JP7065149B2 - 二重特異性ｃｄ３３およびｃｄ３結合タンパク質 - Google Patents

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関連出願の相互参照
この出願は、２０１４年７月１日付で出願された米国仮出願６２／０１９，７９５号；２０１５年２月３日付で出願された米国仮出願６２／１１１，４７０号；の利益を請求し、及び、２０１５年３月９日付で出願された米国出願１４／６４２，４９７号の継続出願であり、各々は参照によって本明細書に組込まれる。
配列表
本出願は配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組込まれる。配列表は、２０１５年６月３０日に作成され、４５３７５－７０４．６０１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１４７，９６５バイトである。
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は成人および小児における急性白血病である。ＣＤ３３は、ＡＭＬにおいて、大多数の骨髄芽球上で発現される。ＣＤ３３は、いくつかの報告書において、一般に早期の多系の骨髄性の前駆細胞に限定され、正常な造血多能性幹細胞では欠如している。
本明細書において、ヒトＣＤ３３に特異的に結合する結合タンパク質、および、ヒトＣＤ３３とヒトＣＤ３とに特異的に結合する二重特異性結合タンパク質が提供される。また本明細書において、例えばタンデムダイアボディのような、二重特異性ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質を多数生成するための、抗ＣＤ３３可変領域および抗ＣＤ３可変領域が提供される。さらにまた本明細書において、ＣＤ３３とＣＤ３とに結合する二重特異性タンデムダイアボディ、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および他の血液系悪性腫瘍の免疫療法、障害あるいは症状に対するそれらの使用が提供される。
特に、ヒトＣＤ３３並びにカニクイザルＣＤ３３の両方に対し結合性を示す結合タンパク質が提供される。これらＣＤ３３／ＣＤ３のタンデムダイアボディは、健康なドナーからの多クローン性ＣＤ３+Ｔ細胞並びにＡＭＬ患者からの自己由来のＴ細胞を再指令することができ、低いＥ：Ｔ細胞比率でＣＤ３３+ＡＭＬ細胞を有効に溶解することが実施例において実証される。このプロセスは、ＣＤ３３+標的細胞およびＴ細胞の両方の存在に依存するが、ＣＤ２５とＣＤ６９の誘導によって示されるように、再指令されたＴ細胞が活性化され、増殖するために刺激される。これらのタンデムダイアボディの抗ＡＭＬ効果は、Ｅ：Ｔ細胞比率と同様に、使用された抗体の濃度に依存することが示される。タンデムダイアボディは四価であり、ＣＤ３３に対する２つの結合部位およびＣＤ３に対する２つの結合部位を有する。本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３のタンデムダイアボディの特徴は、各抗原、すなわちＣＤ３３、ＣＤ３との結合をもたらす二価結合性の結果、それらが有力で効率的なアポトーシスを促進するということである。
要するに、本明細書に記載した提供されるＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、特にタンデムダイアボディにおいて、ＣＤ３３+白血病細胞および原発性ＡＭＬ細胞の有力なインビトロでの細胞崩壊を引き起こす。タンデムダイアボディの抗体フォーマットでの二重特異性ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質の例では、細胞株中のインビボの原発性のＡＭＬ細胞、およびインビボのＡＭＬ細胞株、および被験体に由来する原発性ＡＭＬ細胞モデルでの細胞溶解活性を示す。これは厳密なＡＭＬ ＰＤＸモデルにおいて特に注目すべき高いインビボ活性を示す。さらに、タンデムダイアボディの抗体フォーマットでの二重特異性ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質の例は、新たに診断され、再発性であり、および難治性の患者を含む、ＡＭＬのすべての病期の患者からのサンプル中での細胞崩壊の生体外活性を実証する。
更に、本明細書に記載されたこれらのＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、約４時間以内にＣＤ３３発現細胞の有意な溶解を達成することができる。ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は従って、低いエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比率でも、細胞表面上の低いＣＤ３３密度でも、高い細胞毒性を示す。さらに、本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、ヒトタンパク質への有力なＣＤ３３およびＣＤ３結合親和性を示すのみならず、各カニクイザルタンパク質に対する優れた交差反応性をも示し、例えばヒト：カニクイザルのＫＤ比率は５－０．２の間である。さらに、本明細書に記載したＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、これらの分子の安全性プロフィールの必須コンポーネントであるＣＤ３３+標的細胞がない状態では、サイトカイン放出の有意の誘導を示さない。さらに、本明細書に記載するＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディは、およそ８－２４時間の近似範囲内に半減期を有する分子クラスに属し、このことは、利便性の良い投薬を可能にする。
１つの様相では、ヒトＣＤ３３のエピトープに特異的に結合するＣＤ３３結合タンパク質が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、結合タンパク質はヒト由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む少なくとも１つの結合部位を有し、軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－２７から成る群から選択される配列から成るＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３４から成る群から選択される配列から成るＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４１から成る群から選択される配列から成るＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む少なくとも１つの結合部位を有し、重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２－４８から成る群から選択される配列から成るＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９－５５から成る群から選択される配列から成るＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６－６３から成る群から選択される配列から成るＣＤＲ３を含む。
特定の例において、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る群から選ばれる：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２８および３５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、２９および３６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、３０および３７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３１および３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、３２および３９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、３３および４０；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３４および４１。
特定の例において、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３は、下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る群から選ばれる：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４９および５６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および５７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および５８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および５９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および６０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、５１および６１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、５２および６２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、５３および６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、５４および６３；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、５５および６３。
特定の例において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のヒトＣＤ３３結合部位は、下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯから成る群から選ばれる：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３エピトープは、ヒトＣＤ３３のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）アミノ酸残基６２－７０の内に存在する。
任意の上記実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は少なくとも１つの機能的領域をさらに含む。いくつかの例において、機能的領域はエフェクター細胞に結合するエフェクター領域である。特定の例において、エフェクター領域は、ヒトＣＤ３に対する抗原結合部位を形成する、少なくとも１つの抗体重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含むＣＤ３結合部位である。
特定の例において、ＣＤ３結合部位は、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列、およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）のＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む。他の場合では、ＣＤ３結合部位は、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む。
特定の例において、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の重鎖可変領域４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８の軽鎖可変領域、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９の軽鎖可変領域：６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０の軽鎖可変領域；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７の重鎖可変領域およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１の軽鎖可変領域を含む。
任意の上記実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は二量体のタンパク質である。任意の上記実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は多機能である。
特定の例において、多機能ＣＤ３３結合タンパク質は、ＣＤ３３とＣＤ３に対する二重特異性を有し、結合特異性は、下記配列番号から成る群から選ばれるＣＤ３３およびＣＤ３に対する重鎖可変領域および軽鎖可変領域によって提供される：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６６および７０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６６および７０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６６および７０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６７および７１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１７、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６７および７１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１８、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６７および７１；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、６４および６８。
別の様相では、ヒトＣＤ３およびヒトＣＤ３３に対し特異的な、二重特異性の抗原結合性タンデムダイアボディが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、タンデムダイアボディは第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは互いに結合し合う少なくとも４つの可変鎖領域を有し、各ポリペプチドはそれぞれ、ヒトＣＤ３３に対する特定の重鎖可変領域；ヒトＣＤ３３に対する特定の軽鎖可変領域；ヒトＣＤ３に対する特定の重鎖可変領域、およびヒトＣＤ３に対する特定の軽鎖可変領域を含み、各ポリペプチドにおいて、４つの可変鎖領域は、ペプチド・リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって次々に、下記の順序で結合される；ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ３－ＶＨ（ＣＤ３）；ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ３－ＶＬ（ＣＤ３）；ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ３－ＶＨ（ＣＤ３３）；またはＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ３－ＶＬ（ＣＤ３３）。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－２７から成る群から選ばれる配列から成るＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３４から成る群から選ばれる配列から成るＣＤＲ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４１から成る群から選ばれる配列から成るＣＤＲ３：３５－４１を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＨ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２－４８から成る群から選ばれる配列から成るＣＤＲ１：４２－４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９－５５から成る群から選ばれる配列から成るＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６－６３から成る群から選ばれる配列から成るＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、下記配列番号から成る群から選ばれる配列である：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２８および３５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２、２９および３６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、３０および３７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、３１および３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、３２および３９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、３３および４０；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、３４および４１。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３３に特異的なＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、下記配列番号から成る群から選ばれる配列である：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４９および５６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および５７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および５８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および５９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、５０および６０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、５１および６１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、５２および６２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、５３および６３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、５４と６３；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、５５および６３。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３に特異的なＶＬおよびＶＨ領域は、下記配列番号から成る群から選ばれる配列である：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３に特異的なＶＨ領域は、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列、および、ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）またはＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）のＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ヒトＣＤ３に特異的なＶＬ領域は、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３に特異的なＶＬおよびＶＨ領域は、下記配列番号から成る群から選ばれる配列である：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドはそれぞれ、下記配列番号から成る群から選ばれる４つの可変鎖領域を含む：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６５および６９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６６および７０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６６および７０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６６および７０；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６７および７１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１７、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６７および７１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１８、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６４および６８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６７および７１；並びにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、６４および６８。
いくつかの実施形態において、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は約１２以下のアミノ酸残基から成る。特定の例において、リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は、各々独立に、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）またはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）である。他の場合では、リンカーＬ１およびＬ３はＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）であり、リンカーＬ２は、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）あるいはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）である。
