CN117042801A - 涉及靶向trop2和效应细胞抗原的肿瘤活化抗体的组合物和方法 - Google Patents
涉及靶向trop2和效应细胞抗原的肿瘤活化抗体的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了选择性地结合至TROP2和效应细胞抗原如CD3的多特异性抗体、其药物组合物以及核酸，及其制备和发现方法。
Description
交叉引用
本申请要求2020年12月9日提交的美国临时申请第63/123,327号、2021年5月12日提交的美国临时申请第63/187,719号的权益，这两项申请中的每一个均通过引用以其整体并入本文。
序列表
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发明内容
在某些实施方案中，本文公开了根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包含人的或人源化的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，L1结合至第一抗原识别分子的N末端。在一些实施方案中，A2结合至第一抗原识别分子的C末端。在一些实施方案中，L1结合至第一抗原识别分子的C末端。在一些实施方案中，A2结合至第一抗原识别分子的N末端。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。在一些实施方案中，A1是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A1是单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)或可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段，所述抗CD3e单链可变片段与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3。在一些实施方案中，A1包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链和可变重链各自能够特异性地结合至人CD3。在一些实施方案中，A1包含选自莫罗单抗(muromonab)-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(otelixizumab)(TRX4)、替利组单抗(teplizumab)(MGA031)、维西珠单抗(visilizumab)(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，A1结合至作为效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。在一些实施方案中，作为TCR-CD3复合物的一部分的多肽是人CD3ε。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ IDNO:3；并且scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3：LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ ID NO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ IDNO:8和HC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3：LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ ID NO:11和LC-CDR3：SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ IDNO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，第二抗原识别分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段是人源化的或人的。在一些实施方案中，A2是Fab。在一些实施方案中，Fab包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。在一些实施方案中，Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的单链可变片段(scFv)的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的单链可变片段(scFv)的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A2还包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物是根据式Ia：P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv重链多肽，并且L2结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv重链多肽，并且L2结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，P1削弱A1与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A1。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。在一些实施方案中，P2削弱A2与TROP2的结合。在一些实施方案中，P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A2。在一些实施方案中，P2在抗原结合位点处或附近结合至A2。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于70％的序列同源性。在一些实施方案中，P1或P2包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1或P2包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1或P2包含环肽或线性肽。在一些实施方案中，P1或P2包含环肽。在一些实施方案中，P1或P2包含线性肽。在一些实施方案中，P1包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:26、27或122的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:23-25中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1结合至A1的N末端。在一些实施方案中，L1结合至A1的C末端。在一些实施方案中，L2结合至A2的N末端。在一些实施方案中，L2结合至A2的C末端。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1或L2具有包含(G2S)n(SEQ ID NO:243)的式，其中n是1至3的整数。在一些实施方案中，L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A1暴露于效应细胞抗原时，P1变得与A1未结合。在一些实施方案中，当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A2暴露于TROP2时，P2变得与A2未结合。在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(matriptase)(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，L1或L2包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白(legumain)可切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含根据SEQID NO:31或32的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含根据SEQ ID NO:58或59的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含根据SEQ ID NO:28-61中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，L1或L2包含接头25(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:54)、接头26(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:55)、接头27(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:56)或接头28(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列，或相对于接头25、接头26、接头27或接头28的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1包含白蛋白。在一些实施方案中，H1包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1包含多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是645gH1gL1。在一些实施方案中，单结构域抗体是645dsgH5gL4。在一些实施方案中，单结构域抗体是23-13-A01-sc02。在一些实施方案中，单结构域抗体是A10m3或其片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7r-31。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7h-11-15。在一些实施方案中，单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。在一些实施方案中，单结构域抗体是10E。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ ID NO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ ID NO:71和HC-CDR3：SEQID NO:72。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体是SA21。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。在一些实施方案中，L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L3包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQID NO:74-121具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:83具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:80和SEQID NO:81具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQID NO:86和SEQ ID NO:87具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:90和SEQ IDNO:91具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ IDNO:106和SEQ ID NO:107具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:110和SEQ IDNO:111具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQID NO:116和SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含：(a)本文所述的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在某些实施方案中，本文公开了分离的重组核酸分子，所述分离的重组核酸分子编码本文所述的分离的多肽或多肽复合物。
在某些实施方案中，本文公开了根据式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，所述连接部分在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。在一些实施方案中，当L1a未被切割时，P1a削弱第一抗原识别分子与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，效应细胞抗原是抗CD3效应细胞抗原。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。在一些实施方案中，P1a包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1a包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1a包含环肽或线性肽。在一些实施方案中，P1a包含环肽。在一些实施方案中，P1a包含线性肽。在一些实施方案中，P1a包含选自SEQ ID NO:26、27或122的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1a包含白蛋白。在一些实施方案中，H1a包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1a包含多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是645gH1gL1。在一些实施方案中，单结构域抗体是645dsgH5gL4。在一些实施方案中，单结构域抗体是23-13-A01-sc02。在一些实施方案中，单结构域抗体是A10m3或其片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7r-31。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7h-11-15。在一些实施方案中，单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。在一些实施方案中，单结构域抗体是10E。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ ID NO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ ID NO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体是SA21。在一些实施方案中，H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L1a)。在一些实施方案中，L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L1a包含根据SEQ ID NO:28-61中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文公开了多肽复合物，其包含根据构型1的结构排列：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab重链多肽连接至所述scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。在一些实施方案中，本文公开了多肽复合物，其包含根据构型2的结构排列：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体且单独地指明通过引用并入。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求中详细地阐述。通过参考以下阐述其中利用了本公开的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A-图1B示出了正常方向(图1A)和翻转方向(图1B)的本公开的多肽复合物。
图2A示出了本公开的几种多肽复合物的TROP2结合的滴定数据。
图2B示出了本公开的几种多肽复合物的TROP2结合的滴定数据。
图3A示出了本公开的几种多肽复合物的CD3ε结合的滴定数据。
图3B示出了本公开的几种多肽复合物的CD3ε结合的滴定数据。
图4A示出了用本公开的多肽复合物处理的HCT116细胞的细胞活力数据。
图4B示出了用本公开的多肽复合物处理的HCT116细胞的细胞活力数据。
图4C示出了用本公开的多肽复合物处理的MDAMB231细胞的细胞活力数据。
图4D示出了用本公开的多肽复合物处理的MDAMB231细胞的细胞活力数据。
图5A示出了本公开的几种多肽复合物的TROP2结合的滴定数据。
图5B示出了本公开的几种多肽复合物的TROP2结合的滴定数据。
图6A示出了本公开的几种多肽复合物的CD3ε结合的滴定数据。
图6B示出了本公开的几种多肽复合物的CD3ε结合的滴定数据。
图7A示出了用本公开的多肽复合物处理的HCT116细胞的细胞活力数据。
图7B示出了用本公开的多肽复合物处理的HCT116细胞的细胞活力数据。
图8A-图8C示出了在CD8+ T细胞的存在下多肽复合物介导的H292肿瘤细胞杀伤。
图9A-图9D示出了在CD8+ T细胞的存在下多肽复合物介导的HCT116肿瘤细胞杀伤。
图10A-图10C示出了在CD8+ T细胞的存在下多肽复合物介导的MDAMB231肿瘤细胞杀伤。
图11A示出了在单次IV团注注射(bolus injection)之后多肽复合物PC1在食蟹猴中的药代动力学。
图11B示出了在单次IV团注注射之后多肽复合物PC5在食蟹猴中的药代动力学。
图11C示出了在单次IV团注注射之后多肽复合物PC18在食蟹猴中的药代动力学。
图11D示出了在单次IV团注注射之后多肽复合物PC21在食蟹猴中的药代动力学。
图12A示出了在PC1的单次IV团注之后在食蟹猴中的细胞因子释放。
图12B示出了在多肽复合物PC5的单次IV团注之后在食蟹猴中的细胞因子释放。
图12C示出了在多肽复合物PC18的单次IV团注之后在食蟹猴中的细胞因子释放。
图12D示出了在多肽复合物PC21的单次IV团注之后在食蟹猴中的细胞因子释放。
图12E示出了在施用本文所述的多肽复合物(未掩蔽的TROP2-TCE和掩蔽的TROP2-TRACTr)之后的血浆细胞因子水平。
图13A示出了在PC1的单次IV团注之后在食蟹猴中的血清肝酶。
图13B示出了在多肽复合物PC5的单次IV团注之后在食蟹猴中的血清肝酶。
图13C示出了在多肽复合物PC18的单次IV团注之后在食蟹猴中的血清肝酶。
图13D示出了在多肽复合物PC21的单次IV团注之后在食蟹猴中的血清肝酶。
图14A和图14B示出了如通过ELISA测量的通过TROP2 Fab肽1的丙氨酸扫描肽对TROP2 Fab的抑制。
图15A和图15B示出了如通过ELISA测量的通过TROP2 Fab肽2的丙氨酸扫描肽与TROP2 Fab的结合。
图16A和图16B示出了如通过ELISA测量的通过TROP2 Fab肽2的丙氨酸扫描肽对TROP2 Fab的抑制。
图17A-图17C示出了对TROP2 Fab的肽抑制进行评估的经优化的TROP2 Fab肽1序列。
图18示出了使用WebLogo 3.7.4产生的经优化的TROP2 Fab肽1序列的核心序列基序。
图19A-图19C示出了对肽与TROP2 Fab的结合进行评估的经优化的TROP2 Fab肽2序列。
图20A-图20C示出了对TROP2 Fab的肽抑制进行评估的经优化的TROP2 Fab肽2序列。
图21示出了使用WebLogo 3.7.4产生的经优化的TROP2 Fab肽2序列的核心序列基序。
图22示出了本公开的几种多肽复合物的TROP2结合的滴定数据。
图23示出了本公开的几种多肽复合物的CD3ε结合的滴定数据。
图24A示出了在CD8+ T细胞的存在下PC25介导的HCT116肿瘤细胞杀伤。
图24B示出了在CD8+ T细胞的存在下PC26介导的HCT116肿瘤细胞杀伤。
图24C示出了在CD8+ T细胞的存在下PC25介导的MDAMB231肿瘤细胞杀伤。
图25示出了在单次IV团注注射之后在食蟹猴中PC22的药代动力学。
图26A-图26F示出了在PC22的单次IV团注之后在食蟹猴中的细胞因子释放。
图27A-图27B示出了在PC22的单次IV团注之后在食蟹猴中的血清肝酶水平。
图28A-图28D示出了在带有MDAMB231异种移植肿瘤的人PBMC移植的NCG小鼠中的体内肿瘤生长抑制。观察到的抗肿瘤活性是蛋白酶依赖性的，因为在可切割的接头内缺乏蛋白酶底物的多肽复合物相当于媒介物对照。所示出的是PC3(图28A)、PC17(图28B)、PC23(图28C)、PC24(图28D)。
图29A-图29F示出了如通过ELISA测量的通过抗CD3 scFv肽A和肽B的丙氨酸扫描肽的抗CD3 scFv结合。
图30A-图30F示出了如通过ELISA测量的通过抗CD3 scFv肽A和肽B的丙氨酸扫描肽对抗CD3 scFv与CD3结合的抑制。
图31A-图31B示出了如通过ELISA测量的通过经优化的抗CD3scFv肽B序列的抗CD3scFv结合。
图32A-图32B示出了如通过ELISA测量的通过经优化的抗CD3scFv肽B序列的对抗CD3 scFv与CD3结合的抑制。
图33示出了使用WebLogo 3.7.4产生的经优化的抗CD3 scFv肽B序列的核心序列基序。
具体实施方式
多特异性抗体将源自两种或更多种抗体的不同结合特异性的益处组合到单一组合物中。用于将T细胞重定向至癌症的多特异性抗体在临床前研究和临床研究两者中已经显示出前景。这种方法依赖于抗体的一个抗原相互作用部分与肿瘤相关抗原或标志物的结合，而第二个抗原相互作用部分可以结合至T细胞上的效应细胞抗原，如CD3，其然后触发细胞毒性活性。
一种此类肿瘤相关抗原是TROP2。TROP2(也被称为肿瘤相关钙信号转导子2或上皮糖蛋白-1)是TACSTD2基因的蛋白产物，并且是一种跨膜糖蛋白，其在多种细胞信号传导通路中发挥作用，其中许多细胞信号传导通路与肿瘤发生相关联。TROP2已经被证明在多种人癌症中被过度表达，包括肺癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌和胃癌，并且其表达与不良的患者预后相关。此外，TROP2作为癌基因发挥作用，能够驱动上皮癌症如结肠直肠癌中的肿瘤发生和转移两者。TROP2在癌细胞中的表达长期以来一直与耐药性相关，并且TROP2的高水平表达已经被证明与多种癌症类型的不良预后相关。在包括来自大约2,500名患者的数据的荟萃分析中，增加的TROP2表达与若干种实体瘤的不良的总生存率和无病生存率结果相关联。
与嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)疗法相反，T细胞接合物(TCE)治疗剂具有若干益处，包括它们不是细胞疗法，因此可以作为现成的疗法提供。虽然TCE治疗剂在血液学癌症中显示出强大的抗肿瘤活性，但由于现有TCE技术的局限性，即(i)导致细胞因子释放综合征(CRS)的免疫系统过度激活，(ii)靶标上的健康组织毒性，以及(iii)导致短半衰期的不良药代动力学(PK)，开发用于治疗实体瘤的TCE面临挑战。CRS源于T细胞的系统性活化，并且可以导致危及生命的炎性细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)的升高。在较差的临床研究中，已经观察到在服用使用其他平台的T细胞接合物开发以治疗癌症患者后，严重和急性CRS导致剂量有限的毒性和死亡。这种毒性限制了可以安全服用的T细胞接合物的最大血液水平。因为对靶标上的健康组织的毒性，所以T细胞接合物的有效性也受到了限制。使用不是为肿瘤特异性激活而设计的平台开发的T细胞接合物已经导致了在健康组织中由靶标表达导致的临床保留和剂量限制性毒性。T细胞接合物也受到短半衰期的限制。T细胞接合物在施用后很快达到亚治疗水平，因为它们由于其短的暴露半衰期而很快从体内消除。由于这个原因，通常通过低剂量的连续输注泵在数周时间段内施用诸如博纳吐单抗(blinatumomab)的T细胞接合物，以克服短半衰期的挑战并维持体内药物的治疗水平。连续施用方案对患者来说代表了显著的负担。
为了克服与T细胞接合物的有效性相关联的这些挑战，本文描述了包含选择性地结合至效应细胞抗原和TROP2的结合结构域的分离的多肽或多肽复合物，其中结合结构域中的一个或多个在肿瘤微环境中被选择性地激活，并且分离的多肽或多肽复合物包含半衰期延长分子。此类修饰降低了CRS和靶标上的健康组织的毒性风险，改善了活化前的血流稳定性和血清半衰期。本文描述的分离的多肽或多肽复合物在低水平的靶标表达下具有活性，并且容易制造。
在一些实施方案中，本文所述的分离的多肽或多肽复合物用于治疗癌症的方法中。在一些实施方案中，癌症具有表达TROP2的细胞。在一些情况下，癌症是实体瘤癌症。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌(例如，HER2+；ER/PR+；TNBC)、宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌或胃癌。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)、尿路上皮癌(UC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、胃癌、食道癌、头颈癌、前列腺癌或子宫内膜癌的方法中。在一些实施方案中，本文所述的多肽或多肽复合物用于治疗乳腺癌、肺癌、尿路上皮癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、头颈癌和神经胶质瘤的方法中。在一些实施方案中，是治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至TROP2的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至TROP2的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至TROP2的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至TROP2的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至效应细胞抗原的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式Ia的分离的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2还包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了根据式Ia的分离的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2还包含P2和L2，其中P2是结合至A2的肽；并且L2是将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含式Ia的分离的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2还包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含式Ia的分离的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)
其中A2还包含P2和L2，其中P2是结合至A2的肽；并且L2是将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了根据式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了根据式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了包含式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
第一抗原识别分子(A1)
在一些实施方案中，本文公开了多肽或多肽复合物，其中第一抗原识别分子结合至效应细胞抗原，并且第二抗原识别分子结合至TROP2。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3。在一些实施方案中，A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子。
在一些实施方案中，A1包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，A1包含人的或人源化的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，L1结合至抗体或抗体片段的N末端。在一些实施方案中，L1结合至抗体或抗体片段的N末端，并且A2结合至抗体或抗体片段的另一个N末端。在一些实施方案中，A2结合至抗体或抗体片段的C末端。在一些实施方案中，L1结合至抗体或抗体片段的C末端。在一些实施方案中，A2结合至抗体或抗体片段的N末端。在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。在一些实施方案中，A1是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A1是单结构域抗体。在一些实施方案中，A1包含可变轻链和可变重链，它们各自能够特异性地结合至人CD3。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段。在一些实施方案中，A1包含抗CD3e单链可变片段，其与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。在一些实施方案中，A1包含选自莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19的互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，A1包含结合TROP2的第一抗原识别分子。在一些实施方案中，A1包含可变轻链和可变重链，它们各自能够特异性地结合至人TROP2。
在一些实施方案中，结合至CD3的scFv包含scFv轻链可变结构域和scFv重链可变结构域。在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，scFv轻链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)；并且scFv轻链可变结构域包含表1中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
表1.抗CD3氨基酸序列(如由IMGT编号系统确定的CDR)
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在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:1；HC-CDR2：SEQ ID NO:2；HC-CDR3：SEQ ID NO:3，并且其中CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，scFv重链可变结构域包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv重链可变结构域的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:7；HC-CDR2：SEQ ID NO:8；HC-CDR3：SEQID NO:9，并且其中CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，scFv轻链可变结构域包含互补决定区(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ ID NO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6，并且其中所述CDR在LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，scFv轻链可变结构域包含互补决定区(CDR)：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv轻链可变结构域的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ ID NO:11和LC-CDR3：SEQID NO:12，并且其中所述CDR在LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ IDNO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ ID NO:8和HC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ IDNO:11和LC-CDR3：SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。在一些实施方案中，效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，A1结合至作为效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。在一些实施方案中，作为TCR-CD3复合物的一部分的多肽是人CD3ε。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3：LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ ID NO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，其中scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中scFv的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ ID NO:8和HC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中scFv的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3：LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ IDNO:11和LC-CDR3:SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，效应细胞抗原包含CD3，并且scFv包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A1包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:13具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ IDNO:13具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:13具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A1包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:14具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:14具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQID NO:14具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ IDNO:14具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，A1包含与SEQ ID NO:14具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，与不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少5倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少8倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少15倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少25倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少35倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少45倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少55倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少65倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少85倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少95倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。
