ES2863600T3 - Proteínas de unión a CD33 y CD3 biespecíficas - Google Patents

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Kristina Ellwanger
Luke Evnin
Judith A Fox
Ivica Fucek
Jeanmarie Guenot
Stefan Knackmuss
Lori Kunkel
Melvyn Little
Vera Molkenthin
Erich Rajkovic
Uwe Reusch
Claudia Wall
Michael Weichel
Eugene Zhukovsky
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Abstract

Un diacuerpo en tándem de unión al antígeno biespecífico específico de CD33 humano y CD3 humano, en donde dicho diacuerpo en tándem comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, teniendo cada polipéptido al menos cuatro dominios de cadena variables unidos uno después del otro, en donde cada polipéptido comprende (i) un dominio de cadena pesada variable (VH) específico de CD33 humano; (ii) un dominio de cadena ligera variable (VL) específico de CD33 humano; (iii) un dominio VH específico de CD3 humano, y (iv) un dominio VL específico de CD3 humano, en donde cada polipéptido comprende una combinación de cuatro dominios de cadena variables seleccionados del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 3, 13, 64 y 68; (b) SEQ ID NO: 2, 12, 64 y 68; (c) SEQ ID NO: 4, 14, 64 y 68; (d) SEQ ID NO: 5, 15, 64 y 68; (e) SEQ ID NO: 6, 16, 64 y 68; o (f) SEQ ID NO: 9, 19, 64 y 68; y en donde en cada polipéptido, los cuatro dominios de cadena variables se unen uno después del otro por conectores peptídicos L1, L2 y L3 en el orden de: VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3); VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD3 3); o VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33).

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión a CD33 y CD3 biespecíficas
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. N° 62/019.795, presentada el 1 de julio de 2014; la solicitud provisional de EE. UU. N° 62/111.470, presentada el 3 de febrero de 2015; y es una solicitud no provisional de EE. UU. de continuación N° 14/642.497, presentada el 9 de marzo de 2015.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un Listado de secuencias. El documento del Listado de secuencias, creado el 30 de junio de 2015, se llama 45375-704.601_SL.txt y tiene 147.965 bytes de tamaño.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La leucemia mieloide aguda (LMA) es una leucemia aguda en adultos y niños. CD33 se expresa en la mayoría de los mieloblastos en LMA. En algunos informes, CD33 está restringido, en general, a progenitores mieloide multilinaje tempranos y ausente de células madre hematopoyéticas pluripotentes normales. El documento de patente US2012251554 describe anticuerpos anti-CD33 y el uso de los mismos para el inmunodireccionamiento en el tratamiento de enfermedades asociadas a CD33.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención es como se define en las reivindicaciones.
En el presente documento se proporcionan proteínas de unión que se unen específicamente a CD33 humano, y proteínas de unión biespecíficas que se unen específicamente a CD33 humano y CD3 humano. En el presente documento también se proporcionan dominios variables anti-CD33 y dominios variables anti-CD3 para generar varias proteínas de unión a CD33/CD3 biespecíficas, tales como, por ejemplo, diacuerpos en tándem. También se proporcionan además en el presente documento diacuerpos en tándem biespecíficos que se unen a CD33 y CD3 y su uso para la inmunoterapia de leucemia mieloide aguda (LMA) y otros tumores malignos hematológicos, trastornos o afecciones.
En particular, se proporcionan proteínas de unión que muestran unión a tanto CD33 humano como de macaco cangrejero. Se muestra en los ejemplos que estos diacuerpos en tándem de CD33/CD3 pueden redirigir linfocitos T CD3+ policlonales de donante sano, así como linfocitos T autólogos de pacientes con LMA, para lisar eficazmente células de LMA CD33+ a bajas relaciones de células E:D. En este proceso, dependiendo de la presencia de tanto células diana CD33+ como linfocitos T, se activan los linfocitos T redirigidos, como se muestra por la inducción de CD25 y CD69, y se estimulan para la proliferación. Se muestra que el efecto anti-LMA de estos diacuerpos en tándem es dependiente de la concentración de los anticuerpos usados, así como de la relación de células E:D. El diacuerpo en tándem es tetravalente y tiene dos sitios de unión para CD33 y dos sitios de unión para CD3. Una característica particular de los diacuerpos en tándem de CD33/CD3 descritos en el presente documento es que facilitan la potente y eficiente apoptosis como resultado de la unión bivalente que confiere avidez por cada antígeno, concretamente CD33 y CD3.
