CN117642156A - 涉及靶向egfr和效应细胞抗原的肿瘤活化抗体的组合物和方法 - Google Patents
涉及靶向egfr和效应细胞抗原的肿瘤活化抗体的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了用于将T细胞重定向至癌症的多特异性抗体、其药物组合物、以及核酸，及其制备和发现方法，所述多特异性抗体依赖于抗体的一个抗原相互作用部分与肿瘤相关抗原或标记物例如表皮生长因子受体(EGFR)的结合，而第二抗原相互作用部分可以结合至T细胞上的效应细胞抗原，例如CD3。
Description
交叉引用
本申请要求于2021年5月12日提交的美国临时申请号63/187,690和于2022年4月4日提交的美国临时申请号63/327,317的权益，这两项申请中的每一个均通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交并据此通过引用以其整体并入的序列表。所述ASCII副本创建于2022年4月29日，被命名为52426-738_601_SL.txt并且大小为542,564字节。
发明内容
在某些实施方案中，本文描述了根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包含为人的或人源化的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，L1被结合至第一抗原识别分子的N末端。在一些实施方案中，A2被结合至第一抗原识别分子的C末端。在一些实施方案中，L1被结合至第一抗原识别分子的C末端。在一些实施方案中，A2被结合至第一抗原识别分子的N末端。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。在一些实施方案中，A1是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A1是单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)或可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段，其与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3。在一些实施方案中，A1包含可变轻链和可变重链，它们各自能够特异性地结合至人CD3。在一些实施方案中，A1包含选自莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(otelixizumab)(TRX4)、替利组单抗(teplizumab)(MGA031)、维西珠单抗(visilizumab)(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，A1结合至作为效应细胞上TCR-CD3复合物的一部分的多肽。在一些实施方案中，作为TCR-CD3复合物的一部分的多肽是人CD3ε。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3 LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ ID NO:2和LC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ ID NO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3 LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ IDNO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原识别分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段是人源化的或人的。在一些实施方案中，A2是Fab。在一些实施方案中，Fab包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。在一些实施方案中，Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ IDNO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ IDNO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的单链可变片段(scFv)的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的单链可变片段(scFv)的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A2进一步包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物是根据式Ia：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，P1削弱A1与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合与A1结合。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。在一些实施方案中，P2削弱A2与EGFR的结合。在一些实施方案中，P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合被结合至A2。在一些实施方案中，P2在抗原结合位点处或附近被结合至A2。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于70％的序列同源性。在一些实施方案中，P1或P2包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1或P2包含环肽或线性肽。在一些实施方案中，P1或P2包含环肽。在一些实施方案中，P1或P2包含线性肽。在一些实施方案中，P1包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1被结合至A1的N末端。在一些实施方案中，L1被结合至A1的C末端。在一些实施方案中，L2被结合至A2的N末端。在一些实施方案中，L2被结合至A2的C末端。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2具有包含(G2S)n的式，其中n是1至3的整数(SEQ ID NO:840)。在一些实施方案中，L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P1变得与A1未结合，从而使A1暴露于效应细胞抗原。在一些实施方案中，当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P2变得与A2未结合，从而将A2暴露于EGFR。在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包含MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(matriptase)(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，L1或L2包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白(legumain)可切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含根据SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含根据SEQ ID NO:27-35中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5
(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6
(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7
(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1包含白蛋白。在一些实施方案中，H1包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1包含多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是645gH1gL1。在一些实施方案中，单结构域抗体是645dsgH5gL4。在一些实施方案中，单结构域抗体是23-13-A01-sc02。在一些实施方案中，单结构域抗体是A10m3或其片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7r-31。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7h-11-15。在一些实施方案中，单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。在一些实施方案中，单结构域抗体是10E。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ IDNO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，单结构域抗体是SA21。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。在一些实施方案中，L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L3包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44-61中的任一者具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:52和SEQID NO:53具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:63具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文描述了药物组合物，其包含：(a)本文所述的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方案中，本文描述了分离的重组核酸分子，所述分离的重组核酸分子编码本文所述的分离的多肽或多肽复合物。
在某些实施方案中，本文描述了根据式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与EGFR结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。在一些实施方案中，当L1a未被切割时，P1a削弱了第一抗原识别分子与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，效应细胞抗原是抗CD3效应细胞抗原。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。在一些实施方案中，P1a包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1a包含环肽或线性肽。在一些实施方案中，P1a包含环肽。在一些实施方案中，P1a包含线性肽。在一些实施方案中，P1a包含选自SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含选自SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1a包含白蛋白。在一些实施方案中，H1a包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1a包含多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是645gH1gL1。在一些实施方案中，单结构域抗体是645dsgH5gL4。在一些实施方案中，单结构域抗体是23-13-A01-sc02。在一些实施方案中，单结构域抗体是A10m3或其片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7r-31。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7h-11-15。在一些实施方案中，单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。在一些实施方案中，单结构域抗体是10G。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ ID NO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，单结构域抗体是SA21。在一些实施方案中，H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L1a)。在一些实施方案中，L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L1a包含根据SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含根据SEQ ID NO:27-35中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5
(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6
(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7
(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文描述了包含根据构型1的结构排列的多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接到P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在某些实施方案中，本文描述了包含根据构型2的结构排列的多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接到P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，就像每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入一样。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求中详细地阐述。通过参考以下阐述其中利用了本公开的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A-1B示出了本公开的多肽复合物。
图2示出了通过ELISA测量的本公开的若干种多肽复合物与EGFR的结合。
图3示出了通过ELISA测量的本公开的若干种多肽复合物与CD3的结合。
图4示出了在CD8+T细胞的存在下，本公开的多肽复合物介导的HCT116肿瘤细胞杀伤。
图5示出了在CD8+T细胞的存在下，本公开的多肽复合物介导的A431肿瘤细胞杀伤。
图6示出了本公开的多肽复合物针对人和食蟹猴EGFR的动力学结合和交叉反应性。
图7示出了本公开平衡的多肽复合物针对人和食蟹猴EGFR的结合和交叉反应性。
图8示出了若干种多肽复合物针对人和食蟹猴CD3ε的动力学结合和交叉反应性。
图9示出了本公开的多肽复合物针对人和食蟹猴CD3ε的平衡结合和交叉反应性。
图10A-10B示出了本公开的多肽复合物在单次IV推注注射(bolus injection)后在食蟹猴中的药代动力学。
图11A-11L示出了本公开的多肽复合物在单次IV推注后在食蟹猴中的细胞因子释放。
图12示出了本公开的多肽复合物的给药对炎性细胞因子水平的影响。
图13A-13D示出了本公开的多肽复合物在单次IV推注后在食蟹猴中的血清肝酶。
图14示出了如通过ELISA测量的通过本公开的肽结合αEGFR IgG的结合曲线。
图15示出了如通过ELISA测量的通过本公开的肽对αEGFR IgG与EGFR抗原结合的抑制。
图16示出了如通过ELISA测量的通过本公开的肽结合αEGFR Fab的结合曲线。
图17示出了如通过ELISA测量的通过本公开的肽对αEGFR Fab与EGFR抗原结合的抑制。
图18示出了如通过ELISA测量的通过肽8的丙氨酸扫描肽对αEGFR Fab与EGFR抗原结合的抑制。
图19示出了如通过ELISA测量的通过肽8的丙氨酸扫描肽对αEGFR Fab与EGFR抗原结合的抑制。
图20示出了使用WebLogo 3.7.4产生的优化的αEGFR Fab肽8的共有序列。
图21示出了通过经由噬菌体展示鉴定的肽的αEGFR Fab结合。
图22示出了通过经由噬菌体展示鉴定的肽的αEGFR Fab结合。
图23示出了通过肽鉴定的噬菌体展示抑制αEGFR Fab与EGFR的结合。
图24示出了通过经由噬菌体展示鉴定的肽对αEGFR Fab与EGFR结合的抑制。
图25示出了在带有HCT116异种移植肿瘤的移植有人PBMC的NCG小鼠中，通过不同量的PC1对体内肿瘤生长的抑制。
图26示出了在带有HCT116异种移植肿瘤的移植有人PBMC的NCG小鼠中，通过不同量的PC5对体内肿瘤生长的抑制。
图27示出了在带有HCT116异种移植肿瘤的移植有人PBMC的NCG小鼠中，通过不同量的PC7对体内肿瘤生长的抑制。
图28示出了在带有HCT116异种移植肿瘤的移植有人PBMC的NCG小鼠中，通过不同量的PC6对体内肿瘤生长的抑制。
图29示出了如通过ELISA测量的PC1和PC4与人CD3ε的结合。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。
图30示出了如通过ELISA测量的PC1和PC4与食蟹猴CD3ε的结合。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。
图31示出了如通过ELISA测量的PC1和PC4与人EGFR的结合。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。
图32示出了如通过ELISA测量的PC1和PC4与食蟹猴EGFR的结合。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。
图33示出了如通过ELISA测量的PC4与人白蛋白的结合。
图34示出了如通过ELISA测量的PC4与食蟹猴白蛋白的结合。
图35示出了在外周血单核细胞(PBMC)的存在下PC1和PC4介导的A549细胞的杀伤。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。
图36示出了随着PC4和PC1浓度的增加，EGFR阳性HCT116肿瘤细胞中的IFNγ细胞因子水平。PC4在指示的地方进行蛋白酶处理。
图37示出了随着PC4和PC1浓度的增加，EGFR阳性HCT116肿瘤细胞中的TNF细胞因子水平。PC4在指示的地方进行蛋白酶处理。
图38示出了随着PC4和PC1浓度的增加，EGFR阳性A549肿瘤细胞中的IFNγ细胞因子水平。PC4在指示的地方进行蛋白酶处理。
图39示出了随着PC4和PC1浓度的增加，EGFR阳性A549肿瘤细胞中的TNF细胞因子水平。PC4在指示的地方进行蛋白酶处理。
图40示出了本公开的HCT116小鼠肿瘤模型研究的示意性表示。
图41示出了在植入HCT116肿瘤细胞的移植有PBMC的小鼠中，平均肿瘤体积相对于用PC1、PC7和PC6处理的天数。
图42示出了在植入HCT116肿瘤细胞的移植有PBMC的小鼠中，肿瘤体积相对于用PC5和媒介物处理的天数。
图43示出了在用PC1、PC5和PC6处理的植入HCT116肿瘤细胞的移植有PBMC的小鼠中的存活百分比。
图44示出了本公开的人结肠直肠癌(CRC)器官样研究的示意性表示。
图45示出了在人结肠直肠癌肿瘤样物中用PC1和PC5诱导活化标志物CD25、CD69、4-1BB和颗粒酶。
图46示出了在食蟹猴中PC1的最大耐受剂量(MTD)和PC4的无观察到的副作用水平(NOAEL)。
图47示出了在IV推注注射后在不同给药量的PC4的情况下在食蟹猴中的药代动力学。
图48示出了通过ELISA测量的PC10和PC11与EGFR的结合。
图49示出了通过ELISA测量的PC10和PC11与CD3的结合。
图50示出了在CD8+T细胞的存在下PC10和PC11介导的HCT116肿瘤细胞杀伤的图。
图51A-51F示出了如通过ELISA测量的通过抗CD3 scFv肽A和肽B的丙氨酸扫描肽的抗CD3 scFv结合。
图52A-52F示出了如通过ELISA测量的抗CD3 scFv肽A和肽B的丙氨酸扫描肽对抗CD3 scFv与CD3结合的抑制。
图53A-53B示出了如通过ELISA测量的通过优化的抗CD3 scFv肽B序列的抗CD3scFv结合。
图54A-54B示出了如通过ELISA测量的通过优化的抗CD3 scFv肽B序列对抗CD3scFv与CD3结合的抑制。
图55示出了使用WebLogo 3.7.4产生的优化的抗CD3 scFv肽B序列的核心序列基序。
具体实施方式
多特异性抗体将源自两种或更多种抗体的不同结合特异性的益处组合到单一组合物中。用于将T细胞重定向至癌症的多特异性抗体在临床前研究和临床研究两者中已经显示出前景。这种方法依赖于抗体的一个抗原相互作用部分与肿瘤相关抗原或标志物的结合，而第二个抗原相互作用部分可以结合至T细胞上的效应细胞抗原，如CD3，其然后触发细胞毒性活性。一种此类肿瘤相关抗原是表皮生长因子受体(EGFR)。EGFR是这样的跨膜蛋白，其是细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族成员的受体。EGFR是癌症中最常见的过表达的膜蛋白。然而，EGFR的表达不局限于肿瘤，而是在全身广泛表达，导致EGFR导向疗法的全身毒性。
与嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)疗法相反，T细胞接合物(TCE)治疗剂具有若干益处，包括它们不是细胞疗法，因此可以作为现成的疗法提供。虽然TCE治疗剂在血液学癌症中显示出强大的抗肿瘤活性，但由于现有TCE技术的局限性，即(i)导致细胞因子释放综合征(CRS)的免疫系统过度活化，(ii)靶标上的健康组织毒性，以及(iii)导致短半衰期的不良药代动力学(PK)，开发用于治疗实体瘤的TCE面临挑战。CRS源于T细胞的系统性活化，并且可以导致危及生命的炎性细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)的升高。在较差的临床研究中，已经观察到在服用使用其他平台开发的T细胞接合物以治疗癌症患者后，严重和急性CRS导致剂量有限的毒性和死亡。这种毒性限制了可以安全服用的T细胞接合物的最大血液水平。因为对靶标上的健康组织的毒性，所以T细胞接合物的有效性也受到了限制。使用不是为肿瘤规格活化而设计的平台开发的T细胞接合物已经导致了在健康组织中由靶标表达导致的临床保留和剂量限制性毒性。T细胞接合物也受到短半衰期的限制。T细胞接合物在施用后很快达到亚治疗水平，因为它们由于其短的暴露半衰期而很快从体内消除。由于这个原因，通常通过低剂量的连续输注泵在数周时间段内施用诸如博纳吐单抗(blinatumomab)的T细胞接合物，以克服短半衰期的挑战并维持体内药物的治疗水平。连续施用方案对患者来说代表了显著的负担。
为了克服与T细胞接合物的有效性相关联的这些挑战，本文描述了包含选择性地结合至效应细胞抗原和EGFR的结合结构域的多肽或多肽复合物，其中结合结构域中的一个或多个在肿瘤微环境中被选择性地活化，并且分离的多肽或多肽复合物包含半衰期延长分子。此类修饰降低了CRS和靶标上的健康组织的毒性风险，改善了活化前的血流稳定性和血清半衰期。本文描述的多肽或多肽复合物在低水平的靶标表达下具有活性，并且容易制造。
在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗癌症的方法中。在一些实施方案中，癌症具有表达EGFR的细胞。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、结肠/直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌或胰腺癌的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗对EGFR抑制剂治疗有抗性的对象的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗具有KRAS突变的对象的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗对EGFR抑制剂治疗有抗性且具有KRAS突变的对象的方法中。在一些实施方案中，是治疗癌症的方法，其包括向有此需求的对象施用根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式Ia的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2进一步包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了根据式Ia的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2进一步包含P2和L2，其中P2是结合至A2的肽；并且L2是将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含式Ia的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2进一步包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含式Ia的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2进一步包含P2和L2，其中P2是结合至A2的肽；并且L2是将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了根据式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
第一抗原识别分子(A1)
在一些实施方案中，本文公开了多肽或多肽复合物，其中第一抗原识别分子结合至效应细胞抗原，并且第二抗原识别分子结合至EGFR。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3。在一些实施方案中，A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子。
在一些实施方案中，A1包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，A1包含为人的或人源化的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，L1被结合至抗体或抗体片段的N末端。在一些实施方案中，L1被结合至抗体或抗体片段的N末端，并且A2被结合至抗体或抗体片段的另一个N末端。在一些实施方案中，A2被结合至抗体或抗体片段的C末端。在一些实施方案中，L1被结合至抗体或抗体片段的C末端。在一些实施方案中，A2被结合至抗体或抗体片段的N末端。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。在一些实施方案中，A1是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A1是单结构域抗体。在一些实施方案中，A1包含可变轻链和可变重链，它们各自能够特异性地结合至人CD3。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段，其与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。在一些实施方案中，A1包含选自莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，A1包含结合EGFR的第一抗原识别分子。在一些实施方案中，A1包含可变轻链和可变重链，它们各自能够特异性地结合至人EGFR。
在一些实施方案中，结合至CD3的scFv包含scFv轻链可变结构域和scFv重链可变结构域。在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，scFv轻链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)；并且scFv轻链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
表1.抗CD3氨基酸序列(如由IMGT编号系统确定的CDR)
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在一些实施方案中，scFv轻链可变结构域包含互补决定区(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ ID NO:2和LC-CDR3：SEQ ID NO:3，并且其中CDR在LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，scFv轻链可变结构域包含互补决定区(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQ ID NO:9，并且其中CDR在LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ ID NO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6，并且其中CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12，并且其中CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，A1结合至作为效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。在一些实施方案中，作为TCR-CD3复合物的一部分的多肽是人CD3ε。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3 LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ IDNO:2和LC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ IDNO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3 LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQID NO:2和LC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ IDNO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQID NO:8和LC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ IDNO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，A1包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:13具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ IDNO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:13具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A1包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ IDNO:14具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:14具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少5倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少8倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少15倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少25倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少35倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少45倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少55倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少65倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少85倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少95倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。
在一些实施方案中，与其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少5倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少8倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少15倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少25倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少35倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少45倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少55倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少65倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少85倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少95倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少1000倍。
在一些实施方案中，与其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少1000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。