在一些实施方案中，与其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少5倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少8倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少15倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少25倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少35倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少45倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少55倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少65倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少85倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少95倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少1000倍。
在一些实施方案中，与其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少1000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1或L1的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。
在一些实施方案中，与其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少20倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少30倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少40倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少60倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少70倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少80倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少90倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1,000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少120倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)对肿瘤细胞抗原具有较弱的结合亲和力，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物对肿瘤细胞抗原的结合亲和力的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在IFNγ释放T细胞活化测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式在IFNγ释放T细胞活化测定中的EC50的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的形式的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是不具有P1、L1、P2或L2的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10,000倍。
在一些实施方案中，与其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50相比，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少50倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少75倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少100倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少200倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少300倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少400倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少500倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少600倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少700倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少800倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少900倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少1000倍。在一些实施方案中，所述分离的多肽或多肽复合物P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1(式Ia)在T细胞细胞裂解测定中具有增加的EC50，其是其中L1和L2已经被肿瘤特异性蛋白酶切割的式Ia的分离的多肽或多肽复合物的T细胞细胞裂解测定中的EC50的至少10,000倍。
第二抗原识别分子(A2)
在一些实施方案中，A2包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体、Fab或Fab’。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段是人源化的或人的。在一些实施方案中，A2是Fab或Fab’。在一些实施方案中，Fab或Fab’包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。在一些实施方案中，抗体或其抗体片段包含TROP2结合结构域。
在一些实施方案中，结合至TROP2的抗原结合片段(Fab)或Fab’包含Fab轻链多肽链和Fab重链多肽。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含Fab轻链可变结构域。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含Fab重链可变结构域。在一些实施方案中，Fab重链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，Fab轻链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
在一些实施方案中，Fab重链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)；并且Fab轻链可变结构域包含表2中公开的至少一个、两个或三个互补决定区(CDR)或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
表2.抗TROP2氨基酸序列(如由IMGT编号系统确定的CDR)
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在一些实施方案中，Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。在一些实施方案中，Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中Fab的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17，并且其中CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰；并且Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20，并且其中CDR在LC-CDR1、LC-CDR2或LC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，A2包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A2的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且A2包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A2的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ IDNO:20。
在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的单链可变片段(scFv)的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的单链可变片段(scFv)的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv轻链多肽。
在一些实施方案中，A2还包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv重链多肽，并且L2结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv重链多肽，并且L2结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的Fab重链多肽。
在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv重链多肽，并且L2结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv重链多肽，并且L2结合至A2的Fab重链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab重链多肽结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的Fab轻链多肽。在一些实施方案中，A2的Fab轻链多肽结合至A1的scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的Fab重链多肽。
肽(P1和P2以及P1a)
在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含如表3中公开的序列或与其基本上相同的序列(例如，具有0、1或2个氨基酸修饰的序列)。
表3.P1和P2以及P1a序列
在一些实施方案中，P1削弱A1与第一靶抗原的结合。在一些实施方案中，P1削弱A1与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A1。在一些实施方案中，P1在抗原结合位点处或附近结合至A1。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A1暴露于效应细胞抗原时，P1变得与A1未结合。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于70％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于75％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于98％的序列同一性。在一些实施方案中，P1与效应细胞抗原具有小于99％的序列同一性。在一些实施方案中，P1包含与效应细胞抗原具有小于10％序列同一性的从头氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:26或27的氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，P1包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。在一些实施方案中，Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。在一些实施方案中，Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。
在一些实施方案中，P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。在一些实施方案中，U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。在一些实施方案中，U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:202-228的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据表35的序列中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:229-240的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:239的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2削弱A2与第二靶抗原的结合。在一些实施方案中，其中P2削弱A2与TROP2的结合。在一些实施方案中，P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A2。在一些实施方案中，P2在抗原结合位点处或附近结合至A2。在一些实施方案中，当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A2暴露于TROP2时，P2变得与A2未结合。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于70％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于75％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于98％的序列同一性。在一些实施方案中，P2与TROP2具有小于99％的序列同一性。在一些实施方案中，P2包含与TROP2具有小于10％序列同一性的从头氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:23-25中任一项的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据X1-X2-X3-X4-C-X6-X7-X8-X9-X10-C-X12-X13-X14的氨基酸序列，并且X1选自N、D、S、Y、A、F、H、T、L和V；X2选自S、T、D、A、H、V、Y、N、F、I和L；X3选自L、I和V；X4选自F、L、V、M、W、I、Y和H；X6选自V、F、L、I和W；X7选自K、R、Q、N、H和M；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W、F、Q和L；X12选自W和V；X13选自I、N、H、T、V、Y和D；X14选自D、V、A、S、I、T、N、Y、H和P。在一些实施方案中，X1选自N、D、S、Y、A、F和T；X2选自S、T、D、A、H、V、Y和N；X3为L；X4选自F、L、V、M和W；X6选自V、F和L；X7选自K、R、Q和N；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W和F；X12是W；X13选自I、N、H和T；并且X14选自D、V、A、S、I、T和N。在一些实施方案中，X1选自N、D、S和Y；X2选自S、T和D；X3是L；X4选自F、L和V；X6选自V和F；X7选自K、R和Q；X8是N；X9选自L和V；X10选自Y和W；X12是W；X13选自I、N和H；X14选自D、V、A和S。
在一些实施方案中，P2包含根据J1-J2-J3-C-J5-J6-J7-J8-W-J10-J11-C-J13-J14的氨基酸序列，并且J1选自V、I、L、P、E、F和M；J2选自D和N；J3选自F和W；J5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；J6选自L、M、I、V、F、T、R和S；J7选自Y、F和N；J8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；J10选自P和R；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；并且J14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V和W。在一些实施方案中，J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S、R、K、Y和L；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T和A；并且J14选自T、S、Q、L、D、N、A和E。在一些实施方案中，J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S和R；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R和D；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S和Q；并且J14选自T、S、Q和L。
在一些实施方案中，P2包含根据B1-B2-B3-C-B5-B6-B7-B8-W-B10-B11-C-B13-B14的氨基酸序列，并且B1选自V、I、L、P、E、F和M；B2选自D和N；B3选自F和W；B5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；B6选自L、M、I、V、F、T、R和S；B7选自Y、F和N；B8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；B10选自P和R；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；并且B14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V、G和W。在一些实施方案中，B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、R、K、Y、M、G和L；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、H和A；并且B14选自T、S、Q、L、D、N、A、G和E。在一些实施方案中，B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、K、M、G和R；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、S、H和D；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、H、A、Y和Q；B14选自T、S、Q、G和L。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:133-145的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:146-158的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据表27的序列中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:159-178的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据表29的序列中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:179-201的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:181的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:186的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P2包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列。
在一些实施方案中，当L1a未被切割时，P1a削弱第一抗原识别分子与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，第一抗原识别分子包括抗体或抗体片段。在一些实施方案中，效应细胞抗原是抗CD3效应细胞抗原。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于70％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于75％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于98％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a与效应细胞抗原具有小于99％的序列同一性。在一些实施方案中，P1a包含与第二效应细胞抗原具有小于10％序列同一性的从头氨基酸序列。在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ IDNO:26或27或122的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；并且Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S。在一些实施方案中，Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；并且Z14选自D、Y、N、F、I和P。在一些实施方案中，Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；并且Z14选自D、Y和N。
在一些实施方案中，P1a包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；并且U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。在一些实施方案中，U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；并且U14选自D、Y、N、F、I、M和P。在一些实施方案中，U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；并且U14选自D、Y、M和N。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:202-228的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据表35的序列中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:229-240的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列或相对于SEQ IDNO:239的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1a包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少5个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少6个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含环肽或线性肽。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含环肽。在一些实施方案中，P1、P2或P1a包含线性肽。
在一些实施方案中，P1、P2或P1a或P1、P2和P1a包含经修饰的氨基酸或非天然氨基酸，或经修饰的非天然氨基酸，或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，P1、P2或P1a或P1、P2和P1a包含修饰，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。对P1、P2或P1a或P1、P2和P1a的任何地方(包括肽主链、氨基酸侧链和末端)进行修饰。
在一些实施方案中，P1、P2或P1a不包含白蛋白或白蛋白片段。在一些实施方案中，P1、P2或P1a不包含白蛋白结合结构域。
连接部分(L1、L2、L3和L1a)
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a具有包含(G2S)n(SEQ ID NO:243)的式，其中n是1至3的整数。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a具有包含(G2S)n的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，肿瘤特异性蛋白酶选自金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、豆荚蛋白可切割的氨基酸序列或基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含如表4中公开的序列或与其基本上相同的序列(例如，具有0、1或2个氨基酸修饰的序列)。
在一些实施方案中，L1包含接头25的序列(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，L1包含接头26的序列(SEQ ID NO:55)。在一些实施方案中，L1包含接头27的序列(SEQ ID NO:56)。在一些实施方案中，L1包含接头28的序列(SEQ ID NO:57)。
在一些实施方案中，L2包含接头25的序列(SEQ ID NO:54)。在一些实施方案中，L2包含接头26的序列(SEQ ID NO:55)。在一些实施方案中，L2包含接头27的序列(SEQ ID NO:56)。在一些实施方案中，L2包含接头28的序列(SEQ ID NO:57)。
表4.L1、L2、L3和L1a序列
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在一些实施方案中，L1结合至A1的N末端。在一些实施方案中，L1结合至A1的C末端。在一些实施方案中，L2结合至A2的N末端。在一些实施方案中，L2结合至A2的C末端。在一些实施方案中，当L1被肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A1暴露于效应细胞抗原时，P1变得与A1未结合。在一些实施方案中，当L2被肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A2暴露于TROP2时，P2变得与A2未结合。
在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含经修饰的氨基酸或非天然氨基酸，或经修饰的非天然氨基酸，或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，L1、L2、L3或L1a包含修饰，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。对L1、L2、L3或L1a的任何地方(包括肽主链或氨基酸侧链)进行修饰。
在一些实施方案中，可切割的接头可被蛋白酶切割。在一些实施方案中，相对于健康组织或不是疾病状态微环境的微环境中的水平，蛋白酶在疾病状态微环境中以更高的水平存在。在一些实施方案中，蛋白酶包括肿瘤特异性蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶包括基质金属蛋白酶(MMP)或丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶选自MMP2、MMP7、MMP9、MMP13和MMP14。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP2。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP7。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP9。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP13。在一些实施方案中，基质金属蛋白酶包括MMP14。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶选自蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶和hepsin。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括尿激酶。在一些实施方案中，丝氨酸蛋白酶包括hepsin。在一些实施方案中，可切割的接头被多种蛋白酶切割。在一些实施方案中，可切割的接头被至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或超过20种不同的蛋白酶切割。
半衰期延长分子(H1和H1a)
在一些实施方案中，H1不阻断A1与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。在一些实施方案中，H1a不阻断第一抗原识别分子与效应细胞抗原的结合。在一些实施方案中，H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L3)。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)对第一抗原识别分子没有结合亲和力。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)对效应细胞抗原没有结合亲和力。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)不保护第一抗原识别分子免受效应细胞抗原的影响。在一些实施方案中，半衰期延长分子(H1或H1a)不被直接连接到第一抗原识别分子。
在一些实施方案中，H1或H1a包含如表5中公开的序列或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。
表5.H1和H1a序列
在一些实施方案中，H1或H1a包含具有重复序列基序的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1或H1a包含具有高度有序的二级结构的氨基酸序列。如在该上下文中所使用的“高度有序的二级结构”意指至少约50％，或约70％，或约80％，或约90％的H1或H1a的氨基酸残基有助于二级结构，如通过包括但不限于分光光度法(例如，通过“远紫外”光谱区(190-250nm)中的圆二色光谱法)和计算机程序或算法(例如，Chou-Fasman算法和Garnier-Osguthorpe-Robson(“GOR”)算法)的手段所测量或确定的。
在一些实施方案中，H1或H1a包含聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1或H1a包含白蛋白。在一些实施方案中，H1或H1a包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1或H1a包含多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，单结构域抗体包括结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体选自645gH1gL1、645dsgH5gL4、23-13-A01-sc02、A10m3或其片段、DOM7r-31、DOM7h-11-15、Alb-1、Alb-8、Alb-23、10G、10E和SA21。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ ID NO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ ID NO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68；并且其中所述CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQID NO:70、HC-CDR2：SEQ ID NO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ ID NO:71和HC-CDR3：SEQID NO:72；并且其中所述CDR在HC-CDR1、HC-CDR2或HC-CDR3中的至少一者中包含0-2个氨基酸修饰。
在一些实施方案中，H1包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:69具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQID NO:69具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ IDNO:69具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:69具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:73具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:73具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQID NO:73具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ IDNO:73具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含与SEQ ID NO:73具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1a包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:69具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:69具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:69具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQID NO:69具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ IDNO:69具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1a包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:73具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:73具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ ID NO:73具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQID NO:73具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1a包含与SEQ IDNO:73具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1或H1a或H1和H1a包含经修饰的氨基酸或非天然氨基酸，或经修饰的非天然氨基酸，或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，H1或H1a或H1和H1a包含修饰，所述修饰包括但不限于乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。对H1或H1a或H1和H1a的任何地方(包括肽主链、氨基酸侧链和末端)进行修饰。
