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함하는, 실시양태 66 내지 67 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 69는 A2가 제2 사이토카인을 포함하는, 실시양태 45 내지 61 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 70은 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 야생형 사이토카인인, 실시양태 69의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 71은 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 사이토카인의 뮤테인인, 실시양태 69의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 72는 제2 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체 또는 인터류킨 수용체인, 실시양태 69 내지 71 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 73은 제2 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, IL-21 수용체 또는 TGF-β 수용체를 포함하는, 실시양태 69 내지 72 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 74는 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함하는, 실시양태 69 내지 73 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 75는 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGFβ를 포함하는, 실시양태 69 내지 74 중 어느 하나의 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
실시양태 76은 상기 실시양태 중 어느 하나의 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
실시양태 77은 상기 실시양태 중 어느 하나의 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산 분자를 포함한다.
실시양태 78은 실시양태 77에 따른 단리된 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다.
실시양태 79는 상기 실시양태 중 임의의 것에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드의 생산 방법으로서, 세포를 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 세포가 실시양태 78의 벡터를 포함하는 방법을 포함한다.
실시양태 80은 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드의 제조 방법으로서, (a) 실시양태 77의 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포를 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계 및 (b) 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
실시예
실시예 1. 단백질분해 속도 및 혈청 안정성
폴리펩티드 복합체를 종양 및 혈청 프로테아제 활성에 대해 평가하였다.
간략하게 말하면, 다양한 종양 프로테아제에 의해 인식되는 절단 가능한 링커를 사용하여 폴리펩티드 복합체에 유전적으로 융합된 펩티드 마스크를 포함하는 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4 및 PC-5를 생성하였다. 폴리펩티드 복합체를 다양한 종양 프로테아제에 노출시켰다. 폴리펩티드 복합체를 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13, MMP14, uPa, MTSP1 및 헵신에 노출시켰을 때 절단 속도를 결정하였다. 겉보기 절단 속도 및 상대적 혈청 안정성에 대한 데이터는 표 2 내지 4에서 볼 수 있다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
데이터는 혈청 단백질분해 활성이 혈액보다 크다는 것을 보여준다. 데이터는 또한 절단 가능한 링커 서열이 인간 혈청에서 안정성을 유지하면서 단백질분해 속도를 증가시켰음을 보여준다.
실시예 2. 절단 가능한 링커에 의한 유사한 마스킹의 확인
폴리펩티드 복합체를 EGFR 및 CD3ε 결합에 대해 평가하였다.
간략하게 말하면, EGFR 마스킹을 포함하는 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4 및 PC-5의 결합을 측정하였다. 도 1a에서 볼 수 있는 바와 같이, 다양한 폴리펩티드 복합체에 있어 EGFR 마스킹은 결합을 차단한다. 종양 프로테아제 MTSP1에 의한 절단 후, 폴리펩티드 복합체는 결합할 수 있다(도 1b).
EGFR 결합 이동의 세부사항은 표 5 내지 8에서 볼 수 있다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
폴리펩티드 복합체를 CD3ε 결합에서도 대해 평가하였다. 간략하게 말하면, CD3ε 마스킹을 포함하는 폴리펩티드 복합체 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4 및 PC-5의 결합을 결정하였다. 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 다양한 폴리펩티드 복합체에 있어 마스크는 결합을 차단한다. 종양 프로테아제 MTSP1에 의한 절단 후, 폴리펩티드 복합체는 결합할 수 있다(도 2b).
CD3ε 결합 이동의 세부사항은 표 9 내지 12에서 볼 수 있다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
폴리펩티드 복합체 결합을 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 평가하였다. 비오틴화된 펩티드를 뉴트라비딘 코팅된 플레이트에서 포획하였다. 2차 항체를 사용하여 결합된 폴리펩티드 복합체를 검출하였다. 마스크를 포함하는 PC-2, PC-3, PC-4, PC-5, PC-1에 대한 데이터 및 PC-6 및 마스크의 절단 후의 데이터는 도 3a 내지 3b에서 볼 수 있으며 EC50 결합 데이터는 표 13 내지 14에 요약되어 있다.
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 3. 절단 가능한 링커에 의한 유사한 T-세포 이동의 확인
다음으로 폴리펩티드 복합체를 기능적 시험관내 종양 세포 사멸 및 관련 T 세포 활성화 연구에서 평가하였다.