在一些实施方案中，与其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1,000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少700倍。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是无P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。一些实施方案，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10,000倍。
第二抗原识别分子(A2)
在一些实施方案中，A2包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体、Fab或Fab’。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段是人源化的或人的。在一些实施方案中，A2是Fab或Fab’。在一些实施方案中，Fab或Fab’包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含EGFR结合结构域。
在一些实施方案中，结合至EGFR的抗原结合片段(Fab)或Fab’包含Fab轻链多肽链和Fab重链多肽。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含Fab轻链可变结构域。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含Fab重链可变结构域。在一些实施方案中，Fab重链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，Fab轻链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
在一些实施方案中，Fab重链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)；并且Fab轻链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
表2.抗EGFR氨基酸序列(如由IMGT编号系统确定的)
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在一些实施方案中，Fab包含互补决定区(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且Fab包含CDR：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，Fab包含互补决定区(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:15、LC-CDR2：SEQ IDNO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17，并且其中CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰；并且Fab包含CDR：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ ID NO:20，并且其中CDR在LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，A2包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A2的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ IDNO:17；并且A2包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A2的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ IDNO:20。
在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:23具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:23具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:23具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:23具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:23具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:24具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:24具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:24具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:24具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的单链可变片段(scFv)的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的单链可变片段(scFv)的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽。
在一些实施方案中，A2进一步包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。
在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。
肽(P1和P2以及P1a)
在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含如表3中公开的序列或与其基本上相同的序列(例如，具有0、1或2个氨基酸修饰的序列)。
表3.P1和P2以及P1a序列
在一些实施方案中，P1削弱A1与第一靶抗原的结合。在一些实施方案中，P1削弱A1与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合被结合至A1。在一些实施方案中，P1在抗原结合位点处或附近被结合至A1。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P1变得与A1未结合，从而将A1暴露于效应细胞抗原。在一些实施方案中，蛋白酶包括肿瘤特异性蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于70％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于75％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于98％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于99％的序列同一性。在一些实施方案中，P1包含与效应细胞抗原具有小于10％序列同一性的从头氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A1包含第一抗原识别分子，其包含结合至CD3的抗体或抗体结合片段。在一些实施方案中，P1包含根据SEQ IDNO:25、797-835或843-1690中的任一者的氨基酸序列，或者相对于SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。在一些实施方案中，Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。在一些实施方案中，Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。在一些实施方案中，P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。在一些实施方案中，U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。在一些实施方案中，U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:797-823中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据25、824-835和843-1690中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:824-835中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:810的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:811的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:834的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2削弱A2与第二靶抗原的结合。在一些实施方案中，其中P2削弱A2与EGFR的结合。在一些实施方案中，P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合被结合至A2。在一些实施方案中，P2在抗原结合位点处或附近被结合至A2。在一些实施方案中，当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P2变得与A2未结合，从而将A2暴露于EGFR。在一些实施方案中，蛋白酶包括肿瘤特异性蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于70％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于75％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于98％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与EGFR具有小于99％的序列同一性。在一些实施方案中，P2包含与EGFR具有小于10％序列同一性的从头氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26、71-96、98-776中的任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、71-96、98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据X1-C-X2-X3-X4-X5-D-X6-A-X7-P-X8-C-X9的氨基酸序列，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A、N、I、V、S、H和P；X3选自S、P、F和Y；X4选自H、L、Q、P、R、F、N；X5选自I、F、Y、H、N、T、S、D、A、L和V；X6选自T、P、N、L、I、V、S、D、H、A和Y；X7选自K和Y；X8选自I、P、L和M；并且X9选自A、V、I、T、L、S、D、F、V和H(SEQ ID NO:841)。在一些实施方案中，X1选自P和L；X2选自R、L、T、A和N；X3选自S、P和F；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y、H、N和T；X6选自T、P、N、L、I和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V、I、T、L和S。在一些实施方案中，X1是P；X2选自R、L和T；X3是S；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y和T；X6选自T、P、N和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V和I。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26、86-96中的任一者的氨基酸序列，或相对于26、86-96中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列，或相对于99-118中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:115具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:116具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当L1a未被切割时，P1a削弱抗原识别分子与靶抗原的结合。在一些实施方案中，抗原识别分子包括抗体或抗体片段。在一些实施方案中，靶抗原是抗CD3效应细胞抗原。在一些实施方案中，靶抗原是表皮生长因子受体(EGFR)。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于70％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于75％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于98％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与靶抗原具有小于99％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a包含与第二靶抗原具有小于10％序列同一性的从头氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。在一些实施方案中，Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。在一些实施方案中，Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。在一些实施方案中，P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。在一些实施方案中，U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。在一些实施方案中，U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:797-823中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NOs:25、824-835或843-1690中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:824-835中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:810的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:811的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:834的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少5个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少6个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含环肽或线性肽。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含环肽。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含线性肽。
在一些实施方案中，P1、P2或P1a或P1、P2和P1a包含经修饰的氨基酸或非天然氨基酸，或经修饰的非天然氨基酸，或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，P1、P2或P1a或P1、P2和P1a包含修饰，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。对P1、P2或P1a或P1、P2和P1a的任何地方(包括肽主链、氨基酸侧链和末端)进行修饰。
在一些实施方案中，P1、P2或P1a不包含白蛋白或白蛋白片段。在一些实施方案中，P1、P2或P1a不包含白蛋白结合结构域。
连接部分(L1、L2、L3和L1a)
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a具有包含(G2S)n的式，其中n是1至3的整数(SEQ ID NO:840)。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a具有包含(G2S)n的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白酶选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶(MTSP1)可切割的氨基酸序列、豆荚蛋白可切割的氨基酸序列或基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列。在一些情况中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些情况中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含如表4中公开的序列或与其基本上相同的序列(例如，具有0、1或2个氨基酸修饰的序列)。
在一些实施方案中，L1包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)的氨基酸序列。在一些实施方案中，L2包含接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)的氨基酸序列。在一些实施方案中，L2包含接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列。
表4.L1、L2、L3和L1a序列
在一些实施方案中，L1被结合至A1的N末端。在一些实施方案中，L1被结合至A1的C末端。在一些实施方案中，L2被结合至A2的N末端。在一些实施方案中，L2被结合至A2的C末端。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P1变得与A1未结合，从而将A1暴露于效应细胞抗原。在一些实施方案中，当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P2变得与A2未结合，从而将A2暴露于EGFR。
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含经修饰的氨基酸或非天然氨基酸，或经修饰的非天然氨基酸，或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含修饰，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。对L1、L2、L3或L1a的任何地方(包括肽主链或氨基酸侧链)进行修饰。
在一些实施方案中，可切割的接头可被蛋白酶切割。在一些实施方案中，相对于健康组织或不是疾病状态微环境的微环境中的水平，蛋白酶在疾病状态微环境中以更高的水平存在。在一些实施方案中，蛋白酶包括肿瘤特异性蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶选自MMP2、MMP7、MMP9、MMP13和MMP14。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP7。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP9。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP13。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶选自蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶和hepsin。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括尿激酶。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括hepsin。在一些实施方案中，可切割的接头被多种蛋白酶切割。在一些实施方案中，可切割的接头被至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或超过20种不同的蛋白酶切割。
半衰期延长分子(H1和H1a)
在一些实施方案中，H1不阻断A1与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。在一些实施方案中，H1a不阻断第一抗原识别分子与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L3)。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)对抗原识别分子没有结合亲和力。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)对效应细胞抗原没有结合亲和力。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)不保护抗原识别分子免受效应细胞抗原的影响。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)不被直接连接至抗原识别分子。
在一些实施方案中，H1或H1a包含如表5中公开的序列或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
表5.H1和H1a序列
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在一些实施方案中，H1或H1a包含具有重复序列基序的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1或H1a包含具有高度有序的二级结构的氨基酸序列。如在该上下文中所使用的“高度有序的二级结构”意指至少约50％，或约70％，或约80％，或约90％的H1或H1a的氨基酸残基有助于二级结构，如通过包括但不限于分光光度法(例如，通过“远紫外”光谱区(190-250nm)中的圆二色光谱法)和计算机程序或算法(例如，Chou-Fasman算法和Garnier-Osguthorpe-Robson(“GOR”)算法)的手段所测量或确定的。
在一些实施方案中，H1或H1a包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1或H1a包含白蛋白。在一些实施方案中，H1或H1a包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1或H1a包含多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，单结构域抗体包括结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体选自645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01-sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E和SA21。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38；并且其中所述CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ ID NO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ ID NO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41；并且其中所述CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，H1包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:42具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQID NO:42具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ IDNO:42具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:42具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1a包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:42具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:42具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:42具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQID NO:42具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ IDNO:42具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1包含根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:43具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQID NO:43具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ IDNO:43具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:43具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1a包含根据SEQ ID NO:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:43具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:43具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:43具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQID NO:43具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ IDNO:43具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1或H1a或H1和H1a包含经修饰的氨基酸或非天然氨基酸，或经修饰的非天然氨基酸，或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，H1或H1a或H1和H1a包含修饰，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。对H1或H1a或H1和H1a的任何地方(包括肽主链、氨基酸侧链和末端)进行修饰。
在一些实施方案中，H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。在一些实施方案中，L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L3包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L1a)。在一些实施方案中，L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L1a包含根据SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。
与EGFR和CD3结合的抗体
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含表6中公开的氨基酸序列或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44-61具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ IDNO:50具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
表6.多肽复合物序列
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在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:44和SEQ IDNO:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:48和SEQ IDNO:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:50和SEQ IDNO:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:52和SEQ IDNO:53的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:54和SEQ IDNO:55的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:57的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:58和SEQ IDNO:59的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:60和SEQ IDNO:61的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:62和SEQ IDNO:63的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:64和SEQ IDNO:65的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽或多肽复合物包含表6中所示的序列。在一些实施方案中，该序列与SEQ ID NO:44-65中的任一者包含至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:44-65包含至少或约95％的同源性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:44-65包含至少或约97％的同源性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:44-65包含至少或约99％的同源性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:44-65包含至少或约100％的同源性。在一些情况下，该序列包含具有SEQ ID NO:44、46、48、50、52、54、56、58、60、63或65中的任一者的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210或超过210个氨基酸的至少一部分。在一些情况下，该序列包含具有SEQ IDNO:45、47、49、51、53、55、57、59或62中的任一者的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450或超过450个氨基酸的至少一部分。在一些情况下，该序列包含具有SEQ ID NO:61或64中的任一者的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640或超过640个氨基酸的至少一部分。
如本文所使用的，与序列相关的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入间隙(如果有必要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。在将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B(其可以可替代地表述为与给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％被计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是如由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中记录为相同匹配的氨基酸残基的数量，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数量。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另有具体说明，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％值都是使用ALIGN-2计算机程序如前述段落所述获得的。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型1的结构排列的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接到P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型2的结构排列的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
编码多肽或多肽复合物的多核苷酸
在一些实施方案中，本文公开了编码如本文公开的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物包含Fab和单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式Ia的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含根据构型1的结构排列的多肽或多肽复合物的分离的核酸分子：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接到P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含根据构型2的结构排列的多肽或多肽复合物的分离的核酸分子：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