いくつかの実施形態において、二重特異性タンデムダイアボディは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８－１２１から成る群から選択された配列を有する。他の実施例では、二重特異性タンデムダイアボディは、タンデムダイアボディ ０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８），０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９），０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００），０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１），０５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２），０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３），０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４），０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５），０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６），１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７），１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８），１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９），１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０），１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１），１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２），１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３），１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４），１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５），１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６），２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７），２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８），２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９），２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０），または２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）である。
いくつかの実施形態において、二重特異性の抗原結合タンデムダイアボディは、ＨＬ－６０、ＫＧ－１およびＵ－９３７から選ばれるＣＤ３３+腫瘍細胞上のＣＤ３３に対し、１０ｎＭ以下の結合ＫＤを有する。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合タンデムダイアボディは、ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２－７０）内に存在するヒトＣＤ３３のエピトープに、特異的に結合する。
別の様相では、ＣＤ３３結合タンパク質をコード化するポリヌクレオチド、または、任意の上記実施例のうちの二重特異性タンデムダイアボディが本明細書で提供される。別の様相では、記載されるポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書で提供される。別の様相では、記載されるベクターで形質転換されたホスト細胞が本明細書で提供される。
さらに別の様相では、任意の上記実施形態のＣＤ３３結合タンパク質または二重特異性タンデムダイアボディ、および薬学的に許容可能なキャリヤを含む医薬品組成物が本明細書で提供される。
さらに別の様相において、任意の上記実施例のＣＤ３３結合タンパク質または二重特異性タンデムダイアボディを生産する方法が本明細書で提供され、該方法は、宿主細胞へ任意の上記実施形態のポリヌクレオチドがコード化するＣＤ３３結合タンパク質または二重特異性タンデムダイアボディ、または上記ポリヌクレオチドを含むベクターを導入する方法、ＣＤ３３結合タンパク質または二重特異性タンデムダイアボディが発現し、発現したＣＤ３３結合タンパク質または二重特異性タンデムダイアボディが精製される条件下で宿主細胞を培養する方法を含む。
さらに、任意の上記実施形態の二重特異性タンデムダイアボディのＣＤ３３+癌を患う個体への投与を含む、ＣＤ３３+癌の治療のための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３+癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ前駆細胞リンパ芽球性白血病、骨髄性肉腫、多発性骨髄腫、急性のリンパ腫、急性のリンパ芽球性リンパ腫あるいは慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３+癌は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３+癌は多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３+癌は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。
さらに、任意の上記実施形態の二重特異性タンデムダイアボディの、ＡＭＬを患う個体への投与を含む急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療のための方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、ＡＭＬは、再発性遺伝的異常を伴うＡＭＬ、骨髄形成異常関連の変化を伴うＡＭＬ、治療関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群と関係する骨髄性の増殖、芽細胞の形質細胞様樹状細胞新生物、またはその他の分類されないＡＭＬである。いくつかの実施形態において、ＡＭＬは、ＡＭＬ－Ｍ０、ＡＭＬ－Ｍ１、ＡＭＬ－Ｍ２、ＡＭＬ－Ｍ３、ＡＭＬ－Ｍ４、ＡＭＬ－Ｍ５、ＡＭＬ－Ｍ６あるいはＡＭＬ－Ｍ７である。さらなる実施例では、ＡＭＬは新しく診断され、再発され、難治性である。
さらに、任意の上記実施形態の二重特異性タンデムダイアボディのＭＤＳを患う個体への投与を含む、骨髄性形成障害症候群（ＭＤＳ）の治療のための方法が本明細書で提供される。
さらに、任意の上記実施形態の二重特異性タンデムダイアボディのＭＰＤを患う個体への投与を含む骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）の治療のための方法が本明細書で提供される。
さらに、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を患う個体への任意の上記実施形態の二重特異性タンデムダイアボディの投与を含む、ＣＭＭＬの治療のための方法が本明細書で提供される。
さらに、免疫抑制を患う個体への任意の上記実施形態の二重特異性タンデムダイアボディの投与を含む、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）による免疫抑制治療のための方法が、本明細書で提供される。
治療のための上記の方法において、特定の例では、該方法は、シタラビンおよびアザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、イダルビシン、アドリアマイシンなど）、アムサクリン、フルダラビン、クラファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ 、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシドなど）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、ピクサントロン、ロソクサントロン、ピロクサントロン、アメタントロンなど）、抗ＣＤ２０剤（例えばリツキシマブ、オクレリツマブ、オファツムマブなど）、またはこれらの組合せを投与することをさらに含む。
[本発明1001]
ヒトＣＤ33およびヒトＣＤ3に特異的な二重特異性タンデムダイアボディであって、前記タンデムダイアボディは第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは次々に接続された少なくとも4つの可変鎖領域を有し、各ポリペプチドは、
（ｉ）ヒトＣＤ33に特異的な可変重鎖（ＶＨ）領域；
（ｉｉ）ヒトＣＤ33に特異的な可変軽鎖（ＶＬ）領域；
（ｉｉｉ）ヒトＣＤ3に特異的なＶＨ領域、および
（ｉｖ）ヒトＣＤ3に特異的なＶＬ領域、
を含み、
各ポリペプチドにおいて、4つの可変連鎖領域が、下記の順序でペプチド・リンカーＬ1、Ｌ2およびＬ3によって次々に結合されることを特徴とする、二重特異性タンデムダイアボディ：
ＶＬ（ＣＤ3）－Ｌ1－ＶＨ（ＣＤ33）－Ｌ2－ＶＬ（ＣＤ33）－Ｌ3－ＶＨ（ＣＤ3）；
ＶＨ（ＣＤ3）－Ｌ1－ＶＬ（ＣＤ33）－Ｌ2－ＶＨ（ＣＤ33）－Ｌ3－ＶＬ（ＣＤ3）；
ＶＬ（ＣＤ33）－Ｌ1－ＶＨ（ＣＤ3）－Ｌ2－ＶＬ（ＣＤ3）－Ｌ3－ＶＨ（ＣＤ33）；または
ＶＨ（ＣＤ33）－Ｌ1－ＶＬ（ＣＤ3）－Ｌ2－ＶＨ（ＣＤ3）－Ｌ3－ＶＬ（ＣＤ33）。
[本発明1002]
ヒトＣＤ33に特異的なＶＬ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21－27から成る群から選ばれた配列から成るＣＤＲ1、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：28－34から成る群から選ばれた配列から成るＣＤＲ2、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35－41から成る群から選ばれた配列から成るＣＤＲ3：35－41を含む、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1003]
ヒトＣＤ33に特異的なＶＨ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：42－48から成る群から選ばれた配列から成るＣＤＲ1、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：49－55から成る群から選ばれた配列から成るＣＤＲ2、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：56－63から成る群から選ばれた配列から成るＣＤＲ3を含む、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1004]
ヒトＣＤ33に特異的なＶＬ領域のＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3は、下記から成る群から選択される配列である、本発明1002の二重特異性タンデムダイアボディ：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：21、28および35；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：22、29および36；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：23、30および37；
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：24、31および38；
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：25、32および39；
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：26、33および40；並びに
（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：27、34および41。
[本発明1005]
ＣＤ33に特異的なＶＨ領域のＣＤＲ1、ＣＤＲ2およびＣＤＲ3は、下記から成る群から選択される配列である、本発明1003の二重特異性タンデムダイアボディ：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：42、49および56；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：43、50および57；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：43、50および58；
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：43、50および59；
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：43、50および60；
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：44、51および61；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：45、52および62；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：46、53および63；
（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：47、54および63、並びに
（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：48、55および63。
[本発明1006]
ＣＤ33に特異的なＶＬ領域およびＶＨ領域は、下記から成る群から選択される配列である、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：11；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：12；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：13；
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：14；
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：15；
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：16；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：17；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：18；
（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：19；並びに
（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：20。
[本発明1007]
ヒトＣＤ3に特異的なＶＨ領域は、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：72）のＣＤＲ1配列、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫ Ｄ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：73）のＣＤＲ2配列、および、ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：74）またはＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：75）のＣＤＲ3配列を含む、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1008]
ヒトＣＤ3に特異的なＶＬ領域は、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：90）のＣＤＲ1配列、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：91）のＣＤＲ2配列、およびＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：92）のＣＤＲ3配列を含む、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1009]
ＣＤ3に特異的なＶＬ領域およびＶＨ領域は、下記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：から成る群から選ばれた配列である、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：64およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：68；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：65およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：69；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：66およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：70；並びに
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：67およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：71。
[本発明1010]
各ポリペプチドは、下記から成る群から選択される4つの可変鎖領域を含む、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ：
（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、12、65および69；
（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3、13、65および69；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、14、65および69；
（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5、15、65および69；
（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1、11、64および68；
（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、12、64および68；
（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：2、12、66および70；
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、14、66および70；
（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5、15、66および70；
（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3、13、64および68；
（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：3、13、67および71；
（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：4、14、64および68；
（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：5、15、64および68；
（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：7、17、64および68；
（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6、16、64および68；
（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：6、16、67および71；
（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：8、18、64および68；
（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9、19、64および68；
（ｘｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：9、19、67および71；並びに
（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：10、20、64および68。
[本発明1011]
リンカーＬ1、Ｌ2およびＬ3は約12以下のアミノ酸残基から成る、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1012]
リンカーＬ1、Ｌ2およびＬ3はそれぞれ、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：95）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：96）またはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：97）から独立して選択される、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1013]
リンカーＬ1およびＬ3は、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：95）であり、リンカーＬ2は、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：96）またはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：97）である、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1014]