En resumen, las proteínas de unión a CD33/CD3 proporcionadas descritas en el presente documento, en particular los diacuerpos en tándem, inducen la potente citólisis de células leucémicas CD33+ y células primarias de LMA in vitro. Los ejemplos de proteínas de unión a CD33/CD3 biespecíficas en el formato de anticuerpo de los diacuerpos en tándem demuestran actividad citolítica in vivo en líneas celulares, células primarias de LMA y en modelos in vivo con líneas celulares de LMA y con células primarias de LMA derivadas de pacientes. Esto indica la alta actividad in vivo, especialmente considerable, en el modelo riguroso de XDP de LMA. Además, los ejemplos de proteínas de unión a CD33/CD3 biespecíficas en el formato de anticuerpo de los diacuerpos en tándem demuestran actividad citolítica ex vivo en muestras de pacientes en todas las etapas de LMA, que incluyen pacientes recientemente diagnosticados, recidivantes y resistentes al tratamiento.
Además, estas proteínas de unión a CD33/CD3 descritas en el presente documento son capaces de lograr una lisis significativa de células que expresan CD33 en el plazo de aproximadamente cuatro horas. Las proteínas de unión a CD33/CD3 presentan, por consiguiente, alta citotoxicidad a bajas densidades de CD33 sobre la superficie celular, así como una alta citotoxicidad a bajas relaciones efectoras:diana (E:D). Además, las proteínas de unión a CD33/CD3 descritas en el presente documento presentan no solo potentes afinidades de unión a CD33 y a CD3 por las proteínas humanas, sino que también muestran excelente reactividad cruzada con las respectivas proteínas de macaco cangrejero, por ejemplo con las relaciones de Kd humano:cangrejero entre 5 y 0,2. Además, las proteínas de unión a CD33/CD3 descritas en el presente documento no muestran inducción significativa de la liberación de citocinas en ausencia de células diana CD33+, que es un componente esencial del perfil de seguridad de estas moléculas. Además, los diacuerpos en tándem de CD33/CD3 descritos en el presente documento pertenecen a la clase de moléculas que tienen semividas en el intervalo aproximado de 8-24 h, que debe permitir una administración conveniente.
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan proteínas de unión a CD33 que se unen específicamente a un epítope de CD33 humano. En algunos aspectos, las proteínas de unión comprenden un dominio de cadena pesada variable y un dominio de cadena ligera variable que deriva de humano.
En algunos aspectos de la divulgación, una proteína de unión a CD33 tiene al menos un sitio de unión que comprende un dominio de cadena ligera variable y un dominio de cadena pesada variable, en donde el dominio de cadena ligera variable comprende una CDR1 que consiste en la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21 -27, una CDR2 que consiste en la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 28-34 y una CDR3 que consiste en la secuencia del grupo que consiste en SEQ ID NO: 35-41.
En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 tiene al menos un sitio de unión que comprende un dominio de cadena ligera variable y un dominio de cadena pesada variable, en donde el dominio de cadena pesada variable comprende una CDR1 que consiste en la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42-48, una CDR2 que consiste en la secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 49-55 y una CDR3 que consiste en una secuencias seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56-63.
En ciertos casos, la CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio de cadena ligera variable se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21, 28 y 35; SEQ ID NO: 22, 29 y 36; SEQ ID NO: 23, 30 y 37; SEQ ID NO: 24, 31 y 38; SEQ ID NO: 25, 32 y 39; SEQ ID NO: 26, 33 y 40; y SEQ ID NO: 27, 34 y 41.
En ciertos casos, la CDR1, CDR2 y CD3 del dominio de cadena pesada variable se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 42, 49 y 56; SEQ ID NO: 43, 50 y 57; SEQ ID NO: 43, 50 y 58; SEQ ID NO: 43, 50 y 59; SEQ ID NO: 43, 50 y 60; SEQ ID NO: 44, 51 y 61; SEQ ID NO: 45, 52 y 62; SEQ ID NO: 46, 53 y 63; SEQ ID NO: 47, 54 y 63;.y SEQ ID NO: 48, 55 y 63.
En ciertos casos, el sitio de unión a CD33 humano de un dominio de cadena pesada variable y un dominio de cadena ligera variable se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID n O: 11; SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 20.
En algunas realizaciones, el epítope de CD33 está dentro de 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) (restos de aminoácidos 62-70 de SEQ ID n O: 93) de CD33 humano.
En cualquiera de los aspectos anteriores, la proteína de unión a CD33 comprende al menos un dominio funcional adicional. En algunos casos, el dominio funcional es un dominio efector que se une a una célula efectora. En ciertos casos, el dominio efector es un sitio de unión a CD3 que comprende al menos un dominio de cadena pesada variable del anticuerpo y al menos un dominio de cadena ligera variable que forma un sitio de unión al antígeno para CD3 humano.
En ciertos casos, el sitio de unión a CD3 comprende un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 de STYAMN (SEQ ID NO: 72), una secuencia de CDR2 de RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 73) y una secuencia de CDR3 de HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 74). En otros casos, el sitio de unión a CD3 comprende un dominio de cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 de RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 90), una secuencia de CDR2 de GTNKRAP (SEQ ID NO: 91) y una secuencia de CDR3 de ALWYSNL (SEQ ID NO: 92).