药物组合物
在一些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含：(a)如本文公开的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式I的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式Ia的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)；
和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式II的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子被连接至与表皮生长因子受体(EGFR)结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文公开所述药物组合物包含(a)包含根据构型1的结构排列的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文公开所述药物组合物包含(a)包含根据构型2的结构排列的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物进一步包含可检测标记物、治疗药剂或药代动力学修饰部分。在一些实施方案中，可检测标记物包括荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针或造影剂。
对于向对象施用，如本文公开的分离的多肽或多肽复合物可以与一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂一起以药物组合物的形式提供。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于不干扰成分的生物学活性的效力且对它施用至的患者无毒的任何载剂。合适的药物载剂的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。此类载体可以通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量被施用于对象。优选地，组合物是无菌的。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、乳化剂和分散剂。通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂，可以确保防止微生物的作用。
药物组合物可以为任何合适的形式，(取决于所需的施用方法)。它可以以单位剂型提供，可以在密封的容器中提供，并且可以作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒可以包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂型。
药物组合物可以适于通过任何合适的途径施用，包括肠胃外(例如，皮下、肌内或静脉内)途径。此类组合物可以通过药学领域中已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载剂或赋形剂混合来制备。
根据待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等，本公开的物质的剂量可以在宽限度内变化，并且医生将最终确定待使用的适当的剂量。
削弱抗EGFR结合结构域与EGFR结合的肽
本文公开了多肽或多肽复合物，其包含连接至削弱抗EGFR结合结构域与EGFR结合的肽的抗EGFR结合结构域，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26、71-96、98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、71-96、98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据26、71-96、98-776中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、86-96中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:99-118中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:71的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:71具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:26具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列，或相对于SEQID NO:115具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列，或相对于SEQID NO:116具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
本文公开了包含抗EGFR结合结构域的多肽或多肽复合物，所述抗EGFR结合结构域连接至削弱抗EGFR结合与EGFR的结合的肽，其中所述肽包含根据X1-C-X2-X3-X4-X5-D-X6-A-X7-P-X8-C-X9的氨基酸序列，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A、N、I、V、S、H和P；X3选自S、P、F和Y；X4选自H、L、Q、P、R、F、N；X5选自I、F、Y、H、N、T、S、D、A、L和V；X6选自T、P、N、L、I、V、S、D、H、A和Y；X7选自K和Y；X8选自I、P、L和M；并且X9选自A、V、I、T、L、S、D、F、V和H(SEQ ID NO:841)。在一些实施方案中，X1选自P和L；X2选自R、L、T、A和N；X3选自S、P和F；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y、H、N和T；X6选自T、P、N、L、I和V，X7是K；X8是I；并且X9选自A、V、I、T、L和S。在一些实施方案中，X1是P；X2选自R、L和T；X3是S；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y和T；X6选自T、P、N和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V和I；
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EGFR结合结构域包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体、Fab或Fab’。在一些实施方案中，抗EGFR结合结构域包含重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且抗EGFR结合结构域包含轻链互补决定区CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。
在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含Fab。在一些实施方案中，抗EGFR结合结构域包含根据SEQ ID NO:21-24中任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗EGFR结合结构域通过连接部分(L1)连接至肽。在一些实施方案中，L1是肿瘤特异性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，L1结合至抗EGFR结合结构域的N末端。在一些实施方案中，L1结合至抗EGFR结合结构域的C末端。在一些实施方案中，L1是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1具有包含(G2S)n的式，其中n是1至3的整数(SEQ ID NO:840)。在一些实施方案中，L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，肽变得与抗EGFR结合结构域未结合，从而将抗EGFR结合结构域暴露于EGFR。在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(matriptase)(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，L1包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白可切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含根据SEQ ID NO:30或31中任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含根据SEQID NO:27-35的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ IDNO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物进一步包含半衰期延长分子(H1)。在一些实施方案中，半衰期延长分子连接至肽。在一些实施方案中，H1包括聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1包含白蛋白。在一些实施方案中，H1包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1包括多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，单结构域抗体包括结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是645gH1gL1。在一些实施方案中，单结构域抗体是645dsgH5gL4。在一些实施方案中，单结构域抗体是23-13-A01-sc02。在一些实施方案中，单结构域抗体是A10m3或其片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7r-31。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7h-11-15。在一些实施方案中，单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。在一些实施方案中，单结构域抗体是10E。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体是SA21。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，H1包含将H1连接到肽的连接部分(L3)。在一些实施方案中，L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L3包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
治疗方法
在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗癌症的方法中。在一些实施方案中，癌症具有表达EGFR的细胞。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、结肠/直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌或胰腺癌的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗对EGFR抑制剂治疗有抗性的对象的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗具有KRAS突变的对象的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗对EGFR抑制剂治疗有抗性且具有KRAS突变的对象的方法中。
在一些实施方案中，本文描述了多肽或多肽复合物，其中所述多肽或多肽复合物包含长半衰期。在一些情况下，多肽或多肽复合物的半衰期为至少或约12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、100小时、108小时、120小时、140小时、160小时、180小时、200小时或超过200小时。在一些情况下，多肽或多肽复合物的半衰期在约12小时至约300小时、约20小时至约280小时、约40小时至约240小时、约60小时至约200小时或约80小时至约140小时的范围内。
在一些实施方案中，本文描述了每周施用一次的多肽或多肽复合物。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物通过静脉内、肌内、病灶内、局部、皮下、输注或口服每周施用一次。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物通过推注注射每周施用一次。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物通过连续输注每周施用一次。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物以在不超过60分钟的时间段内连续输注的方式每周一次施用于对象。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物以在不超过30分钟的时间段内连续静脉内输注的形式每周一次施用于对象。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物以在至少10分钟的时间段内连续静脉内输注的形式每周一次施用于对象。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少30小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少50小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少60小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少70小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少80小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少90小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少100小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少110小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少115小时的半衰期。
产生与EGFR和CD3结合的抗体
在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如，抗体及其结合片段)使用本领域已知的用于合成多肽(例如，抗体)的任何方法产生，尤其是通过化学合成或通过重组表达产生，并且优选地通过重组表达技术产生。
在一些情况下，抗体或其结合片段被重组地表达，并且编码抗体或其结合片段的核酸由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等人,1994,BioTechniques 17:242中所述)，其涉及合成含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火和连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可替代地，编码抗体的核酸分子任选地通过使用可与序列的3’端和5’端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针进行克隆从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达免疫球蛋白的任何组织或细胞产生的cDNA文库)产生。
在一些情况下，抗体或其结合任选地通过免疫动物(如小鼠)来产生，以产生多克隆抗体，或更优选地，通过产生单克隆抗体来产生，例如，如Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)所述，或如Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)所述。可替代地，编码抗体的至少Fab部分的克隆任选地通过筛选用于结合特异性抗原的Fab片段的克隆的Fab表达文库(例如，如Huse等人,1989,Science 246:1275-1281中所述)，或者通过筛选抗体文库(参见，例如，Clackson等人,1991,Nature 352:624；Hane等人,1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4937)来获得。
在一些实施方案中，使用了通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而开发的用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人,1984,Nature 312:604-608；Takeda等人,1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分来源于不同的动物物种，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。
在一些实施方案中，描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,694,778；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；和Ward等人,1989,Nature 334:544-54)适于生产单链抗体。经由氨基酸桥连接Fv区的重链片段和轻链片段来形成单链抗体，产生单链多肽。还任选地使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人,1988,Science 242:1038-1041)。
在一些实施方案中，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养经转染的细胞以产生抗体。在具体实施方案中，抗体的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些实施方案中，利用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的抗体或其结合片段。此类宿主表达系统代表通过其产生抗体的编码序列并随后对该编码序列进行纯化的载体，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其结合片段的细胞。这些包括但不限于微生物，如用含有抗体或其结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有抗体或其结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
对于重组蛋白的长期高产率生产，稳定的表达是优选的。在一些情况下，稳定地表达抗体的细胞系任选地被工程改造。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标志物控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，工程改造的细胞然后允许在富集的培养基中生长持续1-2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，并生长以形成转变灶(foci)，该转变灶又被克隆和扩增到细胞系中。此方法可以有利地用于对表达抗体或其结合片段的细胞系进行工程改造。
在一些情况下，使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,1980,Cell 22:817)基因分别用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性被用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:357；O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月,TIB TECH 11(5):155-215)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene30:147)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等人(编辑,1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY；Kriegler,1990,GeneTransfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY；以及Dracopoli等人(编辑),1994,Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1)的第12和13章中。
在一些情况下，通过载体扩增来增加抗体的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel,the use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNAcloning,第3卷(Academic Press,NewYork,1987))。当在表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，在宿主细胞的培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关联，因此抗体的产量也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些情况下，使用本领域中已知的用于纯化抗体的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和(特别是通过在蛋白A之后对特异性抗原的亲和)，和尺寸柱色谱法)、离心、差异溶解，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。
表达载体
在一些实施方案中，载体包括来源于真核来源或原核来源的任何合适的载体。在一些情况下，载体从细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如，巴斯德毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源获得。示例性的细菌载体包括pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAGCTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
示例性的昆虫载体包括pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393M10、pVL1393 M11、pVL1393 M12、FLAG载体如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT 2或MAT载体如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2。
在一些情况下，酵母载体包括pDESTTM14载体、/>pDESTTM15载体、/>pDESTTM17载体、/>pDESTTM24载体、/>pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49/>目标载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA、pGAPZB和pGAPZC巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6 A、pPIC6 B和pPIC6 C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、pYES2/NT B和pYES2/NT C酵母载体或pYES3/CT酵母载体。/>
示例性的藻类载体包括pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体的实例包括瞬时表达载体或稳定表达载体。哺乳动物瞬时表达载体可以包括pRK5、p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a、pFLAG-CMV 6b、pFLAG-CMV 6c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a、pFLAG-CMV5b、pFLAG-CMV 5c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。哺乳动物稳定表达载体可以包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情况下，无细胞系统是来自细胞的细胞质和/或细胞核组分的混合物，并且用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分或真核细胞组分。有时，在基于例如果蝇细胞、爪蟾卵或HeLa细胞的无细胞系统中获得核酸合成。示例性的无细胞系统包括但不限于大肠杆菌S30提取系统、大肠杆菌T7 S30系统或宿主细胞
在一些实施方案中，宿主细胞包括任何合适的细胞，如天然衍生的细胞或基因修饰的细胞。在一些情况下，宿主细胞是生产宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是真核细胞。在其他情况下，宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，真核细胞包括真菌(例如，酵母细胞)、动物细胞或植物细胞。在一些情况下，原核细胞是细菌细胞。细菌细胞的实例包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性细菌。有时，革兰氏阴性细菌是厌氧的，杆状的，或两者。
在一些情况下，革兰氏阳性细菌包括放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)或柔膜菌门(Tenericutes)。在一些情况下，革兰氏阴性细菌包含产水菌门(Aquificae)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、纤维杆菌门-绿菌门/拟杆菌门(Fibrobacteres–Chlorobi/Bacteroidetes)(FCB群)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门-疣微菌门/衣原体门(Planctomycetes–Verrucomicrobia/Chlamydiae)(PVC群)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)或互养菌门(Synergistetes)。其他细菌可以是酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、网团菌门(Dictyoglomi)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)或热袍菌门(Thermotogae)。细菌细胞可以是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)或大肠杆菌(Coli bacilli)。
示例性的原核宿主细胞包括但不限于BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，动物细胞包括来自脊椎动物或来自无脊椎动物的细胞。在一些情况下，动物细胞包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。在一些情况下，真菌细胞包括酵母细胞，如啤酒酵母、面包酵母或葡萄酒酵母。
真菌包括子囊菌(ascomycete)，如酵母、霉菌、丝状真菌、担子菌或接合菌。在一些情况下，酵母包括子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)。在一些情况下，子囊菌门包括酵母亚门(Saccharomycotina)(真正的酵母，例如，酿酒酵母(面包酵母))或外囊菌亚门(Taphrinomycotina)(例如，裂殖酵母纲(Schizosaccharomycetes)(裂殖酵母))。在一些情况下，担子菌门包括伞菌亚门(Agaricomycotina)(例如，银耳纲(Tremellomycetes))或柄锈菌亚门(Pucciniomycotina)(例如，微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes))。
示例性的酵母或丝状真菌包括例如以下属：酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红冬孢酵母属(Rhodosporidi)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)。示例性的酵母或丝状真菌包括例如以下的物种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、产朊假丝酵母、博伊丁假丝酵母(Candidaboidini)、白色假丝酵母、热带假丝酵母、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、甲醇毕赤酵母(Pichia metanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、圆红冬孢酵母-黑曲霉(Rhodosporidium toru-Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesia)、耶氏解脂酵母、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、星形假丝酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)或布拉酵母(Saccharomyces boulardii)。
示例性的酵母宿主细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母菌株如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33；和酿酒酵母酵母菌株如INVSc1。
在一些情况下，额外的动物细胞包括从软体动物、节肢动物、环节动物或海绵动物获得的细胞。在一些情况下，额外的动物细胞是哺乳动物细胞，例如来自灵长类、猿、马、牛、猪、犬、猫或啮齿动物的细胞。在一些情况下，啮齿动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、栗鼠、褐鼠(fancy rat)或豚鼠。
示例性的哺乳动物宿主细胞包括但不限于293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、FUT8 KO CHOK1、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或已经将感兴趣的遗传材料并入到其自身基因组中并在许多代细胞分裂之后具有表达遗传材料的产物的能力的细胞系。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时的细胞系，或尚未将感兴趣的遗传材料并入到其自身基因组中并在许多代细胞分裂后不具有表达遗传材料的产物的能力的细胞系。
示例性的昆虫宿主细胞包括但不限于果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、HighFiveTM细胞和细胞。
在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性的昆虫细胞系包括但不限于来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PPC 7942的菌株。
制品
在本发明的另一方面，提供了含有可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。该制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。该容器装有一种组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合可有效地用于治疗、预防和/或诊断病状，并且可以具有无菌进入端口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性地结合至CD3的第一抗原结合位点和特异性地结合至EGFR的第二抗原结合位点，如本文前面所定义。
标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选的病状。此外，该制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性药剂或其他治疗药剂。本发明的该实施方案中的制品可以进一步包括包装插页，表明该组合物可以用于治疗特定的病状。
可替代地或另外地，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户角度来看所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
某些定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的并且不旨在进行限制。如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指出。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体而言，此类术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包含在内。
术语“抗体”以最广泛的意义使用并且涵盖完全组装的抗体、可以结合抗原的抗体片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、单链抗体(scFv)、双抗体、抗体嵌合体、杂交抗体、双特异性抗体等。