タンデムダイアボディは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：98－121から成る群から選択される配列を有する、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ。
[本発明1015]
タンデムダイアボディは、タンデムダイアボディ01（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：98）、02（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：99）、03（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：100）、04（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：101）、05（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：102）、06（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：103）、07（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：104）、08（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：105）、09（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：106）、10（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：107）、11（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：108）、12（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：109）、13（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：110）、14（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：111）、15（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：112）、16（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：113）、17（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：114）、18（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：115）、19（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：116）、20（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：117）、21（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：118）、22（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：119）、23（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：120）、または24（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：121）である、本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディ
[本発明1016]
タンデムダイアボディは、ＨＬ－60、ＫＧ－1およびＵ－937から選択されるＣＤ33 ＋ 腫瘍細胞上のＣＤ33に対する10ｎＭ以下の結合Ｋ Ｄ を有する、本発明1001の二重特異性抗原結合タンデムダイアボディ。
[本発明1017]
タンデムダイアボディは、特異的にヒトＣＤ33の62ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ70（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：94）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：93のアミノ酸残基62－70）の内にあるヒトＣＤ33のエピトープに結合する、本発明1001の二重特異性抗原結合タンデムダイアボディ。
[本発明1018]
ＣＤ33 ＋ 癌の治療のための方法であって、
ＣＤ33 ＋ 癌を患う個体への本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディの投与を含むことを特徴とする方法。
[本発明1019]
ＣＤ33 ＋ 癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ前駆細胞リンパ芽球性白血病、骨髄性肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
ＣＤ33 ＋ 癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、本発明1018の方法。
[本発明1021]
ＣＤ33 ＋ 癌は、多発性骨髄腫である、本発明1018の方法。
[本発明1022]
ＣＤ33 ＋ 癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、本発明1018の方法。
[本発明1023]
前記方法は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ 、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ20剤、またはこれらの組合せを投与することをさらに含む、本発明1018の方法。
[本発明1024]
ＡＭＬは、再発性遺伝的異常を有するＡＭＬ、脊髄形成異常関連の変化を伴うＡＭＬ、治療関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群と関連する骨髄性の増殖、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、またはその他の分類されないＡＭＬである、本発明1020の方法。
[本発明1025]
ＡＭＬは、ＡＭＬ－Ｍ0、ＡＭＬ－Ｍ1、ＡＭＬ－Ｍ2、ＡＭＬ－Ｍ3、ＡＭＬ－Ｍ4、ＡＭＬ－Ｍ5、ＡＭＬ－Ｍ6、またはＡＭＬ－Ｍ7である、本発明1020の方法。
[本発明1026]
ＡＭＬは、新しく診断され、再発性、または難治性である、本発明1020の方法。
[本発明1027]
前記方法は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ 、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ20剤、またはこれらの組合せを投与することをさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1028]
骨髄性形成障害症候群（ＭＤＳ）の治療のための方法であって、ＭＤＳを患う個体への本発明1001の二重特異性タンデムダイアボディの投与を含むことを特徴とする方法。
[本発明1029]
前記方法は、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、アミサクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ20剤、またはこれらの組合せを投与することをさらに含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
骨髄由来の抑制細胞（ＭＤＳＣ）による免疫抑制の処置のための方法であって、免疫抑制を患う個体への本発明1001の任意の1つに基づく二重特異性タンデムダイアボディの投与を含むことを特徴とする方法。
参照による組込み
本明細書中で言及される出版物、特許、および特許出願はすべて、個々の出版、特許あるいは特許出願が詳細に且つ個別に示され参照によって組込まれるのと同程度に、言及によって本明細書に組込まれる。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲により詳細に述べられる。本発明の特徴および利点についてのよりよい理解は、発明の原理が利用される例証的な実施形態を記載した以下の詳細説明と、添付図面への言及によって得られるだろう：
遺伝子組成およびＣＤ３／ＣＤ３３タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））の領域順序を図式的に表現したものである。タンデムダイアボディが、短いペプチド・リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって連結された４つの可変領域から構成された単一のポリペプチドとして表現されている。発現後、２つのモノマーポリペプチドが、頭部と尾部とが非共有結合で接続して、機能的なホモダイマーのタンデムダイアボディ分子を形成する。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３：リンカー；ＶＨ：重鎖可変領域；ＶＬ：軽鎖可変領域。
ＣＤ３が結合したタンデムダイアボディとその反応の様子を示す。タンデムダイアボディは、ＣＤ３に結合することによって、細胞障害性Ｔ細胞と結合可能である四価の二重特異性タンパク質である。タンデムダイアボディは、４つの結合領域のうちの２つ結合領域でＣＤ３３+腫瘍細胞に結合し、他の２つの結合領域でＣＤ３と結合する。このＴ細胞／標的細胞結合（架橋）事象は、Ｔ細胞の活性化を促進し、ＡＤＣＣによる腫瘍細胞の後続の破壊を促進する。
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの領域順序の変異遺伝子配列コード化タンデムダイアボディ内の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）の領域順序の変異は、分子の内部または外部に位置するＣＤ３３およびＣＤ３特異性を備えた抗体の産生を可能にする。領域特定名、信号配列（ｓｓ）およびリンカー（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の位置、並びにアフィニティータグ（Ｈｉｓ）が、５’および３’－末端と同様に、示される。
健康ドナーＴ細胞の正の豊富化と負の選択との比較ＫＧ－１ａ細胞は、１０の選択されたタンデムダイアボディのうちの１つの１０ｐＭ（およそ１ｎｇ／ｍＬ）および２５ｐＭ（およそ２．５ｎｇ／ｍＬ）と、負の選択がされた健康ドナーＴ細胞または正の選択がされた健康ドナーＴ細胞のいずれかと、ここに示すように、Ｅ：Ｔ細胞比率が１：１または３：１でインキュベートされた。４８時間後、細胞数が決定され、細胞毒性がＤＡＰＩ染色で評価された。結果は、複製ウェル中で実行された３つの独立した実験から、死細胞（上方パネル）のパーセンテージおよび特定の細胞毒性（下方パネル）のパーセンテージに対する平均値±ＳＥＭとして示される。
分析方針１つの健康ドナーＴ細胞分画および１つの代表的なＡＭＬ細胞株（ＨＬ－６０）および原発性ＡＭＬ試料（ＡＭＰ００２）からの分散とヒストグラムのプロットがそれぞれ、タンデムダイアボディに誘発された細胞毒性を決定するために実施された実験方針を示している。ＦＳＣ、前方分散；ＳＳＣ、後方分散。
ＣＤ３３+ＡＭＬ細胞株におけるスクリーニング細胞毒性分析 親のＨＬ－６０（Ａ、Ｂ）およびＫＧ－１ａ（Ｃ、Ｄ）細胞が、２２のＣＤ３３／ＣＤ３のタンデムダイアボディ分子の１つまたは非結合性コントロールタンデムダイアボディ（００）の、１０ｐＭ（約１ｎｇ／ｍＬ）および２５ｐＭ（約２．５ｎｇ／ｍＬ）と、Ｔ細胞比率：１：１（Ａ、Ｃ）あるいは５：１（Ｂ、Ｄ）のいずれかの健康ドナーＴ細胞と共に、ここに示すように、インキュベートされた。４８時間後、細胞数が決定され、細胞毒性が、薬剤特異性細胞毒性を計量するためにＤＡＰＩ染色で評価された。結果は、複製ウェル中で実行された３つの独立した実験からのＤＡＰＩ+細胞のパーセンテージに対する平均値±ＳＥＭとして示される。細胞毒性が特定の細胞毒性のパーセンテージとして表現される場合、質的に同様の結果が得られた。
原発性ＡＭＬ試料の選択の研究原発性ヒトＡＭＬ試料の全体からの凍結した分画が、分析のために取得される。解凍時のＡＭＬ芽細胞のパーセンテージが、ＣＤ４５／側方散乱特性に基づいたフローサイトメトリーによって決定された。試料の生存率が、解凍時、およびサイトカイン含有の液体培養（タンデムダイアボディ分子または健康ドナーＴ細胞の添加なし）の４８時間後に、生存／死滅細胞マーカーとしてＤＡＰＩを使用するサイトフローメトリーによって決定された。解凍時および４８時間後の生存率の結果が、＞５８％のＡＭＬ芽細胞を有しているすべての試料に対して図示される。正方形：原発性のＡＭＬ試料であり、解凍時に＞５０％、および最終分析に含まれるサイトカイン含有液体培養の４８時間後も＞５０％の生存率を示した。
原発性ＡＭＬ試料中のタンデムダイアボディ誘導細胞毒性原発性ＡＭＬ試料は、ここに示すように、健康ドナーＴ細胞を添加しない９つのタンデムダイアボディ分子の１つ（Ａ）、またはＥ：Ｔ細胞比率が１：３（Ｂ）または１：１（Ｃ）の健康ドナーＴ細胞のいずれかの２．５ｐＭ（およそ２５０ｐｇ／ｍＬ）、１０ｐＭ（およそ１ｎｇ／ｍＬ）および２５ｐＭ（およそ２．５ｎｇ／ｍＬ）と共にインキュベートされた。４８時間後、細胞数が決定され、薬剤特異性の細胞毒性を定量するため、ＤＡＰＩ染色で細胞毒性が評価された。結果は、複製ウェル中で実行された試験から、特定の細胞毒性のパーセンテージに対する平均値±ＳＥＭとして示される。
ヒトＣＤ３３（ａａ１８－２５９）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）の細胞外領域の配列である； タンデムダイアボディ １（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）の完全な配列である； タンデムダイアボディ １９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）の完全な配列である； タンデムダイアボディ ２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）の完全な配列である。強調された配列はリンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３を表わす。
ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中のＨＬ－６０細胞の増殖に対するタンデムダイアボディ１６および１２の効果免疫不全のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの８つの実験群が、０日目に４ｘ１０６ＨＬ－６０細胞の懸濁液を皮下注射することによって異種移植された。注射に先立って、ＨＬ－６０細胞は健康ドナーからの３ｘ１０６の精製Ｔ細胞と混合された。腫瘍細胞とＴ細胞で移植された実験群の動物はすべて、ビヒクル（対照）またはタンデムダイアボディ１６または１２が、示されるとおり３種の異なる用量レベル（０．１μｇ、１μｇおよび１０μｇ）で、０、１、２、３および４日目に静脈内ボーラスがなされた。エフェクター細胞およびビヒクル治療を伴わない１つの群が、追加の陰性コントロールとして供された。
ＡＭＬ異種移植片モデル中のタンデムダイアボディ１６の抗腫瘍活性ＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスは、致死量の放射線が照射され（２Ｇｙ）、４ｘ１０６ＨＬ－６０細胞が皮下接種された。９日目に、動物に、抗ａｓｉａｌｏ ＧＭ１ラビットＡｂの単一ボーラスを行った。腫瘍が５０－１５０ ｍｍ３（平均７３±１１ ｍｍ３）の間の体積に到達したとき、その日に、１０の動物を３つの治療グループに振り分けた。グループ２および３（ｎ＝８）は、拡張し活性化された１．５ｘ１０７のヒトＴ細胞が腹腔内注射された。１３日目から２１日目（ｑｄｘｄ９）まで、動物は、側面の尻尾の静脈中へ、タンデムダイアボディ１６（グループ３）またはビヒクル（グループ１およびグループ２）が注入された。
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１２および１６の５μｇ（０．２５ｍｇ／ｋｇ）または５０μｇ（２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いた処置後の、骨髄（ＢＭ）および３８日目のＮＳＧマウスのひ臓中のヒトＡＭＬ芽細胞の相対量（Ａ）および絶対数（Ｂ）を示す。
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの１６の媒介標的細胞に対する溶解の動力学を示す。１ｘ１０４のカルセイン標識化ＨＬ－６０標的細胞が、エフェクター細胞としての原発性ヒトＴ細胞と共に、２５：１のＥ：Ｔ比率で、系列希釈されたタンデムダイアボディ１６の存在下または抗体（ｗ／ｏ）なしで、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間または５時間、インキュベートされた。各時点で、溶解された標的細胞から放出された蛍光性カルセインが、具体的な溶解量を算出するために使用された。３つの複製の平均およびＳＤをプロットした。
ＣＤ３３／ＣＤ３に対するＥＣ５０および特定溶解値の動力学を示す。ＥＣ５０値（黒円）およびタンデムダイアボディ１６－媒介標的細胞溶解（白抜き正方形）は、示された培養時間におけるカルセイン放出細胞毒性分析において、非線形回帰／Ｓ字形用量反応によって決定され、プロットされた。
新しく診断され、再発性、および難治性のＡＭＬ被験者のサンプル中の細胞毒性活性を示す。
第１の様相によれば、少なくともＣＤ３３、好ましくはヒトＣＤ３３に特異性を有する、結合タンパク質が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３３に対する特異性を有する、つまり、交差反応し得る。いくつかの実施形態において、これらの交差反応し得る結合タンパク質は、同様の親和性を持った、ヒトおよびカニクイザルＣＤ３３に結合する。
ＣＤ３３は、例えば急性骨髄白血病（ＡＭＬ）の芽細胞のように、骨髄性細胞上で発現する。ヒトＣＤ３３のようなＣＤ３３に対し特異的な抗体領域を単離するため、抗体ライブラリーがスクリーニングされ得る。例えば、ＩｇＭファージディスプレイライブラリーは、例えば、ヒトＣＤ３３の細胞外領域のアミノ酸１－２４３を含む組み換えＣＤ３３－Ｆｃ融合タンパク質を使用することによって、スクリーニングすることができる（図９Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む少なくとも１つのＣＤ３３結合部位を有する。軽鎖可変領域は軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域は重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、これらの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、表１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－４１）に示されるヒトＣＤＲ配列から選ばれる。特定の例において、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－２７から選ばれる。特定の例において、軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８－３４から選ばれる。特定の例において、軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５－４１から選ばれる。
いくつかの実施形態において、これらの重鎖ＣＤＲ（重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、表２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２－６３）に示されるヒトＣＤＲ配列から選ばれる。特定の例において、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２－４８から選ばれる。特定の例において、重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９－５５から選ばれる。特定の例において、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６－６３から選ばれる。
いくつかの実施形態において、軽鎖および重鎖ＣＤＲは、それぞれの可変領域を包囲するフレームワーク配列なしで選択され、それらは、他の免疫グロブリンからのフレームワーク配列または一致フレームワーク領域を含み、随意に、さらなる突然変異及び／又は他の適切なフレームワーク配列との交換がなされる。したがって、本明細書のいくつかの実施形態において、軽鎖可変領域を含むＣＤ３３結合タンパク質が提供され、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５である。
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変領域を含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変領域を含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変領域を含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変領域を含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変領域を含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は軽鎖可変領域を含み、軽鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７であり；軽鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４であり、および軽鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１である。
さらに、本明細書のいくつかの実施形態において、重鎖可変領域を含むＣＤ３３結合タンパク質が提供され、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３であり、および重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３である。いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は重鎖可変領域を含み、重鎖ＣＤＲ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８であり；重鎖ＣＤＲ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５であり、重鎖ＣＤＲ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３である。