En ciertos casos, el sitio de unión a CD3 comprende un dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 64 y un dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 68; un dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 65 y un dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 69; un dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 66 y un dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 70; o un dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 67 y un dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 71.
En cualquiera de los aspectos anteriores, la proteína de unión a CD33 es una proteína dimérica. En cualquiera de los aspectos anteriores, la proteína de unión a CD33 es multifuncional.
En ciertos casos, la proteína de unión a CD33 multifuncional tiene biespecificidad por CD33 y CD3, en donde las especificidades de unión se proporcionan por el dominio de cadena pesada variable y los dominios de cadena ligera variables para CD33 y CD3 seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 12, 65 y 69; SEQ ID NO: 3, 13, 65 y 69; SEQ ID NO: 4, 14, 65 y 69; SEQ ID NO: 5, 15, 65 y 69; SEQ ID NO: 1, 11, 64 y 68; SEQ ID NO: 2, 12, 64 y 68; SEQ ID NO: 2, 12, 66 y 70; SEQ ID NO: 4, 14, 66 y 70; SEQ ID NO: 5, 15, 66 y 70; SEQ ID NO: 3, 13, 64 y 68; SEQ ID NO: 3, 13, 67 y 71; SEQ ID NO: 4, 14, 64 y 68; SEQ ID NO: 5, 15, 64 y 68; SEQ ID NO: 7, 17, 64 y 68; SEQ ID NO: 6, 16, 64 y 68; SEQ ID NO: 6, 16, 67 y 71; SEQ ID NO: 8, 18, 64 y 68; SEQ ID NO: 9, 19, 64 y 68; SEQ ID NO: 9, 19, 67 y 71; y SEQ ID NO: 10, 20, 64 y 68.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan diacuerpos en tándem biespecíficos de unión al antígeno específicos para CD3 humano y CD33 humano. Según la invención, el diacuerpo en tándem es un diacuerpo en tándem específico para CD33 humano y CD3 humano, en donde dicho diacuerpo en tándem comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, teniendo cada polipéptido al menos cuatro dominios de cadena variables unidos uno después del otro, en donde cada polipéptido comprende (i) un dominio de cadena pesada variable (VH) específico para CD33 humano; (ii) un dominio de cadena ligera variable (VL) específico para CD33 humano; (iii) un dominio VH específico para CD3 humano, y (iv) un dominio VL específico para CD3 humano, en donde cada polipéptido comprende una combinación de cuatro dominios de cadena variables seleccionados del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 3, 13, 64 y 68; (b) SEQ ID NO: 2, 12, 64 y 68; (c) SEQ ID NO: 4, 14, 64 y 68; (d) SEQ ID NO: 5, 15, 64 y 68; (e) SEQ ID NO: 6, 16, 64 y 68; o (f) SEQ ID NO: 9, 19, 64 y 68; y en donde en cada polipéptido, los cuatro dominios de cadena variables se unen uno después del otro por conectores peptídicos L1, L2 y L3 en el orden de: VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); VH(CD3)-L1 -VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3); VL(CD33)-L1 -VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); o VH(CD33)-L1 -VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33).
En algunas realizaciones, los conectores L1, L2 y L3 consisten en aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos. En ciertos casos, los conectores L1, L2 y L3 son cada uno independientemente GGSGGS (SEQ ID NO: 95), GGSG (SEQ iD NO: 96) o GGSGG (SEQ ID NO: 97). En otros casos, los conectores L1 y L3 son GGSGGS (SEQ ID NO: 95) y el conector L2 es GGSG (SEQ ID NO: 96) o GGSGG (SEQ ID NO: 97).
En algunas realizaciones, un diacuerpo en tándem biespecífico es un diacuerpo en tándem 12 (SEQ ID NO: 109), 14 (SEQ ID NO: 111), 15 (SEQ ID NO: 112), 16 (SEQ ID NO: 113), 19 (SEQ ID NO: 116) o 22 (SEQ ID NO: 119).
En algunas realizaciones, los diacuerpos en tándem de unión al antígeno biespecíficos poseen Kd de unión de 10 nM o menos a CD33 en células tumorales CD33+ seleccionadas de HL-60, KG-1 y U-937.
En algunas realizaciones, los diacuerpos en tándem de unión al antígeno biespecíficos se une específicamente a un epítope de CD33 humano que está dentro de 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) (restos de aminoácidos 62-70 de SEQ ID NO: 93) de CD33 humano.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan polinucleótidos que codifican una proteína de unión a CD33 o diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores. En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos. En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan células hospedadoras transformadas con los vectores descritos.
En otro aspecto más, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína de unión a CD33 o diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto más, en el presente documento se proporcionan métodos de producción de una proteína de unión a CD33 o diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores que comprenden introducir en una célula hospedadora un polinucleótido que codifica una proteína de unión a CD33 o diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores, o un vector que comprende los polinucleótidos descritos, cultivar la célula hospedadora en condiciones por las cuales se expresa la proteína de unión a CD33 o el diacuerpo en tándem biespecífico, y purificar la proteína de unión a CD33 expresada o el diacuerpo en tándem biespecífico.