간략하게 말하면, HCT116 세포를 96웰 조직 배양 처리된 평평한 바닥 플레이트에 시딩하고 밤새 부착되도록 하였다. 다음날, 배양 배지 및 비부착성 세포를 제거하고 지시된 농도에서 적정된 폴리펩티드 복합체를 함유하는 신선한 배지로 교체하였다. PC-2, PC-3, PC-4, PC-5, PC-1 및 PC-6에 대한 데이터는 도 4a 내지 4e 및 표 15 내지 16에서 볼 수 있다.
Figure pct00018
Figure pct00019
실시예 4. 생체내 시노몰구스 원숭이 PK 비교
폴리펩티드 복합체를 시노몰구스 원숭이에서 약동학 및 안전성에 대해 평가하였다.
시노몰구스 원숭이
어린 나이브(naive) 수컷 시노몰구스 원숭이를 군별로 짝을 지어 사육하고 독특한 신체 문신으로 식별하였다. 모든 동물을 연구 시작 전 3일 동안 사육 조건에 순응시켰다. 시작 전에 모든 동물은 연구 수의사에 의해 신체 검사를 받았다. 연구 수의사의 의견에 따라 건강하고 기준을 충족하는 동물만이 연구에 허용되었다. 음식은 투여 전에 밤새 금지되었다. Purina 5049가 동물의 체격에 적합한 양으로 매일 제공되었다. 수돗물은 자동 급수 장치를 통해 자유롭게 제공되었다.
약동학
폴리펩티드 PC-1, PC-2, PC-3, PC-4, 및 PC-5에 대한 폴리펩티드 복합체 약동학을 2 내지 3kg 체중의 나이브 수컷 시노몰구스 원숭이에서 결정하였다. 간단히 말하면, 투여군당 2마리로 군 사육된 원숭이를 사용하고 투여 전에 주변 환경에 순응되도록 하였다. 동물을 투여 및 출혈 전에 케타민 HCL 10 내지 20 mg/kg IM으로 진정시켰다. 농축된 시험 물품을 멸균 포스페이트 완충된 식염수로 희석하고 kg 단위의 동물 질량에 대한 양으로 동물에게 투여하였다. 각 시험 물품의 용량을 1 mL/kg 투여 용적에서 정맥내 투여하였다. 투여를 위해, 좌측 및 우측 사지를 고정시키고 알코올로 수술 준비시켰다. 복재 정맥을 식별하고, IV 볼루스 주입을 위해 (좌측 또는 우측 사지에) 표준 카테터를 배치하였다. 시험 물품 투여 용액을 주사기를 통해 카테터에 부착하였고, 볼루스 주입은 주사기의 수동 압축을 통해 발생하였다.
혈액 수집을 위해, 케타민을 사용하여 동물을 진정시키고, 대퇴부 삼각형을 준비하고, 22G 1.5인치 바늘, 진공채혈기 쉬스(vacutainer sheath) 및 수집 튜브를 사용하여 대퇴부 정맥으로부터 혈액을 수집하였다. 정맥 천자 후, 지혈이 달성될 때까지 정맥의 수동 압축을 유지하였다. 혈액 수집은 동물의 체중에 기반하였으며 IACUC에 의해 설정된 AGI 최대 출혈을 초과하지 않았다. 혈액을 EDTA 튜브에 수집하고 혈장으로 가공처리하였다. 혈액 샘플을 10분 동안 3000xg에서 저온 원심분리하여 혈장으로부터 세포를 분리하였다. 혈장 상청액을 수거하고 분석 전에 냉동 보관하였다.
시노몰구스 혈장 샘플 중의 폴리펩티드 복합체의 농도는 ELISA에 의해 결정하였다. 간단히 말하면, 항-his태그 포획 항체를 ELISA 플레이트에 직접 코팅하였다. 동물 PK 시험 샘플을 비교할 수 있는 보정 곡선을 생성하기 위해 시모몰구스 혈청 중의 폴리펩티드 복합체의 표준 희석액을 사용하였다. 표준물 및 시험 샘플을 플레이트에 첨가하고 밤새 차갑게 인큐베이션하였다. 신호가 표준 곡선의 적절한 동적 범위 내에 있는지 확인하기 위해 시험 샘플의 몇몇 상이한 희석액을 사용하였다. 플레이트를 세척하고 항-인간 HRP 검출 항체와 함께 짧은 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 표준 ELISA 기술을 사용하여 세척하고 현상하고 중단하였다. 450nm에서의 흡광도 대 기지의 폴리펩티드 복합체 농도를 플롯팅한 표준 곡선을 사용하여 각 마우스 PK 혈장 샘플 중의 미지의 시험 물품의 농도를 계산하였다. 폴리펩티드 복합체의 농도를 시간에 대해 플롯팅하고 표준 2단계 분포 및 제거 약동학 모델에 핏팅시켰다. 시노몰구스 원숭이로부터의 PC-1, PC-7, PC-4, 및 PC-5에 대해 계산된 약동학 및 매개변수는 도 5a 내지 5d 및 표 17 내지 20에 나타낸다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
데이터는 절단 가능한 링커를 포함하는 폴리펩티드 복합체가 시노몰구스 원숭이에서 연장된 혈청 반감기를 나타낸다는 것을 보여준다.