在一些实施方案中，H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。在一些实施方案中，L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L3包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
在一些实施方案中，H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L1a)。在一些实施方案中，L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L1a包含根据SEQ ID NO:28-61中任一项的氨基酸序列。
与TROP2和CD3结合的抗体
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含表6中公开的氨基酸序列或与其基本上相同的序列(例如，具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列)。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74-132和241-242具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:83具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
表6.多肽复合物序列
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在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:74和SEQ IDNO:75的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:76和SEQ IDNO:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:78和SEQ IDNO:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:80和SEQ IDNO:81的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:82和SEQ IDNO:83的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:84和SEQ IDNO:85的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:86和SEQ IDNO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:88和SEQ IDNO:89的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:90和SEQ IDNO:91的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:92和SEQ IDNO:93的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:94和SEQ IDNO:95的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:96和SEQ IDNO:97的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:98和SEQ IDNO:99的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:100和SEQ IDNO:101的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:102和SEQ IDNO:103的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:104和SEQ IDNO:105的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:106和SEQ IDNO:107的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:108和SEQ IDNO:109的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:110和SEQ IDNO:111的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:112和SEQ IDNO:113的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:114和SEQ IDNO:115的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:116和SEQ IDNO:117的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:118和SEQ IDNO:119的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:120和SEQ IDNO:121的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:123和SEQ IDNO:124的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:125和SEQ IDNO:126的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:127和SEQ IDNO:128的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:129和SEQ IDNO:130的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:130具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:241和SEQ IDNO:131的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:131具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:131具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:131具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含根据SEQ ID NO:132和SEQ IDNO:242的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:242具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:242具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:242具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多肽或多肽复合物包含表6中所示的序列。在一些实施方案中，该序列与SEQ ID NO:74-132、241-242中的任一项包含至少或约70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:74-132、241-242包含至少或约95％的同源性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:74-132、241-242包含至少或约97％的同源性。在一些情况下，该序列与SEQID NO:74-132、241-242包含至少或约99％的同源性。在一些情况下，该序列与SEQ ID NO:74-132、241-242包含至少或约100％的同源性。在一些情况下，该序列包含具有SEQ ID NO:74、77、78、81、82、84、87、89、90、93、94、97、98、100、103、105、106、108、111、113、114、116、118、120、123、126、127、130、241或242中的任一项的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、或超过210个氨基酸的至少一部分。在一些情况下，该序列包含具有SEQ ID NO:75、76、79或80中的任一项的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450或超过450个氨基酸的至少一部分。在一些情况下，该序列包含具有SEQID NO:83、85、86、88、91、92、95、96、99、101、102、104、107、109、112、115、117、119、121、124、125、128、129、131或132中的任一项的至少或约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640或超过640个氨基酸的至少一部分。
如本文所使用的，与序列相关的术语“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列并引入间隙(如果有必要)以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与特定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，如EMBOSS MATCHER、EMBOSS WATER、EMBOSS STRETCHER、EMBOSS NEEDLE、EMBOSS LALIGN、BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的全长序列上实现最大比对所需的任何算法。在将ALIGN-2用于氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B(其可以可替代地表述为与给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性百分比的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性百分比被计算如下：100乘以分数X/Y，其中X是如由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中记录为相同匹配的氨基酸残基的数量，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数量。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B与A的氨基酸序列同一性百分比。除非另有具体说明，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性百分比值都是使用ALIGN-2计算机程序如前述段落所述获得的。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型1的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型2的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型3的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的轻链可变结构域，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽链和Fab重链多肽链，并且其中Fab重链多肽链连接至scFv的重链可变结构域的C末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型4的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至所述scFv的轻链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的重链可变结构域的C末端，并且其中Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型5的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv进一步连接至削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的轻链可变结构域的N末端，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的重链可变结构域的C末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型6的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至所述scFv重链可变结构域的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中Fab连接至P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型7的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽链和Fab重链多肽链，并且其中Fab重链多肽链连接至scFv的轻链可变结构域的C末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型8的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv连接至削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型9的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至Fab轻链多肽的N末端，并且所述P1进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的重链可变结构域连接至Fab重链多肽的N末端，其中scFv连接至P2和L2，其中P2包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且L2包含将scFv的轻链可变结构域连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型10的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至Fab轻链多肽的N末端，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的重链可变结构域连接至Fab重链多肽的N末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型11的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至Fab重链多肽的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的重链可变结构域连接至Fab轻链多肽的N末端，其中scFv进一步连接至P2和L2，其中P2包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且L2包含将scFv的轻链可变结构域连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型12的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至Fab重链多肽的N末端，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的重链可变结构域连接至Fab轻链多肽的N末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型13的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至Fab轻链多肽的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的轻链可变结构域连接至Fab重链多肽的N末端，其中scFv连接至P2和L2，其中P2包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且L2包含将scFv的重链可变结构域连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型14的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至Fab轻链多肽的N末端，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的轻链可变结构域连接至Fab重链多肽的N末端。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型15的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的(P1)，并且P1通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分(L1)连接至Fab重链多肽的N末端，并且P1进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的轻链可变结构域连接至Fab轻链多肽的N末端，其中scFv连接至P2和L2，其中P2包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且L2包含将scFv的重链可变区连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了包含根据构型16的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述分离的多肽或多肽复合物包含结合至TROP2的Fab，所述Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中所述Fab连接至削弱Fab与TROP2结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至Fab重链多肽的N末端，并且所述肽进一步连接至半衰期延长分子；和与效应细胞抗原结合的单链可变片段(scFv)，该scFv包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中scFv的轻链可变结构域连接至Fab轻链多肽的N末端。
编码多肽或多肽复合物的多核苷酸
在一些实施方案中，本文公开了编码如本文公开的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物包含抗体或抗体片段。在一些实施方案中，多肽或多肽复合物包含Fab和单链可变片段(scFv)。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式I的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至TROP2的第二抗原识别分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式Ia的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码根据式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含式II的多肽或多肽复合物的分离的重组核酸分子：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含根据构型1的结构排列的多肽或多肽复合物的分离的核酸分子：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
在一些实施方案中，本文公开了编码包含根据构型2的结构排列的多肽或多肽复合物的分离的核酸分子：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
药物组合物
在一些实施方案中，本文公开了药物组合物，其包含：(a)如本文公开的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至TROP2的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：A1是结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1是结合至A1的肽；L1是将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1是半衰期延长分子；并且A2是结合至TROP2的第二抗原识别分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式Ia的分离的多肽或多肽复合物：
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)；
和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)根据式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含(a)包含式II的分离的多肽或多肽复合物：
L1a-P1a-H1a
(式II)
其中：L1a是肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，其在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a是当L1a未被切割时与第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a是半衰期延长分子；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含(a)包含根据构型1的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文公开的药物组合物包含(a)包含根据构型2的结构排列的分离的多肽或多肽复合物：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱所述scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至所述scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；和(b)药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物还包含可检测标记物、治疗药剂或药代动力学修饰部分。在一些实施方案中，可检测标记物包括荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针或造影剂。
对于向对象施用，如本文公开的分离的多肽或多肽复合物可以与一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂一起以药物组合物的形式提供。术语“药学上可接受的载剂”包括但不限于不干扰成分的生物学活性的效力且对它施用至的患者无毒的任何载剂。合适的药物载剂的实例在本领域中是熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。此类载体可以通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量被施用于对象。优选地，组合物是无菌的。这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、乳化剂和分散剂。通过加入各种抗细菌剂和抗真菌剂，可以确保防止微生物的作用。
药物组合物可以为任何合适的形式(取决于所需的施用方法)。它可以以单位剂型提供，可以在密封的容器中提供，并且可以作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒可以包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂型。
药物组合物可以适于通过任何合适的途径施用，包括肠胃外(例如，皮下、肌内或静脉内)途径。此类组合物可以通过药学领域中已知的任何方法制备，例如通过在无菌条件下将活性成分与载剂或赋形剂混合来制备。
根据待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等，本公开的物质的剂量可以在宽限度内变化，并且医生将最终确定待使用的适当的剂量。
削弱抗TROP2结合结构域与TROP2结合的肽
本文公开了包含抗TROP2结合结构域的分离的多肽或多肽复合物，所述抗TROP2结合结构域连接至削弱抗TROP2结合与TROP2的结合的肽，其中所述肽包含根据X1-X2-X3-X4-C-X6-X7-X8-X9-X10-C-X12-X13-X14的氨基酸序列，并且X1选自N、D、S、Y、A、F、H、T、L和V；X2选自S、T、D、A、H、V、Y、N、F、I和L；X3选自L、I和V；X4选自F、L、V、M、W、I、Y和H；X6选自V、F、L、I和W；X7选自K、R、Q、N、H和M；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W、F、Q和L；X12选自W和V；X13选自I、N、H、T、V、Y和D；X14选自D、V、A、S、I、T、N、Y、H和P；或者所述肽包含根据J1-J2-J3-C-J5-J6-J7-J8-W-J10-J11-C-J13-J14的氨基酸，并且J1选自V、I、L、P、E、F和M；J2选自D和N；J3选自F和W；J5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；J6选自L、M、I、V、F、T、R和S；J7选自Y、F和N；J8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；J10选自P和R；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；J14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V和W；或者所述肽包含根据B1-B2-B3-C-B5-B6-B7-B8-W-B10-B11-C-B13-B14的氨基酸序列，并且B1选自V、I、L、P、E、F和M；B2选自D和N；B3选自F和W；B5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；B6选自L、M、I、V、F、T、R和S；B7选自Y、F和N；B8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；B10选自P和R；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；并且B14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V、G和W。在一些实施方案中，X1选自N、D、S、Y、A、F和T；X2选自S、T、D、A、H、V、Y和N；X3是L；X4选自F、L、V、M和W；X6选自V、F和L；X7选自K、R、Q和N；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W和F；X12是W；X13选自I、N、H和T；并且X14选自D、V、A、S、I、T和N。在一些实施方案中，X1选自N、D、S和Y；X2选自S、T和D；X3是L；X4选自F、L和V；X6选自V和F；X7选自K、R和Q；X8是N；X9选自L和V；X10选自Y和W；X12是W；X13选自I、N和H；并且X14选自D、V、A和S。在一些实施方案中，J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S、R、K、Y和L；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T和A；并且J14选自T、S、Q、L、D、N、A和E。在一些实施方案中，J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S和R；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R和D；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S和Q；J14选自T、S、Q和L。在一些实施方案中，B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、R、K、Y、M、G和L；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、H和A；B14选自T、S、Q、L、D、N、A、G和E。在一些实施方案中，B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、K、M、G和R；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、S、H和D；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、H、A、Y和Q；并且B14选自T、S、Q、G和L。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:133-145的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:146-158的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据表27的序列中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:159-178的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据表29的序列中任一项的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:179-201的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列，或相对于SEQID NO:24的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列，或相对于SEQID NO:181的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列，或相对于SEQID NO:186的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TROP2结合结构域包含抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体、Fab或Fab’。
在一些实施方案中，抗TROP2结合结构域包含重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ IDNO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且抗TROP2结合结构域包含轻链互补决定区CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中Fab的LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。
在一些实施方案中，抗体或抗体片段包含Fab。在一些实施方案中，抗TROP2结合结构域包含根据SEQ ID NO:21-22的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物还包含半衰期延长分子(H1)。在一些实施方案中，半衰期延长分子连接至肽。在一些实施方案中，H1包括聚合物。在一些实施方案中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，H1包含白蛋白。在一些实施方案中，H1包含Fc结构域。在一些实施方案中，白蛋白是血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白。在一些实施方案中，H1包括多肽、配体或小分子。在一些实施方案中，多肽、配体或小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。在一些实施方案中，血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。在一些实施方案中，循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。在一些实施方案中，血清蛋白是白蛋白。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。在一些实施方案中，单结构域抗体包括结合至白蛋白的单结构域抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，单结构域抗体是645gH1gL1。在一些实施方案中，单结构域抗体是645dsgH5gL4。在一些实施方案中，单结构域抗体是23-13-A01-sc02。在一些实施方案中，单结构域抗体是A10m3或其片段。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7r-31。在一些实施方案中，单结构域抗体是DOM7h-11-15。在一些实施方案中，单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。在一些实施方案中，单结构域抗体是10E。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ ID NO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中单结构域抗体的HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ ID NO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些实施方案中，单结构域抗体是SA21。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。在一些实施方案中，经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。在一些实施方案中，H1包含将H1连接至肽的连接部分(L3)。在一些实施方案中，L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。在一些实施方案中，L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，L3包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
治疗方法
在一些实施方案中，是在有需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向对象施用如本文所述的分离的多肽或多肽复合物。在一些实施方案中，癌症具有表达TROP2的细胞。在一些情况下，癌症是实体瘤癌症。在一些实施方案中，癌症是肺癌、乳腺癌(例如，HER2+；ER/PR+；TNBC)、宫颈癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌或胃癌。
在一些实施方案中，是在有需要的对象中治疗三阴性乳腺癌(TNBC)、尿路上皮癌(UC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、胃癌、食道癌、头颈癌、前列腺癌或子宫内膜癌的方法，所述方法包括向所述对象施用如本文所述的分离的多肽或多肽复合物。在一些实施方案中，是在有需要的对象中治疗乳腺癌、肺癌、尿路上皮癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、头颈癌和神经胶质瘤的方法，所述方法包括向所述对象施用如本文所述的分离的多肽或多肽复合物。
在一些实施方案中，本文描述了多肽或多肽复合物，其中所述多肽或多肽复合物包含长半衰期。在一些情况下，多肽或多肽复合物的半衰期为至少或约12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、84小时、96小时、100小时、108小时、119小时、120小时、140小时、160小时、180小时、200小时或超过200小时。在一些情况下，多肽或多肽复合物的半衰期在约12小时至约300小时、约20小时至约280小时、约40小时至约240小时、约60小时至约200小时或约80小时至约140小时的范围内。