En el presente documento también se proporcionan métodos para el tratamiento de un cáncer CD33+ que comprende la administración de un diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores a un individuo que padece cáncer CD33+. En algunas realizaciones, el cáncer CD33+ es leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfoblástica de linfocitos B precursores, sarcoma mieloide, mieloma múltiple, linfoma agudo, linfoma linfoblástico agudo o leucemia mielomonocítica crónica (LMMC). En algunas realizaciones, el cáncer CD33+ es leucemia mieloide aguda (LMA). En algunas realizaciones, el cáncer CD33+ es mieloma múltiple. En algunas realizaciones, el cáncer CD33+ es leucemia linfoblástica aguda (LLA).
En el presente documento también se proporcionan métodos para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (LMA) que comprenden la administración de un diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores a un individuo que padece LMA. En algunas realizaciones, la LMA es LMA con anomalías genéticas recurrentes, LMA con cambios relacionados con mielodisplasia, neoplasias mieloides relacionadas con la terapia, sarcoma mieloide, proliferaciones mieloides relacionadas con el síndrome de Down, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas, o LMA no categorizada de otro modo. En algunas realizaciones, la LMA es LMA-M0, LMA-M1, LMA-M2, LMA-M3, LMA-M4, LMA-M5, LMA-M6 o LMA-M7. En realizaciones adicionales, la LMA se ha diagnosticado recientemente, es recidivante o resistente al tratamiento.
En el presente documento también se proporcionan métodos para el tratamiento de síndrome displásico mieloide (SDM) que comprende la administración de un diacuerpo en tándem biespecífico de cualquiera de las realizaciones anteriores a un individuo que padece SDM.
En el presente documento también se proporcionan métodos para el tratamiento de inmunosupresión por células supresoras derivadas de mieloides (CSDM) que comprenden la administración de un diacuerpo en tándem biespecífico en cualquiera de las realizaciones anteriores a un individuo que padece inmunosupresión.
En los métodos anteriores para el tratamiento, en ciertos casos, los métodos comprenden además administrar citarabina, azacitidina, decitabina, una antraciclina (por ejemplo, daunorubicina, idarubicina, doxorubicina y similares), amsacrina, fludarabina, clofarabina, cladribina, nelarabina, metotrexato, bortezomib, carfilzomib, melfalán, ibrutinib, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, apremilast, una epipodofilotoxina (por ejemplo, etopósido, tenipósido y similares), una antracenodiona (por ejemplo, mitoxantrona, pixantrona, losoxantrona, piroxantrona, ametantrona y similares), un agente anti-CD20 (por ejemplo, rituximab, ocrelizumab, ofatumumab y similares) o combinaciones de los mismos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las novedosas características de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá un mejor entendimiento de las características y ventajas de la presente invención por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en la que los principios de la invención se utilizan, y los dibujos adjuntos de los cuales:
Figura 1 Representación esquemática de la organización génica y un orden de dominios de los diacuerpos en tándem de CD3/CD33 (TandAb®). Los diacuerpos en tándem se expresan como un único polipéptido que comprende cuatro dominios variables conectados por los conectores peptídicos cortos L1, L2 y L3. Después de la expresión, se asocian no covalentemente cabeza con cola dos polipéptidos monoméricos para formar la molécula de diacuerpo en tándem homodimérica funcional. L1, L2, L3: conector; Vh: dominio de cadena pesada variable; Vl: dominio de cadena ligera variable.
Figura 2 Diacuerpo en tándem que se acopla con CD3 y su modo de acción. Los diacuerpos en tándem son proteínas biespecíficas tetravalentes que se pueden acoplar a linfocitos T citotóxicos por unión a CD3. El diacuerpo en tándem se une a una célula tumoral CD33+ con dos de los cuatro dominios de unión y a CD3 con los otros dos dominios de unión. Este acontecimiento de unión linfocito T/célula diana (reticulación) promueve la activación del linfocito T y promueve la posterior destrucción de la célula tumoral por ADCC.
Figura 3 Variantes de orden de dominios de diacuerpos en tándem de CD33/CD3. Variaciones del orden de dominios de cadenas variables pesadas (VH) y variables ligeras (VL) dentro de secuencias de genes que codifican los diacuerpos en tándem permiten la producción de anticuerpos con especificidades por CD33 y CD3 situados sobre el interior o el exterior de la molécula. Se indican especificidades de dominio, localización de secuencias señal (ss) y conectores (L1, L2, L3) y marcas de afinidad (His), así como extremos 5' y 3'.