실시예 5. 생체내 시노몰구스 원숭이 사이토카인 방출
사이토카인 방출을 시노몰구스 원숭이에서 측정하였다.
처리 후 혈장에 존재하는 사이토카인은 BD Biosciences의 비인간 영장류 Th1/Th2 세포측정 비드 어레이 분석 키트(카탈로그 번호 557800)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 측정하였다. 데이터는 도 6a 내지 6d 및 표 21에 나타낸다.
Figure pct00024
실시예 6. 생체내 시노몰구스 원숭이 간 ALT/AST
ALT/AST 수준을 측정하였다. 도 7a 및 7b 및 표 22에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리펩티드 복합체는 시노몰구스 원숭이에서 간 독성을 예방하였다.
Figure pct00025
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 당업자라면, 본 발명에서 벗어나지 않으면서 다수의 변형, 변경 및 치환을 고안해 낼 수 있을 것이다. 본원에 설명된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이들 청구범위 내의 방법과 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> JANUX THERAPEUTICS, INC. <120> CLEAVABLE LINKER COMPOSITION AND METHODS <130> 52426-720.601 <140> <141> <150> 63/064,268 <151> 2020-08-11 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Leu Ser Gly Arg Ser Asp Ala Gly 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Asn His 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ile Ser Ser Gly Leu Leu Ser Gly Arg Ser Asp Ala Gly 1 5 10 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Ala Ala Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp 1 5 10 15 Ala Gly <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 545 550 555 560 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 565 570 575 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 580 585 590 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 595 600 605 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 610 615 620 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 625 630 635 640 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ala Ala His His His His 645 650 655 His His His His 660 <210> 20 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Gly Gly Pro Cys Arg Ser His Ile Asp Val Ala Lys Pro Ile Cys Val 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Ala Gly Ser 20 25 30 Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ile Leu Leu Thr Gln 35 40 45 Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser 50 55 60 Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln 65 70 75 80 Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser 85 90 95 Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 100 105 110 Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr 115 120 125 Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr 130 135 140 Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 145 150 155 160 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 165 170 175 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 180 185 190 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 195 200 205 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 210 215 220 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 225 230 235 240 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 245 250 255 <210> 21 <211> 660 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Phe 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Arg Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Val Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Gly Gln Ser 115 120 125 Gly Gln Gly Tyr Leu Trp Gly Cys Glu Trp Asn Cys Ala Gly Ile Thr 130 135 140 Thr Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Ala 145 150 155 160 Gly Ser Pro Leu Gly Leu Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val 165 170 175 Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr 180 185 190 Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala 195 200 205 Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly 210 215 220 Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 225 230 235 240 Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val Gln Pro Glu 245 250 255 Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 260 265 270 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 275 280 285 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 290 295 300 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala 305 310 315 320 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln 325 330 335 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr 340 345 350 Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr 355 360 365 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn 370 375 380 Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn 385 390 395 400 Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 405 410 415 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Lys 420 425 430 Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr 435 440 445 Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val 450 455 460 Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser 465 470 475 480 Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile 485 490 495 Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu 500 505 510 Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr 515 520 525 Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 530 535 540 Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 545 550 555 560 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 565 570 575 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 580 585 590 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 595 600 605 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 610 615 620 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 625 630 635 640 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ala Ala His His His His 645 650 655 His His His His 660 <210> 22 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Gln Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 23 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg 165 170 175 Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 210 215 220 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 245 250 255 Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu 260 265 270 Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val 275 280 285 His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val 290 295 300 Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg 305 310 315 320 Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met 325 330 335 Asn Ser Leu Gln Ser Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala 340 345 350 Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 355 360 365 Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 370 375 380 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 385 390 395 400 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 405 410 415 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 420 425 430 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 435 440 445 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 450 455 460 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly His His 465 470 475 480 His His His His His His Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala 485 490 495 Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 500 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 503 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg 165 170 175 Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg 210 215 220 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 245 250 255 Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu 260 265 270 Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val 275 280 285 His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val 290 295 300 Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg 305 310 315 320 Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met 325 330 335 Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala 340 345 350 Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 355 360 365 Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 370 375 380 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 385 390 395 400 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 405 410 415 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 420 425 430 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 435 440 445 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 450 455 460 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly His His 465 470 475 480 His His His His His His Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala 485 490 495 Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 500 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Ala Gly Leu Leu Ala Pro Pro Gly Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Ala 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Type I cytokine receptor sequence <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 27 Trp Ser Xaa Trp Ser 1 5

Claims (80)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열(LSGRSDAG)에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 서열번호 3의 아미노산 서열(ISSGLLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 서열번호 5의 아미노산 서열(SPLGLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 서열번호 6의 아미노산 (LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 프로테아제에 의해 절단 가능한 것인 단리된 폴리펩티드.