在一些实施方案中，本文描述了每周施用一次的分离的多肽或多肽复合物。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物通过静脉内、肌内、病灶内、局部、皮下、输注或口服每周施用一次。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物通过团注注射每周施用一次。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物通过连续输注每周施用一次。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物以在不超过60分钟的时间段内连续输注的方式每周一次施用于对象。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物以在不超过30分钟的时间段内连续静脉内输注的形式每周一次施用于对象。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物以在至少10分钟的时间段内连续静脉内输注的形式每周一次施用于对象。
在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少30小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少50小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少60小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少70小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少80小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少90小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少100小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少110小时的半衰期。在一些实施方案中，分离的多肽或多肽复合物每周一次施用于对象，并且分离的多肽或多肽复合物具有至少115小时的半衰期。
产生与TROP2和CD3结合的抗体
在一些实施方案中，本文所述的多肽(例如，抗体及其结合片段)使用本领域已知的用于合成多肽(例如，抗体)的任何方法产生，尤其是通过化学合成或通过重组表达产生，并且优选地通过重组表达技术产生。
在一些情况下，抗体或其结合片段被重组地表达，并且编码抗体或其结合片段的核酸由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier等人，1994，BioTechniques 17:242中所述)，其涉及合成含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火和连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可替代地，编码抗体的核酸分子任选地通过使用可与序列的3’端和5’端杂交的合成引物进行PCR扩增，或通过使用对特定基因序列特异性的寡核苷酸探针进行克隆从合适的来源(例如，抗体cDNA文库，或从表达免疫球蛋白的任何组织或细胞产生的cDNA文库)产生。
在一些情况下，抗体或其结合片段任选地通过免疫动物(如小鼠)来产生，以产生多克隆抗体，或更优选地，通过产生单克隆抗体来产生，例如，如Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)所述，或如Kozbor等人(1983,Immunology Today 4:72)或Cole等人(1985in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,第77-96页)所述。可替代地，编码抗体的至少Fab部分的克隆任选地通过筛选用于结合特异性抗原的Fab片段的克隆的Fab表达文库(例如，如Huse等人，1989,Science 246:1275-1281中所述)，或者通过筛选抗体文库(参见，例如，Clackson等人，1991,Nature 352:624；Hane等人，1997Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:4937)来获得。
在一些实施方案中，使用了通过将来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因与来自具有适当生物学活性的人抗体分子的基因拼接在一起而开发的用于产生“嵌合抗体”的技术(Morrison等人,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:851-855；Neuberger等人,1984,Nature 312:604-608；Takeda等人,1985,Nature 314:452-454)。嵌合抗体是这样的分子，其中不同的部分来源于不同的动物物种，例如具有来源于鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些。
在一些实施方案中，描述的用于生产单链抗体的技术(美国专利第4,694,778号；Bird,1988,Science 242:423-42；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和Ward等人,1989,Nature 334:544-54)适于生产单链抗体。经由氨基酸桥连接Fv区的重链片段和轻链片段来形成单链抗体，产生单链多肽。还任选地使用在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术(Skerra等人,1988,Science 242:1038-1041)。
在一些实施方案中，通过常规技术(例如，电穿孔、脂质体转染和磷酸钙沉淀)将包含抗体的核苷酸序列的表达载体或抗体的核苷酸序列转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养经转染的细胞以产生抗体。在具体实施方案中，抗体的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些实施方案中，利用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的抗体或其结合片段。此类宿主表达系统代表通过其产生抗体的编码序列并随后对该编码序列进行纯化的载体，但也代表当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达抗体或其结合片段的细胞。这些包括但不限于微生物，如用含有抗体或其结合片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有抗体或其结合片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有抗体或其结合片段编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，所述重组表达构建体含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
对于重组蛋白的长期高产率生产，稳定的表达是优选的。在一些情况下，稳定地表达抗体的细胞系任选地被工程改造。不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标志物控制的DNA转化宿主细胞。在引入外源DNA后，工程改造的细胞然后允许在富集的培养基中生长持续1-2天，然后转移到选择性培养基中。重组质粒中的选择性标志物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，并生长以形成病灶(foci)，该病灶又被克隆和扩增到细胞系中。此方法可以有利地用于对表达抗体或其结合片段的细胞系进行工程改造。
在一些情况下，使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人,1980,Cell 22:817)基因分别用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。此外，抗代谢物抗性被用作选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:357；O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月,TIB TECH 11(5):155-215)和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene 30:147)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等人(编辑，1993,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,纽约州；Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,纽约州；以及第12和13章,Dracopoli等人(编辑),1994,Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,纽约州；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1)中。
在一些情况下，通过载体扩增来增加抗体的表达水平(关于综述，参见Bebbington和Hentschel,the use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,第3卷(Academic Press,纽约州,1987))。当在表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，在宿主细胞的培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加标志物基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体的核苷酸序列相关联，因此抗体的产量也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些情况下，使用本领域中已知的用于纯化抗体的任何方法，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和(特别是通过在蛋白A之后对特异性抗原的亲和)，和尺寸柱色谱法)、离心、差异溶解，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。
表达载体
在一些实施方案中，载体包括来源于真核来源或原核来源的任何合适的载体。在一些情况下，载体从细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如，巴斯德毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源获得。示例性的细菌载体包括pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAGCTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
示例性的昆虫载体包括pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393M11、pVL1393 M12、FLAG载体如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2、或MAT载体如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2。
在一些情况下，酵母载体包括pDESTTM 14载体、/>pDESTTM 15载体、/>pDESTTM 17载体、/>pDESTTM 24载体、/>pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49/>目标载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA、pGAPZB和pGAPZC巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6 A、pPIC6 B和pPIC6 C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、pYES2/NT B和pYES2/NT C酵母载体、或pYES3/CT酵母载体。
示例性的藻类载体包括pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体的实例包括瞬时表达载体或稳定表达载体。哺乳动物瞬时表达载体可以包括pRK5、p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV 19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a、pFLAG-CMV 6b、pFLAG-CMV 6c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a、pFLAG-CMV5b、pFLAG-CMV 5c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。哺乳动物稳定表达载体可以包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV 14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
在一些情况下，无细胞系统是来自细胞的细胞质和/或细胞核组分的混合物，并且用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分或真核细胞组分。有时，在基于例如果蝇细胞、爪蟾卵或HeLa细胞的无细胞系统中获得核酸合成。示例性的无细胞系统包括但不限于大肠杆菌S30提取系统、大肠杆菌T7 S30系统或
宿主细胞
在一些实施方案中，宿主细胞包括任何合适的细胞，如天然衍生的细胞或基因修饰的细胞。在一些情况下，宿主细胞是生产宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是真核细胞。在其他情况下，宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，真核细胞包括真菌(例如，酵母细胞)、动物细胞或植物细胞。在一些情况下，原核细胞是细菌细胞。细菌细胞的实例包括革兰氏阳性菌或革兰氏阴性细菌。有时，革兰氏阴性细菌是厌氧的，杆状的，或两者。
在一些情况下，革兰氏阳性细菌包括放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)或柔膜菌门(Tenericutes)。在一些情况下，革兰氏阴性细菌包含产水菌门(Aquificae)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、纤维杆菌门-绿菌门/拟杆菌门(Fibrobacteres–Chlorobi/Bacteroidetes)(FCB群)、梭杆菌门(Fusobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、浮霉菌门-疣微菌门/衣原体门(Planctomycetes–Verrucomicrobia/Chlamydiae)(PVC群)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)或互养菌门(Synergistetes)。其他细菌可以是酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、产金菌门(Chrysiogenetes)、蓝细菌(Cyanobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)、网团菌门(Dictyoglomi)、热脱硫杆菌门(Thermodesulfobacteria)或热袍菌门(Thermotogae)。细菌细胞可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)或大肠杆菌(Coli bacilli)。
示例性的原核宿主细胞包括但不限于BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些情况下，动物细胞包括来自脊椎动物或来自无脊椎动物的细胞。在一些情况下，动物细胞包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。在一些情况下，真菌细胞包括酵母细胞，如啤酒酵母、面包酵母或葡萄酒酵母。
真菌包括子囊菌(ascomycete)，如酵母、霉菌、丝状真菌、担子菌或接合菌。在一些情况下，酵母包括子囊菌门(Ascomycota)或担子菌门(Basidiomycota)。在一些情况下，子囊菌门包括酵母亚门(Saccharomycotina)(真正的酵母，例如，酿酒酵母(面包酵母))或外囊菌亚门(Taphrinomycotina)(例如，裂殖酵母纲(Schizosaccharomycetes)(裂殖酵母))。在一些情况下，担子菌门包括伞菌亚门(Agaricomycotina)(例如，银耳纲(Tremellomycetes))或柄锈菌亚门(Pucciniomycotina)(例如，微球黑粉菌纲(Microbotryomycetes))。
示例性的酵母或丝状真菌包括例如以下属：酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、红冬孢酵母属(Rhodosporidi)、曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)或木霉属(Trichoderma)。示例性的酵母或丝状真菌包括例如以下的物种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、产朊假丝酵母、博伊丁假丝酵母(Candidaboidini)、白色假丝酵母、热带假丝酵母、类星形假丝酵母(Candida stellatoidea)、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母(Candida krusei)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、季也蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)、葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)、胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)、甲醇毕赤酵母(Pichia metanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)、茁芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、圆红冬孢酵母-黑曲霉(Rhodosporidium toru-Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichodermareesia)、耶氏解脂酵母、布鲁塞尔酒香酵母(Brettanomyces bruxellensis)、星形假丝酵母(Candida stellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、拜氏接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、加特隐球酵母(Cryptococcus gattii)或布拉酵母(Saccharomyces boulardii)。
示例性的酵母宿主细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母菌株如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33；和酿酒酵母酵母菌株如INVSc1。
在一些情况下，额外的动物细胞包括从软体动物、节肢动物、环节动物或海绵动物获得的细胞。在一些情况下，额外的动物细胞是哺乳动物细胞，例如来自灵长类、猿、马、牛、猪、犬、猫或啮齿动物的细胞。在一些情况下，啮齿动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、栗鼠、褐鼠(fancy rat)或豚鼠。
示例性的哺乳动物宿主细胞包括但不限于293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、FUT8 KO CHOK1、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HepaRGTM细胞、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或已经将感兴趣的遗传材料并入到其自身基因组中并在许多代细胞分裂之后具有表达遗传材料的产物的能力的细胞系。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时的细胞系，或尚未将感兴趣的遗传材料并入到其自身基因组中并在许多代细胞分裂后不具有表达遗传材料的产物的能力的细胞系。
示例性的昆虫宿主细胞包括但不限于果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、HighFiveTM细胞和细胞。
在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性的昆虫细胞系包括但不限于来自莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcuselongatus)PPC 7942的菌株。
制品
在本发明的另一方面，提供了包含用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料的制品。该制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可以由多种材料(例如玻璃或塑料)形成。该容器装有一种组合物，该组合物本身或与另一种组合物组合可有效地用于治疗、预防和/或诊断病状，并且可以具有无菌进入端口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性地结合至CD3的第一抗原结合位点和特异性地结合至TROP2的第二抗原结合位点，如本文前面所定义。
标签或包装插页表明该组合物用于治疗所选的病状。此外，该制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性药剂或其他治疗药剂。本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装插页，表明该组合物可以用于治疗特定的病状。
可替代地或另外地，制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包括药学上可接受的缓冲液，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度来看所期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。
某些定义
本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的并且不旨在进行限制。如本文所使用的，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“该/所述(the)”旨在也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指出。此外，就在详细描述和/或权利要求中使用的术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“具有(with)”或其变体而言，此类术语旨在以类似于术语“包含(comprising)”的方式包含在内。
术语“抗体”以最广泛的意义使用并且涵盖完全组装的抗体、可以结合抗原的抗体片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、单链抗体(scFv)、双抗体、抗体嵌合体、杂交抗体、双特异性抗体等。
术语“互补决定区”或“CDR”是抗体的可变区的区段，其在结构上与抗体结合的表位互补，并且比可变区的其余部分更易变。因此，CDR有时被称为高变区。可变区包含三个CDR。CDR肽可以通过构建编码感兴趣的抗体的CDR的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备此类基因。参见，例如，Larrick等人，Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991)；Courtenay-Luck,“Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Production,Engineering and Clinical Application,Ritter等人(编辑)，第166-179页(Cambridge University Press 1995)；和Ward等人,“Genetic Manipulation andExpression of Antibodies,”Monoclonal Antibodies:Principles and Applications,Birch等人(编辑)，第137-185页(Wiley-Liss,Inc.1995)。
术语“Fab”是指包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)的蛋白质。Fab片段与Fab’片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH在本文中是Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离的硫醇基团。Fab’片段通过还原F(ab’)2片段的重链二硫键产生。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
“单链可变片段(scFv)”是抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。为了灵活性，接头通常富含甘氨酸，以及为了溶解性，富含丝氨酸或苏氨酸，并且可以将VH的N末端与VL的C末端连接起来，或者反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但这种蛋白质仍保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如在Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96中描述。此外，抗体片段包含具有VH结构域的特征的单链多肽，即能够与VL结构域装配在一起，或具有VL结构域的特征的单链多肽，即能够与VH结构域装配在一起到达功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合性质。
虽然已经在本文中示出和描述了本公开的优选的实施方案，但对本领域技术人员而言将显而易见的是，此类实施方案仅通过示例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本公开时，可以采用本文描述的本公开的实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。
实施方案
实施方案1包括一种根据式I的分离的多肽或多肽复合物：A2-A1-L1-P1-H1，其中：A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；P1包含结合至A1的肽；L1包含将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分；H1包含半衰期延长分子；并且A2包含结合至TROP2的第二抗原识别分子。
实施方案2包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
实施方案3包括根据实施方案1-2中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含人的或人源化的抗体或抗体片段。
实施方案4包括根据实施方案1-3中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
实施方案5包括根据实施方案1-4中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
实施方案6包括根据实施方案1-3中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
实施方案7包括根据实施方案1-3和6中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
实施方案8包括根据实施方案2所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。
实施方案9包括根据实施方案8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单链可变片段(scFv)。
实施方案10包括根据实施方案9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。
实施方案11包括根据实施方案8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单结构域抗体。
实施方案12包括根据实施方案2所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)或可变结构域(VHH)。
实施方案13包括根据实施方案1-10和12中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段。
实施方案14包括根据实施方案1-10和12-13中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段，所述抗CD3e单链可变片段与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。
实施方案15包括根据实施方案1-14中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3。
实施方案16包括根据实施方案1-15中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链和可变重链各自能够特异性地结合至人CD3。
实施方案17包括根据实施方案1-16中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19。
实施方案18包括根据实施方案1-17中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。
实施方案19包括根据实施方案1-17中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至所述效应细胞。
实施方案20包括根据实施方案18-19中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞是T细胞。
实施方案21包括根据实施方案18-20中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1结合至作为所述效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。
实施方案22包括根据实施方案21所述的分离的多肽或多肽复合物，其中作为所述TCR-CD3复合物的一部分的所述多肽是人CD3ε。
实施方案23包括根据实施方案9-10和12-22中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ ID NO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。
实施方案24包括根据实施方案1-23中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ IDNO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。
实施方案25包括根据实施方案9-10和12-22中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
实施方案26包括根据实施方案9-10和12-22中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ ID NO:8和HC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ ID NO:11和LC-CDR3：SEQ ID NO:12。
实施方案27包括根据实施方案1-22中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ ID NO:8和HC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ IDNO:11和LC-CDR3：SEQ ID NO:12。
实施方案28包括根据实施方案9-10和12-22中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
实施方案29包括根据实施方案1-28中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中第二抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
实施方案30包括根据实施方案29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab。
实施方案31包括根据实施方案30所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。
实施方案32包括根据实施方案29-31中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段是人源化的或人的。
实施方案33包括根据实施方案30所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2是所述Fab。
实施方案34包括根据实施方案33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。
实施方案35包括根据实施方案33-34中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述Fab的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且所述Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述Fab的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ IDNO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。
实施方案36包括根据实施方案1-35中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A2的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQID NO:17；并且A2包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A2的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQID NO:20。
实施方案37包括根据实施方案34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
实施方案38包括根据实施方案34和37所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Fab重链多肽包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
实施方案39包括根据实施方案34和37-38中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述单链可变片段(scFv)的C末端。
实施方案40包括根据实施方案34和37-38中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。
实施方案41包括根据实施方案34、37-38和40中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述单链可变片段(scFv)的N末端。
实施方案42包括根据实施方案34和37-39中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。
实施方案43包括根据实施方案34-38中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽。