术语“互补决定区”或“CDR”是抗体的可变区的区段，其在结构上与抗体结合的表位互补，并且比可变区的其余部分更易变。因此，CDR有时被称为高变区。可变区包含三个CDR。CDR肽可以通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见，例如，Larrick等人,Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991)；MonoclonalAntibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter等人(编辑),第166-179页(Cambridge University Press1995)中的Courtenay-Luck,“GeneticManipulation of Monoclonal Antibodies”；和Monoclonal Antibodies:Principles andApplications,Birch等人(编辑)，第137-185页(Wiley-Liss,Inc.1995)中的Ward等人,“Genetic Manipulation and Expression of Antibodies”。
术语“Fab”是指包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)的蛋白质。Fab片段与Fab’片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离的硫醇基团。Fab’片段通过还原F(ab’)2片段的重链二硫键产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与十至约25个氨基酸的短接头肽连接。为了灵活性，接头通常富含甘氨酸，以及为了溶解性，富含丝氨酸或苏氨酸，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接起来，或者反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但这种蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如在Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中描述。此外，抗体片段包含具有VH结构域的特征的单链多肽，即能够与VL结构域装配在一起，或具有VL结构域的特征的单链多肽，即能够与VH结构域装配在一起到达功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合性质。
虽然在本文中已经示出和描述了本公开的优选的实施方案，但对本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本公开时，可以采用本文描述的本公开的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
实施方案
实施方案1包括一种根据式I的分离的多肽或多肽复合物：A2-A1-L1-P1-H1，其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
实施方案2包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
实施方案3包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中第一抗原识别分子包含为人的或人源化的抗体或抗体片段。
实施方案4包括根据实施方案1-3中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
实施方案5包括根据实施方案1-3中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2被结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
实施方案6包括根据实施方案1-3中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
实施方案7包括根据实施方案1-3中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2被结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
实施方案8包括根据实施方案2-7中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。
实施方案9包括根据实施方案8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单链可变片段(scFv)。
实施方案10包括根据实施方案9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。
实施方案11包括根据实施方案8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单结构域抗体。
实施方案12包括根据实施方案8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)或可变结构域(VHH)。
实施方案13包括根据实施方案1-12中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段。
实施方案14包括根据实施方案1-12中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段，所述抗CD3e单链可变片段与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。
实施方案15包括根据实施方案1-14中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3。
实施方案16包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含可变轻链和可变重链，其各自能够特异性地结合至人CD3。
实施方案17包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19。
实施方案18包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。
实施方案19包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。
实施方案20包括根据实施方案19所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞是T细胞。
实施方案21包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1结合至作为效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。
实施方案22包括根据实施方案21所述的分离的多肽或多肽复合物，其中作为TCR-CD3复合物的一部分的多肽是人CD3ε。
实施方案23包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3 LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ ID NO:2和LC-CDR3：SEQID NO:3；并且scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ ID NO:5和HC-CDR3：SEQID NO:6。
实施方案24包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ ID NO:2和LC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ ID NO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6。
实施方案25包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
实施方案26包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3 LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQID NO:9；并且所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12。
实施方案27包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12。
实施方案28包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
实施方案29包括根据实施方案1-28中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中第二抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
实施方案30包括根据实施方案29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab。
实施方案31包括根据实施方案29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。
实施方案32包括根据实施方案29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段是人源化的或人的。
实施方案33包括根据实施方案30所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2是Fab。
实施方案34包括根据实施方案33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Fab包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。
实施方案35包括根据实施方案33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQID NO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ ID NO:20。
实施方案36包括根据实施方案29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A2的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQID NO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且A2包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A2的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ ID NO:20。
实施方案37包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
实施方案38包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
实施方案39包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:23的氨基酸序列。
实施方案40包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
实施方案41包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab轻链多肽被结合至A1的单链可变片段(scFv)的C末端。
实施方案42包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab重链多肽被结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。
实施方案43包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab轻链多肽被结合至A1的单链可变片段(scFv)的N末端。
实施方案44包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab重链多肽被结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。
实施方案45包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽。
实施方案46包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽。
实施方案47包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽。
实施方案48包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽。
实施方案49包括根据实施方案1-48中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2进一步包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
实施方案50包括根据实施方案49所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物根据式Ia：P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1。
实施方案51包括根据实施方案50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。
实施方案52包括根据实施方案50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。
实施方案53包括根据实施方案50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab重链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab轻链多肽。
实施方案54包括根据实施方案50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的Fab轻链多肽被结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的Fab重链多肽。
实施方案55包括根据实施方案1-54中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1削弱A1与效应细胞抗原的结合。
实施方案56包括根据实施方案1-55中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A1。
实施方案57包括根据实施方案1-56中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1与所述效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。
实施方案58包括根据实施方案49-57中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2削弱A2与EGFR的结合。
实施方案59包括根据实施方案49-58中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A2。
实施方案60包括根据实施方案49-59中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2在抗原结合位点处或附近结合至A2。
实施方案61包括根据实施方案49-60中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2与EGFR具有小于70％的序列同源性。
实施方案62包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案63包括根据实施方案1-62中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。
实施方案64包括根据实施方案1-63中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。
实施方案65包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。
实施方案66包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
实施方案67包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽或线性肽。
实施方案68包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽。
实施方案69包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含线性肽。
实施方案70包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
实施方案71包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
实施方案72包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案73包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
实施方案74包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26、71-96、98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、71-96、98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案75包括根据实施方案1-61中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据X1-C-X2-X3-X4-X5-D-X6-A-X7-P-X8-C-X9的氨基酸序列，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A、N、I、V、S、H和P；X3选自S、P、F和Y；X4选自H、L、Q、P、R、F、N；X5选自I、F、Y、H、N、T、S、D、A、L和V；X6选自T、P、N、L、I、V、S、D、H、A和Y；X7选自K和Y；X8选自I、P、L和M；并且X9选自A、V、I、T、L、S、D、F、V和H(SEQ ID NO:841)。
实施方案76包括根据实施方案75所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A和N；X3选自S、P和F；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y、H、N和T；X6选自T、P、N、L、I和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V、I、T、L和S。
实施方案77包括根据实施方案76所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1是P；X2选自R、L和T；X3是S；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y和T；X6选自T、P、N和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V和I。
实施方案78包括根据实施方案1-77中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、86-96中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案79包括根据实施方案78所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列。
实施方案80包括根据实施方案1-77中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案81包括根据实施方案80所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。
实施方案82包括根据实施方案1-77中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:99-118中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案83包括根据实施方案82所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。
实施方案84包括根据实施方案1-77中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案85包括根据实施方案84所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案86包括根据实施方案1-85中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ IDNO:25、797-835或843-1690中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案87包括根据实施方案1-85中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。
实施方案88包括根据实施方案87所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。
实施方案89包括根据实施方案88所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。
实施方案90包括根据实施方案1-85中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。
实施方案91包括根据实施方案90所述的分离的多肽或多肽复合物，其中U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。
实施方案92包括根据实施方案91所述的分离的多肽或多肽复合物，其中U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
实施方案93包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:797-823中任一者的氨基酸序列。
实施方案94包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:25、824-835或843-1690中任一者的氨基酸序列。
实施方案95包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:824-835中任一者的氨基酸序列。
实施方案96包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:810的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案97包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:811的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案98包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:834的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案99包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列。
实施方案100包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列。
实施方案101包括根据实施方案1-92中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列。
实施方案102包括根据实施方案1-101中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至A1的N末端。
实施方案103包括根据实施方案1-101中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至A1的C末端。
实施方案104包括根据实施方案49-101中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2被结合至A2的N末端。
实施方案105包括根据实施方案49-101中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2被结合至A2的C末端。
实施方案106包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案107包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案108包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案109包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案110包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案111包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2具有包含(G2S)n的式，其中n是1至3的整数(SEQ ID NO:840)。
实施方案112包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案113包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P1变得与A1未结合，从而将A1暴露于效应细胞抗原。
实施方案114包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割时，P2变得与A2未结合，从而使A2暴露于EGFR。
实施方案115包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
实施方案116包括根据实施方案115所述的分离的多肽或多肽复合物，其中基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。
实施方案117包括根据实施方案115所述的分离的多肽或多肽复合物，其中丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
实施方案118包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白可切割的氨基酸序列。
实施方案119包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。
实施方案120包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ ID NO:27-35中任一者的氨基酸序列。
实施方案121包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ IDNO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案122包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含聚合物。
实施方案123包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
实施方案124包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含白蛋白。
实施方案125包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含Fc结构域。
实施方案126包括根据实施方案124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
实施方案127包括根据实施方案124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
实施方案128包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含多肽、配体或小分子。
实施方案129包括根据实施方案128所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。
实施方案130包括根据实施方案129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
实施方案131包括根据实施方案129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
实施方案132包括根据实施方案129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
实施方案133包括根据实施方案128所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
实施方案134包括根据实施方案133所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
实施方案135包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
实施方案136包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是人的或人源化的抗体。
实施方案137包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
实施方案138包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
实施方案139包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
实施方案140包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
实施方案141包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
实施方案142包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
实施方案143包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
实施方案144包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
实施方案145包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。
实施方案146包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ ID NO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41。
实施方案147包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
实施方案148包括根据实施方案1-147中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。
实施方案149包括根据实施方案148所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。
实施方案150包括根据实施方案1-149中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。
实施方案151包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案152包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案153包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案154包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案155包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案156包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ IDNO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案157包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
实施方案158包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44-61中的任一者具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案159包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案160包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案161包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案162包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案163包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案164包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案165包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案166包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案167包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案168包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案169包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案170包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案171包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案172包括一种药物组合物，其包含：(a)根据实施方案1-171中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