Figura 4 Comparación de linfocitos T de donante sano positivamente enriquecidos frente a negativamente seleccionados. Se incubaron células KG-1a con 10 pM (aprox. 1 ng/mL) y 25 pM (aprox. 2,5 ng/mL) de uno de los 10 diacuerpos en tándem seleccionados y ya fuera linfocitos T de donante sano negativamente seleccionados o positivamente seleccionados en una relación de células E:D de 1:1 o 3:1, como se indica. Después de 48 horas, se determinaron las cifras de células y se evaluó la citotoxicidad con tinción con DAPI. Los resultados se muestran como media ± EEM para el porcentaje de células muertas (paneles superiores) y el porcentaje de citotoxicidad específica (paneles inferiores) de 3 experimentos independientes realizados en pocillos duplicados.
Figura 5 Estrategia de análisis. Gráficos de dispersión y de histograma de una alícuota de linfocitos T de donante sano y 1 línea celular de LMA representativa (HL-60) y espécimen de LMA primario (AMP002) que ilustran cada uno la estrategia perseguida para determinar la citotoxicidad inducida por diacuerpos en tándem. FSC, dispersión hacia adelante; SSC, dispersión lateral.
Figura 6 Cribado de ensayos de citotoxicidad en líneas celulares de LMA CD33+. Se incubaron células HL-60 (A,B) y KG-1a (C,D) parentales con 10 pM (aprox. 1 ng/mL) y 25 pM (aprox. 2,5 ng/mL) de una de las 22 moléculas de diacuerpo en tándem de CD33/CD3 o un diacuerpo en tándem de control no de unión (00) y linfocitos T de donante sano en una relación de células E:D de o 1:1 (A,C) o 5:1 (B,D) como se indica. Después de 48 horas, se determinaron las cifras de células y se evaluó la citotoxicidad con tinción con DAPI para cuantificar la citotoxidad específica de fármaco. Los resultados se muestran como media ± EEM para el porcentaje de células DAPI+ de 3 experimentos independientes realizados en pocillos duplicados. Se obtuvieron resultados cualitativamente similares cuando la citotoxicidad se expresó como el porcentaje de citotoxicidad específica.
Figura 7 Selección de especímenes primarios de LMA para el estudio. Se obtuvieron alícuotas congeladas de un total de especímenes primarios de LMA humana para análisis. Se determinó el porcentaje de blastos de LMA después de la descongelación por citometría de flujo basada en propiedades de CD45/dispersión lateral. Se determinó la viabilidad de los especímenes después de la descongelación, así como después de 48 horas en cultivo líquido que contiene citocinas (sin adición de moléculas de diacuerpo en tándem o linfocitos T de donante sano) por citometría de flujo usando DAPI como marcador de células vivas/muertas. Los resultados para la viabilidad después de la descongelación, así como después de 48 horas, se representan para todos los especímenes, que tuvieron >58 % de blastos de LMA. Cuadrados: Especímenes primarios de LMA que mostraron una viabilidad de >50% en la descongelación, así como >50 % después de 48 horas en cultivo líquido que contiene citocinas que se incluyeron en los análisis finales.
Figura 8 Citotoxicidad inducida por diacuerpos en tándem en especímenes primarios de LMA. Se incubaron los especímenes primarios de LMA con 2,5 pM (aprox. 250 pg/mL), 10 pM (aprox. 1 ng/mL) y 25 pM (aprox.
2,5 ng/mL) de una de las 9 moléculas de diacuerpo en tándem sin linfocitos T de donante sano añadidos (A) o con linfocitos T de donante sano en una relación de células E:D de o 1:3 (B) o 1:1 (C) como se indica. Después de 48 horas, se determinaron las cifras de células y se evaluó la citotoxicidad con tinción con DAPI para cuantificar la citotoxicidad específica de fármaco. Los resultados se muestran como media ± EEM para el porcentaje de citotoxicidad específica de experimentos realizados en pocillos duplicados.
La Figura 9A es una secuencia del dominio extracelular de CD33 humano (aa 18 - 259) (SEQ ID NO: 93); a Figura 9B es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 1 (SEQ ID NO: 98);
a Figura 9C es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 2 (SEQ ID NO: 99);
a Figura 9D es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 3 (SEQ ID NO: 100);
a Figura 9E es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 4 (SEQ ID NO: 101);
a Figura 9F es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 5 (SEQ ID NO: 102);
a Figura 9G es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 6 (SEQ ID NO: 103);
a Figura 9H es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 7 (SEQ ID NO: 104);
a Figura 9I es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 8 (SEQ ID NO: 105);
a Figura 9J es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 9 (SEQ ID NO: 106);
a Figura 9K es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 10 (SEQ ID NO: 107);
a Figura 9L es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 11 (SEQ ID NO: 108);
a Figura 9M es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 12 (SEQ ID NO: 109);
a Figura 9N es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 13 (SEQ ID NO: 110);
a Figura 9O es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 14 (SEQ ID NO: 111);
a Figura 9P es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 15 (SEQ ID NO: 112);
a Figura 9Q es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 16 (SEQ ID NO: 113);
a Figura 9R es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 17 (SEQ ID NO: 114);
a Figura 9S es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 18 (SEQ ID NO: 115);
a Figura 9T es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 19 (SEQ ID NO: 116);
a Figura 9U es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 20 (SEQ ID NO: 117);
a Figura 9V es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 21 (SEQ ID NO: 118);
a Figura 9W es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 22 (SEQ ID NO: 119);
a Figura 9X es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 23 (SEQ ID NO: 120); y
a Figura 9Y es una secuencia completa del diacuerpo en tándem 24 (SEQ ID NO: 121). Las secuencias subrayadas representan los conectores L1, L2 y L3.