さらなる実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は、表３に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１０から選ばれる軽鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質は、表４に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１－２０から選ばれる可変重鎖領域を含む。さらなる実施形態例では、ＣＤ３３結合タンパク質は、表３に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－１０から選ばれる軽鎖可変領域、および表４に示されるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１－２０から選ばれる可変重鎖領域を含む。
用語「結合タンパク質」は、抗原結合特性を有する免疫グロブリン派生物、すなわち、抗原結合部位を含んでいる免疫グロブリンポリペプチドまたはそのフラグメントを指す。結合タンパク質は、抗体の可変領域またはそのフラグメントを含む。各抗原結合領域は抗体、すなわち免疫グロブリン、同じエピトープに結合する可変重鎖領域（ＶＨ）および抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）によって形成され、可変重鎖領域（ＶＨ）は３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；および、軽鎖可変領域（ＶＬ）は３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。いくつかの例において、本明細書で述べたいくつかの実施形態に基づく結合タンパク質は、免疫グロブリン不変領域が欠けている。いくつかの例において、抗原結合部位を形成する可変軽鎖および重鎖領域は、互いと共有結合で結合され、例えば、ペプチド・リンカーや他の場合には、可変軽鎖および重鎖領域は、抗原結合部位を形成するために互いに非共有結合で接続する。用語「結合タンパク質」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ、タンデム単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）２、両特性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ（登録商標））、２重親和性再標的抗体（ＤＡＲＴ（商標））、ダイアボディおよびタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標）））を含む抗体フラグメントまたは抗体派生物に指す。更に、特定の例において、結合タンパク質は多価性、つまり、ＣＤ３に対する２、３、あるいはそれ以上の結合部位を有する。
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Figure 0007065149000002
Figure 0007065149000003
Figure 0007065149000004
Figure 0007065149000005
いくつかの実施形態において、ＣＤ３３に特異性を与える結合タンパク質は、表３および表４に示されるヒトＣＤ３３の結合部位を形成する、可変重鎖領域および可変軽鎖領域の下記の組合せのうちの１つから選択される。限定しない例は下記を含む：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１，（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２，（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３，（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４，（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５，（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６，（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７，（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８，（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９，ａｎｄ（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ ａｎｄ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０。
本明細書に、ＣＤ３３に特異性を有するだけでなく、同様にさらに少なくとも１つの機能領域も有する結合タンパク質が記載される。さらなる実施形態では、少なくとも１つのさらなる機能的領域は、エフェクター領域である。「エフェクター領域」は、エフェクター細胞に特異的な抗体の結合部位を含み、それは、細胞毒性、食作用、抗原提示、サイトカイン放出を刺激するか引き起こすことができる。そのようなエフェクター細胞は、例えば、限定的ではなく、Ｔ細胞である。特にエフェクター領域は、例えばヒトＣＤ３のような、Ｔ細胞上の抗原に対する抗原結合部位を形成する、少なくとも１つの抗体重鎖可変領域および少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤ３３結合タンパク質は多機能である。本明細書に使用されるように、多機能という用語は、結合タンパク質が２つ以上の異なる生物学的機能を示すことを意味する。例えば異なる生物学的機能は、異なる抗原に対する異なる特異性である。特定の例において、多機能のＣＤ３３結合タンパク質は多重特異性である、つまり、ＣＤ３３および１つ以上のさらなる抗原に対して結合特異性を持っている。特定の例において、結合タンパク質は、ＣＤ３３とＣＤ３に対し特異的な二重特異性である。そのようなダイアボディ結合タンパク質は、例えば、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧあるいはＩｇＭの二重特異性モノクローナル抗体、ダイアボディ、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、タンデム単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）２、例えば二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ（登録商標））、２重親和性再標的抗体（ＤＡＲＴ（商標））、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、およびｆｌｅｘｉｂｏｄｉｅｓを含む。
ある実施例では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ヒトＣＤ３に対する、およびいくつかの例ではカニクイザル ＣＤ３に対する特異性を有する。そのような結合部位の例は、表５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４－６７）に示される配列からのＶＨ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と、表６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８－７１）に示される配列からのＶＬ領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３とを含むポリペプチドである。特定の例において、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４の可変重鎖領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８の軽鎖可変領域：６８との組合せである。特定の例において、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５の可変重鎖領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９の軽鎖可変領域：６８との組合せである。特定の例において、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６の可変重鎖領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０の軽鎖可変領域：６８との組合せである。特定の例において、ＣＤ３結合部位は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７の可変重鎖領域と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１の軽鎖可変領域：６８との組合せである。
Figure 0007065149000006
Figure 0007065149000007
さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＳＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２）のＣＤＲ１配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３）のＣＤＲ２配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態例では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４）のＣＤＲ３配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＹＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５）のＣＤＲ３配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２－７４である、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、７３および７５である．ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む可変重鎖領域を有する。
さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＮＴＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６）、ＮＴＹＡＭＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７）およびＮＫＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）から成る群から選ばれるＣＤＲ１配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＲＩＲＮＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）、ＲＩＲＮＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＤＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０）、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＡＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１）、ＲＩＲＮＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＡＳＶＫＤ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）、ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３）およびＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＥＹＡＤＳＶＫＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４）から成る群から選ばれるＣＤＲ２配列を含む可変重鎖領域を有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＨＧＮＦＧＤＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５）、ＨＧＮＦＧＮＴＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６）、ＨＧＮＦＧＣＳＹＶＳＷＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７）、ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８）およびＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＦＦＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９）から成る群から選ばれるＣＤＲ３配列を含む可変重鎖領域を有する。
さらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、下記配列番号のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む可変重鎖領域を有する：それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、７３および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、７９および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８０および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８１および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８２および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８３および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、８３および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、８３および８５、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６、８３および８６、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、８３および７４、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２、８３および８７、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、７３および８８、またはそれぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８、８４および８９。
さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０）のＣＤＲ１配列を含む軽鎖可変領域を有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＧＴＮＫＲＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１）のＣＤＲ２配列を含む軽鎖可変領域を有する。さらなる実施形態では、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合部位は、ＡＬＷＹＳＮＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２）のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有する。さらなる実施形態では、ＣＤ３結合部位は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０－９２である、ＣＤＲ１、ＣＤ２およびＣＤ３配列を含む軽鎖可変領域を有する。
特定の例において、ＣＤ３結合部位はＣＤ３に対して高親和性を有する。代替的に、他の例において、重鎖領域および軽鎖領域からの、あるいは随意的に軽鎖可変領域および可変重鎖領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、例えば、ＵＣＨＴ１、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシツマブ（ＴＲＸ４）、テプリツマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリツマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）などのような、他のＣＤ３抗体に由来する。
別の様相において、本明細書に、ヒト化された、あるいは完全にヒトである、つまりヒト起源のＣＤ３３結合タンパク質、並びに二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質が記載される。
いくつかの実施形態において、二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３３とＣＤ３の可変軽鎖および重鎖領域による、ＣＤ３３およびＣＤ３特異性を提供する下記の組合せのうちの１つを有する：下記を含むが限定されない、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６５および６９、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６５および６９、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６５および６９、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６５および６９、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１、６４および６８、（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６４および６８、（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６６および７０、（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６６および７０、（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６６、７０、（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６４および６８、（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６７および７１、（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６４および６８、（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６４および６８、（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１７、６４および６８、（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６４および６８、（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６７および７１、（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１８、６４および６８、（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６４および６８、（ｘｉｘ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６７および７１、ならびに（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、６４および６８。
ＣＤＲ配列および重鎖および軽鎖領域の保存された変異
他の実施形態において、重鎖領域および軽鎖領域は、本明細書に記載するＣＤＲ配列の免疫学的に活性な同族体あるいは変異体を組込む。従って、いくつかの実施形態において、ＣＤ３３またはＣＤ３に結合する重鎖領域または軽鎖領域中のＣＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－６３または７２－９２で示されるアミノ酸配列と類似するが、同一ではない。特定の例において、ＣＤＲ変異配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１－６３または７２－９０の配列と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し、免疫学的に活性である。
さらなる例において、ＣＤＲ変異配列は、１、２、３、４、あるいは５の、保存されたアミノ酸置換を組込む。保存的置換は、所定のアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と置換するアミノ酸置換を含み、さらにアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの脂肪族アミノ酸の相互交換において、水酸基残留物セリンおよびトレオニンの相互交換、酸性の残基アスパルテートおよびグルタメートの交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンの間の置換、塩基性残基リジンおよびアルギニンの交換、および芳香族残基フェニルアラニンおよびチロシン中の置換を含んでいる。
さらなる例において、ＣＤＲ変異配列は、例えば安定性の増加、プロテアーゼに対する耐性及び／又はＣＤ３３に対する結合親和性のような、ＣＤＲの特性を増強する置換を組込む。
他の例において、ＣＤＲ変異配列は、非重要残基または非重要領域の残基を変更するために修飾される。重要でないアミノ酸は、例えば親和性成熟、ＣＤＲウォーキング、部位特定変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、フォトアフィニティーラベリングあるいはアラニン走査突然変異生成のような、既知の方法によって同定することができる。