实施方案44包括根据实施方案34-38中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽。
实施方案45包括根据实施方案34-48中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽。
实施方案46包括根据实施方案34-38中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽。
实施方案47包括根据实施方案1-46中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2还包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
实施方案48包括根据实施方案47所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物是根据式Ia：P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1。
实施方案49包括根据实施方案47-48中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab轻链多肽。
实施方案50包括根据实施方案47-48中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab重链多肽。
实施方案51包括根据实施方案47-48中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab轻链多肽。
实施方案52包括根据实施方案47-48中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab重链多肽。
实施方案53包括根据实施方案1-52中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1削弱A1与所述效应细胞抗原的结合。
实施方案54包括根据实施方案1-53中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A1。
实施方案55包括根据实施方案1-54中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1与所述效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。
实施方案56包括根据实施方案47-55中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2削弱A2与TROP2的结合。
实施方案57包括根据实施方案47-56中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A2。
实施方案58包括根据实施方案47-57中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2在抗原结合位点处或附近结合至A2。
实施方案59包括根据实施方案47-58中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2与TROP2具有小于70％的序列同源性。
实施方案60包括根据实施方案47-59中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案61包括根据实施方案47-60中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。
实施方案62包括根据实施方案47-59中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。
实施方案63包括根据实施方案47-60和62中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。
实施方案64包括根据实施方案47-63中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
实施方案65包括根据实施方案47-64中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽或线性肽。
实施方案66包括根据实施方案47-65中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽。
实施方案67包括根据实施方案47-65中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含线性肽。
实施方案68包括根据实施方案1-67中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
实施方案69包括根据实施方案1-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:26、27或122的氨基酸序列。
实施方案70包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:23-25中任一项的氨基酸序列。
实施方案71包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据X1-X2-X3-X4-C-X6-X7-X8-X9-X10-C-X12-X13-X14的氨基酸序列，并且X1选自N、D、S、Y、A、F、H、T、L和V；X2选自S、T、D、A、H、V、Y、N、F、I和L；X3选自L、I和V；X4选自F、L、V、M、W、I、Y和H；X6选自V、F、L、I和W；X7选自K、R、Q、N、H和M；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W、F、Q和L；X12选自W和V；X13选自I、N、H、T、V、Y和D；X14选自D、V、A、S、I、T、N、Y、H和P。
实施方案72包括根据实施方案71所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自N、D、S、Y、A、F和T；X2选自S、T、D、A、H、V、Y和N；X3是L；X4选自F、L、V、M和W；X6选自V、F和L；X7选自K、R、Q和N；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W和F；X12是W；X13选自I、N、H和T；X14选自D、V、A、S、I、T和N。
实施方案73包括根据实施方案71-72中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自N、D、S和Y；X2选自S、T和D；X3是L；X4选自F、L和V；X6选自V和F；X7选自K、R和Q；X8是N；X9选自L和V；X10选自Y和W；X12是W；X13选自I、N和H；X14选自D、V、A和S。
实施方案74包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据J1-J2-J3-C-J5-J6-J7-J8-W-J10-J11-C-J13-J14的氨基酸序列，并且J1选自V、I、L、P、E、F和M；J2选自D和N；J3选自F和W；J5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；J6选自L、M、I、V、F、T、R和S；J7选自Y、F和N；J8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；J10选自P和R；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；J14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V和W；或者P2包含根据B1-B2-B3-C-B5-B6-B7-B8-W-B10-B11-C-B13-B14的氨基酸序列，并且B1选自V、I、L、P、E、F和M；B2选自D和N；B3选自F和W；B5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；B6选自L、M、I、V、F、T、R和S；B7选自Y、F和N；B8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；B10选自P和R；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；B14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V、G和W。
实施方案75包括根据实施方案74所述的分离的多肽或多肽复合物，其中J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S、R、K、Y和L；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T和A；J14选自T、S、Q、L、D、N、A和E；并且B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、R、K、Y、M、G和L；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、H和A；B14选自T、S、Q、L、D、N、A、G和E。
实施方案76包括根据实施方案74-75中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S和R；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R和D；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S和Q；J14选自T、S、Q和L；并且B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、K、M、G和R；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、S、H和D；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、H、A、Y和Q；B14选自T、S、Q、G和L。
实施方案77包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:133-145的氨基酸序列。
实施方案78包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:146-158的氨基酸序列。
实施方案79包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据表27的序列中任一项的氨基酸序列。
实施方案80包括根据实施方案71-73或79中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:159-178的氨基酸序列。
实施方案81包括根据实施方案47-68中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据表29的序列中任一项的氨基酸序列。
实施方案82包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:179-201的氨基酸序列。
实施方案83包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案84包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:181的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案85包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:186的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案86包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
实施方案87包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
实施方案88包括根据实施方案74-76或81中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列。
实施方案89包括根据实施方案1-68和70-88中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S；或者P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。
实施方案90包括根据实施方案89所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；Z14选自D、Y、N、F、I和P；并且U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；U14选自D、Y、N、F、I、M和P。
实施方案91包括根据实施方案89-90中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；Z14选自D、Y和N；并且U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；U14选自D、Y、M和N。
实施方案92包括根据实施方案1-68和70-88中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:202-228的氨基酸序列。
实施方案93包括根据实施方案1-68和70-88中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据表35的序列中任一项的氨基酸序列。
实施方案94包括根据实施方案89-91或93中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:229-240的氨基酸序列。
实施方案95包括根据实施方案89-91或93中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:239的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案96包括根据实施方案89-91或93中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案97包括根据实施方案1-68和70-88中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案98包括根据实施方案89-91或93中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
实施方案99包括根据实施方案89-91或93中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
实施方案100包括根据实施方案1-68和70-88中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案101包括根据实施方案1-5、8-40和43-100中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至A1的N末端。
实施方案102包括根据实施方案1-3、6-38和41-100中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至A1的C末端。
实施方案103包括根据实施方案1-38和41-100中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2结合至A2的N末端。
实施方案104包括根据实施方案1-40和43-100中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2结合至A2的C末端。
实施方案105包括根据实施方案1-104中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案106包括根据实施方案1-105中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案107包括根据实施方案1-106中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案108包括根据实施方案1-107中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案109包括根据实施方案1-108中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案110包括根据实施方案1-109中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2具有包含(G2S)n(SEQ ID NO:243)的式，其中n是1至3的整数。
实施方案111包括根据实施方案1-109中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案112包括根据实施方案1-111中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A1暴露于所述效应细胞抗原时，P1变得与A1未结合。
实施方案113包括根据实施方案1-112中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L2被所述肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A2暴露于TROP2时，P2变得与A2未结合。
实施方案114包括根据实施方案1-113中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
实施方案115包括根据实施方案114所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。
实施方案116包括根据实施方案114所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
实施方案117包括根据实施方案1-116中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白可切割的氨基酸序列。
实施方案118包括根据实施方案1-117中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ ID NO:31或32的氨基酸序列。
实施方案119包括根据实施方案1-117中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ ID NO:58或59的氨基酸序列。
实施方案120包括根据实施方案1-117中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ ID NO:28-61中任一项的氨基酸序列。
实施方案121包括根据实施方案1-117中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含接头25(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:54)、接头26(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:55)、接头27(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:56)或接头28(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列，或者相对于接头25、接头26、接头27或接头28的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
实施方案122包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含聚合物。
实施方案123包括根据实施方案122所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
实施方案124包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含白蛋白。
实施方案125包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含Fc结构域。
实施方案126包括根据实施方案124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
实施方案127包括根据实施方案124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
实施方案128包括根据实施方案1-121中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含多肽、配体或小分子。
实施方案129包括根据实施方案128所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、所述配体或所述小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。
实施方案130包括根据实施方案129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
实施方案131包括根据实施方案129中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
实施方案132包括根据实施方案129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
实施方案133包括根据实施方案128-132中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
实施方案134包括根据实施方案133所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
实施方案135包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
实施方案136包括根据实施方案134-135中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。
实施方案137包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
实施方案138包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
实施方案139包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
实施方案140包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
实施方案141包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
实施方案142包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
实施方案143包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
实施方案144包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
实施方案145包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ IDNO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。
实施方案146包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
实施方案147包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ IDNO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。
实施方案148包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
实施方案149包括根据实施方案134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
实施方案150包括根据实施方案1-149中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。
实施方案151包括根据实施方案150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。
实施方案152包括根据实施方案1-151中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。
实施方案153包括根据实施方案152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案154包括根据实施方案152-153中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案155包括根据实施方案152-154中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案156包括根据实施方案152-155中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案157包括根据实施方案152-156中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案158包括根据实施方案152-157中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案159包括根据实施方案152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
实施方案160包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74-132、241-242具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案161包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案162包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:83具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案163包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案164包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案165包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案166包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案167包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案168包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:85具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案169包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:86和SEQ ID NO:87具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案170包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案171包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案172包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:92和SEQ ID NO:93具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案173包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:95具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案174包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案175包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案176包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案177包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案178包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:105具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案179包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案180包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案181包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:111具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案182包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案183包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案184包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案185包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案186包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案187包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:124具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案188包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:126具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案189包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:128具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案190包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:129和SEQ IDNO:130具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案191包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:241和SEQ ID NO:131具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案192包括根据实施方案1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:242具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
实施方案193包括一种药物组合物，其包含：(a)根据实施方案1-193中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
实施方案194包括一种分离的重组核酸分子，其编码实施方案1-错误！未找到参考源中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案195包括一种根据式II的分离的多肽或多肽复合物：L1a-P1a-H1a，其中：L1a包含肿瘤特异性蛋白酶切割的连接部分，所述连接部分在未被切割时将P1a连接至与效应细胞抗原结合的第一抗原识别分子，并且所述第一抗原识别分子连接至与TROP2结合的第二抗原识别分子；P1a包含当L1a未被切割时与所述第一抗原识别分子结合的肽；并且H1a包含半衰期延长分子。
实施方案196包括根据实施方案195所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1a未被切割时，P1a削弱所述第一抗原识别分子与所述效应细胞抗原的结合。
实施方案197包括根据实施方案195-196中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
实施方案198包括根据实施方案195-197中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原是抗CD3效应细胞抗原。
实施方案199包括根据实施方案195-198中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a与所述效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。
实施方案200包括根据实施方案195-199中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案201包括根据实施方案195-200中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。
实施方案202包括根据实施方案195-201中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。
实施方案203包括根据实施方案195-200和202中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。
实施方案204包括根据实施方案195-203中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
实施方案205包括根据实施方案195-204中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含环肽或线性肽。
实施方案206包括根据实施方案195-205中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含环肽。
实施方案207包括根据实施方案195-205中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含线性肽。
实施方案208包括根据实施方案195-201和203-207中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含选自SEQ ID NO:26、27或122的氨基酸序列。
实施方案209包括根据实施方案195-201和203-207中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；Z4选自G和W；Z6选自E、D、V和P；Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；Z8选自E、D、P和Q；Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S；或者P1a包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；U4选自G和W；U6选自E、D、V和P；U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；U8选自E、D、P和Q；U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。
实施方案210包括根据实施方案209所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y、F、I和N；Z2选自D、Y、L、F、I和N；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L、F和V；Z8选自E和D；Z9选自E、D、Y和V；Z10选自S、D、Y、T和I；Z11选自I、Y、F、V、L和T；Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；Z14选自D、Y、N、F、I和P；并且U1选自D、Y、F、I、V和N；U2选自D、Y、L、F、I和N；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、F、G和V；U8选自E和D；U9选自E、D、Y和V；U10选自S、D、Y、T和I；U11选自I、Y、F、V、L和T；U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；U14选自D、Y、N、F、I、M和P。