Figura 10 Efecto de los diacuerpos en tándem 16 y 12 sobre el crecimiento de células HL-60 en ratones NOD/scid. Se xenotrasplantaron ocho grupos experimentales de ratones NOD/scid inmunodeficientes por inyección subcutánea con una suspensión de 4x106 células HL-60 en el día 0. Antes de la inyección, se mezclaron células HL-60 con 3x106 linfocitos T purificados de donante sano. Todos los animales de los grupos experimentales trasplantados con células tumorales y linfocitos T recibieron un bolo intravenoso en los días 0, 1, 2, 3 y 4 de o vehículo (control) o diacuerpo en tándem 16 o 12 en tres niveles de dosis diferentes como se indica (0,1 pg, 1 pg y 10 pg). Un grupo sin células efectoras y tratamiento con vehículo sirvió de control negativo adicional.
Figura 11 Actividad antitumoral del diacuerpo en tándem 16 en un modelo de xenoinjerto de LMA. Se irradiaron subletalmente (2 Gy) ratones NOD/scid y se inocularon por vía subcutánea con 4x106 células HL-60. En el día 9, los animales recibieron una única inyección en bolo de Ab de conejo anti-asialo GM1. Cuando los tumores alcanzaron un volumen entre 50-150 mm3 (media 73 ± 11 mm3) en el día 10, los animales se asignaron a 3 grupos de tratamiento. Los grupos 2 y 3 (n = 8) se inyectaron por vía intraperitoneal con 1,5x107 linfocitos T humanos expandidos y activados. Desde el día 13 hasta el día 21 (qdxd9), los animales recibieron o diacuerpo en tándem 16 (grupo 3) o vehículo en la vena lateral de la cola (grupo 1 y grupo 2).
Figura 12 Cantidad relativa (A) y cifras absolutas (B) de blastos de LMA humana en la médula ósea (MO) y bazo de ratones NSG en el día 38 después del tratamiento con 5 gg (0,25 mg/kg) o 50 gg (2,5 mg/kg) de diacuerpo en tándem de CD33/CD3 12 y 16.
Figura 13 Cinética de la lisis de células diana mediada por el diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16. Se incubaron 1x104 células diana HL-60 marcadas con calceína con linfocitos T humanos primarios como células efectoras en una relación E:D de 25:1 en presencia de diluciones sucesivas del diacuerpo en tándem 16 o sin anticuerpo (sin) durante 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h o 5 h. En cada momento de tiempo, se usó calceína fluorescente liberada de células diana lisadas para calcular la lisis específica. Se presentan la media y DE de tres duplicados.
Figura 14 Cinética de CE50 y valores de lisis específica para el diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16. Se determinaron los valores de CE50 (círculos negros rellenos) y lisis de células diana mediada por el diacuerpo en tándem 16 (cuadrados blancos) en ensayos de citotoxicidad por liberación de calceína en el momento indicado de las incubaciones por regresión no lineal/respuesta a dosis sigmoide y se representaron.
Figura 15 Actividad citotóxica en muestras de paciente con LMA recién diagnosticada, recidivante y resistente al tratamiento.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención es como se define en las reivindicaciones.
Según un primer aspecto, en el presente documento se describen proteínas de unión que tienen especificidad por al menos CD33, preferentemente CD33 humano. En algunas realizaciones, las proteínas de unión a CD33 tienen especificidad por CD33 humano y de cangrejero, es decir, reaccionan de forma cruzada. En algunas realizaciones, estas proteínas de unión reactivas de forma cruzada se unen a CD33 humano y de cangrejero con afinidad similar.
CD33 se expresa en células mieloides, por ejemplo, tales como los blastos de leucemia mieloide aguda (LMA). Para el aislamiento de dominios de anticuerpo específicos para CD33, tales como CD33 humano, se pueden cribar bibliotecas de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden cribar bibliotecas de presentación en fagos de IgM empleando, por ejemplo, una proteína de fusión recombinante de CD33-Fc que contiene los aminoácidos 1-243 del dominio extracelular de CD33 humano (Figura 9A, SEQ ID NO: 93).