さらに代替的な実施形態では、ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、本明細書で提供される重鎖および軽鎖領域配列の免疫学的に活発な同族体あるいは変異体ある、重鎖領域および軽鎖領域を含む。従って、いくつかの実施形態において、ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２０または６４－７１で表されたアミノ酸配列と類似するが、同一ではない、重鎖または軽鎖領域配列を含む。特定の例において、変異重鎖または軽鎖領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１－２０または６４－７１の配列と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有し、それらは免疫学的に活性である。
さらなる例において、変異重鎖または軽鎖領域配列は、１、２、３、４、あるいは５の保存されたアミノ酸置換を組込む。保存的置換は、所定のアミノ酸を同様の特性を有する別のアミノ酸と置換するアミノ酸置換を含み、さらにアラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンの脂肪族アミノ酸の相互交換において、水酸基残留物セリンおよびトレオニンの相互交換、酸性の残基アスパルテートおよびグルタメートの交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンの間の置換、塩基性残基リジンおよびアルギニンの交換、および芳香族残基フェニルアラニンおよびチロシンの置換を含んでいる。
さらなる例において、変異重鎖または軽鎖領域配列は、例えば安定性の増加、プロテアーゼに対する耐性及び／又はＣＤ３３に対する結合親和性のような、ＣＤＲの特性を増強する置換を組込む。
他の例において、Ｒ変異重鎖または軽鎖領域配列は、非重要残基または非重要領域の残基を変更するために修飾される。 重要でないアミノ酸は、例えば親和性成熟、ＣＤＲウォーキング、部位特定変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、フォトアフィニティーラベリングあるいはアラニン走査突然変異生成のような、既知の方法によって同定することができる。
ＣＤ３３およびＣＤ３二重特異性のタンデムダイアボディ
別の様相において、ＣＤ３３結合タンパク質あるいは二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質は、二量体、すなわちＣＤ３３とＣＤ３に対する抗原結合部位を備えた２つのポリペプチドを含む。
また他の様相において、本明細書で、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））のフォーマットの二量体の二重特異性ＣＤ３３およびＣＤ３結合タンパク質が提供される。そのようなタンデムダイアボディは、ホモ二量体化を可能にする単一の遺伝子構成（図１）における４つの抗体可変結合領域（２つの重鎖可変領域（ＶＨ）および２つの軽鎖可変領域（ＶＬ））を結合することによって構築される。そのようなタンデムダイアボディでは、リンカー長さは、分子がそれ自体で折り返して単鎖のダイアボディを形成することができないように可変領域の分子内対合を防ぐ長さであるが、別の鎖の相補的な領域とはむしろ対合することが強制されるような長さである。この領域は、対応するＶＨおよびＶＬ領域がこの二量体化中に対合するようにも配置される。単一遺伝子構成からの発現に続いて、２つの同一ポリペプチド鎖が、頭部と尾部とを合わせるように折り重ねられ、およそ１０５ ＫＤａの機能的な非共有結合のホモ二量体を形成する（図１）。分子間共有結合の欠如にもかかわらず、一度形成されたホモ二量体は高度に安定しており、そのままの状態を維持し、モノマー形態に戻らない。
タンデムダイアボディは、従来のモノクローナル抗体および他のより小さなダイアボディ分子に対する利点を呈する多数の特性を有している。タンデムダイアボディは、抗体可変領域だけを含んでおり、したがって、副作用あるいはＦｃ部分と結合し得る非特異性の相互作用を無くすように考慮される。例えば、Ｆｃ領域へ結合可能なＦｃ受容体は、白血球（例えば好塩基性細胞、Ｂ細胞、好酸球、ナチュラルキラー細胞、好中性球など）やクッパー細胞のような多数の細胞タイプ上で発見される。タンデムダイアボディはＣＤ３３およびＣＤ３それぞれに対する二価結合を可能にするので、結合力はＩｇＧのそれと同じである。およそ１０５ＫＤａのタンデムダイアボディの大きさは、ＩｇＧより小さく、腫瘍浸透の増強を可能にするかもしれない。しかしながら、このサイズは、ファーストパス・クリアランスのための腎閾値を十分上回っており、より小さな二重特異性形態と比較して、抗体結合領域または非抗体スキャフォールドに基づく、薬物動態学的な長所を有している。さらに、タンデムダイアボディは、より長い内因性半減期と迅速な細胞毒性とをもたらすこの薬物動態学と結合力特性に基づき、ＢｉＴＥまたはＤＡＲＴ分子のような他の二重特異性結合タンパク質よりも有利である。タンデムダイアボディは、ホスト細胞中、例えば哺乳類のＣＨＯ細胞中で、よく発現する。堅実な上流および下流の生成工程は、タンデムダイアボディに利用可能であることが考慮される。
本明細書に記載されるＣＤ３３およびＣＤ３の二重特異性タンデムダイアボディは、細胞障害性Ｔ細胞の補充によるＣＤ３３+腫瘍細胞を特定の標的にすることを可能にすることを意図している。このことは、単独の抗原を対象とする完全長さを有し、かつ細胞障害性Ｔ細胞を直接補充することができない抗体と比較して、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介細胞毒性）を向上させる。反対に、特にこれらの細胞上で発現したＣＤ３分子と結合することによって、タンデムダイアボディは、高度に特異的な方法で、ＣＤ３３+腫瘍細胞に、細胞障害性Ｔ細胞を交差結合させることができ、それによって、そのような分子の細胞毒性能力を著しく増大させる。この機構は図２に概説される。タンデムダイアボディは、強力で、特異的および効率的なＡＤＣＣを示す。
Ｔ細胞が、腫瘍成長の制御に役割を果たせることが報告されている。例えば、ＮＨＬ患者からのリンパ節と同様に、結腸直腸腫瘍中の細胞障害性Ｔ細胞の存在が、より良好な臨床結果と関連することが示された。更に、Ｔ細胞応答を引き起こすことを目指した治療の可能性は、Ｔ細胞活性の失活制御であるＣＴＬＡ－４を対象とする抗体と同様に、黒色腫ワクチン剤に対しても実証された。本明細書に記載されたタンデムダイアボディは、表面に発現されたＣＤ３に結合することによって細胞障害性Ｔ細胞と結合し、それによりＴ細胞受容体の一部を形成する。特定の腫瘍細胞の表面上で発現したＣＤ３およびＣＤ３３に対するこのタンデムダイアボディの同時的結合は、Ｔ細胞活性化を引き起こし、後続する腫瘍細胞の溶解を媒介する（図２）。
したがってさらなる様相において、タンデムダイアボディは多重特異性である。いくつかの実施形態において、多重特異性タンデムダイアボディは、２、３あるいはそれ以上の異なるエピトープに対して特異性を有し、２つ以上のエピトープは、同じ抗原標的でもよく、あるいは異なる抗原標的でもあり得る。特定の実施形態において、多重特異性タンデムダイアボディは、二重特異性であり、四価、つまり４つの抗原結合部位を含む。そのような二重特異性タンデムダイアボディは、少なくとも１つの抗原結合部位で、ヒトＣＤ３およびヒトＣＤ３３に結合し、特定の例において、ヒトＣＤ３に対する２つの抗原結合部位およびヒトＣＤ３３に対する２つの他の抗原結合部位によって、タンデムダイアボディは結合する。つまり、タンデムダイアボディは、各抗原と二価結合する。
いくつかの実施形態において、二重特異性抗原結合タンデムダイアボディはヒトＣＤ３３およびヒトＣＤ３に特異的であり、前記タンデムダイアボディは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、次々に接続する少なくとも４つの可変鎖領域を有し、各ポリペプチドはそれぞれ以下を含む；（ｉ）ヒトＣＤ３３に特異的な可変重鎖（ＶＨ）領域；（ｉｉ） ヒトＣＤ３３に特異的な可変軽鎖（ＶＬ）領域；（ｉｉｉ） ヒトＣＤ３に特異的なＶＨ領域、および（ｉｖ）ヒトＣＤ３に特異的なＶＬ領域。
特定の実施形態において、二重特異性タンデムダイアボディは、特にヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２－７０）の内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに結合する。特定の例において、そのようなタンデムダイアボディは第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは次々に接続する少なくとも４つの可変鎖領域を有し、各ポリペプチドは以下を含む；（ｉ）それぞれヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２－７０）の内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的な可変重鎖領域；（ｉｉ）ヒトＣＤ３３の６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のアミノ酸残基６２－７０）の内にあるヒトＣＤ３３のエピトープに特異的な軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）ヒトＣＤ３に特異的な可変重鎖領域、および（ｉｖ）ヒトＣＤ３に特異的な可変軽鎖領域。
他の実施形態において、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤを備えたＣＤ３３+細胞上のＣＤ３３に対する親和性を有しているＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディが本明細書に記載される。ＣＤ３３+細胞は、例えばＨＬ－６０やＫＧ－１のような腫瘍細胞から選ぶことができる。
更なる実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディはＣＤ３と結合し、特定の例において、ＣＤ３+細胞上のＣＤ３のε鎖、特にＴ細胞と、１０ ｎＭ以下、５ ｎＭ以下、あるいは２ ｎＭ以下のＫＤで結合する。
いくつかの実施形態において、二重特異性タンデムダイアボディのポリペプチドはそれぞれ、４つの可変鎖領域の以下の組合せのうちの１つを含む：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６５および６９、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６５および６９、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６５および６９、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６５および６９、（ｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、１１、６４および６８、（ｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６４および６８、（ｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、１２、６６および７０、（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６６および７０、（ｉｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６６、７０および（ｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６４および６８、（ｘｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、１３、６７および７１、（ｘｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、１４、６４および６８、（ｘｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、１５、６４および６８、（ｘｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、１７、６４および６８、（ｘｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６４および６８、（ｘｖｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、１６、６７および７１、（ｘｖｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、１８、６４および６８、（ｘｖｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６４および６８、（ｘｉｘ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、１９、６７および７１、ならびに（ｘｘ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、２０、６４および６８。
本明細書に使用されるように、「二量体」は２つのポリペプチドの複合体を指す。特定の実施形態において、特に２つのポリペプチド間に共有結合がないという条件で、２つのポリペプチドが互いに非共有結合する。特定の例において、２つのポリペプチドは、二量体の安定化を支援するために形成されるジスルフィド結合のような、共有結合を有する。特定の実施形態では、二量体はホモダイマー、つまり２つの同一ポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」は、アミド結合によって結合されたアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチドは、特定の例において、単一鎖の融合タンパク質であり、分枝を持たない。ポリペプチドにおいて、可変抗体領域は次々に結合している。ポリペプチドは、他の例において、可変領域のＮ末端及び／又はＣ末端残基に付加した、連続するアミノ酸残基を有し得る。例えば、そのような連続するアミノ酸残基は、タグ配列を、ある例ではＣ末端に含んでもよく、それはポリペプチドの精製および検出のために役立つように考慮される。
１つの様相では、二重特異性タンデムダイアボディのポリペプチドはそれぞれ４つの可変領域、ＣＤ３結合タンパク質の可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）、および、ＣＤ３結合タンパク質の可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）を含む。
ある実施例では、４つの可変領域が、ペプチド・リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３によって結合され、いくつかの例において、Ｎ末端からＣ末端への配列は、以下のとおりである：領域順序：（１）ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ３－ＶＨ（ＣＤ３）；あるいは（２）ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ３－ＶＬ（ＣＤ３）；あるいは（３）ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ３－ＶＨ（ＣＤ３３）；あるいは（４）ＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ１－ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ２－ＶＨ（ＣＤ３）－Ｌ３－ＶＬ（ＣＤ３３）。
リンカーの長さは、報告された研究によれば、抗原結合タンデムダイアボディの柔軟性に影響を及ぼす。従って、いくつかの実施形態において、ペプチド・リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３の長さは、１つのポリペプチドの領域が、二量体抗原結合タンデムダイアボディを形成するために、別のポリペプチドの領域と分子間結合することができるような長さである。特定の実施形態では、そのようなリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアミノ酸残基から成る。したがって、特定の例において、リンカーは約１２以下のアミノ酸残基から成る。アミノ酸残基が０の場合、リンカーはペプチド結合である。そのような短いリンカーは、異なるポリペプチドの抗体可変軽鎖領域と抗体可変重鎖領域との間での結合および正確な抗原結合部位を形成することによる、２つのポリペプチドの分子間二量体化を支持する。リンカーを約１２以下のアミノ酸残基に短縮することは、一般に、同じポリペプチド鎖の隣接領域が互いに分子間干渉するのを防止する。いくつかの実施形態において、これらのリンカーは、約３から約１０まで、例えば４、５または６の連続するアミノ酸残基からなる。
リンカーのアミノ酸組成については、２つのポリペプチドの二量体化の妨げにならないペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリン残基を含むリンカーは一般に、プロテアーゼ抵抗性を提供する。リンカーのアミノ酸列は、抗原結合力および抗原結合ポリペプチド二量体の生産性を改善するため、例えばファージディスプレー法によって最適化することができる。いくつかの実施形態中のタンデムダイアボディに適しているペプチド・リンカーの例は、ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）、ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）あるいはＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）である。
［０１０２］ 本明細書に記載されるようなタンデムダイアボディの限定的でない例は、抗ＣＤ３３ ＶＬおよびＶＨ領域、抗ＣＤ３ ＶＬおよびＶＨ領域、領域順序、および表７に従うリンカーを有するタンデムダイアボディである。
Figure 0007065149000008
Figure 0007065149000009
いくつかの実施形態では、タンデムダイアボディは、図９Ｂから９Ｙに表されるようにタンデムダイアボディ０１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）、０２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）、０３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）、０５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）、０６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）、０７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）、０８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、０９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、１０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）、１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）、１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０）、１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）、１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２）、１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）、１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４）、１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５）、１９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６）、２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７）、２１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８）、２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９）、２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０）、または２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１）である。
本明細書に記載された、ＣＤ３３結合タンパク質およびＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性の結合タンパク質（例えばＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性タンデムダイアボディ）は、いくつかの実施形態では、抗原結合タンデムダイアボディを形成するために別の同一のポリヌクレオチドと結合してタンデムダイアボディのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを発現することで生成される。したがって、別の態様は、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡである。
ポリヌクレオチドは、ペプチドリンカーで分離された、または、他の実施形態では、ペプチド結合によって、適切なプロモータおよび選択的に適切な転写ターミネータと作動的に連結した単一の遺伝子的な構築体と直接的に連結された、少なくとも４つの抗体可変領域をコード化する遺伝子を結合し、およびこれをバクテリアまたは例えばＣＨＯ細胞などの他の発現システムで発現するような、既知の方法で構築される。利用されたベクターシステムおよびホストに依存して、任意の数の適切な転写、および恒常的および誘導性のプロモータを含む翻訳要素を使用してもよい。それぞれのホスト細胞でポリヌクレオチドの発現を駆り立てるように、プロモータは選択される。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、さらなる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。既知の方法に従ってこの組み換え型のベクターを構築することができる。
様々な発現ベクター／ホストシステムが、記載された抗原結合タンデムダイアボディのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含有し発現するために、利用可能である。Ｅ．ｃｏｌｉの発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４） ２８５（１）：１１１－２７）、または、哺乳動物の細胞中の発現のためのｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