实施方案173包括一种分离的重组核酸分子，其编码根据实施方案1-171中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案174一种根据式II的分离的多肽或多肽复合物：L1a-P1a-H1a其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且所述第一抗原识别分子连接至与EGFR结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
实施方案175包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1a未切割时，P1a削弱第一抗原识别分子与效应细胞抗原的结合。
实施方案176包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
实施方案177包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原是抗CD3效应细胞抗原。
实施方案178包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a与所述效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。
实施方案179包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案180包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。
实施方案181包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。
实施方案182包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。
实施方案183包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
实施方案184包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含环肽或线性肽。
实施方案185包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含环肽。
实施方案186包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含线性肽。
实施方案187包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含选自SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
实施方案188包括根据实施方案174所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
实施方案189包括根据实施方案174-187中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含聚合物。
实施方案190包括根据实施方案189所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
实施方案191包括根据实施方案174-190中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案192包括根据实施方案174-190中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。
实施方案193包括根据实施方案192所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。
实施方案194包括根据实施方案193所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。
实施方案195包括根据实施方案174-190中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。
实施方案196包括根据实施方案195所述的分离的多肽或多肽复合物，其中U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。
实施方案197包括根据实施方案196所述的分离的多肽或多肽复合物，其中U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
实施方案198包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:797-823中任一者的氨基酸序列。
实施方案199包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:25、824-835或843-1690中任一者的氨基酸序列。
实施方案200包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:824-835中任一者的氨基酸序列。
实施方案201包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:810的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案202包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:811的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案203包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:834的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案204包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列。
实施方案205包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列。
实施方案206包括根据实施方案174-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列。
实施方案207包括根据实施方案174-206中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含白蛋白。
实施方案208包括根据实施方案174-206中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含Fc结构域。
实施方案209包括根据实施方案207所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
实施方案210包括根据实施方案209所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
实施方案211包括根据实施方案174-206中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含多肽、配体或小分子。
实施方案212包括根据实施方案211所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。
实施方案213包括根据实施方案212所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
实施方案214包括根据实施方案212所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
实施方案215包括根据实施方案212所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
实施方案216包括根据实施方案211所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
实施方案217包括根据实施方案216所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
实施方案218包括根据实施方案216所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
实施方案219包括根据实施方案216所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体是人的或人源化的抗体。
实施方案220包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
实施方案221包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
实施方案222包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
实施方案223包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
实施方案224包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
实施方案225包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
实施方案226包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
实施方案227包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10G。
实施方案228包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。
实施方案229包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ ID NO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41。
实施方案230包括根据实施方案217所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
实施方案231包括根据实施方案174-230中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L1a)。
实施方案232包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案233包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案234包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案235包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案236包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案237包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ IDNO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案238包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a包含根据SEQ ID NO:30或31的氨基酸序列。
实施方案239包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ ID NO:27-35中任一者的氨基酸序列。
实施方案240包括根据实施方案231所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案241包括一种分离的多肽复合物，其包含根据构型1的结构排列：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接到P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
实施方案242包括一种分离的多肽复合物，其包含根据构型2的结构排列：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至表皮生长因子受体(EGFR)的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与EGFR结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接到P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
实施方案243包括一种分离的多肽或多肽复合物，其包含连接至削弱抗EGFR结合结构域与EGFR结合的肽的抗EGFR结合结构域，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26、71-96、98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、71-96、98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案244包括根据实施方案243所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26、71-96、98-776中任一者的氨基酸序列。
实施方案245包括根据实施方案243所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、86-96中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案246包括根据实施方案245所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列。
实施方案247包括根据实施方案243所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案248包括根据实施方案247所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。
实施方案249包括根据实施方案243所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:99-118中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案250包括根据实施方案249所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。
实施方案251包括根据实施方案243所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:71的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:71具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案252包括根据实施方案251所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:71的氨基酸序列。
实施方案253包括根据实施方案243所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案254包括根据实施方案253所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案255包括一种分离的多肽或多肽复合物，所述多肽或多肽复合物包含连接至肽的抗EGFR结合结构域，所述肽削弱抗EGFR结合与EGFR的结合，其中所述肽包含根据X1-C-X2-X3-X4-X5-D-X6-A-X7-P-X8-C-X9的氨基酸序列，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A、N、I、V、S、H和P；X3选自S、P、F和Y；X4选自H、L、Q、P、R、F、N；X5选自I、F、Y、H、N、T、S、D、A、L和V；X6选自T、P、N、L、I、V、S、D、H、A和Y；X7选自K和Y；X8选自I、P、L和M；并且X9选自A、V、I、T、L、S、D、F、V和H(SEQ ID NO:841)。
实施方案256包括根据实施方案255所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A和N；X3选自S、P和F；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y、H、N和T；X6选自T、P、N、L、I和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V、I、T、L和S。
实施方案257包括根据实施方案256所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1是P；X2选自R、L和T；X3是S；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y和T；X6选自T、P、N和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V和I。
实施方案258包括根据实施方案255-257中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。
实施方案259包括根据实施方案255-258中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。
实施方案260包括根据实施方案255-257中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案261包括根据实施方案243-260中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗EGFR结合结构域包含抗体或抗体片段。
实施方案262包括根据实施方案261所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体、Fab或Fab’。
实施方案263包括根据实施方案243-262中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗EGFR结合结构域包含重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且所述抗EGFR结合结构域包含轻链互补决定区CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。
实施方案264包括根据实施方案261所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含Fab。
实施方案265包括根据实施方案243-264中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗EGFR结合结构域包含根据SEQ ID NO:21-24中任一者的氨基酸序列。
实施方案266包括根据实施方案243-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗EGFR结合结构域通过连接部分(L1)连接至肽。
实施方案267包括根据实施方案243-266中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1是肿瘤特异性蛋白酶的底物。
实施方案268包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至抗EGFR结合结构域的N末端。
实施方案269包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至抗EGFR结合结构域的C末端。
实施方案270包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案271包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案272包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案273包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案274包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案275包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1具有包含(G2S)n的式，其中n是1至3的整数(SEQ ID NO:840)。
实施方案276包括根据实施方案243-267中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案277包括根据实施方案243-276中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，所述肽变得与抗EGFR结合结构域未结合，从而将抗EGFR结合结构域暴露于EGFR。
实施方案278包括根据实施方案267-277中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
实施方案279包括根据实施方案278所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。
实施方案280包括根据实施方案278所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
实施方案281包括根据实施方案267-277中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白可切割的氨基酸序列。
实施方案282包括根据实施方案266所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1包含根据SEQ ID NO:30或31中任一者的氨基酸序列。
实施方案283包括根据实施方案266所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1包含根据SEQ ID NO:27-35的氨基酸序列。
实施方案284包括根据实施方案266所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案285包括根据实施方案243-284中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物进一步包含半衰期延长分子(H1)。
实施方案286包括根据实施方案285所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述半衰期延长分子连接至肽。
实施方案287包括根据实施方案285所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含聚合物。
实施方案288包括根据实施方案287所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
实施方案289包括根据实施方案285所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含白蛋白。
实施方案290包括根据实施方案285所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含Fc结构域。
实施方案291包括根据实施方案289所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
实施方案292包括根据实施方案289所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
实施方案293包括根据实施方案285所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含多肽、配体或小分子。
实施方案294包括根据实施方案293所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。
实施方案295包括根据实施方案294所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
实施方案296包括根据实施方案294所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
实施方案297包括根据实施方案294所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
实施方案298包括根据实施方案294所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
实施方案299包括根据实施方案298所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
实施方案300包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
实施方案301包括根据实施方案300所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是人的或人源化的抗体。
实施方案302包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
实施方案303包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
实施方案304包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
实施方案305包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
实施方案306包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
实施方案307包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
实施方案308包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
实施方案309包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
实施方案310包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。
实施方案311包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
实施方案312包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。
实施方案313包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
实施方案314包括根据实施方案299所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
实施方案315包括根据实施方案1-314中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。
实施方案316包括根据实施方案315所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。
实施方案317包括根据实施方案285-316中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。
实施方案318包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案319包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案320包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案321包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案322包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案323包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ IDNO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案324包括根据实施方案317所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
实施方案325包括一种治疗癌症的方法，该方法包括向有此需求的对象施用上述实施方案中任一项所述的多肽或多肽复合物。
实施方案326包括根据实施方案325所述的方法，其中所述癌症具有表达EGFR的细胞。
实施方案327包括一种治疗结肠直肠癌(CRC)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、非小细胞肺癌(NSCLC)、前列腺癌、乳腺癌、结肠/直肠癌、头颈癌、食管胃癌、肝癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌或胰腺癌的方法，其包括向有此需求的对象施用上述实施方案中任一项所述的多肽或多肽复合物。
实施方案328包括根据实施方案327所述的方法，其中所述有此需求的对象对EGFR抑制剂治疗有抗性。
实施方案329包括根据实施方案327所述的方法，其中所述有此需求的对象具有KRAS突变。
实施方案330包括根据实施方案327所述的方法，其中所述有此需求的对象对EGFR抑制剂治疗有抗性并且具有KRAS突变。
实施方案331包括根据实施方案1-77中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:115具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案332包括根据实施方案331所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
实施方案333包括根据实施方案1-77中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:116具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
实施方案334包括根据实施方案333所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
实施方案335包括根据实施方案255-257中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
实施方案336包括根据实施方案255-257中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
实施例
实施例1：EGFR多肽复合物结合
评估EGFR-CD3多肽复合物的EGFR和CD3ε结合。
简而言之，以标准酶联免疫吸附测定(ELISA)形式来评估多肽复合物分子结合EGFR以及CD3的能力。在蛋白酶处理之前和之后测量EGFR或CD3的多肽复合物结合。简而言之，生物素化的抗原被捕获在中性亲和素包被的板上。多肽复合物分子在指示的地方用活性蛋白裂解酶(MTSP1)处理。然后将在缓冲液中稀释的多肽复合物分子加入到抗原包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的多肽复合物。使用GraphpadPrism软件来计算获得50％最大信号(EC50)所需的多肽复合物的浓度。
图2示出了通过ELISA测量的与EGFR结合的代表性多肽分子。图3示出了通过ELISA测量的与CD3结合的代表性多肽。
实施例2：多肽复合物介导的肿瘤细胞毒性和T细胞活化
使用EGFR阳性肿瘤细胞系HCT116和A431，在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估多肽复合物。使用来自Agilent的xCelligence实时细胞分析仪来测量肿瘤细胞杀伤，该分析仪依赖于传感器阻抗测量结果(细胞指数)，其随着肿瘤细胞在传感器的表面上的粘附、扩散和扩展而增加。同样，随着肿瘤细胞被杀死，阻抗降低。每孔加入10,000个肿瘤细胞，并且允许在96孔E板上粘附过夜。第二天，将在补充人血清的培养基中滴定的多肽复合物连同30,000个CD8+T细胞加入到孔中。每10分钟获取细胞指数测量结果持续另外的72小时。然后将细胞指数乘以小时数(肿瘤细胞生长动力学)相对于多肽复合物的浓度作图，其中使用Graphpad Prism软件来计算降低肿瘤生长50％所需的浓度(IC50)。
图4示出了在CD8+T细胞的存在下多肽复合物介导的HCT116肿瘤细胞杀伤的图。图5示出了在CD8+T细胞的存在下多肽复合物介导的A431肿瘤细胞杀伤的图。
实施例3：多肽复合物结合
在与EGFR和CD3ε的结合研究中评估多肽复合物
使用Octet RED96仪器，通过生物层干涉测量法来评估多肽分子与人和食蟹猴EGFR的动力学结合。简而言之，生物传感器负载有抗原并且在缓冲液中基线化。在溶液中以50nM、25nM、12.5nM和6.25nM滴定多肽分子，然后将其缔合到负载抗原的传感器上。在短暂的缔合期后，将传感器转移到缓冲液中，并且测量结合的多肽分子的解离。实验的时间和步骤在表7中示出。实时记录缔合和解离信号，并且使用仪器软件中的1:1结合模型进行分析。使用1:1结合模型的分析使得能够计算结合速率和解离速率常数以及亲和力KD。解离速率常数被转换成半衰期，如附图所示。数据参见图6。
表7
还以标准酶联免疫吸附测定(ELISA)形式来评估多肽复合物分子结合人和食蟹猴抗原EGFR的能力。简而言之，与人Fc结构域融合的抗原被直接包被在高结合ELISA板上。然后将在缓冲液中稀释的多肽复合物分子加入到抗原包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的多肽复合物。使用Graphpad Prism软件来计算获得50％最大信号(EC50)所需的多肽复合物的浓度。数据参见图7。
使用Octet RED96仪器，通过生物层干涉测量法来评估多肽分子与人和食蟹猴CD3的动力学结合。简而言之，生物传感器负装载有抗原并且在缓冲液中基线化。在溶液中以50nM、25nM、12.5nM和6.25nM滴定多肽分子，然后将其结合到负载抗原的传感器上。在短暂的结合期后，将传感器转移到缓冲液中，并且测量结合的多肽分子的解离。实验的时间和步骤在表8中示出。实时记录结合和解离信号，并且使用仪器软件中的1:1结合模型进行分析。使用1:1结合模型的分析使得能够计算结合速率和解离速率常数以及亲和力KD。解离速率常数被转换成半衰期，如附图所示。数据参见图8。
表8.