实施方案211包括根据实施方案209-210中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Z1选自D、Y和F；Z2选自D、Y、L和F；Z4选自G和W；Z6选自E和D；Z7选自W、L和F；Z8选自E和D；Z9选自E和D；Z10选自S、D和Y；Z11选自I、Y和F；Z12选自F、D、Y和L；Z14选自D、Y和N；并且U1选自D、Y、V和F；U2选自D、Y、L和F；U4选自G和W；U6选自E和D；U7选自W、L、G和F；U8选自E和D；U9选自E和D；U10选自S、D、T和Y；U11选自I、Y、V、L和F；U12选自F、D、Y、G、A和L；U14选自D、Y、M和N。
实施方案212包括根据实施方案195-201和203-207中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:202-228的氨基酸序列。
实施方案213包括根据实施方案195-201和203-207中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据表35的序列中任一项的氨基酸序列。
实施方案214包括根据实施方案209-211或213中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:229-240的氨基酸序列。
实施方案215包括根据实施方案209-211或213中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:239的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案216包括根据实施方案209-211或213中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案216包括根据实施方案195-201和203-207中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案218包括根据实施方案209-211或213中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
实施方案219包括根据实施方案209-211或213中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
实施方案220包括根据实施方案195-201和203-207中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1a包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
实施方案221包括根据实施方案195-220中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含聚合物。
实施方案222包括根据实施方案221所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
实施方案223包括根据实施方案195-221中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含白蛋白。
实施方案224包括根据实施方案195-221中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含Fc结构域。
实施方案225包括根据实施方案223所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
实施方案226包括根据实施方案223所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
实施方案227包括根据实施方案195-220中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含多肽、配体或小分子。
实施方案228包括根据实施方案227所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、所述配体或所述小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。
实施方案229包括根据实施方案228所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
实施方案230包括根据实施方案228所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
实施方案231包括根据实施方案228-229中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
实施方案232包括根据实施方案227-231中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
实施方案233包括根据实施方案232所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
实施方案234包括根据实施方案232-233中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
实施方案235包括根据实施方案232-234中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
实施方案236包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
实施方案237包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
实施方案238包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
实施方案239包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
实施方案240包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
实施方案241包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
实施方案242包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
实施方案243包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
实施方案244包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ IDNO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。
实施方案245包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
实施方案246包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ IDNO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。
实施方案247包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
实施方案248包括根据实施方案233所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
实施方案249包括根据实施方案195-248中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1a包含将H1a连接至P1a的连接部分(L1a)。
实施方案250包括根据实施方案249所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案251包括根据实施方案249-250中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案252包括根据实施方案249-251中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案253包括根据实施方案249-252中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案254包括根据实施方案249-253中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案255包括根据实施方案249-254中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。
实施方案256包括根据实施方案249所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1a包含根据SEQ ID NO:28-61中任一项的氨基酸序列。
实施方案257包括一种多肽复合物，其包含根据构型1的结构排列：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab重链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中所述Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab轻链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
实施方案258包括一种多肽复合物，其包含根据构型2的结构排列：
其中所述多肽复合物包含单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含轻链可变结构域和重链可变结构域，其中所述scFv还包含削弱scFv与效应细胞抗原结合的肽，并且所述肽通过作为肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分连接至scFv的重链可变结构域的N末端，并且所述肽还包含半衰期延长分子；和结合至TROP2的Fab，其中Fab包含Fab轻链多肽和Fab重链多肽，其中Fab轻链多肽连接至scFv的轻链可变结构域的C末端，并且其中Fab还包含P2和L2，其中P2包含削弱与TROP2结合的肽；并且L2包含将Fab重链多肽连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
实施方案259包括分离的多肽或多肽复合物，所述分离的多肽或多肽复合物包含抗TROP2结合结构域，所述抗TROP2结合结构域连接至削弱抗TROP2结合与TROP2结合的肽，其中所述肽包含根据X1-X2-X3-X4-C-X6-X7-X8-X9-X10-C-X12-X13-X14的氨基酸序列，并且X1选自N、D、S、Y、A、F、H、T、L和V；X2选自S、T、D、A、H、V、Y、N、F、I和L；X3选自L、I和V；X4选自F、L、V、M、W、I、Y和H；X6选自V、F、L、I和W；X7选自K、R、Q、N、H和M；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W、F、Q和L；X12选自W和V；X13选自I、N、H、T、V、Y和D；X14选自D、V、A、S、I、T、N、Y、H和P；或者所述肽包含根据J1-J2-J3-C-J5-J6-J7-J8-W-J10-J11-C-J13-J14的氨基酸，并且J1选自V、I、L、P、E、F和M；J2选自D和N；J3选自F和W；J5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；J6选自L、M、I、V、F、T、R和S；J7选自Y、F和N；J8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；J10选自P和R；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；J14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V和W；或者所述肽包含根据B1-B2-B3-C-B5-B6-B7-B8-W-B10-B11-C-B13-B14的氨基酸序列，并且B1选自V、I、L、P、E、F和M；B2选自D和N；B3选自F和W；B5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；B6选自L、M、I、V、F、T、R和S；B7选自Y、F和N；B8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；B10选自P和R；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；B14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V、G和W。
实施方案260包括根据实施方案259所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自N、D、S、Y、A、F和T；X2选自S、T、D、A、H、V、Y和N；X3是L；X4选自F、L、V、M和W；X6选自V、F和L；X7选自K、R、Q和N；X8选自N和K；X9选自L、V和I；X10选自Y、W和F；X12是W；X13选自I、N、H和T；X14选自D、V、A、S、I、T和N。
实施方案261包括根据实施方案259-260中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中X1选自N、D、S和Y；X2选自S、T和D；X3是L；X4选自F、L和V；X6选自V和F；X7选自K、R和Q；X8是N；X9选自L和V；X10选自Y和W；X12是W；X13选自I、N和H；X14选自D、V、A和S。
实施方案262包括根据实施方案259-261中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S、R、K、Y和L；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T和A；J14选自T、S、Q、L、D、N、A和E。
实施方案263包括根据实施方案259-262中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中J1选自V、I和L；J2是D；J3是F；J5选自A、E、S和R；J6选自L、M和I；J7是Y；J8选自N、R和D；J10是P；J11选自V和I；J13选自D、G、N、R、S和Q；J14选自T、S、Q和L。
实施方案264包括根据实施方案259所述的分离的多肽或多肽复合物，其中B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、R、K、Y、M、G和L；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、H和A；B14选自T、S、Q、L、D、N、A、G和E。
实施方案265包括根据实施方案264所述的分离的多肽或多肽复合物，其中B1选自V、I和L；B2是D；B3是F；B5选自A、E、S、K、M、G和R；B6选自L、M和I；B7是Y；B8选自N、R、S、H和D；B10是P；B11选自V和I；B13选自D、G、N、R、S、H、A、Y和Q；B14选自T、S、Q、G和L。
实施方案266包括根据实施方案259所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据表27的序列中任一项的氨基酸序列。
实施方案267包括根据实施方案259-261或266中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:159-178的氨基酸序列。
实施方案268包括根据实施方案259所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据表29的序列中任一项的氨基酸序列。
实施方案269包括根据实施方案259、262-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:179-201的氨基酸序列。
实施方案270包括根据实施方案259、264-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案271包括根据实施方案259、264-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:181的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案272包括根据实施方案259、264-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:186的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
实施方案273包括根据实施方案259、264-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
实施方案274包括根据实施方案259、264-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
实施方案275包括根据实施方案259、264-265中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肽包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列。
实施方案276包括根据实施方案259-275中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中抗TROP2结合结构域包含抗体或抗体片段。
实施方案277包括根据实施方案276所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体、Fab或Fab’。
实施方案278包括根据实施方案276-277中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗TROP2结合结构域包含重链互补决定区HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ IDNO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且抗TROP2结合结构域包含轻链互补决定区CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述Fab的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含：LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。
实施方案279包括根据实施方案277所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含Fab。
实施方案280包括根据实施方案259-279中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中抗TROP2结合结构域包含根据SEQ ID NO:21-22的氨基酸序列。
实施方案281包括根据实施方案280所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含Fab或Fab’。
实施方案282包括根据实施方案259-280中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物还包含半衰期延长分子(H1)。
实施方案283包括根据实施方案282所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述半衰期延长分子连接至肽。
实施方案284包括根据实施方案282-283中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含聚合物。
实施方案285包括根据实施方案284所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
实施方案286包括根据实施方案282-284中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含白蛋白。
实施方案287包括根据实施方案282-284中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含Fc结构域。
实施方案288包括根据实施方案286所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
实施方案289包括根据实施方案286所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
实施方案290包括根据实施方案282-283中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含多肽、配体或小分子。
实施方案291包括根据实施方案290所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、所述配体或所述小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段或CD35/CR1。
实施方案292包括根据实施方案291所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
实施方案293包括根据实施方案291所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
实施方案294包括根据实施方案291-292中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
实施方案295包括根据实施方案290-294中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
实施方案296包括根据实施方案295所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
实施方案297包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
实施方案298包括根据实施方案296-297中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。
实施方案299包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
实施方案300包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
实施方案301包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
实施方案302包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
实施方案303包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
实施方案304包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
实施方案305包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
实施方案306包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
实施方案307包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ IDNO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。
实施方案308包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
实施方案309包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ IDNO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。
实施方案310包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
实施方案311包括根据实施方案296所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
实施方案312包括根据实施方案259-311中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。
实施方案313包括根据实施方案312所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。
实施方案314包括根据实施方案282-313中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含将H1连接至肽的连接部分(L3)。
实施方案315包括根据实施方案314所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
实施方案316包括根据实施方案314-315中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
实施方案317包括根据实施方案314-315中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。
实施方案318包括根据实施方案314-317中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。
实施方案319包括根据实施方案314-318中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。
实施方案320包括根据实施方案314-319中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)(SEQ ID NO:65)n的式，其中n是至少1的整数。
实施方案321包括根据实施方案314-315中任一项所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
实施方案322包括一种治疗三阴性乳腺癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案323包括一种治疗尿路上皮癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案324包括一种治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案325包括一种治疗小细胞肺癌(SCLC)的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案326包括一种治疗胃癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案327包括一种治疗食道癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案328包括一种治疗头颈癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案329包括一种治疗前列腺癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案330包括一种治疗子宫内膜癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案331包括一种治疗乳腺癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案332包括一种治疗结肠癌的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施方案333包括一种治疗神经胶质瘤的方法，所述方法包括向有需要的对象施用根据实施方案1-192或257-321所述的分离的多肽或多肽复合物。
实施例
实施例1：TROP2多肽复合物结合
评估表7的TROP2-CD3多肽复合物的TROP2和CD3ε结合。
表7.多肽复合物
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以标准的酶联免疫吸附测定(ELISA)形式来评估表7的多肽复合物分子结合TROP2以及CD3的能力。在蛋白酶处理之前和之后测量TROP2或CD3的多肽复合物结合动力学。简而言之，生物素化的抗原被捕获在中性抗生物素蛋白包被的板上。多肽复合物分子在指示的地方用活性蛋白裂解酶(MTSP1)处理。然后将在缓冲液中稀释的多肽复合物分子加入到抗原包被的板中。使用标准辣根过氧化物酶缀合物二级抗体来检测结合的多肽复合物。计算获得50％最大信号(EC50)所需的多肽复合物的浓度。
图2A和图2B示出了TROP2结合的代表性ELISA。在表8和9中总结了该数据。PC13和PC5的掩蔽的多肽复合物的EC50是PC1的未掩蔽的多肽复合物的约400倍，蛋白酶处理将PC13和PC5的EC50拯救到仅是未掩蔽的多肽复合物的约4倍。类似地，PC6的掩蔽的多肽复合物具有是PC1的300倍的EC50，并且蛋白酶处理将其拯救到是PC1的约4.5倍。PC14的掩蔽的多肽复合物具有是PC1的约200倍的EC50，并且蛋白酶处理将其拯救到是PC1的约5倍。
具有翻转的方向的多肽复合物显示出类似的模式。PC7和PC8的EC50分别是PC2的100倍和60倍。PC15和PC16的EC50分别是PC2的50倍和30倍。蛋白酶处理拯救了所有四种复合物的结合，使得EC50接近PC2的EC50。
表8.TROP2结合
表9.TROP2结合
图3A和3B示出了CD3结合的代表性ELISA。该数据总结在表10和11中。PC13和PC14的掩蔽的多肽复合物的EC50分别是PC1的未掩蔽的多肽复合物的约1313和1723倍，蛋白酶处理将EC50拯救到低于未掩蔽的多肽复合物的2倍。类似地，PC5和PC6的掩蔽的多肽复合物分别具有是PC1的约321和267倍的EC50，并且蛋白酶处理拯救了两者的EC50，使其是PC1的约1.5倍。具有翻转的方向的多肽复合物显示出类似的模式。PC15和PC16的EC50分别是PC2的390倍和442倍。PC7和PC8的EC50分别是PC2的138倍和165倍。蛋白酶处理拯救了所有四种复合物的EC50，使得EC50接近PC2的EC50。
表10.CD3结合
表11.CD3结合
实施例2：多肽复合物介导的肿瘤细胞毒性和T细胞活化
使用TROP2阳性肿瘤细胞系HCT116和MDAMB231，在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估多肽复合物。使用来自Acea Biosciences的实时细胞分析仪来测量肿瘤细胞杀伤，该分析仪依赖于传感器阻抗测量(细胞指数)，其随着肿瘤细胞在传感器的表面上的粘附、扩散和扩展而增加。同样，随着肿瘤细胞被杀死，阻抗降低。每孔加入25,000个肿瘤细胞，并允许其粘附过夜。第二天，将在补充人血清的培养基中滴定的多肽复合物连同75,000个CD8+ T细胞加入到孔中。每10分钟获取细胞指数测量值持续另外的96小时。然后将细胞指数乘以小时数(肿瘤细胞生长动力学)相对于多肽复合物的浓度作图，其中使用Graphpad Prism来计算降低肿瘤生长50％所需的浓度(IC50)。
HCT116肿瘤细胞系具有每细胞<10,000个拷贝的TROP2密度。图4A和图4B示出了HCT116的代表性活力数据。在表12和13中总结了该数据。PC5的掩蔽的多肽复合物的IC50高于PC1的未掩蔽的多肽复合物的6000倍，蛋白酶处理将IC50拯救到仅是未掩蔽的多肽复合物的约3倍。类似地，PC6的掩蔽的多肽复合物具有是PC1的约5750倍的IC50，并且蛋白酶处理将其拯救到是PC1的约8.6倍。具有翻转的方向的多肽复合物显示出类似的模式。PC7和PC8的IC50分别是PC2的4567倍和1707倍。蛋白酶处理拯救了这两种复合物，使得IC50少于PC2的IC50的3倍。
表12.HCT116细胞测定
表13.HCT116细胞测定
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MDAMB231肿瘤细胞系具有每细胞约32,000个拷贝的TROP2密度。图4C和4D示出了MDAMB231的代表性活力数据。在表14中总结了该数据。PC5的掩蔽的多肽复合物的IC50高于PC1的未掩蔽的多肽复合物的12000倍，蛋白酶处理将IC50拯救到低于未掩蔽的多肽复合物的2倍。PC6的掩蔽的多肽复合物的IC50是PC1的约24,000倍。具有翻转的方向的多肽复合物显示出类似的模式。PC7的IC50是PC2的6864倍。
表14.MDAMB231细胞测定
在表14中示出了具有不同Cd3掩蔽序列的一些另外的多肽复合物。如上所述评估表15的TROP2-CD3多肽复合物的TROP2和CD3ε结合。
表15.多肽复合物
图5A和5B示出了TROP2结合的代表性ELISA。在表16和17中总结了该数据。PC9的掩蔽的多肽复合物的EC50高于PC1的未掩蔽的多肽复合物的450倍，蛋白酶处理将EC50拯救到仅是未掩蔽的多肽复合物的约3.3倍。类似地，PC11的掩蔽的多肽复合物具有高于PC1的200倍的EC50，并且蛋白酶处理将其拯救到是PC1的约8倍。具有翻转的方向的多肽复合物显示出类似的模式。PC10和PC12的EC50分别是PC2的约128倍和37倍。蛋白酶处理拯救了这两种复合物，使得EC50是PC2的EC50的约两倍。
表16:TROP2结合
表17:TROP2结合
图6A和6B示出了CD3e结合的代表性ELISA。在表18和19中总结了该数据。PC9的掩蔽的多肽复合物的EC50高于PC1的未掩蔽的多肽复合物的78倍，蛋白酶处理将EC50拯救到仅与未掩蔽的多肽复合物大约相同。类似地，PC11的掩蔽的多肽复合物具有是PC1的约70倍的EC50，并且蛋白酶处理将其拯救到是PC1的约2.5倍。具有翻转的方向的多肽复合物显示出类似的模式。PC10和PC12的EC50分别是PC2的约85倍和50倍。蛋白酶处理拯救了这两种复合物，使得EC50是PC2的EC50的约两倍。
表18:CD3结合
表19:CD3结合
还在如上所述使用HCT116，在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估了表14的多肽复合物。HCT116肿瘤细胞系具有每细胞<10,000拷贝的TROP2密度。图7A和7B示出了HCT116的代表性活力数据。在表20中总结了该数据。PC9和PC11的掩蔽的多肽复合物的IC50分别是PC1的未掩蔽的多肽复合物的约1259和488倍，蛋白酶处理将IC50拯救到是未掩蔽的多肽复合物的约2.5和5倍。PC10和PC12的掩蔽的多肽复合物的IC50分别是PC2的未掩蔽的多肽复合物的约2337和935倍，蛋白酶处理将IC50拯救到是未掩蔽的多肽复合物的约2和3倍。
表20.HCT116细胞测定
实施例3：多肽复合物介导的肿瘤细胞杀伤
使用TROP2阳性肿瘤细胞系HCT116、NCI-H292和MDAMB231，在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估多肽复合物。使用来自Agilent的xCelligence实时细胞分析仪来测量肿瘤细胞杀伤，该分析仪依赖于传感器阻抗测量值(细胞指数)，其随着肿瘤细胞在传感器的表面上的粘附、扩散和扩展而增加。同样，随着肿瘤细胞被杀死，阻抗降低。每孔加入10,000个肿瘤细胞，并允许其在96孔E板上粘附过夜。第二天，将在补充人血清的培养基中滴定的多肽复合物连同30,000个CD8+ T细胞加入到孔中。每10分钟获取细胞指数测量值持续另外的72小时。然后将细胞指数乘以小时数(肿瘤细胞生长动力学)相对于多肽复合物的浓度作图，其中使用Graphpad Prism软件来计算降低肿瘤生长50％所需的浓度(IC50)。NCI-H292(H292)的数据见图8A-8C。HCT116的数据见图9A-9D。MDMAB231的数据见图10A-10C。
实施例4：在食蟹猴中多肽复合物的药代动力学
在食蟹猴中评估了多肽分子的药代动力学和探索性安全性。简而言之，对体重约3kg的食蟹猴以IV团注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药之后，在特定的时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。相对于在对照cyno血浆中稀释的参考标准品，经由标准ELISA技术来测量血浆中多肽分子的浓度。血浆浓度曲线符合代表分布和消除阶段的标准两相指数方程。药代动力学的拟合能够计算表21所示的TROP2TCE多肽复合物的和表22-24所示和图11A-图11D的TROP2 TRACTr多肽复合物的Cmax、半衰期、分布体积、清除率和7天曲线下面积(AUC)。
表21.
表22.
表23.
表24.