したがって、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディは、いくつかの実施形態では、上記に記載されるようなポリペプチドをコード化するベクターをホスト細胞へ導入し、およびポリペプチド鎖が発現され、分離され、および随意に、さらに精製される条件下で前記ホスト細胞を培養することにより生成される。
他の態様では、本明細書に記載されたＣＤ３３結合タンパク質またはＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性の結合タンパク質（例えばＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性タンデムダイアボディ）は、修飾を有する。典型的な修飾は、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、薬物接合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合の架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、フォルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、例えばアルギニル化などの、転移ＲＮＡに媒介されたタンパク質へのアミノ酸の追加、およびユビキチン化を含む。さらなる実施形態では、ＣＤ３３結合タンパク質またはＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性結合タンパク質は、リーダーまたは分泌性の配列、またはポリペプチドの精製のための配列など付加的なアミノ酸で修飾される。
他の態様では、ＣＤ３３結合タンパク質、抗原結合タンデムダイアボディ、抗原結合タンデムダイアボディのポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含むベクターまたはこのベクターで形質転換されたホスト細胞および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が本明細書において提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」は、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性を妨げない、およびそれが投与される患者に有毒ではない任意の担体を含む。適切な製薬の担体の例は当該技術分野において公知であり、リン酸塩緩衝食塩水溶液、水、油／水の乳剤などの乳剤、様々なタイプの加湿薬、無菌液などを含む。そのような担体は従来の方法で処方することができ、適切な投与量で被検体に投薬することができる。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物はまた、防腐剤、乳化剤および分散剤などの補助剤を含み得る。微生物の活動の防止は様々な抗菌物質および抗真菌物質の封入で確実にされ得る。
ＣＤ３３およびＣＤ３への高親和性の結合を有する二重特異性ＣＤ３３／ＣＤ３結合タンパク質は、多くの主要なＡＭＬ試料において高度に活性であり、これらの分子が、最小のＣＤ３３発現の場合であっても細胞遺伝学的な／分子の疾患スペクトル全体にわたってヒトＡＭＬに対して活性であり得ることを示唆する。注目すべきことに、薬剤に特異的な細胞毒性は残余の自己由来のＴ細胞がある状態でも観察され、制御された量の健康なドナーＴ細胞の追加によって著しく増大する（実施例６を参照）。
ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性の結合タンパク質は、特定のタンデムダイアボディで、ＣＤ３３＋白血病細胞の有力な細胞崩壊をインビトロで引き起こす場合がある。データは、ＣＤ３３およびＣＤ３の両方への高親和性の結合が、二重特異性のタンパク質に引き起こされたＴ細胞活性化および抗ＡＭＬ効果を最大化することを示す。本明細書に記載されたタンデムダイアボディなどの、高親和性のＣＤ３３／ＣＤ３に配向された二重特異性結合タンパク質は、主要なＡＭＬの細胞崩壊の活性をインビトロで示す。したがって、これらの二重特異性結合タンパク質およびタンデムダイアボディは、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）または、例えば骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、または骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）などの他の血液系悪性腫瘍の処置のための治療の手法に適している。
したがって、ＣＤ３３＋癌（例えば急性骨髄白血病（ＡＭＬ））、疾患または疾病の処置のために、被検体（例えば患者）に、本明細書で上記に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディを有効量で投与する方法が本明細書において提供される。ＣＤ３３＋癌は、限定されないが、急性骨髄白血病などの急性白血病、Ｂ前駆細胞リンパ芽球性白血病を含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄性肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性リンパ腫などの急性リンパ腫、慢性骨髄単球性白血病などを含む。ＣＤ３３＋疾患および疾病は、特定の癌および慢性炎症における骨髄由来の抑制細胞（ＭＤＳＣ）に起因する免疫抑制の状態または環境を含む。
いくつかの実施形態では、急性骨髄白血病（ＡＭＬ）の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の実施形態では、急性骨髄白血病サブタイプの処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
ＦＡＢ分類システムは、ＡＭＬを８つのサブタイプに分ける：ＡＭＬ－Ｍ０（最小限の分化）、ＡＭＬ－Ｍ１（成熟を伴わない）、ＡＭＬ－Ｍ２（顆粒白血球の成熟を伴う）、ＡＭＬ－Ｍ３（前骨髄球または急性前骨髄球性白血病）、ＡＭＬ－４（急性骨髄単球性白血病）、ＡＭＬ－Ｍ５（急性単芽球性または単球性白血病）、ＡＭＬ－Ｍ６（急性の赤白血病）およびＡＭＬ－Ｍ７（急性の巨核芽球性白血病）。特定の場合には、ＡＭＬ－Ｍ０、ＡＭＬ－Ｍ１、ＡＭＬ－Ｍ２、ＡＭＬ－Ｍ３、ＡＭＬ－Ｍ４、ＡＭＬ－Ｍ５、ＡＭＬ－Ｍ６またはＡＭＬ－Ｍ７の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
ＷＨＯ ＡＭＬ分類スキームは、次のサブタイプに従ってＡＭＬを体系化する：再発性遺伝的異常を有するＡＭＬ、脊髄形成異常関連の変更を有するＡＭＬ、療法関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄性の増殖、芽細胞の形質細胞様樹状細胞新生物、および他の点では分類されないＡＭＬ。特定の他の場合では、再発性遺伝的異常を有するＡＭＬ、脊髄形成異常関連の変更を有するＡＭＬ、療法関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群に関連する骨髄性の増殖、芽細胞の形質細胞様樹状細胞新生物、または他の点では分類されないＡＭＬの処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
他のいくつかの実施形態では、新しく診断された、再発性、または難治性のＡＭＬの処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
さらなる実施形態では、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）などの前白血病血液疾患の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の場合には、ＭＤＳの処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の場合には、ＭＰＤの処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
他の実施形態では、多発性骨髄腫の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらなる実施形態では、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
他の実施形態では、骨髄由来の抑制細胞（ＭＤＳＣ）を抑制または排除するために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。ＭＤＳＣは、一定の分離された病変組織中でＣＤ３３を大幅に過剰発現させ、強い免疫抑制性の活性を有する。特定のヒトの癌（ＣＤ３３＋、および非ＣＤ３３＋）では、ＭＤＳＣは増殖し、活性化され、腫瘍に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を抑制し、Ｔｒｅｇ細胞を誘導し、腫瘍または癌が微小環境で成育することを可能にする。慢性炎症では、ＭＤＳＣは報告によれば増殖し、炎症部位で発見されＴ細胞免疫機能を抑制する。他の実施形態では、ＭＤＳＣに関連する疾病の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実施形態では、免疫抑制の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実施形態では、ＭＤＳＣで抑えられた炎症の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実施形態では、ＭＤＳＣに引き起こされた、低下した免疫反応の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実施形態では、ＭＤＳＣによって促進される癌の血管形成、腫瘍侵入、または転移の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実施形態では、ＭＤＳＣによって増強されるか、増大されるか、悪化するか、増加された癌または腫瘍の処置のために、本明細書に記載されるような抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
本明細書に記載された抗原結合タンデムダイアボディは、医薬品としての使用のために考慮される。投与は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、または皮内の投与などの異なる方法によって実施される。いくつかの実施形態では、投薬の経路は、治療法の種類および薬学的な組成物に含有される化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医および他の臨床の要素で判断されることになる。任意の１人の患者のための量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、時間、および投与経路を含む多くの要素、療法の種類、公衆衛生、および同時に投与されている他の薬剤に依存する。「有効投与量」とは、その疾患のコースおよび重症度に影響を与え、そのような病理の軽減または緩解に結びつくのに十分な量の有効成分を言うものとする。既知の方法を使用して、ＡＭＬを処置および／または予防するのに有用な「有効投与量」を判断してもよい。
さらなる実施形態では、ＣＤ３３＋癌、疾患または疾病への標準的治療と組み合わせて、本明細書に記載された抗原結合タンデムダイアボディが投与される。標準的な治療法は、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、放射、手術、遺伝子治療などを含む。特定の実例では、標準のＡＭＬ療法と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の実例では、シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど）、アムサクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレキセート、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシドなど）、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、ピクサントロン、ロソキサントロン、ピロキサントロン、アメタントロンなど）、抗ＣＤ２０薬剤（例えばリツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、またはそれらの組み合わせ）と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の実例では、シタラビン（ａｒａ－Ｃ）と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の実例では、アザシチジンと組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。特定の実例では、デシタビンと組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらなる実例では、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン、イダルビシン、ドキソルビシンなど）と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。他の実例では、チェックポイント阻害剤（例えばＰＤ－１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤など）と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実例では、エピポドフィロトキシン（例えばエトポシド、テニポシドなど）と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。さらに他の実例では、アントラセンジオン（例えばミトキサントロン、ピクサントロン、ロソキサントロン、ピロキサントロン、アメタントロンなど）と組み合わせて、本明細書に記載された、抗原結合タンデムダイアボディが投与される。
下記の実施例はさらに、本発明の範囲を制限せずに、記載される実施形態を示す。
実施例１
一本鎖Ｆｖ抗体をコード化するＤＮＡ発現構築体のクローン化
Ｅ．ｃｏｌｉ中の抗ＣＤ３３一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体のバクテリアの発現のために、すべての分子のＤＮＡコード配列がバクテリアの発現ベクターへクローン化された。すべての発現構築体は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）－タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）のための暗号配列を含むように設計され、ペリプラスムへの抗体分泌および精製をそれぞれ促進する。すべての抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖクローンからのＶＬおよびＶＨ領域のアミノ酸配列は、表３および表４において示される。
組換えの抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ抗体のＥ．ｃｏｌｉ中の発現
Ｅ．ｃｏｌｉペリプラスム中の可溶の分泌されたタンパク質として、組換えのｓｃＦｖ抗体が発現された。最初の工程で、アンピシリンが追加された小さな培地は、変形したバクテリアの接種を受けて、２８℃で１６時間インキュベートされた。続いて、アンピシリンが追加された第２の培地を加えることにより、光電密度が調節され、６００ｎｍで０．６－０．８の範囲内の光電密度に到達するまで、２８℃でもう一度培養された。タンパク質発現は、５０μＭ ＩＰＴＧの追加および２１－２８℃培養物のインキュベーションおよび１６時間以内の２００ｒｐｍ処理を通じて引き起こされた。インキュベーションに続いて、細胞はペレットにされ（３０分、４℃、７５００ｒｐｍ）、さらなる処理まで－２０℃で保存された。
抗ＣＤ３３一本鎖Ｆｖ抗体の精製
組換えのｓｃＦｖは、細菌細胞培養の遠心分離の後、緩衝液中に細胞ペレット剤を再懸濁し、緩やかに撹拌しながら室温で３０分インキュベートすることによってＥ．ｃｏｌｉペリプラスムから抽出された。細胞はペレットになり、組換えタンパク質を含んでいる上清が保存された。上清がプールされる前に、その手順がもう一度繰り返され、超音波処理で均質化された。ホモジェネートは希釈され、低濃度のイミダゾールが追加され、あらかじめ包装され、固定された金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に載置された。カラムはベースラインが到達されるまで洗浄され、その後に、結合されたタンパク質がイミダゾール緩衝液で溶出された。抗体を含んでいる部分はプールされ、続いてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で精製された。最終的に、タンパク質溶出物は、限外濾過で濃縮され、保管緩衝液に対して透析された。低ｐＨ処置（３７℃で２０－２４時間のｐＨ３．０のインキュベーション）の後に続き、サンプルはトリスを使用して中和された。精製されたタンパク質は小分けにして、使用まで－８０℃で保存された。
実施例２
タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））をコード化するＤＮＡ発現構築体のクローン化
ＣＨＯ細胞の二重特異性タンデムダイアボディの発現のために、すべての分子のコード配列が、哺乳類発現ベクターシステムへクローン化された。表７および図３に示されるように組織化された領域を用いて、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ領域と結合してＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディを構築するために、実施例１の抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖ領域が使用された。手短に述べると、ペプチドリンカー（ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ）で分離された抗ＣＤ３３ ＶＨおよびＶＬ領域をコード化する遺伝子配列が合成されサブクローン化された。結果として生じる構築体は消化され、リンカー配列内にあるＢａｍ ＨＩ制限部位を利用して、分離したＶＨおよびＶＬをコード化する配列が生成された。これらのＶＨおよびＶＬのフラグメントは、その後、抗ＣＤ３（ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＶＨ）のＶＨおよびＶＬの領域をコード化するＤＮＡフラグメントと連結され、最終の構築体が産出された。ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの領域オーダー変異体（Ｄｏｍａｉｎ ｏｒｄｅｒ ｖａｒｉａｎｔｓ）１から３が図３に示される。すべての発現構築体は、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端ヘキサヒスチジン（６ｘＨｉｓ）－タグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）のためのコード化配列を含むように設計され、抗体分泌および精製をそれぞれ促進する。
安定してトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中のタンデムダイアボディの発現
ＣＨＯ細胞発現システム（Ｆｌｐ－Ｉｎ（登録商標），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、すなわちＣＨＯ－Ｋ１ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）（Ｋａｏ ａｎｄ Ｐｕｃｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６８；６０（４）：１２７５－８１）の誘導体が使用された。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで提供される標準の細胞培養プロトコルに従って、付着細胞は二次培養された。
懸濁液中での増殖への適応のために、細胞は組織培養フラスコから分離され、無血清培地に配置された。懸濁液適応細胞は、１０％のＤＭＳＯを有する培地で凍結保存された。
分泌されたタンデムダイアボディを安定して発現する組換えのＣＨＯ細胞株は、懸濁液適応細胞のトランスフェクションで生成された。抗生物質ヒグロマイシンＢを用いた選択中に、生細胞密度が週に二度測定され、細胞は遠心分離され、０．１ｘ１０６生細胞／ｍＬの最大密度で、新鮮な選択培地で再懸濁された。細胞プールを安定して発現するダイアボディは、選択の２－３週間後に回復され、その時点で振盪フラスコ中の標準培地に細胞を移された。組換え型の分泌されたタンパク質の発現は、タンパク質ゲル電気泳動またはフローサイトメトリーの実行により確認された。安定した細胞プールは、ＤＭＳＯを含んでいる培地で凍結保存された。
タンデムダイアボディは、細胞培養の上清の中への分泌によって安定なトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株の、１０日間の流加培養物内で生成された。細胞培養の上清は１０日後に採取され、培養生存率は典型的には７５％を超えている。隔日で生産培養からサンプルが収集され、細胞密度と生存率が評価された。採取日に、細胞培養の上清はさらなる使用の前に遠心分離と吸引濾過で取り除かれた。
細胞培養の上清中のタンパク質発現滴定濃度および生成物の完全性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析された。
タンデムダイアボディの精製
タンデムダイアボディは、二段階のプロセスでＣＨＯ細胞培養の上清から精製された。第１段階ではＨｉｓ６タグを付けられた（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２）構築体はＮｉ－ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗクロマトグラフィーに供され、その後第２段階でＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００の上で調製用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で処理された。溶出されたタンデムダイアボディはそれらのホモダイマー（タンデムダイアボディ）内容物に対して特徴づけられ、ホモダイマー内容物が９０％以上であった場合プールされた。最終的に、プールされたサンプルは緩衝液交換され、＞１ｍｇ／ｍＬの典型的な濃度への限外濾過で濃縮された。最終的なサンプルの純度および均一性（典型的に＞９０％）はそれぞれ、還元条件および非還元条件下のＳＤＳ ＰＡＧＥ、続いて抗Ｈｉｓタグ抗体を使用する免疫ブロット法に加えて分析的なＳＥＣで評価された。精製されたタンパク質は、使用まで－８０℃で小分けにして保存された。