以标准的酶联免疫吸附测定(ELISA)形式来评估多肽复合物分子结合人和食蟹猴抗原CD3的能力。简而言之，与人Fc结构域融合的抗原被直接包被在高结合ELISA板上。然后将在缓冲液中稀释的多肽复合物分子加入到抗原包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的多肽复合物。使用Graphpad Prism软件来计算获得50％最大信号(EC50)所需的多肽复合物的浓度。数据参见图9。
实施例4：多肽复合物在食蟹猴中的药代动力学
在食蟹猴中评估多肽分子的药代动力学和探索性安全性。简而言之，对体重约3kg的食蟹猴以IV推注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。相对于在对照食蟹猴血浆中稀释的参考标准品，经由标准ELISA技术来测量血浆中多肽分子的浓度。血浆浓度曲线符合代表分布和消除阶段的标准两相指数方程。药代动力学的拟合能够计算Cmax、半衰期、分布体积、清除率和7天曲线下面积(AUC)，如表9-10所示。在食蟹猴中测量的药代动力学支持人类每周给药一次。数据参见图10A-10B。图10A表明，在体外测定中，本文所述的包含掩蔽的多肽复合物对表达EGFR的肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤作用比同等的未掩蔽的TCE弱超过8,500效力。如图10B和下面的表9所见，PC4(掩蔽的)显示出约94小时的半衰期，与显示出约1小时半衰期的未掩蔽的多肽复合物相比，这支持每周给药一次。
表9.
表10.
实施例5：多肽复合物在食蟹猴中细胞因子释放
在食蟹猴中评估了在通过IV推注施用多肽分子后的细胞因子释放。简而言之，对体重约3kg的食蟹猴以IV推注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。按照制造商的说明，使用来自BD biosciences的非人灵长类细胞计数Th1/Th2珠阵列试剂盒来分析血浆样品的细胞因子。血浆中的干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素5、白细胞介素4和白细胞介素2水平相对于设置有珠阵列试剂盒的参考标准进行计算。数据参见图11A-11L和图12。图12示出了本文所述的多肽复合物(EGFRTRACTr)以100μg/kg的给药导致了最小水平的炎性细胞因子释放，相对于10μg/kg的未掩蔽的EGFR-TCE，其导致了IL-6的大于20倍表达。
实施例6：多肽复合物对食蟹猴的毒性
在食蟹猴中评估在通过IV推注施用多肽分子之后的全身性肝酶。简而言之，对体重约3kg的食蟹猴以IV推注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。分析血浆样品中作为潜在肝毒性的迹象的肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的存在。对于在给药后测试的所有时间点，AST和ALT水平都保持在正常范围内，表明没有肝毒性。AST和ALT按照在来自Millipore的市售试剂盒中提供的说明进行定量。根据制造商的说明，相对于阳性对照参考标准品，计算AST和ALT水平。数据参见图13A-13D。
实施例7：肽结合EGFR IgG并且抑制EGFR IgG与EGFR抗原结合
以ELISA形式来评估表11的肽序列(肽1至肽6)与EGFR IgG的结合(参见表11)。简而言之，生物素化的肽被捕获在中性链亲和素包被的板上。然后将在缓冲液中稀释的EGFRIgG加入到肽包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的EGFRIgG。将ELISA信号相对于对数级抗体浓度作图。使用Graphpad Prism软件来计算观察半最大结合信号(EC50)所需的抗体浓度。图14示出了肽结合EGFR IgG的结合曲线，并且表12提供了肽结合EGFR IgG的计算的EC50。在该系列测试的肽中，SEQ ID NO:76的肽6显示出与EGFRIgG最强的结合(最低的EC50)。
表11.用于EGFR IgG结合的肽序列和EGFR IgG序列
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表12.肽结合EGFR IgG的EC50
对于起掩蔽作用的肽，它还必须抑制感兴趣的抗体与其同源抗原结合。同样，基于ELISA的竞争性抑制研究也用于测试每种肽抑制EGFR IgG与EGFR抗原结合的能力。生物素化的抗原被捕获在中性亲和素包被的板上，使用生物素猝灭，并洗涤。在一系列稀释中滴定抑制性肽，并且用恒定浓度的抗体预温育。然后在抗原捕获的板上温育抑制性肽和抗体混合物。然后使用辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测与板结合抗原结合的抗体。将ELISA信号相对于对数级肽浓度作图(参见图15)。信号的剂量依赖性降低表明肽竞争抗体与同源抗原的结合。使用Graphpad Prism软件来计算达到50％最大信号(IC50)所需的肽的抑制性浓度。IC50数据在表13中提供。在该系列测试的肽中，肽6在抑制EGFR IgG与EGFR抗原结合方面是最有效的。
表13.用于肽抑制EGFR IgG与EGFR抗原结合的IC50
实施例8：肽结合EGFRFab并且抑制EGFR Fab与EGFR抗原结合
以ELISA形式来评估表14的肽序列与EGFR Fab的结合。如以上实施例7中所述进行结合研究。在图16中示出了结合曲线，并且在表15-16中提供了结合的EC50。在该系列测试的肽中，肽8和肽15显示出对EGFR Fab最强的结合亲和力(最低的EC50)。
表14.用于αEGFR IgG结合的肽序列
表15.肽与αEGFR Fab结合的EC50
表16.肽与αEGFR Fab结合的EC50
竞争性抑制研究也用于测试每种肽以ELISA形式抑制EGFR-Fab与EGFR抗原结合的能力。如以上实施例7中所述进行竞争性抑制测量。在图17中示出了EGFR Fab与EGFR抗原结合的剂量依赖性肽抑制，并且在表17-18中提供了IC50数据。值得注意的是，肽8(SEQ ID NO:26)在抑制EGFR Fab与EGFR抗原结合方面是最有效的。
表17.用于肽抑制αEGFR Fab与EGFR抗原结合的IC50
表18.用于肽抑制αEGFR Fab与EGFR抗原结合的IC50
实施例9：序列活性关系-EGFR Fab肽
建立了肽8的序列活性关系(SAR)，发现其表现出与EGFR Fab的强结合和对EGFRFab与EFGR抗原结合的抑制。通过将肽中的单独的残基突变为丙氨酸，并且测量每个突变对肽抑制EGFR Fab与EGFR抗原结合的能力的影响，建立了序列活性关系。丙氨酸扫描序列在表19中提供。
表19.丙氨酸扫描肽序列
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如以上实施例7中所述，以ELISA形式进行抑制测量。丙氨酸扫描肽的竞争性抑制图显示在图18-19中，并且计算的IC50在表20-21中提供。其丙氨酸突变显著降低肽的抑制活性(或显著提高IC50)的肽残基被认为是不耐受突变的关键残基(分类为不耐受，或“NT”)。其丙氨酸突变仅在一定程度上降低肽的抑制活性的肽残基被认为是有一定耐受性的(分类为有一定耐受性，或“ST”)。其丙氨酸突变与未突变的肽8序列表现相似的肽残基被认为是非关键位点，其中突变确实是耐受的(分类为耐受，或“T”)。
表20.肽8丙氨酸扫描突变体的竞争性抑制和SAR数据
表21.肽8丙氨酸扫描突变体的竞争性抑制和SAR数据
如从表20-21可以看出，在肽8的Asp-7、Lys-10、Pro-11和Ile-12处的丙氨酸突变耐受性最差，表明这些残基是抑制EGFR Fab与EGFR抗原结合的关键残基。突变研究表明，Pro-1和Ser-4可能对结合抑制也很重要。此外，结果表明Arg-3、Ile-6、Val-8和Val-14是抑制EGFR与EGFR抗原结合的非关键残基。
实施例10：肽8的优化的噬菌体文库构建
使用实施例9的肽序列活性关系，构建DNA寡聚物文库，其中编码肽8内的关键残基的密码子被最小地突变，并且编码在丙氨酸扫描突变研究中耐受的非关键残基(例如，Arg-3、Ile-6、Val-8和Val-14)的密码子发生严重突变。将得到的寡聚物克隆到噬菌体载体中，所述噬菌体载体用于经由与噬菌体的pIII丝融合来展示SAR指导的肽。然后使用本领域的标准技术，经由在细菌中扩增，将相关载体用于产生噬菌体优化文库。
实施例11：优化的噬菌体文库的淘选
一旦完成噬菌体优化文库，使用负载EGFR Fab的珠对噬菌体文库进行生物淘选。进行多轮淘选，其中允许噬菌体与负载EGFR Fab的珠结合，洗涤、洗脱并扩增。在使用固定浓度的EGFR抗原或肽8的每一轮淘选期间包括额外的选择压力。在淘选之后，将噬菌体感染的细菌铺板，并且将菌落挑到96孔块中。然后经由离心从细菌细胞中扩增并分离克隆噬菌体。在存在或不存在饱和浓度的EGFR抗原的情况下，在针对EGFR Fab包被的板的结合ELISA中测试含有噬菌体的上清液。如果在EGFR的存在下结合信号降低，则选择能够结合EGFRFab的噬菌体用于序列分析。
实施例12：淘选ELISA-EGFR Fab肽
克隆噬菌体作为粗上清液收获，并且经由标准ELISA筛选。简而言之，生物素化的EGFR Fab被捕获在中性亲和素包被的板上。在加入克隆噬菌体之前，将孔与封闭缓冲液和EGFR抗原或单独的封闭缓冲液一起温育。在不洗涤或抽吸的情况下，将克隆噬菌体上清液加入到孔中，并且温育持续短暂时间。然后洗涤孔，接着使用辣根缀合的抗M13抗体来检测结合的噬菌体。然后将感兴趣的克隆噬菌体送去用于序列分析。
肽8文库序列的噬菌体淘选结果在表22中示出。鉴定了679个克隆噬菌体序列。使用WebLogo 3.7.4从表22的所有序列计算共有序列。共有序列在图20中示出。
表22.αEGFR Fab肽8文库序列的噬菌体淘选结果。(-)表示与αEGFR Fab肽8相应位置相同的氨基酸。
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在679个克隆噬菌体中，选择20个用于肽合成，并且评估EGFR Fab的结合和抑制。在表23中示出了选择用于合成的肽的序列。在图21-22中示出了如通过ELISA测量的肽与EGFR Fab结合的结合曲线，并且在表24-25中提供了相对于肽8和EGFR-Bio的EC50。图23-24示出了如通过ELISA测量的肽对EGFR Fab与EGFR抗原结合的剂量依赖性抑制。在表26-27中提供了肽相对于肽8的结合抑制的IC50数据。结合和抑制数据证明噬菌体文库鉴定了更有效力的肽掩蔽，例如肽45和肽46。
表23.选择用于合成的肽序列(EGFR Fab肽8优化)
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表24.肽与αEGFR Fab结合的EC50
| 肽 | EC50(nM) |
| EGFR-Bio(3nM) | 0.17 |
| 肽8 | 699.6 |
| 肽29 | 150.6 |
| 肽30 | 194.0 |
| 肽31 | 171.8 |
| 肽32 | 66.55 |
| 肽33 | 340.2 |
| 肽34 | 377.5 |
| 肽35 | 149.2 |
| 肽36 | 154.2 |
| 肽37 | 358.0 |
| 肽38 | 1294 |
表25.肽与αEGFR Fab结合的EC50
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表26.用于肽抑制αEGFR Fab与EGFR抗原结合的IC50
| 肽 | IC50(μM) |
| 肽8 | 7.76 |
| 肽29 | 2.08 |
| 肽30 | 4.55 |
| 肽31 | 3.72 |
| 肽32 | 2.08 |
| 肽33 | 2.30 |
| 肽34 | 4.91 |
| 肽35 | 2.22 |
| 肽36 | 1.97 |
| 肽37 | 4.16 |
| 肽38 | 29.9 |
表27.用于肽抑制αEGFR Fab与EGFR抗原结合的IC50
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实施例13：在结肠直肠癌的小鼠模型中的抗肿瘤功效
雌性小鼠被皮下植入在50％matrigel中的500万HCT116结肠直肠肿瘤细胞。在接种HCT116的同一天，经由尾静脉移植2000万个人PBMC。当肿瘤达到250mm3时，将小鼠随机分组，并且每天静脉给予化合物，持续10天。每两到三天测量肿瘤体积，并且随时间作图。肿瘤体积生长动力学表明掩蔽的EGFR靶向双特异性化合物的抗肿瘤活性。观察到的抗肿瘤活性是蛋白酶依赖性的，因为在可切割的接头内缺乏蛋白酶底物的化合物相当于媒介物对照。图25-28示出了不同给药量的PC1(图25)、PC5(图26)、PC7(图27)和PC6(图28)的体内肿瘤生长抑制数据。
实施例14：PC1和PC4与人和食蟹猴CD3ε、EGFR和白蛋白的结合
通过ELISA评估多肽复合物PC1和PC4与人和食蟹猴CD3ε、EGFR和白蛋白的结合。简而言之，生物素化的抗原被捕获在中性亲和素包被的板上。多肽复合物分子在指示的地方用活性蛋白酶处理。然后将在缓冲液中稀释的多肽复合物分子加入到抗原包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的多肽复合物。使用Graphpad Prism软件拟合结合曲线。在图29和30中分别示出了PC1和PC4与人和食蟹猴CD3ε的结合曲线。在图31和32中分别示出了PC1和PC4与人和食蟹猴EGFR的结合曲线。如从曲线中可以看出，靶接合是切割依赖性的，因为掩蔽使CD3ε和EGFR结合分别降低至低于1000分之一和低于300分之一。用蛋白酶处理PC4能够实现与未掩蔽的PC1相当的有效抗原结合。在图33和34中分别示出了PC4与人和食蟹猴白蛋白的结合曲线。如可以看出的，PC4显示出与人和猴白蛋白的有效结合。
实施例15：多肽复合物介导的肿瘤细胞毒性和T细胞活化(A549细胞)
使用EGFR阳性肿瘤细胞系A549在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估多肽复合物。使用来自Agilent的xCelligence实时细胞分析仪来测量肿瘤细胞杀伤，该分析仪依赖于传感器阻抗测量结果(细胞指数)，其随着肿瘤细胞在传感器的表面上的粘附、扩散和扩展而增加。同样，随着肿瘤细胞被杀死，阻抗降低。向每个孔中加入肿瘤细胞，并且允许在96孔E板上粘附过夜。第二天，将在补充人血清的培养基中滴定的多肽复合物与人PBMC一起加入到孔中。每10分钟获取细胞指数测量结果持续另外的72小时。然后将细胞指数乘以小时数(肿瘤细胞生长动力学)相对于多肽复合物的对数浓度作图，其中使用Graphpad Prism软件来计算降低肿瘤生长50％所需的浓度(IC50)。图35示出了在PBMC的存在下PC1和PC4介导的A549肿瘤细胞杀伤的图。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。蛋白酶处理使PC4的活性相对于未处理的PC4增加了约43000倍。蛋白酶处理的PC4的活性水平与未掩蔽的PC1的活性水平相当(参见图35)。
实施例16：在体外细胞因子诱导测定中评估多肽复合物
使用EGFR阳性肿瘤细胞系HCT116(结肠直肠癌(CRC)细胞-KRAS和PIK3CA突变体)和A549(非小细胞肺癌(NSCLC)细胞-KRAS突变体)，在功能性体外细胞因子诱导测定中评估多肽复合物PC1和PC4。使用Meso Scale Discovery(MSD)电化学发光仪器来测量T细胞细胞因子诱导。将肿瘤细胞加入到孔中，并且允许在96孔上粘附过夜。第二天，多肽复合物与人PBMC一起在补充人血清的培养基中滴定。72小时后收集上清液并测量细胞因子水平(干扰素γ(IFNg)和肿瘤坏死因子(TNF))。然后将细胞因子水平相对于多肽复合物的对数浓度作图，其中使用Graphpad Prism软件来计算诱导最大值的50％(EC50)所需的浓度。图36-39示出了HCT116细胞(图36-37)和A549细胞(图38-39)中随着PC1和PC4浓度增加的细胞因子水平。PC4在指示的地方用蛋白酶处理。PC4 EGFR和CD3结合结构域的掩蔽降低了诱导细胞因子释放的能力。此外，在T细胞共培养测定中，发现抗KRAS突变型抗EGFR抗性CRC和NSCLC细胞系的功能活性是切割依赖性的。蛋白酶处理的PC4相对于未掩蔽的PC1表现出相似的效力。
实施例17：在HCT116小鼠肿瘤模型中的活性
在小鼠肿瘤模型研究中评估多肽复合物。雌性小鼠被皮下植入在50％matrigel中的500万HCT116结肠直肠肿瘤细胞。在接种HCT116的同一天，经由尾静脉移植2000万个人PBMC。当肿瘤达到250mm3时，将小鼠随机分组，并且每天静脉内给予化合物，持续10天(参见图40)。每两到三天测量一次肿瘤体积，并且随时间作图。肿瘤体积生长动力学表明掩蔽的EGFR靶向双特异性化合物的抗肿瘤活性类似于未掩蔽的化合物的抗肿瘤活性。观察到的抗肿瘤活性是蛋白酶依赖性的，因为在可切割的接头(不可切割的)内缺乏蛋白酶底物的化合物相当于媒介物对照。基于研究中存活的小鼠数量相对于时间生成存活图。图41示出了PC1(0.5mg/kg)、PC7(0.5mg/kg)、不可切割的PC6(0.5mg/kg)和媒介物处理的小鼠的平均肿瘤体积相对于治疗天数的图。图42示出了媒介物和PC5处理的小鼠的肿瘤体积相对于治疗天数的图。在图43中示出了小鼠的百分比存活率相对于用PC1(0.5mg/kg)、PC5(0.5mg/kg)、不可切割的PC6(0.5mg/kg)和媒介物处理的天数。在植入抗EGFR抗性KRAS和PIK3CA突变HCT116人肿瘤细胞的移植有人PBMC的小鼠中，发现同等剂量水平的可切割的PC7和PC1诱导肿瘤完全根除(参见图41)。
实施例18：在人结肠直肠癌(CRC)类器官中的切割依赖性活性
从结肠直肠癌患者中获得新鲜肿瘤组织，在不破坏基础免疫区室或肿瘤微环境的情况下将其分离成小的三维肿瘤样物，并且将其分配至96孔板。用多肽复合物处理新鲜的肿瘤样物，并且保持培养持续24至72小时(参见图44)。在研究结束时，使用结合细胞标志物CD25、CD69、4-1BB和颗粒酶-B(GzB)的荧光标记的抗体来消化和染色肿瘤样物。经由流式细胞术运行染色的细胞，并且在活细胞上门控荧光信号。对于每种多肽处理条件，对给定标志物的阳性染色的细胞的百分比作图。参考图45，CD25、CD69、4-1BB和颗粒酶的上调是蛋白酶切割依赖性的，其中缺乏可切割底物(不可切割)的多肽复合物PC6是无活性的，并且相当于媒介物对照。在这些原发性人结肠直肠癌肿瘤样物中，可切割的和非掩蔽的多肽复合物是活性的，并且能够诱导肿瘤驻留免疫区室内的活化标志物(参见图45)。此外，观察到PC5的浓度依赖性活性(参见图45)。
实施例19：非人类灵长类动物(NHP)毒性研究
在食蟹猴中评估了多肽分子PC1和PC4的药代动力学和探索性安全性。简而言之，对体重约3kg的食蟹猴以IV推注施用多肽，每周一次，持续三周，或者经由连续IV输注施用。每天观察动物是否有不良事件的迹象。PC1经由持续IV(cIV)输注以5μg/kg/天、15μg/kg/天和30μg/kg/天给药。针对PC4经由IV推注注射，使用0.1mg/kg/剂量、0.3mg/kg/剂量和0.6mg/kg/剂量的给药量。在给药后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。相对于在对照食蟹猴血浆中稀释的参考标准品，经由标准ELISA技术测量血浆中多肽分子的浓度。将掩蔽的多肽复合物PC4在动物中达到的最大血浆浓度与使用未掩蔽的多肽复合物PC1达到的最大血浆浓度进行比较。用掩蔽的多肽复合物获得的最大血浆浓度与未掩蔽的多肽复合物的最大耐受血浆浓度的比较揭示了>3,000倍的倍数(参见图46-47)。在0.6mg/kg/剂量的最高测试剂量下，掩蔽的多肽复合物在动物中没有不良事件(参见图46)。通过连续IV输注，未掩蔽的多肽复合物PC1的最大耐受剂量(MTD)为15μg/kg/天。由于严重的不良事件(参见图46)，施用30μg/kg/天连续IV输注未掩蔽的多肽复合物的动物是不耐受的。PC4毒性研究支持其增强的药代动力学、安全性和设计。值得注意的是，连续三周每周施用一次的PC4耐受性良好，没有临床化学、血液学或病理学的临床观察结果或显著变化。相比之下，以15μg/kg/天通过持续IV输注给药的PC1使体温升高并且使肝酶增加。由于严重的不良事件，包括动物的发热、皮疹、GI毒性和缺乏应答性，在给药后24小时必须终止以30μg/kg/天通过持续IV输注用PC1进行的治疗(参见图46)。临床观察结果、体温和临床病理学测量结果支持PC4相对于未掩蔽的PC1具有较大的安全倍数(>3,000倍)。尽管EGFR在组织中广泛表达，但发现PC4在食蟹猴高暴露时减少细胞因子释放和健康组织毒性(GI、肝脏、皮肤)。PC4的NOAEL(未观察到的不良反应水平)为≥0.6mg/kg/剂量，每周IV推注，持续三周(参见图46)。
实施例20：PC10和PC11的EGFR多肽复合物结合
评估EGFR-CD3多肽复合物的EGFR和CD3ε结合。
简而言之，以标准酶联免疫吸附测定(ELISA)形式来评估多肽复合物分子结合EGFR以及CD3的能力。在蛋白酶处理之前和之后测量EGFR或CD3的多肽复合物结合。简而言之，生物素化的抗原被捕获在中性亲和素包被的板上。多肽复合物分子在指示的地方用活性蛋白裂解酶(MTSP1)处理。然后将在缓冲液中稀释的多肽复合物分子加入到抗原包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的多肽复合物。使用GraphpadPrism软件来计算获得50％最大信号(EC50)所需的多肽复合物的浓度。