En algunos aspectos, la proteína de unión a CD33 tiene al menos un sitio de unión a CD33 que comprende un dominio de cadena ligera variable y un dominio de cadena pesada variable. El dominio de cadena ligera variable comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera y el dominio de cadena pesada variable comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada. En algunos aspectos, estas CDR de la cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) se seleccionan de las secuencias de CDR humanas mostradas en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 21-41). En ciertos casos, la CDR1 de la cadena ligera se selecciona de SEQ ID NO: 21-27. En ciertos casos, la CDR2 de la cadena ligera se selecciona de SEQ ID NO: 28-34. En ciertos casos, la CDR3 de la cadena ligera se selecciona de SEQ ID NO: 35-41.
En algunos aspectos, estas CDR de la cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada) se seleccionan de las secuencias de CDR humanas mostradas en la Tabla 2 (SEQ ID NO: 42-63). En ciertos casos, la CDR1 de la cadena pesada se selecciona de SEQ ID NO: 42-48. En ciertos casos, la CDR2 de la cadena pesada se selecciona de SEQ ID NO: 49-55. En ciertos casos, la CDR3 de la cadena pesada se selecciona de SEQ ID NO: 56-63.
En algunos aspectos, las CDR ligeras y pesadas se seleccionan sin las secuencias de la región estructural circundantes de los dominios variables respectivos, que incluyen secuencias de la región estructural de otras inmunoglobulinas o regiones estructurales consenso, opcionalmente se mutan y/o sustituyen aún más por otras secuencias de la región estructural adecuadas. Por tanto, en el presente documento se proporciona en algunos aspectos una proteína de unión a CD33 que comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 21; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 28 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 35. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 22; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 29 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 36. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 23; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 30 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 37. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 24; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 31 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 38. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 25; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 32 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 39. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 26; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 33 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 40. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable, en donde la cadena ligera CDR1 es SEQ ID NO: 27; la cadena ligera CDR2 es SEQ ID NO: 34 y la cadena ligera CDR3 es SEQ ID NO: 41.
También se proporciona en el presente documento en algunos aspectos una proteína de unión a CD33 que comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 42; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 49 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 56. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 43; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 50 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 57. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 43; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 50 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 58. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 43; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 50 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 59. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 43; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 50 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 60. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 44; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 51 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 61. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 45; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 52 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 62. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 46; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 53 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 63. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 47; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 54 y la CDR3 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 63. En algunos aspectos, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable, en donde la CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 48; la CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO: 55 y la CDR3 de la cadena pesada es SeQ ID NO: 63.
En aspectos adicionales, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable seleccionado de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1-10 mostradas en la Tabla 3. En aspectos adicionales, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena pesada variable seleccionado de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 11 -20 mostradas en la Tabla 4. En aspectos aún adicionales, una proteína de unión a CD33 comprende un dominio de cadena ligera variable seleccionado de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1 -10 mostradas en la Tabla 3 y un dominio de cadena pesada variable seleccionado de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 11­ 20 mostradas en la Tabla 4.
El término "proteína de unión" se refiere a un derivado de inmunoglobulina con propiedades de unión al antígeno, es decir, polipéptidos de inmunoglobulina o fragmentos de los mismos que contienen un sitio de unión al antígeno. La proteína de unión comprende dominios variables de un anticuerpo o fragmentos del mismo. Cada dominio de unión al antígeno está formado por un anticuerpo, es decir, inmunoglobulina, dominio de cadena pesada variable (VH) y un dominio de cadena ligera variable (VL) de anticuerpo que se une al mismo epítope, mientras que el dominio de cadena pesada variable (VH) comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada: CDR1, CDR2 y CDR3; y el dominio de cadena ligera variable (VL) comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera: CDR1, CDR2 y CDR3. En algunos casos, la proteína de unión según algunas realizaciones en el presente documento carece de dominios constantes de inmunoglobulina. En algunos casos, los dominios de cadena ligera y pesada variables que forman el sitio de unión al antígeno se unen covalentemente entre sí, por ejemplo, por un conector peptídico, o en otros casos, los dominios de cadena ligera y pesada variables se asocian no covalentemente entre sí para formar el sitio de unión al antígeno. El término "proteína de unión" también se refiere a fragmentos de anticuerpos o derivados de anticuerpo que incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fv de una sola cadena, Fv de una sola cadena en tándem ((scFv)2, enlazadores de linfocitos T biespecíficos (BiTE®), anticuerpos de reorientación de doble afinidad (DART™), diacuerpo y diacuerpo en tándem (TandAb®). Además, en ciertos casos, la proteína de unión es multivalente, es decir, tiene dos, tres o más sitios de unión para CD33.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera variable anti-CD33
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Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada variable anti-CD33
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Tabla 3: Secuencias de aminoácidos de todos los dominios de cadena ligera variable anti-CD33 (las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera variable están en negrita y subrayadas)
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Tabla 4: Secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable anti-CD33 (las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada variable están en negrita y subrayadas)
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En algunos aspectos, se selecciona una proteína de unión que confiere especificidad a CD33 de una de las siguientes combinaciones de un dominio de cadena pesada variable y un dominio de cadena ligera variable que forman el sitio de unión a CD33 humano mostrado en la Tabla 3 y en la Tabla 4. Los ejemplos no limitantes incluyen (i) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 11, (ii) SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 12, (iii) SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 13, (iv) SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 14, (v) SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 15, (vi) SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 16, (vii) SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 17, (viii) SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 18, (ix) SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 19, y (x) SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 20.