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディのポリペプチドは表７および図３に示される。タンデムダイアボディはそれぞれ２つの同一のポリペプチド（図１）から成る。外部のリンカーＬ１およびＬ３の両方は６つのアミノ酸ＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）で構成され、他方で、中央のペプチドリンカー２は、それぞれ、配列ＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、ＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）またはＧＧＳＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）で長さ（４－６のアミノ酸）が変化した。
一連の抗ＣＤ３３可変領域および抗ＣＤ３可変領域を使用して、トランスフェクトされた細胞株で安定して生成可能で、および体温において、および反復する凍結／解凍サイクル後も安定性を維持する、多くのタンデムダイアボディ分子が生成された。さらなる開発および症状発現前の毒性学研究を促進するために、人間およびカニクイザルの両方のＣＤ３３に結合を示したタンデムダイアボディ分子の選択に重点が置かれた。完全なアミノ酸配列の例はそれぞれ、図９Ｍ、９Ｏおよび９Ｑにおいて、タンデムダイアボディ１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）、１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１）および１６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３）の一本鎖で示される。この実施例において、可変領域の順序およびそれらの構造のためのリンカーは以下の通りである：ＶＬ（ＣＤ３）－Ｌ１－ＶＨ（ＣＤ３３）－Ｌ２－ＶＬ（ＣＤ３３）－Ｌ３－ＶＨ（ＣＤ３）。
実施例３
フローサイトメトリーによる抗体親和性の測定
細胞は、系列希釈された１００μＬのＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディとインキュベートされた。ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄された後、細胞は、氷上で４５分、同様な緩衝液中の０．１ｍＬの１０μｇ／ｍＬマウス単クローンの抗Ｈｉｓ抗体とインキュベートされた。２番目の洗浄サイクルの後に、以前と同様の条件下で、細胞は、１５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣを結合したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の０．１ ｍＬとインキュベートされた。対照として、細胞は、抗Ｈｉｓ ＩｇＧ、続いて抗ＣＤ３３タンデムダイアボディを伴わずにＦＩＴＣが結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体でインキュベートされた。その後、細胞は再び洗浄され、死細胞を除外するために２μｇ／ｍＬのプロピジウムヨウ化物（ＰＩ）を含んでいる０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁された。１ｘ１０４生細胞の蛍光は、ＭＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＢｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター、またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを使用して測定された。細胞サンプルの平均の蛍光強度は、ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＩｎｃｙｔｅソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して計算された。第２および第３の試薬で単独で染色された細胞の蛍光強度値を差し引いた後に、値はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ６．００ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ， ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）の１サイト結合のための方程式（双曲線）によるＫＤ値の計算に使用された。
タンデムダイアボディは、ヒトＣＤ３＋およびＣＤ３３＋細胞およびカニクイザルＣＤ３＋およびＣＤ３３＋細胞へのそれらの結合親和性に関してテストされた。選択されたタンデムダイアボディのための典型的な結合データは表８に要約される：
Figure 0007065149000010
ｃｙｎｏ ＣＤ３３／ヒトＣＤ３３の＃ＫＤ比率は、それぞれ、カニクイザルＣＤ３３およびヒトＣＤ３３を発現するＣＨＯ細胞上で測定されたＫＤ値に基づいて計算された。‡ＫＤ比率ｈｕ ＣＤ３／ｈｕ ＣＤ３３は、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ｈｕ ＣＤ３）上で測定されたＫＤ値、および３つのヒトＣＤ３３＋腫瘍細胞株（ＨＬ－６０、ＫＧ－１、Ｕ９３７）の平均のＫＤに基づいて計算された。
ＣＤ３結合能および交差反応性は、滴定および、ＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｄｒ． Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ， ＤＫＦＺ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ提供；ヒト急性Ｔ細胞白血病）およびカニクイザルＣＤ３＋ＨＳＣ－Ｆ細胞株（ＪＣＲＢ，ｃａｔ．：ＪＣＲＢ１１６４）のフローサイトメトリー実験中に評価された。ＣＤ３３結合および交差反応性は、ヒトＣＤ３３＋腫瘍細胞株：ＨＬ－６０（ＤＳＭＺ，ｃａｔ．：ＡＣＣ ３，ヒトＢ前駆細胞白血病）、Ｕ－９３７（ＤＳＭＺ，ｃａｔ．：ＡＣＣ５；ヒト細網肉腫）、およびＫＧ－１（ＤＳＭＺ，ｃａｔ．：ＡＣＣ１４；急性骨髄白血病）上で評価された。交差反応性のＫＤ比率は、一方の組換えのヒトまたは組換えのカニクイザル抗原を発現するＣＨＯ細胞株上で測定されたＫＤ値を使用して計算された。
タンデムダイアボディは、１ｎＭ未満である大半の試験済みの腫瘍細胞株上で、ヒトＣＤ３３＋への比較的高い親和性を示した。ヒトＣＤ３への親和性は２ｎＭ以下であると測定された。
実施例４
細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイのために標準条件下で培養された標的細胞が採取され、希釈剤Ｃで洗浄および再懸濁され、２ｘ１０７細胞／ｍＬの密度でＰＫＨ６７Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｍｉｎｉ Ｋｉで提供された。細胞懸濁液はその後、等量の２倍濃縮されたＰＫＨ６７標識溶液と混合されて、室温で２－５分間インキュベートされた。染色反応は等量のＦＣＳを加えて１分間インキュベートすることにより、実施された。標識化をされた標的細胞を完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した後に、細胞は数えられ、完全なＲＰＭＩ培地中で２ｘ１０５細胞／ｍＬの密度に再懸濁された。２ｘ１０４標的細胞はその後、微量定量プレートの個別のウェル中の濃度が増大する示されたタンデムダイアボディの存在下で、エフェクター細胞としての濃縮したヒトＴ細胞と一緒に５：１のＥ：Ｔ比率で、全量が２００μＬ／ウェルで接種された。各プレートについて少なくとも３回反復して、抗体がない状態での標的の自発的な細胞死およびＴ細胞による死滅が判断された。遠心分離の後、アッセイプレートは、５％のＣＯ２を有する湿潤雰囲気中で、示された期間の間３７℃でインキュベートされた。インキュベーションの後に、培養物はＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄され、その後、２μｇ／ｍＬのＰＩが追加された１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁された。生存している標的細胞の絶対量は、ＰＫＨ６７を用いた陽性緑色染色法と、Ｂｅｃｋｍａｎ－ＣｏｕｌｔｅｒＦＣ５００ ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用した、ＰＩの陰性染色法とを用いて測定された。測定された残存する生存した標的細胞に基づき、特定の細胞溶解のパーセンテージは次の式に従って計算された：［１－（生存している標的の数（サンプル）／生存している標的の数（自発性））］ｘ１００％。Ｓ字型用量反応曲線およびＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して、非線形回帰／４－パラメータ記号論理学適合により計算された。所定の抗体濃度に得られた溶解値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用する４パラメータ記号論理学適合分析でＳ字型用量反応曲線を計算するために使用された。
ＥＣ５０値は、５：１の比率でエフェクター細胞として濃縮されたヒトＴ細胞を有するＣＤ３３＋Ｕ－９３７（ＤＳＭＺ，ｃａｔ．：ＡＣＣ５；ヒト細網肉腫）標的細胞の２０－２４時間のアッセイで測定された。ある程度のタンデムダイアボディは、ＣＤ３３＋ＫＧ－１（ＤＳＭＺ，ｃａｔ．：ＡＣＣ１４；急性骨髄白血病）およびＨＬ－６０標的細胞の細胞毒性アッセイでテストされた。具体的には、ＨＬ－６０細胞はＣＤ３３（任意のＭＦＩ［平均±ＳＥＭ：］：３，１３３±２１５；ｎ＝３）の比較的高い細胞表面発現を有するＡＭＬのモデルとして選択され、ＫＧ－１ａは、非常に限定されたＣＤ３３発現（任意のＭＦＩ：２７７±１１；ｎ＝３）を有するＡＭＬのモデルとして選択された。選択されたタンデムダイアボディの典型的な細胞毒性データは表９に要約される。ＨＬ－６０細胞株のための追加の細胞毒性データは、表８の最後のカラムで発見される。
Figure 0007065149000011
ＥＣ５０値は、２０－２４時間培養された示された標的細胞株上の原発性ヒトＴ細胞を５：１のＥ：Ｔ比率でエフェクター細胞として用いた、ＦＡＣＳに基づく細胞毒性アッセイで判断される。それぞれのタンデムダイアボディは、少なくとも２つの独立した実験中の各腫瘍細胞株でテストされた。平均値が提供される。
実施例５
ヒトＣＤ３３＋ＡＭＬ細胞株における４８時間のさらなる細胞毒性スクリーニング実験
上記に記載されたように、有意な細胞毒性は２４時間という早期に検知されたが、一方で４８時間の時点で高位レベルの毒性が検知可能である。後のアッセイのために、４８時間の時点が選択された。タンデムダイアボディに誘導された細胞毒性へのＴ細胞選択の影響がテストされた。これを達成するために、健康なボランティアのドナーからの無刺激のＰＢＭＣが獲得され、およびＣＤ３＋細胞は、ＣＤ３微小ビーズの使用による単純な「正の濃縮（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」、同様に、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、およびＣＤ２３５ａに対する抗体の微小ビーズカクテルを介したより複雑な「負の選択（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」の両方によって単離された。図４に表されるように、タンデムダイアボディに誘導された細胞毒性は、正の選択をされたＴ細胞より負の選択をされた健康なドナーのＴ細胞でより大きかった。しかしながら、個別のタンデムダイアボディの相対的な細胞毒性活性は、Ｔ細胞選択の方法に影響されなかった。したがって、正の濃縮をされた健康なドナーＴ細胞で続くアッセイが実施された。
無刺激の単核細胞は、ＦＨＣＲＣ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄで承認された研究プロトコルの下で Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ （ＦＨＣＲＣ）Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｅ（Ｃｏｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ）による白血球除去で健常成人ボランティアから集められた。Ｔ細胞は、ＣＤ３微小ビーズ（「正の濃縮」）、またはＰａｎＴ細胞隔離キット（「負の選択」；両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）によって磁気細胞選別を通じて濃縮され、その後、分画で凍結され、液体窒素に保存された。解凍された細胞分画は、製造者の指示に従って３μＭ ＣｅｌｌＶｕｅＢｕｒｇｕｎｄｙ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，（ＣＡ））で標識化された。精製されたＰＢＭＣは、タンデムダイアボディ分子の様々な濃度下で培養された。
薬剤性の細胞毒性の定量化のために、細胞は、実施例４のように、３７℃（５％のＣＯ２および空気中）で、異なるＥ：Ｔ細胞比率で培養された。２４－７２時間後、細胞数および薬剤性の細胞毒性は、生存不能な細胞を検知するためにＤＡＰＩを使用し、ＬＳＲＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定され、ＦｌｏｗＪｏで分析された。ＡＭＬ細胞は、識別された全面／側面の散乱特性、および、健康なドナーＴ細胞が加えられ、ＣｅｌｌＶｕｅＢｕｒｇｕｎｄｙ染料（図５）について陰性である実験で測定される。薬剤性の特定の細胞毒性は次のように提供される：
％細胞毒性＝１００ｘ（１－生存している処置された標的細胞／生存している対照の標的細胞）。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として細胞毒性アッセイからの結果が提供される。連続的なサンプル特性の間の相関を計算するために、スピアマンのノンパラメトリックである相関を使用した。Ｐ値はすべて両側である。ＧｒａｐｈＰａｄプリズムソフトウェアを使用して、統計分析が実施された。
健康なドナーＴ細胞がない状態で、ＣＤ３３／ＣＤタンデムダイアボディのいずれも、Ｔ細胞がない状態でのＡＭＬ細胞株に任意の顕著な細胞毒性も及ぼさず、それらの細胞毒性にはＴ細胞が絶対的に必要であることが確認された（データは示さず）。Ｔ細胞の存在下で、タンデムダイアボディに誘導された特定の細胞毒性の範囲は、タンデムダイアボディの濃度に加えてＥ：Ｔ細胞比率に依存した。ＣＤ３３／ＣＤ３指向タンデムダイアボディ分子および１つの対照タンデムダイアボディ（００）間の直接の１対１の比較は、ＨＬ－６０細胞（図６Ａ／Ｂおよび表１０）およびＫＧ－１ａ細胞（図６Ｃ／Ｄおよび表１０）の両方で、抗体に誘導された細胞毒性において相当な相違を示し、結果は反復した実験において高い再現性を有する。全体としてタンデムダイアボディに誘導された細胞毒性の程度は、原発性ヒトＴ細胞（ＫＧ－１ａ細胞の細胞毒性については２５ｐＭへのＣＤ３の結合親和性と関連した（約２．５ｎｇ／ｍＬ）およびＥ：Ｔ＝５：１： ｒ＝－０．５４２、ｐ＝０．００９；ＨＬ－６０細胞の細胞毒性については２５ｐＭおよびＥ：Ｔ＝５：１： ｒ＝－０．３９１、ｐ＝０．０７）。タンデムダイアボディ１２、１４、１６は、ＨＬ－６０およびＫＧ－１ａ細胞の両方に対して高度に細胞毒性であった。
Figure 0007065149000012
実施例６
原発性ヒトＡＭＬ試料でのタンデムダイアボディのさらなる特徴化
これらの候補の細胞毒性の特性の包括的な特徴化のために、ＦＨＣＲＣ試料リポジトリから、研究用のＡＭＬ患者からの試料が得られた。
ＡＭＬを有する成人患者からの前処理（「診断」）の末梢血または骨髄試料からの、フィコールに分離された単核細胞の冷凍された分画がＦＨＣＲＣのリポジトリから得られた。我々は、ＡＭＬ（Ｖａｒｄｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ． ２００９； １１４（５）：９３７－９５１）を定義するために２００８年のＷＨＯの基準を使用し、細胞遺伝学的な危険性（Ｇｒｉｍｗａｌｄｅ ｅｔ ａｌ．； Ｂｌｏｏｄ． ２０１０；１１６（３）：３５４－３６５）を確認するために改定された英国医学研究会議（ＭＲＣ）の基準を使用した。患者は、ＦＨＣＲＣ施設内治験審査委員会で承認されたプロトコルの下に、研究用のバイオ試料の収集および使用のための書面のインフォームドコンセントを提供した。臨床データ、および医療保険の携行性と責任に関する法律の規定に従って匿名化された。解凍の後、細胞は、ＣＤ３３（クローンＰ６７．６；ＰＥ－Ｃｙ７－抱合型）、ＣＤ３（クローンＳＫ７；ＰｅｒＣＰ抱合型）、ＣＤ３４（クローン８Ｇ１２；ＡＰＣ－抱合型；全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， ＣＡによる）、およびＣＤ４５（クローンＨＩ３０；ＡＰＣｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０－抱合型；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を認識する直接標識化された抗体で染色された。生育不能な細胞を識別するために、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）でサンプルが染色された。少なくとも１０，０００の事象がＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で入手され、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ， Ａｓｈｌａｎｄ， ＯＲ）を使用してＤＡＰＩ－細胞が分析された。
解凍の後に、試料はＣＤ４５／側散乱特性に基づくフローサイトメトリーで判断されるように、＞５８％のＡＭＬ芽細胞を有していた。試料は、解凍直後に＞５０％の生細胞を有し、サイトカインを含んでいる液体での培養の４８時間後に＞５０％の生細胞を有していた（図７）。患者の中央値の年齢は５８．１（範囲：２３．９－７６．２）歳であった；細胞遺伝学的な疾患の危険性は２人において程度で、１８人において中度で、７人において高度であった。ＮＰＭ１、ＦＬＴ３およびＣＥＢＰＡの変異状態についての情報は不完全であった；しかしながら、あるサンプルはＣＥＢＰＡｄｏｕｂｌｅ－ｍｕｔａｎｔとして知られ、また、別のサンプルはＮＰＭ１ｐｏｓ／ＦＬＴ３－ＩＴＤｎｅｇであった。研究された試料での骨髄性の芽細胞およびＣＤ３＋Ｔ細胞の中央値のパーセンテージは、それぞれ８６．１％（範囲：５８．４－９７．０％）および２．０％（範囲：０－１１．９％）であり、また、４８時間の培養後においてサンプルの中央値の生存率は８０．１％（範囲：５３．６－９３．６％）であった。患者の１５人は新しくＡＭＬが診断され、他方で、検体収集の時点で１２人は再発性（ｎ＝７）または難治性（ｎ＝５）疾患であった。表１１に要約されるように、新しく診断されたＡＭＬを持った患者からの試料の基礎的な特性は、骨髄性の芽細胞上のＣＤ３３発現、自己由来のＴ細胞の量、骨髄性の芽細胞の割合、および培養生存率に関して、再発性または難治性の疾患を有する患者と同様であった。
ＡＭＬ試料培養へのタンデムダイアボディ分子の追加は、適度の用量依存性の細胞毒性を結果としてもたらし（図８Ａ）、活性なＡＭＬを有する患者から試料に含まれていた自己由来のＴ細胞が白血病細胞を溶解するために結合できることが実証された。健康なドナーのＴ細胞の存在下で、個別のタンデムダイアボディの細胞毒性活性は、薬物の投与量およびＥ：Ｔ細胞比率（図８Ｂ／Ｃ）に厳密に依存した。しかしながら、タンデムダイアボディの高い活性はＡＭＬ芽細胞に関する非常に低いＣＤ３３発現を有するいくつかの試料でさえ観察された。タンデムダイアボディ分子の中で、１２は、Ｅ：Ｔ＝１：３およびＥ：Ｔ＝１：１の両方において、低い濃度（２．５ｐＭ（約２５０ｎｇ／ｍＬ）、およびより不明瞭な程度では、同様に１０ｐＭ（約１ｎｇ／ｍＬ））で最も高い細胞毒性を有していたため、最も活性であるように見えた。
代表的なＡＭＬ患者の血液サンプルでＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディがスクリーニングされ、これらの患者の性別、年齢、疾病段階（新しく診断されたもの、難治性、再発）、ＣＤ３３発現の程度および細胞発生の危険（表１１）の点において多種多様である。注目するべきことに、多くの検査されたタンデムダイアボディ（例えば０２、０８、０９、１１、１２、１４、１６、１９、２２、および２３）は、図１５に示されるような疾患スペクトルを介してほぼすべての患者サンプルにおいて高度に活性であった。さらに、活性の程度および範囲は、新しく診断された患者、再発された患者および難治性の患者を含む、ＡＭＬのすべてのステージにおいて類似している。
Figure 0007065149000013
実施例７
異なるレベルのＣＤ３３を発現する様々な起源の異なるＣＤ３３＋細胞株に対するＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１２およびタンデムダイアボディ１６の効力および効果
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの効力および効果が標的細胞のＣＤ３３密度に依存するかどうかを評価するために、様々なヒトＣＤ３３＋腫瘍細胞株および組換えのヒトＣＤ３３を示すＣＨＯ細胞が、ＱＩＦＩＫＩＴ量化キットおよび抗ＣＤ３３ ｍＡｂ ＷＭ５３を使用して、それらのＣＤ３３発現レベルに関してテストされた。表１２中の結果は、腫瘍細胞株のＣＤ３３密度が～１３００ＳＡＢＣ（標準化された抗体結合能）から～４６０００ＳＡＢＣの間の範囲であったことを示す。ＣＨＯ－ＣＤ３３細胞の発現は～１９７０００ＳＡＢＣであり、腫瘍細胞株上よりも実質的に高かった。試験したＣＤ３３＋細胞株はすべて、系列希釈したＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１２およびタンデムダイアボディ１６の存在下で、ヒトＴ細胞を５：１のエフェクター対標的の比率でエフェクター細胞とした、少なくとも３つの独立のＦＡＣＳベースの細胞毒性アッセイで標的細胞として使用された。各アッセイでは、ＥＣ５０およびタンデムダイアボディを媒介とした溶解値は非線形回帰で計算された。結果は、１２および１６の、効力（ＥＣ５０値）および効果（％溶解）のいずれも標的細胞の表面のＣＤ３３密度と関連しないことを実証する。
注目すべきことに、少なくとも１２および１６は、１５００未満のＳＡＢＣの非常に低いＣＤ３３密度を有するＳＥＭのような細胞に対しても細胞毒性活性を示す。
Figure 0007065149000014
ＣＤ３３＋細胞株の標準化された抗体結合能（ＳＡＢＣ）は、ＱＩＦＩＫＩＴおよび抗ＣＤ３３ ｍＡｂ ＷＭ５３を使用して測定された。タンデムダイアボディ１２およびタンデムダイアボディ１６に再指示された標的細胞溶解のＥＣ５０値は、５：１のＥ：Ｔ比率および２０－２４時間のインキュベーションにおいてヒトの主要なＴ細胞をエフェクター細胞とした、ＦＡＣＳベースの細胞毒性アッセイで判断された；ＣＤ３３を表現するＣＨＯ細胞でのアッセイは、４０－４８時間インキュベートされた。少なくとも３つの独立したアッセイの中央値およびＳＤが示された。
実施例８
Ｔ細胞のＴａｎｄＡｂ－活性化およびＡＭＬ細胞のインビトロの死滅