图48示出了通过ELISA测量的PC10和PC11与EGFR的结合。
图49示出了通过ELISA测量的PC10和PC11与CD3的结合。
实施例21：PC10和PC11介导的肿瘤细胞毒性和T细胞活化
使用EGFR阳性肿瘤细胞系HCT116，在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估多肽复合物PC10和PC11。使用来自Agilent的xCelligence实时细胞分析仪测量肿瘤细胞杀伤，该分析仪依赖于传感器阻抗测量结果(细胞指数)，其随着肿瘤细胞在传感器的表面上的粘附、扩散和扩展而增加。同样，随着肿瘤细胞被杀死，阻抗降低。每孔加入10,000个肿瘤细胞，并且允许在96孔E板上粘附过夜。第二天，将在补充人血清的培养基中滴定的多肽复合物连同30,000个CD8+T细胞加入到孔中。每10分钟获取细胞指数测量结果持续另外的72小时。然后将细胞指数乘以小时数(肿瘤细胞生长动力学)相对于多肽复合物的浓度作图，其中使用Graphpad Prism软件来计算降低肿瘤生长50％所需的浓度(IC50)。
图50示出了在CD8+T细胞的存在下PC10和PC11介导的HCT116肿瘤细胞杀伤的图。
实施例22：经优化的噬菌体文库构建-CD3 scFv肽
通过将肽中的每个单独残基突变为丙氨酸并测量针对SP34.185scFv的结合和抑制，建立了肽A和肽B的序列活性关系(SAR)。其丙氨酸突变显著削弱结合和抑制的肽残基可以被认为是不容许突变的关键残基。其丙氨酸突变表现类似于未突变的序列的肽残基可以被认为是非关键位点，其中突变确实是可耐受的。使用肽SAR，构建DNA寡聚物文库，其中编码每个肽序列内的关键残基的密码子被最小地突变，并且编码非关键残基的密码子被严重突变。将得到的寡聚物被克隆到噬菌体载体中，所述噬菌体载体用于经由与噬菌体的pIII丝融合来展示SAR引导的肽。然后使用本领域的标准技术，经由在细菌中扩增，将相关载体用于产生噬菌体优化文库。
通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估肽结合SP34.185 scFv的能力。简而言之，生物素化的肽被捕获在中性抗生物素蛋白包被的板上，用生物素猝灭，然后进行洗涤步骤。然后将SP34.185 scFv滴定到肽捕获的板上。然后洗涤板并使用二级辣根过氧化物酶抗体缀合物检测结合的SP34.185 scFv。在再次洗涤之后，使用标准ELISA技术对板进行显影，并使用酸停止。使用Graphpad prism来计算达到50％最大信号或EC50所需的SP34.185 scFv的浓度。数据显示在图51A-51F中并且总结在表28A-28D中。在表30中示出了肽A和肽B的CD3Ala扫描肽的肽序列。
表28A.图51B的总结
表28B.图51C的总结
| ELISA | 肽A | 肽I | 肽J | 肽K | 肽L | 肽M | 肽N |
| EC50 nM | 0.986 | 310.8 | 3.134 | 1,960 | 4.363 | 2.76 | 1.546 |
表28C.图51E的总结
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表28D.图51F的总结
通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估肽抑制SP34.185 scFv结合CD3ε的能力。简而言之，将固定浓度的SP34.185 scFv与不同浓度的肽在溶液中一起温育。将SP34.185scFv和肽溶液在加入到CD3包被的板中之前温育持续1小时。在洗涤前允许结合进行30分钟。在洗涤之后，使用二级辣根过氧化物酶抗体缀合物结合的SP34.185 scFv。在再次洗涤之后，使用标准ELISA技术对板进行显影，并停止使用酸。使用Graphpad prism来计算抑制50％的SP34.185 scFv CD3结合信号(IC50)所需的肽浓度。数据显示在图52A-52F中并总结在表29A-29D中。
表29A.图52B的总结
表29B.图52C的总结
表29C.图52E的总结
表29D.图52F的总结
表30.CD3 Ala扫描序列-肽A和肽B
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实施例23：淘选经优化的噬菌体文库构建体-CD3 scFv肽
一旦完成噬菌体优化文库，使用负载SP34.185 scFv的珠对噬菌体文库进行生物淘选。进行多轮淘选，其中允许噬菌体与负载SP34.185scFv的珠结合，洗涤、洗脱和扩增。在使用固定浓度的CD3、肽A或肽B的每一轮淘选期间包括额外的选择性压力。在淘选之后，将噬菌体感染的细菌铺板，并将菌落挑到96孔块中。然后经由离心从细菌细胞中扩增并分离克隆噬菌体。在存在或不存在饱和浓度的CD3的情况下，在针对SP34.185 scFv包被的板的结合ELISA中测试含有噬菌体的上清液。如果在CD3的存在下结合信号降低，则选择能够结合SP34.185scFv的噬菌体用于序列分析。
实施例24：淘选ELISA-CD3 scFv肽
克隆噬菌体作为粗上清液收获，并经由标准酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选。简而言之，生物素化的SP34.185 scFv被捕获在中性抗生物素蛋白包被的板上。在加入克隆噬菌体之前，将孔与封闭缓冲液和CD3或单独的封闭缓冲液一起温育。在不洗涤或抽吸的情况下，将克隆噬菌体上清液加入到孔中，并温育持续短的时间。然后洗涤孔，随后使用辣根过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测结合的噬菌体。然后将感兴趣的克隆噬菌体送去用于序列分析。
在表31中示出了CD3 scFv肽B文库序列的噬菌体淘选结果。在表32中示出了选择用于合成的那些肽的序列，并且进一步评估了与抗CD3 scFv的结合(图53A-53B)和对抗CD3scFv与CD3结合的抑制(图54A-54B)。图55所示的共有序列是从表31所示的所有序列中计算出来的，并使用WebLogo 3.7.4生成。
表31.来自肽B优化文库淘选(-)的克隆噬菌体肽序列表明与CD3 scFv肽B相应位置(例如噬菌体1位置)相同的氨基酸。
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表32.选择用于合成的那些肽的序列(CD3 scFv肽B优化)
虽然在本文中已经示出和描述了本公开的优选的实施方案，但对本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本公开时，可以采用本文描述的本公开的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
Claims (177)
1.一种根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：
A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；
P1包含结合至A1的肽；
L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；
H1包含半衰期延长分子；并且
A2包含结合至表皮生长因子受体(EGFR)的第二抗原识别分子。
2.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
3.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含为人的或人源化的抗体或抗体片段。
4.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
5.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2被结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
6.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
7.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2被结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
8.根据权利要求2所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。
9.根据权利要求8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单链可变片段(scFv)。
10.根据权利要求9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。
11.根据权利要求8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单结构域抗体。
12.根据权利要求8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)或可变结构域(VHH)。
13.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段。
14.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段，所述抗CD3e单链可变片段与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。
15.根据权利要求1-14所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3。
16.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含可变轻链和可变重链，其各自能够特异性地结合至人CD3。
17.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19。
18.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的所述分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。
19.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的所述分离的多肽或多肽复合物结合至所述效应细胞。
20.根据权利要求19所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞是T细胞。
21.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1结合至作为所述效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。
22.根据权利要求21所述的分离的多肽或多肽复合物，其中作为所述TCR-CD3复合物的一部分的所述多肽是人CD3ε。
23.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3为LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ ID NO:2和LC-CDR3：SEQ IDNO:3；并且所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3为HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ ID NO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6。
24.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:1、LC-CDR2：SEQ ID NO:2和LC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:4、HC-CDR2：SEQ ID NO:5和HC-CDR3：SEQ ID NO:6。
25.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
26.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3为LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQ IDNO:9；并且所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3为HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ ID NO:12。
27.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:7、LC-CDR2：SEQ ID NO:8和LC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:10、HC-CDR2：SEQ ID NO:11和HC-CDR3：SEQ IDNO:12。
28.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
29.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第二抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
30.根据权利要求29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab。
31.根据权利要求29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。
32.根据权利要求29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段是人源化的或人的。
33.根据权利要求29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2是所述Fab。
34.根据权利要求33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。
35.根据权利要求33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述Fab的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且所述Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述Fab的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ IDNO:20。
36.根据权利要求33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A2的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ IDNO:15、LC-CDR2：SEQ ID NO:16和LC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且A2包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A2的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:18、HC-CDR2：SEQ ID NO:19和HC-CDR3：SEQ ID NO:20。
37.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
38.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
39.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Fab重链多肽包含根据SEQID NO:23的氨基酸序列。
40.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Fab重链多肽包含根据SEQID NO:24的氨基酸序列。
41.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽被结合至A1的所述单链可变片段(scFv)的C末端。
42.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽被结合至所述单链可变片段(scFv)A1的C末端。
43.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽被结合至A1的所述单链可变片段(scFv)的N末端。
44.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽被结合至所述单链可变片段(scFv)A1的N末端。
45.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽被结合至A1的所述scFv重链多肽。
46.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽被结合至A1的所述scFv重链多肽。
47.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽被结合至A1的所述scFv轻链多肽。
48.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽被结合至A1的所述scFv轻链多肽。
49.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2进一步包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
50.根据权利要求49所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物是根据式Ia：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
51.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽被结合至A1的所述scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的所述Fab轻链多肽。
52.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽被结合至A1的所述scFv重链多肽，并且L2被结合至A2的所述Fab重链多肽。
53.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽被结合至A1的所述scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的所述Fab轻链多肽。
54.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽被结合至A1的所述scFv轻链多肽，并且L2被结合至A2的所述Fab重链多肽。
55.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1削弱A1与所述效应细胞抗原的结合。
56.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合被结合至A1。
57.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1与所述效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。
58.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2削弱A2与EGFR的结合。
59.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合被结合至A2。
60.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2在抗原结合位点处或附近被结合至A2。
61.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2与EGFR具有小于70％的序列同源性。
62.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。
63.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。
64.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。