  8. 제7항에 있어서, 프로테아제가 종양 특이적 프로테아제를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  9. 제7항에 있어서, 프로테아제가 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP) 또는 세린 프로테아제를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 매트릭스 메탈로프로테아제가 MMP2, MMP7, MMP9, MMP13 또는 MMP14를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  11. 제9항에 있어서, 세린 프로테아제가 매트립타제, 우로키나제 또는 헵신을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  12. 제1항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드가 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 항원 결합 도메인이 절단 가능한 링커에 대해 C-말단인 단리된 폴리펩티드.
  14. 제12항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드가 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 추가로 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 절단 가능한 링커에 대해 C-말단인 단리된 폴리펩티드.
  16. 제1항에 있어서, 절단 가능한 링커가 구조식 I: A1-L1-P1에 따른 배열(configuration)에서 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인에 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편에 펩티드를 연결시키고, 상기 식에서 A1이 표적 항원에 결합하는 항원 결합 도메인 또는 사이토카인 수용체에 결합하는 사이토카인 또는 사이토카인 단편을 포함하고; L1이 절단 가능한 링커를 포함하고; P1이 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 사이토카인 수용체에 대한 사이토카인의 결합을 손상시키는 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, P1이 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A1이 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  18. 제16항에 있어서, P1이 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A1이 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  19. 제16항에 있어서, P1이 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층(Pi-stacking) 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A1에 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  20. 제16항에 있어서, P1이 표적 항원 또는 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 폴리펩티드.
  21. 제16항에 있어서, P1이 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  22. 제16항에 있어서, P1이 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, P1이 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  24. 제16항에 있어서, P1이 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  25. 제16항에 있어서, P1이 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  26. 제16항에 있어서, P1이 사이클릭 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  27. 제16항에 있어서, P1이 반감기 연장 모이어티에 추가로 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  28. 제27항에 있어서, 반감기 연장 모이어티가 단일 도메인 항체인 단리된 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 단일 도메인 항체가 10G를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  30. 제16항에 있어서, A1이 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 낙타과(camelid) 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH), Fab, Fab', Fab 경쇄 폴리펩티드, 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  31. 제30항에 있어서, 표적 항원이 종양 항원을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  32. 제31항에 있어서, A1이 Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  33. 제30항에 있어서, A1이 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  34. 제16항에 있어서, 표적 항원이 이펙터 세포 항원을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  35. 제34항에 있어서, A1이 scFv를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, scFv가 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  37. 제16항에 있어서, A1이 사이토카인을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  38. 제37항에 있어서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 야생형 사이토카인인 단리된 폴리펩티드.
  39. 제37항에 있어서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 사이토카인의 뮤테인인 단리된 폴리펩티드.
  40. 제16항에 있어서, 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체 또는 인터류킨 수용체인 단리된 폴리펩티드.