ＴａｎｄＡｂは、精製されたヒトＴ細胞およびＶＰＤ－４５０－標識化ヒトＣＤ３３＋白血病細胞株、ＫＧ－１、またはＣＤ３３－ヒトＡＬＬ細胞株、Ｇ２（Ｅ：Ｔ ５：１）とインキュベートされた。ＴａｎｄＡｂ（１０－１５から１０－８Ｍ；２４時間、３７℃）で標的細胞溶解を評価するためにフローサイトメトリーが使用された。
ヒトＴ細胞を有する、ＴａｎｄＡｂ１２、１６および１９のインキュベーションは、効率的にＫＧ－１細胞を溶解した（それぞれＩＣ５０～０．０１、０．５、および５ｐＭ）。４０％以内の、Ｔ細胞は活性化され（ＣＤ２５＋）、細胞毒性活性が上昇した。無関係の標的、００（＞１０－７Ｍ）を有する対照のＴａｎｄＡｂは、ＫＧ－１のインビトロでの有意な死滅を結果として生じなかった。別々に、１６は、ＫＧ－１細胞（ＩＣ５０＝５×１０－１２Ｍ）の溶解を引き起こす一方、１×１０－８ＭはＣＤ３３－Ｇ２細胞に対して効果が無かった。結果は、Ｔ細胞は、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＴａｎｄＡｂによってＣＤ３３＋白血病細胞（ＫＧ－１）および原発性ＣＤ３３＋ＡＭＬ芽細胞を標的とした時に活性化され、強力に腫瘍細胞を溶解することを示す。
実施例９
エピトープマッピング
異なるＣＤ３３結合成分を含んでいるタンデムダイアボディは、ＣＤ３３を結合するエピトープを同定するために、ＣＬＩＰＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｅｐｓｃａｎ）を使用したエピトープマッピングに供された。
ＣＬＩＰＳ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙは、一回のループ、二重ループ、三重ループ、シート状のフォールド、螺旋状のフォールド、およびそれらの組み合わせにペプチドを組み立てることを促進し、標的分子の不連続のエピトープをマッピングする可能性を提供する。
７０００を超える独立したペプチドのアレイが合成され、ＥＬＩＳＡでペプチドの各抗体の結合がテストされた。
タンデムダイアボディ１２、１４、１６および２２は、ヒトＣＤ３３の領域のような最初のＩｇで伸張６２ＤＱＥＶＱＥＥＴＱ７０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４）に結合する。図９Ａにおいて、それぞれのアミノ酸伸張は、下線および太字で示される。タンデムダイアボディ０１、０２、０４、０６、０８、０９、１３、および２３はまた、これらのタンデムダイアボディが、タンデムダイアボディ１２、１４、１６、および１２と同様なＣＤ３３結合領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２および１２、３および１３、５および１５、９と１９）を共通して有するため、このエピトープに結合することが考慮される。
実施例１０
予防薬のインビボの腫瘍モデルにおける用量反応
タンデムダイアボディ１２および１６は、ヒトＴ細胞で再構成されたＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中の予防的なＨＬ－６０腫瘍異種移植モデル中の異なる投与量レベルで比較される。用量反応を達成するために、１０、１および０．１μｇ（０．５、０．０５および０．００５ｍｇ／ｋｇ）の３つの投与量レベルが選択された。
８つの免疫不全のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスの目標実験群が、４ｘ１０６ＨＬ－６０細胞の懸濁液を有する皮下注射で異種移植された。注入前に、細胞は、負の選択を使用する軟膜（健康なドナー）から分離された３ｘ１０６Ｔ細胞と混合された。Ｔ細胞の潜在的なドナー不安定性を説明するために、それぞれの実験群は、それぞれが１人の個別のドナーのみのＴ細胞を収容する３つのコホートへ細分された。腫瘍細胞とＴ細胞で移植された実験群の動物はすべて、０日目、１日目、２日目、３日目、および４日目（ｑｄｘｄ５）に、示されるような（０．１μｇ、１μｇ、および１０μｇ）３つの異なる投与量レベルのビヒクル（対照）、１６、または１２のいずれかの静脈内ボーラスを受けた。エフェクター細胞およびビヒクル処置を伴わない１つの群は、付加的な対照として機能した。表１３は群の割り当て、および投与スケジュールを要約する。
Figure 0007065149000015
ＨＬ－６０異種移植モデル中のインビボにおける用量反応の研究のための処置群。対照群中の動物はすべて、確実に腫瘍を生じさせて、均質の腫瘍成長を示した。Ｔ細胞の存在は腫瘍の進行に影響がなかった。ビヒクルが処置された対照群中において、Ｔ細胞が存在する状態または存在しない状態で、ＨＬ－６０増殖の相違は観察されなかった。
両方の試験項目による処置は、明瞭な用量依存性の抗腫瘍の効果（図１０）を示した。本質的な相違は２つのタンデムダイアボディ間で発見されなかった。大半の処置群が完全であった時、２９日に、図１０の平均の腫瘍容積のプロッティングが制限された。研究は４５日まで継続され、動物は腫瘍なしの生存が観察された。１０または１μｇの１６で処置された群では、９匹の動物のうち６匹は観察期間の終わりに腫瘍が無く、また、１０μｇの１２を受けている９匹の動物の５匹は４５日の時点で腫瘍がなかった。１μｇの１２で処置された時、１匹の動物は腫瘍が無いままであった。
対照群中の動物はすべて、確実に腫瘍を生じさせて、均一な腫瘍増殖を示した。タンデムダイアボディのいずれかによる処置は用量依存的な抗腫瘍効果を明らかにし、また、本質的な違いは２９日まで２つのタンデムダイアボディ間で発見されなかった。
検知可能な差異は、延長された観察（日４５）の後にのみ観察され、この時低投与量の群および対照群は大きな腫瘍の増殖により既に終了していた。１６で処置された群はより多くの腫瘍なしの動物を有していた。
実施例１１
確立された腫瘍モデル
１６を使用するあらかじめ確立されたＨＬ－６０腫瘍を有するＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中の異種移植モデルは、概念実証を示すために開発された。
手短に言えば、雌の免疫不全のＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスは亜致死性で放射線照射され（２Ｇｙ）、皮下に４ｘ１０６ ＨＬ－６０細胞の接種を受けた。９日目において、動物は、ネズミ科のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を消耗するために、抗アシアロ ＧＭ１ウサギ抗体（Ｗａｋｏ，Ｎｅｕｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の一回の急速注入を受けた。１０日目において、腫瘍が５０－１５０ｍｍ３（平均７３±１１ｍｍ３）の間の体積に達した時、動物は３つの処置グループに割り振られた。グループ２および３（それぞれ８匹の動物）は、腹腔内に１．５ｘ１０７に活性化されたヒトＴ細胞が注入された。注入前に、負の選択を使用する軟膜（健康なドナー）からＴ細胞が分離された。Ｔ細胞は、製造者の規格（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従ったＴ細胞活性化／増殖キットで増殖され、活性化された。潜在的なドナーの不安定性を検討するために、グループ２および３は２つのコホートに細分され、各々が個体のドナーから増殖および活性化したＴ－細胞を受け取る。それぞれのコホートは１つの個別のＴ細胞ドナーのみからＴ細胞を受けた。
Figure 0007065149000016
１３日から開始し、群３の動物は、１０５ｍｍ３の平均の腫瘍体積を示し、合計９回、５０μｇのタンデムダイアボディ１６（ｑｄｘ９ｄ）の静脈内の投与で処置された。表１４は群の割付けおよび投与スケジュールを例証する。群１および２はビヒクルのみで処置された。２７日まで、体重と腫瘍体積が測定された。
動物はすべて確実に腫瘍を生じさせ、これは６日目で明白であった。ビヒクルが処置された群１および２（ＨＬ－６０）の動物の平均の腫瘍容積は、継続して２７日目の研究終了まで増加した（図１１）。ＨＬ－６０腫瘍細胞に加えて主要な活性化したヒトＴ細胞を受けた群２の動物では、平均の腫瘍体積は、群１（ＨＬ－６０のみ）と比較してより速く上昇した。
ヒトＴ細胞（群３）の存在下での１３日から２１日（ｑｄｘｄ９）の反復したタンデムダイアボディ１６（５０μｇ／動物；２．５ｍｇ／ｋｇ）による静脈内の処置は、群１および群２と比較して急速に腫瘍の成長を遅らせた。タンデムダイアボディ１６は、ビヒクルが処置された対照群（群２）と比較して、群３の腫瘍成長をおよそ４－５日遅らせた。６日目から２７日目までの期間の統計的有意差は、群２（ＨＬ－６０、Ｔ細胞、ビヒクル）および群３（ＨＬ－６０、Ｔ細胞、１６）の間で２２日目（ｐ＜０．０５）、２３日目（ｐ＜０．０１）、および２７日目（ｐ＜０．０１）に確認された（二元配置反復測定分散分析およびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉポストテスト）。群１の腫瘍の異常な低成長により、統計的有意差は群１および群３の間で存在しない。
異なるドナーからＴ細胞を受けた、群の内のコホート１およびコホート２の腫瘍進行を比較した場合、Ｔ細胞活性に関連したドナーの不安定性は観察されなかった（表１４を参照）。
実施例１０は、あらかじめ定着させられたＨＬ－６０腫瘍（ＡＭＬ）および、腹腔内に移植されたヒトＴ細胞を有するＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中の異種移植モデルが、順調に発達したことを示す。タンデムダイアボディ１６の単一の投与量での反復した投与は、それぞれのビヒクルで処置された対照群と比較して、腫瘍増殖の統計的に有意な遅れを引き起こす。生成されたデータは、ＣＤ３３／ＣＤ３ ＢｉＴＥ（商標）（Ａｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１２； Ｌｅｕｋｅｍｉａ， ２０１３， Ａｐｒ；２７（５）：１１０７－１５））における同様の研究の公表された結果に匹敵する。
実施例１２
ＮＳＧマウス中のＡＭＬ ＰＤＸモデルにおけるＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの効果
２－４％のＣＤ３＋Ｔ細胞を含むＣＤ３３＋白血病ＡＭＬ患者からの凍結保存された細胞が、ＮＳＧマウス中のＡＭＬ ＰＤＸモデルを確立するために使用された。腫瘍細胞の注射の１時間後、放射線照射された（２５０ ｃＧｙ）ＮＳＧマウスに、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６または１２が、２つの静脈内の投与（５０μｇまたは５μｇ；ｎ＝８マウス／群）のいずれかで、２００μＬのボーラスで注入された。タンデムダイアボディの付加的な注入が、後続の４日間のそれぞれで実行された。マウスは毎週１回計量され、続いて、フローサイトメトリー（ｈｕＣＤ３３、ｈｕＣＤ３４、ｈｕＣＤ４５、ｍｕＣＤ４５、ｈｕＣＤ１４、ｈｕＣＤ３、ｈｕＣＤ４、ｈｕＣＤ８、および７ＡＡＤ）による分析のための末梢血、骨髄および脾臓の収集を可能にするために３８日目で屠殺された。結果は図１２において示される。
図１２は、未処置のマウスが３８日後に骨髄と脾臓において相当な量のヒト芽細胞を有していたことを示す。対照的に、タンデムダイアボディ１２または１６が毎日静脈内に注入されたマウスは、骨髄、および脾臓で実質的により低い数のヒトＡＭＬ芽細胞を示した。両方の投与量レベル（５および５０μｇ／注入）においてＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの強い抗ＡＭＬ効果が観察された。
ＣＤ３３／ＣＤ３の両方のタンデムダイアボディ１２および１６の観察された抗ＡＭＬ効果は、同一のマウスモデル中のＣＤ１２３／ＣＤ３ ＤＡＲＴ（登録商標）抗体照準法ＡＭＬの効果よりはるかに強力であった（Ｈｕｓｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．：” Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＤ１２３ Ｉｎ Ｌｅｕｋｅｍｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （ＤＡＲＴｓ（登録商標）Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １５， ２０１３； Ｂｌｏｏｄ： １２２ （２１））。骨髄と脾臓でＡＭＬ芽細胞をほぼすべて排除したＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディとは対照的に、Ｈｕｓｓａｉｎｉらは、ＣＤ１２３／ＣＤ３ ＤＡＲＴ（登録商標）が２．５および０．２５ｍｇ／ｋｇでの因子５０－１０００によってのみ、ＰＤＸモデル中の骨髄および脾臓中のＡＭＬ芽細胞の数を減少させると報告し、著者はさらに、ＣＤ１２３／ＣＤ３ ＤＡＲＴ（商標）が骨髄中のＡＭＬ芽細胞およびＰＤＸモデル中の脾臓の数を０．５ｍｇ／ｋｇで４０－７８％のみ減少させると報告した。
実施例１３
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６を媒介とした標的細胞溶解の迅速な発現
ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディを媒介とした標的細胞溶解の動力学を評価するために、異なるインキュベーション回数でカルセイン放出細胞毒性の分析が実行された。２５：１のＥ：Ｔ比率で３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、または５時間、カルセインに標識化されたＣＤ３３＋ＨＬ－６０標的細胞は、エフェクター細胞としての原発性ヒトＴ細胞の存在下において、系列希釈されたタンデムダイアボディ１６でインキュベートされた。それぞれの時点で、溶解された標的細胞から放出されたカルセインは、ＥＣ５０の値、および非線形回帰／Ｓ字型の用量応答を使用するタンデムダイアボディ１６に媒介された標的細胞溶解を計算するために使用された。図１３は、飽和したタンデムダイアボディ濃度で３０分のインキュベーションの後の、４０％を超える溶解を有するタンデムダイアボディを媒介とした標的細胞溶解の予期しない速い発現を示す。４時間のインキュベーション後、９０％以上の標的細胞溶解に達した。表１５および図１４は、３０分から５時間の間のインキュベーションが行われたタンデムダイアボディ１６のための測定されたＥＣ５０および特定の溶解値を要約してい。結果はさらに、使用されたアッセイの条件下で２時間のインキュベーションの後に最大の効力（最小のＥＣ５０の値）に到達し、および５時間のインキュベーションの後にほぼ全ての標的細胞が溶解されたことを示す。まとめると、これらの結果は、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディに媒介された非常に速く、有力で、効果的な標的細胞の溶解を示す。
Figure 0007065149000017
実施例１４
ＡＭＬ患者へのＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディの投薬のための概念実証臨床試験プロトコル
急性骨髄白血病（ＡＭＬ）の処置としてのＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６の研究の期Ｉ／ＩＩ臨床試験
研究結果：
一次：ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６の最大耐用量
二次：ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６のインビトロの反応が臨床反応に関連するかどうかを判断すること
第Ｉ期
試験の第Ｉ期で最大耐用量（ＭＴＤ）が決定される。
１．１ 試験の第Ｉ期で最大耐用量（ＭＴＤ）が決定される。
１．２ ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６の試験に適格基準を満たす患者が加えられる。
１．３ 目標は、参加者の重度のまたは収拾不可能な副作用を伴わなずに安全に実施することができるＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６の最大投与量を明らかにすることである。与えられる投与量は、事前の研究で登録された参加者の数、および、どれくらいよく投与量が許容されたかに依存する。すべての参加者が同一の投与量を受けるとは限らない。
第ＩＩ期
２．１ 引き続き第ＩＩ期は、ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６の療法を有する療法が少なくとも２０％の反応率を結果として生じるかを判断するという目標で、ＭＴＤで処置される。
ＩＩ期の第一の結果－－－ＣＤ３３／ＣＤ３タンデムダイアボディ１６の療法が、少なくとも２０％の患者において臨床反応（芽細胞反応、軽症の反応、部分応答または完全寛解）の達成を結果としてもたらすかを判断すること
適格性：
急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の患者を除き、ＷＨＯの基準に適合する、末梢血および骨髄の分析によって記述されたＡＭＬ
一次誘導化学療法に抵抗性であるＡＭＬを有するか、再発された疾患を有する、または年齢≧６０であり、かつ年齢、活動状態、および／または有害な危険因子のために、処置をしている医師による標準細胞傷害性療法に適正でない患者。
年齢≧１８歳
カルノフスキーパフォーマンスステータス≧５０％またはＥＣＯＧ活動度０－２
平均余命≧６週
本発明の好ましい実施形態が図示され説明されたが、そのような実施形態は実施例としてのみ提供されることは、当業者に明らかだろう。多くの変形、変更、及び置換が本発明から逸脱することなく当業者に想起されるだろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施形態を実施する際に使用されてもよいことが理解されるべきである。以下の請求項は発明とその方法の範囲、およびこれらの請求項の範囲内の構造を定義し、これらの等価物がそれによって網羅されることが意図される。

Claims (12)

  1. ヒトＣＤ３３およびヒトＣＤ３に特異的な二重特異性抗原結合タンデムダイアボディであって、前記タンデムダイアボディは２つの同一のポリペプチドを含み、
    該ポリペプチドが、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示されるＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９に示されるアミノ酸配列、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示されるＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１に示されるアミノ酸配列、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示されるＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３に示されるアミノ酸配列
    を含む、二重特異性抗原結合タンデムダイアボディを含む、ＣＤ３３＋癌の治療のための注射または注入のための医薬。
  2. ＣＤ３３＋癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ前駆細胞リンパ芽球性白血病、骨髄性肉腫、多発性骨髄腫、急性リンパ腫、急性リンパ芽球性リンパ腫または慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である、請求項１に記載の医薬。
  3. ＣＤ３３＋癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１に記載の医薬。
  4. ＣＤ３３＋癌は、多発性骨髄腫である、請求項１に記載の医薬。
  5. ＣＤ３３＋癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項１に記載の医薬。
  6. シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ２０剤、またはこれらの組合せと組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の医薬。
  7. ＡＭＬは、再発性遺伝的異常を有するＡＭＬ、脊髄形成異常関連の変化を伴うＡＭＬ、治療関連の骨髄性の新生物、骨髄性肉腫、ダウン症候群と関連する骨髄性の増殖、芽球性形質細胞様樹状細胞新生物、またはその他の分類されないＡＭＬである、請求項３に記載の医薬。
  8. ＡＭＬは、ＡＭＬ－Ｍ０、ＡＭＬ－Ｍ１、ＡＭＬ－Ｍ２、ＡＭＬ－Ｍ３、ＡＭＬ－Ｍ４、ＡＭＬ－Ｍ５、ＡＭＬ－Ｍ６、またはＡＭＬ－Ｍ７である、請求項３に記載の医薬。
  9. ＡＭＬは、新しく診断され、再発性、または難治性である、請求項３、７または８に記載の医薬。
  10. シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ 、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ２０剤、またはこれらの組合せと組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項３、７または８に記載の医薬。
  11. ヒトＣＤ３３およびヒトＣＤ３に特異的な二重特異性抗原結合タンデムダイアボディであって、前記タンデムダイアボディは２つの同一のポリペプチドを含み、
    該ポリペプチドが、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示されるＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９に示されるアミノ酸配列、
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示されるＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１に示されるアミノ酸配列、または
    ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２に示されるＣ末端ヘキサ－ヒスチジン（６ｘＨｉｓ）を除くＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３に示されるアミノ酸配列
    を含む、二重特異性抗原結合タンデムダイアボディを含む、骨髄性形成障害症候群（ＭＤＳ）の治療のための注射または注入のための医薬。
  12. シタラビン、アザシチジン、デシタビン、アントラサイクリン、アミサクリン、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ネララビン、メトトレザト、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、メルファラン、イブルチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、アプレミラスト、エピポドフィロトキシン、アントラセンジオン、抗ＣＤ２０剤、またはこれらの組合せと組み合わせて用いられることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬。
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