65.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。
66.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
67.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽或线性肽。
68.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽。
69.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含线性肽。
70.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
71.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
72.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
73.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:70的氨基酸序列。
74.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26、71-96、98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:26、71-96、98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
75.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据X1-C-X2-X3-X4-X5-D-X6-A-X7-P-X8-C-X9的氨基酸序列，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A、N、I、V、S、H和P；X3选自S、P、F和Y；X4选自H、L、Q、P、R、F、N；X5选自I、F、Y、H、N、T、S、D、A、L和V；X6选自T、P、N、L、I、V、S、D、H、A和Y；X7选自K和Y；X8选自I、P、L和M；并且X9选自A、V、I、T、L、S、D、F、V和H(SEQ IDNO:841)。
76.根据权利要求75所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自P和L；X2选自R、L、T、A和N；X3选自S、P和F；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y、H、N和T；X6选自T、P、N、L、I和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V、I、T、L和S。
77.根据权利要求76所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1是P；X2选自R、L和T；X3是S；X4选自H、L、Q和P；X5选自I、F、Y和T；X6选自T、P、N和V；X7是K；X8是I；并且X9选自A、V和I。
78.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列，或相对于26、86-96中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
79.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26、86-96中任一者的氨基酸序列。
80.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:98-776中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:98-776中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
81.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:SEQID NO:98-776中任一者的氨基酸序列。
82.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列，或相对于99-118中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
83.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:99-118中任一者的氨基酸序列。
84.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
85.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
86.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中任一者的氨基酸序列，或相对于SEQ ID NO:25、797-835或843-1690中的任一者具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
87.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。
88.根据权利要求87所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。
89.根据权利要求88所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。
90.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。
91.根据权利要求90所述的分离的多肽或多肽复合物，其中U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。
92.根据权利要求91所述的分离的多肽或多肽复合物，其中U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
93.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:797-823中任一者的氨基酸序列。
94.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:25、824-835或843-1690中任一者的氨基酸序列。
95.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:824-835中任一者的氨基酸序列。
96.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:810的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
97.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:811的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
98.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:834的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
99.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:810的氨基酸序列。
100.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:811的氨基酸序列。
101.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:834的氨基酸序列。
102.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至A1的N末端。
103.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1被结合至A1的C末端。
104.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2被结合至A2的N末端。
105.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2被结合至A2的C末端。
106.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
107.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
108.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个氨基酸的肽序列。
109.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少18个氨基酸的肽序列。
110.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少26个氨基酸的肽序列。
111.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2具有包含(G2S)n的式，其中n是1至3的整数(SEQ ID NO:840)。
112.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
113.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割时，P1变得与A1未结合，从而将A1暴露于所述效应细胞抗原。
114.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L2被所述肿瘤特异性蛋白酶切割时，P2变得与A2未结合，从而将A2暴露于EGFR。
115.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
116.根据权利要求115所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。
117.根据权利要求115所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
118.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白可切割的氨基酸序列。
119.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ IDNO:30或31的氨基酸序列。
120.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ IDNO:27-35中任一项的氨基酸序列。
121.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含接头4(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:66)、接头5(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:67)、接头6(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:68)或接头7(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列，或相对于接头4、接头5、接头6或接头7的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
122.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含聚合物。
123.根据权利要求122所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
124.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含白蛋白。
125.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含Fc结构域。
126.根据权利要求124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
127.根据权利要求126所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
128.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含多肽、配体或小分子。
129.根据权利要求128所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、所述配体或所述小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。
130.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
131.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
132.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
133.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
134.根据权利要求133所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
135.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
136.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。
137.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
138.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
139.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
140.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
141.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
142.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
143.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
144.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
145.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:36、HC-CDR2：SEQ ID NO:37和HC-CDR3：SEQ ID NO:38。
146.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:39、HC-CDR2：SEQ ID NO:40和HC-CDR3：SEQ ID NO:41。
147.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
148.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。
149.根据权利要求148所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。
150.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。
151.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
152.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
153.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。
154.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。
155.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。
156.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:836)、(GGGS)n(SEQ ID NO:837)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:838)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:839)的式，其中n是至少1的整数。
157.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3包含根据SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
158.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44-61中的任一者具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
159.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
160.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
161.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
162.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
163.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
164.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
165.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
166.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
167.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
168.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
169.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
170.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:63具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
171.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
172.一种药物组合物，其包含：(a)根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
173.一种分离的重组核酸分子，其编码根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物。
174.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:115具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
175.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
176.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:116具有1、2或3个氨基酸突变、取代或缺失的氨基酸序列。
177.根据权利要求50所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:116的氨基酸序列。
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2022
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