  41. 제16항에 있어서, 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, IL-21 수용체 또는 TGF-β 수용체를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  42. 제16항에 있어서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  43. 제16항에 있어서, 사이토카인 또는 사이토카인 단편이 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGFβ를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  44. 제16항에 있어서, 상기 단리된 폴리펩티드가 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편을 포함하는 제2 단리된 폴리펩티드와 복합체화되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  45. 제44항에 있어서, 제2 단리된 폴리펩티드가 구조식 II: A2-L2-P2에 따른 배열로 있으며, 상기 식에서 A2가 제2 항원 결합 도메인 또는 제2 사이토카인을 포함하고; L2가 제2 절단 가능한 링커를 포함하고; P2가 제2 표적 항원에 대한 제2 항원 결합 도메인의 결합을 손상시키거나 제2 사이토카인 수용체에 대한 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편의 결합을 손상시키는 제2 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  46. 제45항에 있어서, 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 1의 아미노산 (LSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  47. 제45항에 있어서, 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 3의 아미노산 (ISSGLLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  48. 제45항에 있어서, 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 26의 아미노산 서열(AGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  49. 제45항에 있어서, 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 4의 아미노산 서열(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  50. 제45항에 있어서, 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 5의 아미노산 (SPLGLSGRSDAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  51. 제45항에 있어서, 제2 절단 가능한 링커가 서열번호 6의 아미노산 (LSGRSDAGSPLGLAG)을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  52. 제45항에 있어서, P2가 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되고 A2가 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  53. 제45항에 있어서, P2가 제2 절단 가능한 링커에 C-말단 연결되고 A2가 제2 절단 가능한 링커에 N-말단 연결되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  54. 제45항에 있어서, P2가 이온성 상호작용, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 파이-적층 상호작용 및 H-결합 상호작용 또는 이들의 조합을 통해 A2에 결합되는 것인 단리된 폴리펩티드.
  55. 제45항에 있어서, P2가 제2 표적 항원 또는 제2 사이토카인 수용체에 대해 70% 미만의 서열 상동성을 갖는 것인 단리된 폴리펩티드.
  56. 제45항에 있어서, P2가 적어도 10개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  57. 제45항에 있어서, P2가 적어도 10개 아미노산 길이 및 20개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  58. 제57항에 있어서, P2가 적어도 16개 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  59. 제45항에 있어서, P2가 40개 이하의 아미노산 길이의 펩티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  60. 제45항에 있어서, P2가 사이클릭 펩티드 또는 선형 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  61. 제45항에 있어서, P2가 사이클릭 펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  62. 제45항에 있어서, A2가 항체, 단일 사슬 가변 단편(scFv), 중쇄 가변 도메인(VH 도메인), 경쇄 가변 도메인(VL 도메인), 낙타과 유래의 단일 도메인 항체의 가변 도메인(VHH), Fab, Fab', Fab 경쇄 폴리펩티드, 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  63. 제45항에 있어서, 제2 표적 항원이 종양 항원을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  64. 제62항에 있어서, A2가 Fab 경쇄 폴리펩티드 또는 Fab 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  65. 제62항에 있어서, A2가 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 결합 도메인을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  66. 제45항에 있어서, 제2 표적 항원이 이펙터 세포 항원을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  67. 제62항에 있어서, A2가 scFv를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  68. 제67항에 있어서, scFv가 항-CD3e 단일 사슬 가변 단편을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  69. 제45항에 있어서, A2가 제2 사이토카인을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  70. 제69항에 있어서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 야생형 사이토카인인 단리된 폴리펩티드.
  71. 제69항에 있어서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 사이토카인의 뮤테인인 단리된 폴리펩티드.
  72. 제69항에 있어서, 제2 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체 또는 인터류킨 수용체인 단리된 폴리펩티드.
  73. 제72항에 있어서, 제2 사이토카인 수용체가 인터페론 수용체, GM-CSF 수용체, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-7 수용체, IL-10 수용체, IL-12 수용체, IL-15 수용체, IL-21 수용체 또는 TGF-β 수용체를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  74. 제72항에 있어서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 인터페론, GM-CSF, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 또는 IL-21을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  75. 제72항에 있어서, 제2 사이토카인 또는 제2 사이토카인 단편이 IL-2, IL-12, IL-6, IL-4, IL-10 또는 TGFβ를 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
  76. 제1항에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  77. 제1항에 따른 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 재조합 핵산.
  78. 제77항에 따른 재조합 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  79. 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드의 생산 방법으로서, 상기 방법이 세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포가 제78항의 벡터를 포함하는 것인 방법.
  80. 절단 가능한 링커를 포함하는 단리된 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 상기 방법이 (a) 제77항의 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포를 상기 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건 하에 배양하는 단계 및 (b) 상기 폴리펩티드를 단리하는 단계를 포함하는 방법.
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