实施例5：多肽复合物在食蟹猴中细胞因子释放
在食蟹猴中评估通过IV团注施用多肽分子之后的细胞因子释放。简而言之，对体重大约3kg的食蟹猴以IV团注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药之后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆在被冷冻储存直到分析。按照制造商的说明，使用来自BD biosciences的非人灵长类细胞Th1/Th2珠阵列试剂盒来分析血浆样品的细胞因子。血浆中的干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素5、白细胞介素4和白细胞介素2的水平相对于由珠阵列试剂盒提供的参考标准品进行计算。数据见图12A-图12D。
实施例6：多肽复合物在食蟹猴中的毒性
在食蟹猴中评估了通过IV团注施用多肽分子之后的全身性肝酶。简而言之，对体重大约3kg的食蟹猴以IV团注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药之后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。分析血浆样品中作为潜在肝毒性的迹象的肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的存在。对于在给药后测试的所有时间点，AST和ALT水平都保持在正常范围内，表明没有肝毒性。AST和ALT按照在来自Millipore的市售试剂盒中提供的说明进行定量。根据制造商的说明，相对于阳性对照参考标准品，计算AST和ALT水平。数据见图13A-13D。
实施例7：经优化的噬菌体文库构建-TROP2 Fab肽
通过将肽内的每个单独的残基突变为丙氨酸并测量针对TROP2 Fab的结合和抑制，建立了TROP2 Fab肽1和TROP2 Fab肽2的序列活性关系。其丙氨酸突变显著地削弱结合和抑制的肽残基被认为是不容许突变的关键残基。其丙氨酸突变表现与未突变的序列相似的肽残基被认为是非关键位点，在这些关键位点中，突变确实是可耐受的。使用肽序列活性关系(SAR)，构建了DNA寡聚物文库，其中编码每个肽序列内的关键残基的密码子被最小地突变，并且编码非关键残基的密码子被严重突变。将得到的寡聚物克隆到噬菌体载体中，所述噬菌体载体用于经由与噬菌体的pIII丝融合展示SAR引导的肽。然后使用本领域中的标准技术，经由在细菌中扩增，将相关载体用于产生噬菌体优化文库。图14A和图14B示出了TROP2 Fab肽1的丙氨酸扫描肽(其序列在表25中示出)的TROP2 Fab抑制。图15A和图15B示出了TROP2 Fab肽2的丙氨酸扫描肽的TROP2 Fab结合。图16A和图16B示出了TROP2 Fab肽2的丙氨酸扫描肽(其序列在表26中示出)的TROP2 Fab抑制。
表25.TROP2 Fab肽1Ala扫描肽序列
表26.TROP2 Fab肽2Ala扫描肽序列
实施例8：淘选经优化的噬菌体文库-TROP2 Fab肽
一旦完成了噬菌体优化文库，使用TROP2 Fab负载的珠对噬菌体文库进行生物淘选。进行多轮淘选，其中噬菌体被允许与TROP2 Fab负载的珠结合，洗涤、洗脱和扩增。在使用固定浓度的TROP2可溶性蛋白、TROP2 Fab肽1或TROP2 Fab肽2的每一轮淘选期间，包括额外的选择性压力。在淘选之后，将噬菌体感染的细菌铺板，并将菌落挑选到96孔块中。然后经由离心从细菌细胞中扩增并分离克隆噬菌体。在存在或不存在饱和浓度的TROP2可溶性蛋白的情况下，在针对TROP2 Fab包被的板的结合ELISA中测试含有上清液的噬菌体。如果在存在TROP2可溶性蛋白的情况下结合信号降低，则选择能够结合TROP2 Fab的噬菌体用于序列分析。
实施例9：淘选ELISA-TROP2 Fab肽
克隆噬菌体作为粗上清液收获，并经由标准酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选。简而言之，生物素化的TROP2 Fab被捕获在中性抗生物素蛋白(neutravidin)包被的板上。在加入克隆噬菌体之前，将孔与封闭缓冲液和TROP2可溶性蛋白或单独的封闭缓冲液一起温育。在不洗涤或抽吸的情况下，将克隆噬菌体上清液加入到孔中，并温育持续短的时间。然后洗涤孔，随后使用辣根过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测结合的噬菌体。然后将感兴趣的克隆噬菌体送去用于序列分析。
在表27中示出了TROP2 Fab肽1文库序列的噬菌体淘选结果。鉴定了979个克隆噬菌体序列。选择979个克隆噬菌体中的20个用于肽合成，并评估TROP2 Fab的肽抑制。在表28中示出了选择用于合成的那些肽的序列，并进一步评估了对TROP2 Fab的抑制，如图17A至图17C所示。从表27的所有序列计算的共有序列显示在图18中，并且使用WebLogo 3.7.4产生。
在表29中示出了TROP2 Fab肽2文库序列的噬菌体淘选结果。鉴定了596个克隆噬菌体序列。选择596个中的23个用于肽合成，并评估肽与TROP2 Fab的结合(图19A-图19C)和TROP2 Fab的肽抑制(图20A-20C)。在表30中示出了选择用于合成的那些肽的序列。从表29的所有序列计算的共有序列显示在图21中，并使用WebLogo 3.7.4产生。表27.TROP2 Fab肽1文库序列的噬菌体淘选结果。(-)表示与TROP2Fab肽1相应位置(例如噬菌体-1位置)相同的氨基酸。
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表28.选择用于合成的那些肽的序列(TROP2 Fab肽1优化)
表29.TROP2 Fab肽2文库序列的噬菌体淘选结果。(-)表示与TROP2 Fab肽2相应位置(例如噬菌体-981位置)相同的氨基酸。
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表30.选择用于合成的那些肽的序列(TROP2 Fab肽2优化)
| 构建体描述 | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
| 肽50 | IDFCAMYQWPICDT | 179 |
| 肽51 | IDFCAVYKWPVCQV | 180 |
| 肽52 | IDFCMLYNWPICAG | 181 |
| 肽53 | VDFCKIYAWPICGS | 182 |
| 肽54 | VDFCKLYNWPVCQT | 183 |
| 肽55 | IDFCLIYNWPVCDT | 184 |
| 肽56 | EDFCKLYNWPICYQ | 185 |
| 肽57 | VDFCGLYHWPICYQ | 186 |
| 肽58 | VDFCYLYNWPVCSK | 187 |
| 肽59 | IDFCAIYQWPVCRS | 188 |
| 肽60 | VDFCALYNWPVCET | 189 |
| 肽61 | PDFCAVYRWPICYQ | 190 |
| 肽62 | VDFCELYRWPICNS | 191 |
| 肽63 | LDFCKIYDWPICHL | 192 |
| 肽64 | LDFCKLYQWPVCFT | 193 |
| 肽65 | IDFCLLYDWPVCAS | 194 |
| 肽66 | IDFCLLYDWPICGR | 195 |
| 肽67 | MDFCQIYDWPICRL | 196 |
| 肽68 | PDFCQLYNWPVCAG | 197 |
| 肽69 | VDFCSFYRWPICET | 198 |
| 肽70 | IDFCSLYQWPVCGT | 199 |
| 肽71 | VDFCTIYKWPVCEG | 200 |
| 肽72 | VDFCYQYGWPICSR | 201 |
实施例10：TROP2多肽复合物结合(PC25、PC26、PC27、PC28、PC29和PC30)
根据实施例1的方法评估PC25、PC26、PC27、PC28、PC29和PC30(其序列在表6中提供)的TROP2和CD3ε结合。图22和23分别示出了TROP2和CD3ε结合的代表性ELISA。
实施例11：多肽复合物介导的肿瘤细胞毒性
使用TROP2阳性肿瘤细胞系HCT116、NCI-H292和MDAMB231，在功能性体外肿瘤细胞杀伤测定中评估多肽复合物。使用来自Agilent的xCelligence实时细胞分析仪来测量肿瘤细胞杀伤，该分析仪依赖于传感器阻抗测量值(细胞指数)，其随着肿瘤细胞在传感器的表面上的粘附、扩散和扩展而增加。同样，随着肿瘤细胞被杀死，阻抗降低。每孔加入10,000个肿瘤细胞，并允许在96孔E板上粘附过夜。第二天，将在补充人血清的培养基中滴定的多肽复合物连同30,000个CD8+ T细胞加入到孔中。每10分钟获取细胞指数测量值持续另外的72小时。然后将细胞指数乘以小时数(肿瘤细胞生长动力学)相对于多肽复合物的浓度作图，其中使用Graphpad Prism软件来计算降低肿瘤生长50％所需的浓度(IC50)。图24A示出了在CD8+ T细胞的存在下PC25介导的HCT116肿瘤细胞杀伤。图24B示出了在CD8+ T细胞的存在下PC26介导的HCT116肿瘤细胞杀伤。图24C示出了在CD8+ T细胞的存在下PC25介导的MDAMB231肿瘤细胞杀伤。
实施例12：多肽复合物-22(PC22)在食蟹猴中的药代动力学
在食蟹猴中评估了多肽分子的药代动力学和探索性安全性。简而言之，对体重大约3kg的食蟹猴以IV团注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药之后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。相对于在对照cyno血浆中稀释的参考标准品，经由标准ELISA技术来测量血浆中多肽分子的浓度。血浆浓度曲线符合代表分布和消除阶段的标准两相指数方程。药代动力学的拟合能够计算表31和图25中所示的Cmax、半衰期、分布体积、清除率和7天曲线下面积(AUC)。在cyno中测量的药代动力学支持在人体内每周给药一次。
表31.PC22 PK计算
实施例13：PC22在食蟹猴中的细胞因子释放
在食蟹猴中评估了在通过IV团注施用多肽分子之后的细胞因子释放。简而言之，对体重大约3kg的食蟹猴以IV团注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药之后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。按照制造商的说明，使用来自BD biosciences的非人灵长类细胞Th1/Th2珠阵列试剂盒来分析血浆样品的细胞因子。血浆中的干扰素γ、肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素5、白细胞介素4和白细胞介素2的水平相对于在珠阵列试剂盒提供的参考标准品进行计算。图26A-图26F示出了在PC22的单次IV团注之后在食蟹猴中的细胞因子释放。
实施例14：PC22在食蟹猴中的毒性
在食蟹猴中评估了在通过IV团注施用PC22之后的全身肝酶。简而言之，对体重大约3kg的食蟹猴以IV团注施用多肽，并且每天观察不良事件的迹象。没有观察到生活中的不良事件。在给药之后，在特定时间点将血液收集在K2 EDTA管中，并加工成血浆。血浆被冷冻储存直到分析。分析血浆样品中作为潜在肝毒性迹象的肝酶天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的存在。对于在给药后测试的所有时间点，AST和ALT水平都保持在正常范围内，表明没有肝毒性。AST和ALT按照在来自Millipore的市售试剂盒中提供的说明进行定量。根据制造商的说明，相对于阳性对照参考标准品，计算AST和ALT水平。图27A-27B示出了在PC22的单次IV团注之后在食蟹猴中的血清肝酶水平。
实施例15：在人三阴性乳腺癌的小鼠模型中的抗肿瘤功效
雌性NCG小鼠被皮下植入5百万个MDA-MB-231三阴性肿瘤细胞。当肿瘤达到50-80mm3时，经由尾静脉移植2000万个人PBMC。当肿瘤达到275mm3时，将小鼠随机分组，并且每天静脉内给药化合物，持续10天。每两到三天测量一次肿瘤体积，并随时间作图。肿瘤体积生长动力学表明掩蔽的TROP2靶向双特异性化合物的抗肿瘤活性。观察到的抗肿瘤活性是蛋白酶依赖性的，因为在可切割的接头内缺乏蛋白酶底物的化合物相当于媒介物对照。所示出的是PC3(图28A)、PC17(图28B)、PC23(图28C)、PC24(图28D)。
实施例16：经优化的噬菌体文库构建-CD3 scFv肽
通过将肽中的每个单独残基突变为丙氨酸并测量针对SP34.185scFv的结合和抑制，建立了肽A和肽B的序列活性关系(SAR)。其丙氨酸突变显著削弱结合和抑制的肽残基可以被认为是不容许突变的关键残基。其丙氨酸突变表现类似于未突变的序列的肽残基可以被认为是非关键位点，其中突变确实是可耐受的。使用肽SAR，构建DNA寡聚物文库，其中编码每个肽序列内的关键残基的密码子被最小地突变，并且编码非关键残基的密码子被严重突变。将得到的寡聚物被克隆到噬菌体载体中，所述噬菌体载体用于经由与噬菌体的pIII丝融合来展示SAR引导的肽。然后使用本领域的标准技术，经由在细菌中扩增，将相关载体用于产生噬菌体优化文库。
通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估肽结合SP34.185 scFv的能力。简而言之，生物素化的肽被捕获在中性抗生物素蛋白包被的板上，用生物素猝灭，然后进行洗涤步骤。然后将SP34.185 scFv滴定到肽捕获的板上。然后洗涤板并使用二级辣根过氧化物酶抗体缀合物检测结合的SP34.185 scFv。在再次洗涤之后，使用标准ELISA技术对板进行显影，并使用酸停止。使用Graphpad prism来计算达到50％最大信号或EC50所需的SP34.185scFv的浓度。数据显示在图29A-29F中并且总结在表32A-32D中。在表34中示出了肽A和肽B的CD3 Ala扫描肽的肽序列。
表32A.图29B的总结
表32B.图29C的总结
表32C.图29E的总结
表32D.图29F的总结
通过标准酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估肽抑制SP34.185 scFv结合CD3e的能力。简而言之，将固定浓度的SP34.185 scFv与不同浓度的肽在溶液中一起温育。将SP34.185scFv和肽溶液在加入到CD3包被的板中之前温育持续1小时。在洗涤前允许结合进行30分钟。在洗涤之后，使用二级辣根过氧化物酶抗体缀合物结合的SP34.185 scFv。在再次洗涤之后，使用标准ELISA技术对板进行显影，并停止使用酸。使用Graphpad prism来计算抑制50％的SP34.185 scFv CD3结合信号(IC50)所需的肽浓度。数据显示在图30A-图30F中并总结在表33A-表33D中。
表33A.图30B的总结
表33B.图30C的总结
表33C.图30E的总结
表33D.图30F的总结
表34.CD3 Ala扫描序列-肽A和肽B
实施例17：淘选经优化的噬菌体文库构建-CD3 scFv肽
一旦完成了噬菌体优化文库，使用SP34.185 scFv负载的珠对噬菌体文库进行生物淘选。进行多轮淘选，其中允许噬菌体结合至SP34.185scFv负载的珠，洗涤、洗脱和扩增。在使用固定浓度的CD3、肽A或肽B的每一轮淘选期间，包括额外的选择性压力。在淘选之后，将噬菌体感染的细菌铺板，并将菌落挑选到96孔块中。然后经由离心从细菌细胞中扩增并分离克隆噬菌体。在存在或不存在饱和浓度的CD3的情况下，在针对SP34.185 scFv包被的板的结合ELISA中测试含有上清液的噬菌体。如果在CD3的存在下结合信号降低，则选择能够结合SP34.185 scFv的噬菌体用于序列分析。
实施例18：淘选ELISA-CD3 scFv肽
克隆噬菌体作为粗上清液收获，并经由标准酶联免疫吸附测定(ELISA)筛选。简而言之，生物素化的SP34.185 scFv被捕获在中性抗生物素蛋白包被的板上。在加入克隆噬菌体之前，将孔与封闭缓冲液和CD3或单独的封闭缓冲液一起温育。在不洗涤或抽吸的情况下，将克隆噬菌体上清液加入到孔中，并温育持续短的时间。然后洗涤孔，随后使用辣根过氧化物酶缀合的抗M13抗体检测结合的噬菌体。然后将感兴趣的克隆噬菌体送去用于序列分析。
在表35中示出了CD3 scFv肽A文库序列的噬菌体淘选结果。在表36中示出了选择用于合成的那些肽的序列，并进一步评估了与抗CD3scFv的结合(图31A-图31B)和对抗CD3scFv与CD3结合的抑制(图32A-图32B)。图33所示的共有序列是从表35所示的所有序列中计算出来的，并使用WebLogo 3.7.4生成。
表35.来自肽B优化文库淘选的克隆噬菌体肽序列(-)指示与CD3scFv肽B相应位置(例如噬菌体1位置)相同的氨基酸。
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表36.选择用于合成的那些肽的序列(CD3 scFv肽B优化)
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Claims (162)
1.一种根据式I的分离的多肽或多肽复合物：
A2-A1-L1-P1-H1
(式I)
其中：
A1包含结合至效应细胞抗原的第一抗原识别分子；
P1包含结合至A1的肽；
L1包含连接部分，所述连接部分将A1连接至P1并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物；
H1包含半衰期延长分子；并且
A2包含结合至肿瘤相关钙信号转导子2(TROP2)的第二抗原识别分子。
2.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
3.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第一抗原识别分子包含人的或人源化的抗体或抗体片段。
4.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
5.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
6.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至所述第一抗原识别分子的C末端。
7.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2结合至所述第一抗原识别分子的N末端。
8.根据权利要求2所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab片段。
9.根据权利要求8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单链可变片段(scFv)。
10.根据权利要求9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述scFv包含scFv重链多肽和scFv轻链多肽。
11.根据权利要求8所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1是所述单结构域抗体。
12.根据权利要求2所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)或可变结构域(VHH)。
13.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段。
14.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含抗CD3e单链可变片段，所述抗CD3e单链可变片段与CD3表达细胞上的CD3具有1μM或更小的KD结合。
15.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3。
16.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含可变轻链和可变重链，所述可变轻链和可变重链各自能够特异性地结合至人CD3。
17.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1包含互补决定区(CDR)，所述互补决定区选自莫罗单抗-CD3(OKT3)、奥昔组单抗(TRX4)、替利组单抗(MGA031)、维西珠单抗(Nuvion)、SP34、X35、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01、UCHT-1、WT-31、15865、15865v12、15865v16和15865v19。
18.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至效应细胞。
19.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割并且A1结合至效应细胞时，式I的分离的多肽或多肽复合物结合至所述效应细胞。
20.根据权利要求18所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞是T细胞。
21.根据权利要求18所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A1结合至作为所述效应细胞上的TCR-CD3复合物的一部分的多肽。
22.根据权利要求21所述的分离的多肽或多肽复合物，其中作为所述TCR-CD3复合物的一部分的所述多肽是人CD3ε。
23.根据权利要求9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ ID NO:3；并且所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQID NO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。
24.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:1、HC-CDR2：SEQ ID NO:2和HC-CDR3：SEQ IDNO:3；并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:4、LC-CDR2：SEQ ID NO:5和LC-CDR3：SEQ ID NO:6。
25.根据权利要求9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列。
26.根据权利要求9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中所述scFv包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述scFv的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ ID NO:8和HC-CDR3：SEQ ID NO:9；并且所述scFv包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述scFv的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ ID NO:11和LC-CDR3：SEQ ID NO:12。
27.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，其中A1包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A1的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:7、HC-CDR2：SEQ ID NO:8和HC-CDR3：SEQ IDNO:9；并且A1包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A1的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:10、LC-CDR2：SEQ ID NO:11和LC-CDR3：SEQ ID NO:12。
28.根据权利要求9所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述效应细胞抗原包含CD3，并且所述scFv包含根据SEQ ID NO:14的氨基酸序列。
29.根据权利要求10所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述第二抗原识别分子包含抗体或抗体片段。
30.根据权利要求29所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含单链可变片段、单结构域抗体或Fab。
31.根据权利要求30所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段包含骆驼科动物来源的单结构域抗体的单链可变片段(scFv)、重链可变结构域(VH结构域)、轻链可变结构域(VL结构域)、可变结构域(VHH)。
32.根据权利要求31所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体或其抗体片段是人源化的或人的。
33.根据权利要求30所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2是所述Fab。
34.根据权利要求33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab包含(a)Fab轻链多肽和(b)Fab重链多肽。
35.根据权利要求33所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述Fab的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且所述Fab包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中所述Fab的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ IDNO:20。
36.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中A2的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:15、HC-CDR2：SEQ ID NO:16和HC-CDR3：SEQ ID NO:17；并且A2包含CDR：LC-CDR1、LC-CDR2和LC-CDR3，其中A2的所述LC-CDR1、所述LC-CDR2和所述LC-CDR3包含LC-CDR1：SEQ ID NO:18、LC-CDR2：SEQ ID NO:19和LC-CDR3：SEQ ID NO:20。
37.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述Fab轻链多肽包含根据SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
38.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中Fab重链多肽包含根据SEQID NO:22的氨基酸序列。
39.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述单链可变片段(scFv)的C末端。
40.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的C末端。
41.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述单链可变片段(scFv)的N末端。
42.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至单链可变片段(scFv)A1的N末端。
43.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽。
44.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽。
45.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽。
46.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽。
47.根据权利要求34所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2还包含P2和L2，其中P2包含结合至A2的肽；并且L2包含将A2连接至P2并且是肿瘤特异性蛋白酶的底物的连接部分。
48.根据权利要求47所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物是根据式Ia
P2-L2-A2-A1-L1-P1-H1
(式Ia)。
49.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab轻链多肽。
50.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv重链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab重链多肽。
51.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab重链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab轻链多肽。
52.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中A2的所述Fab轻链多肽结合至A1的所述scFv轻链多肽，并且L2结合至A2的所述Fab重链多肽。
53.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1削弱A1与所述效应细胞抗原的结合。
54.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A1。
55.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1与所述效应细胞抗原具有小于70％的序列同源性。
56.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2削弱A2与TROP2的结合。
57.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2通过离子相互作用、静电相互作用、疏水相互作用、π堆积相互作用和氢键相互作用或其组合结合至A2。
58.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2在抗原结合位点处或附近结合至A2。
59.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2与TROP2具有小于70％的序列同源性。
60.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸的肽序列。
61.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少10个氨基酸且长度不超过20个氨基酸的肽序列。
62.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度为至少16个氨基酸的肽序列。
63.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含长度不超过40个氨基酸的肽序列。
64.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
65.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽或线性肽。
66.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含环肽。
67.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1或P2包含线性肽。
68.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含至少两个半胱氨酸氨基酸残基。
69.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:26、27或122的氨基酸序列。
70.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:23-25中任一项的氨基酸序列。
71.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据X1-X2-X3-X4-C-X6-X7-X8-X9-X10-C-X12-X13-X14的氨基酸序列，并且
X1选自N、D、S、Y、A、F、H、T、L和V；
X2选自S、T、D、A、H、V、Y、N、F、I和L；
X3选自L、I和V；
X4选自F、L、V、M、W、I、Y和H；
X6选自V、F、L、I和W；
X7选自K、R、Q、N、H和M；
X8选自N和K；
X9选自L、V和I；
X10选自Y、W、F、Q和L；
X12选自W和V；
X13选自I、N、H、T、V、Y和D；
X14选自D、V、A、S、I、T、N、Y、H和P。
72.根据权利要求71所述的分离的多肽或多肽复合物，其中
X1选自N、D、S、Y、A、F和T；
X2选自S、T、D、A、H、V、Y和N；
X3是L；
X4选自F、L、V、M和W；
X6选自V、F和L；
X7选自K、R、Q和N；
X8选自N和K；
X9选自L、V和I；
X10选自Y、W和F；
X12是W；
X13选自I、N、H和T；
X14选自D、V、A、S、I、T和N。
73.根据权利要求72所述的分离的多肽或多肽复合物，其中
X1选自N、D、S和Y；
X2选自S、T和D；
X3是L；
X4选自F、L和V；
X6选自V和F；
X7选自K、R和Q；
X8是N；
X9选自L和V；
X10选自Y和W；
X12是W；
X13选自I、N和H；
X14选自D、V、A和S。
74.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据J1-J2-J3-C-J5-J6-J7-J8-W-J10-J11-C-J13-J14的氨基酸序列，并且
J1选自V、I、L、P、E、F和M；
J2选自D和N；
J3选自F和W；
J5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和
D；
J6选自L、M、I、V、F、T、R和S；
J7选自Y、F和N；
J8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；
J10选自P和R；
J11选自V和I；
J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；
J14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、
H、P、V和W；或者
P2包含根据B1-B2-B3-C-B5-B6-B7-B8-W-B10-B11-C-B13-B14的氨基酸序列，并且
B1选自V、I、L、P、E、F和M；
B2选自D和N；
B3选自F和W；
B5选自A、E、S、R、K、Y、L、Q、G、M、F、T、W和D；
B6选自L、M、I、V、F、T、R和S；
B7选自Y、F和N；
B8选自N、R、D、H、K、Q、S、G、A、E和M；
B10选自P和R；
B11选自V和I；
B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、A、E、L、V、K、M、I、H、F和W；
B14选自T、S、Q、L、D、N、A、E、K、M、V、R、I、H、P、V、G和W。
75.根据权利要求74所述的分离的多肽或多肽复合物，其中
J1选自V、I和L；
J2是D；
J3是F；
J5选自A、E、S、R、K、Y和L；
J6选自L、M和I；
J7是Y；
J8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；
J10是P；
J11选自V和I；
J13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T和A；
J14选自T、S、Q、L、D、N、A和E；并且
B1选自V、I和L；
B2是D；
B3是F；
B5选自A、E、S、R、K、Y、M、G和L；
B6选自L、M和I；
B7是Y；
B8选自N、R、D、H、K、Q、S和G；
B10是P；
B11选自V和I；
B13选自D、G、N、R、S、Q、Y、T、H和A；
B14选自T、S、Q、L、D、N、A、G和E。
76.根据权利要求75所述的分离的多肽或多肽复合物，其中J1选自V、I和L；
J2是D；
J3是F；
J5选自A、E、S和R；
J6选自L、M和I；
J7是Y；
J8选自N、R和D；
J10是P；
J11选自V和I；
J13选自D、G、N、R、S和Q；
J14选自T、S、Q和L；并且
B1选自V、I和L；
B2是D；
B3是F；
B5选自A、E、S、K、M、G和R；
B6选自L、M和I；
B7是Y；
B8选自N、R、S、H和D；
B10是P；
B11选自V和I；
B13选自D、G、N、R、S、H、A、Y和Q；
B14选自T、S、Q、G和L。
77.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:133-145的氨基酸序列。
78.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:146-158的氨基酸序列。
79.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据表27的序列中任一项的氨基酸序列。
80.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:159-178的氨基酸序列。
81.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据表29的序列中任一项的氨基酸序列。
82.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:179-201的氨基酸序列。
83.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:24的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
84.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:181的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
85.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包
含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:186的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
86.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
87.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:181的氨基酸序列。
88.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P2包含根据SEQ ID NO:186的氨基酸序列。
89.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据Z1-Z2-C-Z4-P-Z6-Z7-Z8-Z9-Z10-Z11-Z12-C-Z14的氨基酸序列，并且
Z1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；
Z2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；
Z4选自G和W；
Z6选自E、D、V和P；
Z7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；
Z8选自E、D、P和Q；
Z9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；
Z10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；
Z11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；
Z12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S和H；
Z14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L和S；或者P1包含根据U1-U2-C-U4-P-U6-U7-U8-U9-U10-U11-U12-C-U14的氨基酸序列，并且
U1选自D、Y、F、I、N、V、H、L、A、T、S和P；
U2选自D、Y、L、F、I、N、A、V、H、T和S；
U4选自G和W；
U6选自E、D、V和P；
U7选自W、L、F、V、G、M、I和Y；
U8选自E、D、P和Q；
U9选自E、D、Y、V、F、W、P、L和Q；
U10选自S、D、Y、T、I、F、V、N、A、P、L和H；
U11选自I、Y、F、V、L、T、N、S、D、A和H；
U12选自F、D、Y、L、I、V、A、N、T、P、S、G和H；
U14选自D、Y、N、F、I、P、V、A、T、H、L、M和S。
90.根据权利要求89所述的分离的多肽或多肽复合物，其中
Z1选自D、Y、F、I和N；
Z2选自D、Y、L、F、I和N；
Z4选自G和W；
Z6选自E和D；
Z7选自W、L、F和V；
Z8选自E和D；
Z9选自E、D、Y和V；
Z10选自S、D、Y、T和I；
Z11选自I、Y、F、V、L和T；
Z12选自F、D、Y、L、I、V、A和N；
Z14选自D、Y、N、F、I和P；并且
U1选自D、Y、F、I、V和N；
U2选自D、Y、L、F、I和N；
U4选自G和W；
U6选自E和D；
U7选自W、L、F、G和V；
U8选自E和D；
U9选自E、D、Y和V；
U10选自S、D、Y、T和I；
U11选自I、Y、F、V、L和T；
U12选自F、D、Y、L、I、V、A、G和N；
U14选自D、Y、N、F、I、M和P。
91.根据权利要求90所述的分离的多肽或多肽复合物，其中
Z1选自D、Y和F；
Z2选自D、Y、L和F；
Z4选自G和W；
Z6选自E和D；
Z7选自W、L和F；
Z8选自E和D；
Z9选自E和D；
Z10选自S、D和Y；
Z11选自I、Y和F；
Z12选自F、D、Y和L；
Z14选自D、Y和N；并且
U1选自D、Y、V和F；
U2选自D、Y、L和F；
U4选自G和W；
U6选自E和D；
U7选自W、L、G和F；
U8选自E和D；
U9选自E和D；
U10选自S、D、T和Y；
U11选自I、Y、V、L和F；
U12选自F、D、Y、G、A和L；
U14选自D、Y、M和N。
92.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:202-228的氨基酸序列。
93.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据表35的序列中任一项的氨基酸序列。
94.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:229-240的氨基酸序列。
95.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:239的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
96.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:27的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
97.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列或相对于SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的肽序列。
98.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:239的氨基酸序列。
99.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
100.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中P1包含根据SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
101.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至A1的N末端。
102.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1结合至A1的C末端。
103.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2结合至A2的N末端。
104.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L2结合至A2的C末端。
105.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
106.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
107.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少10个氨基酸的肽序列。
108.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少18个氨基酸的肽序列。
109.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2是具有至少26个氨基酸的肽序列。
110.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2具有包含(G2S)n(SEQID NO:243)的式，其中n是1至3的整数。
111.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。
112.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L1被所述肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A1暴露于所述效应细胞抗原时，P1变得与A1未结合。
113.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中当L2被所述肿瘤特异性蛋白酶切割从而将A2暴露于TROP2时，P2变得与A2未结合。
114.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述肿瘤特异性蛋白酶选自基质金属蛋白酶(MMP)、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
115.根据权利要求114所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述基质金属蛋白酶包括MMP2、MMP7、MMP9、MMP13或MMP14。
116.根据权利要求114所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述丝氨酸蛋白酶包括蛋白裂解酶(MTSP1)、尿激酶或hepsin。
117.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含尿激酶可切割的氨基酸序列、蛋白裂解酶可切割的氨基酸序列、基质金属蛋白酶可切割的氨基酸序列或豆荚蛋白可切割的氨基酸序列。
118.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ IDNO:31或32的氨基酸序列。
119.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ IDNO:58或59的氨基酸序列。
120.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含根据SEQ IDNO:28-61中任一项的氨基酸序列。
121.根据权利要求48所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L1或L2包含接头25(ISSGLLSGRSDAG)(SEQ ID NO:54)、接头26(AAGLLAPPGGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:55)、接头27(SPLGLSGRSDAG)(SEQ ID NO:56)或接头28(LSGRSDAGSPLGLAG)(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列，或者相对于接头25、接头26、接头27或接头28的氨基酸序列具有1、2或3个氨基酸取代、添加或缺失的氨基酸序列。
122.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含聚合物。
123.根据权利要求122所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
124.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含白蛋白。
125.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含Fc结构域。
126.根据权利要求124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是血清白蛋白。
127.根据权利要求124所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白。
128.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含多肽、配体或小分子。
129.根据权利要求128所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽、所述配体或所述小分子结合血清蛋白或其片段、循环免疫球蛋白或其片段、或CD35/CR1。
130.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白包含甲状腺素结合蛋白、甲状腺素运载蛋白、1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、转铁蛋白受体或其转铁蛋白结合部分、纤维蛋白原或白蛋白。
131.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述循环免疫球蛋白分子包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、slgA、IgM或IgD。
132.根据权利要求129所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述血清蛋白是白蛋白。
133.根据权利要求128所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述多肽是抗体。
134.根据权利要求133所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述抗体包含单结构域抗体、单链可变片段或Fab。
135.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含结合至白蛋白的单结构域抗体。
136.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是人抗体或人源化抗体。
137.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645gH1gL1。
138.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是645dsgH5gL4。
139.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是23-13-A01-sc02。
140.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是A10m3或其片段。
141.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7r-31。
142.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是DOM7h-11-15。
143.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是Alb-1、Alb-8或Alb-23。
144.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是10E。
145.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:66、HC-CDR2：SEQ ID NO:67和HC-CDR3：SEQ ID NO:68。
146.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
147.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含互补决定区(CDR)：HC-CDR1、HC-CDR2和HC-CDR3，其中所述单结构域抗体的所述HC-CDR1、所述HC-CDR2和所述HC-CDR3包含：HC-CDR1：SEQ ID NO:70、HC-CDR2：SEQ ID NO:71和HC-CDR3：SEQ ID NO:72。
148.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体包含根据SEQ ID NO:73的氨基酸序列。
149.根据权利要求134所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述单结构域抗体是SA21。
150.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含经修饰的氨基酸、非天然氨基酸、经修饰的非天然氨基酸或其组合。
151.根据权利要求150所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述经修饰的氨基酸或经修饰的非天然氨基酸包含翻译后修饰。
152.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中H1包含将H1连接至P1的连接部分(L3)。
153.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少5个至不超过50个氨基酸的肽序列。
154.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个至不超过30个氨基酸的肽序列。
155.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少10个氨基酸的肽序列。
156.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少18个氨基酸的肽序列。
157.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3是具有至少26个氨基酸的肽序列。
158.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3具有选自(G2S)n、(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:62)、(GGGS)n(SEQ ID NO:63)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:64)和(GSSGGS)n(SEQ ID NO:65)的式，其中n是至少1的整数。
159.根据权利要求152所述的分离的多肽或多肽复合物，其中L3包含根据SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
160.根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物，其中所述分离的多肽或多肽复合物包含与SEQ ID NO:74-132、241-242具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
161.一种药物组合物，其包含：(a)根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物；和(b)药学上可接受的赋形剂。
162.一种分离的重组核酸分子，其编码根据权利要求1所述的分离的多肽或多肽复合物。
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