En el presente documento también se describen proteínas de unión que no solo tienen especificidad por CD33, sino que también tienen al menos un dominio funcional adicional. En una realización adicional, al menos un dominio funcional adicional es un dominio efector. Un "dominio efector'' comprende un sitio de unión de un anticuerpo específico por una célula efectora, que puede estimular o provocar citotoxicidad, fagocitosis, presentación de antígenos, liberación de citocinas. Dichas células efectoras son, por ejemplo, pero no se limitan a, linfocitos T. En particular, el dominio efector comprende al menos un dominio de cadena pesada variable de anticuerpo y al menos un dominio de cadena ligera variable que forma un sitio de unión al antígeno para un antígeno en linfocitos T, tales como, por ejemplo, CD3 humano.
Así, en algunos aspectos, la proteína de unión a CD33 es multifuncional. El término multifuncional, como se usa en el presente documento, significa que una proteína de unión presenta dos o más funciones biológicas diferentes. Por ejemplo, las funciones biológicas diferentes son diferentes especificidades por diferentes antígenos. En ciertos casos, la proteína de unión a CD33 multifuncional es multiespecífica, es decir, tiene especificidad de unión por CD33 y uno o más antígenos adicionales. En ciertos casos, la proteína de unión es biespecífica con especificidades por CD33 y CD3. Dichas proteínas de unión biespecíficas incluyen, por ejemplo, anticuerpos monoclonales biespecíficos de las clases IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, diacuerpos, diacuerpos de una sola cadena (scDb), Fv de una sola cadena en tándem (scFv)2, por ejemplo enlazadores de linfocitos T biespecíficos (BiTE®), anticuerpos de reorientación de doble afinidad (DART™), diacuerpos en tándem (TandAb®) y flexicuerpos.
En ciertas realizaciones, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene especificidad por CD3 humano y, en algunos casos, CD3 de cangrejero. Los ejemplos de dicho sitio de unión son polipéptidos que comprenden CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio VH de las secuencias mostradas en la Tabla 5 (SEQ ID n O: 64-67) y CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio VL de la secuencia mostrada en la Tabla 6 (SEQ ID NO: 68-71). En ciertos casos, un sitio de unión a CD3 es la combinación del dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 64 y el dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 68. En ciertos casos, un sitio de unión a CD3 es la combinación del dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 65 y el dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 69. En ciertos casos, un sitio de unión a CD3 es la combinación del dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 66 y el dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 70. En ciertos casos, un sitio de unión a CD3 es la combinación del dominio de cadena pesada variable de SEQ ID NO: 67 y el dominio de cadena ligera variable de SEQ ID NO: 71.
Tabla 5: Secuencia de aminoácidos de un dominio de cadena pesada variable anti-CD3 (las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada variable están en negrita y subrayadas)
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Tabla 6: Secuencia de aminoácidos de un dominio de cadena ligera variable anti-CD3 (las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera variable están en negrita y subrayadas)
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En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 de STYAMN (SEQ ID NO: 72). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR2 de RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 73). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR3 de HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 74). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR3 de HGNfGn SYVSYFAY (SEQ ID NO: 75). En aspectos aún adicionales, el sitio de unión a CD3 tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 72-74 respectivamente. En aspectos aún adicionales, el sitio de unión a CD3 tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 72, 73 y 75 respectivamente.
En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en NTYAMN (SEQ ID n O: 76), NTYAMH (SEQ iD NO: 77) y NKYAMN (SEQ ID NO: 78). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en RIRNKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 79), RIRNKYNNYATEYADSVKD (SEQ ID NO: 80), RIRSKYNNYATEYAASVKD (SEQ ID NO: 81), RIRNKYNNYATEYAASVKD (SEQ ID NO: 82), RIRSKYNNYATYYADSVKG (SEQ ID NO: 83) y RIRSKYNNYATEYADSVKS (SEQ ID NO: 84). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en HGNFGDSYVSWFAY (SEQ ID NO: 85), HGNFGNTYVSWFAY (SEQ ID NO: 86), HGNFGCSYVSWFAY (SEQ ID NO: 87), HGNFGNSYISYWAY (SEQ ID NO: 88) y HGNFGNSYVSFFAY (SEQ ID NO: 89).
). En aspectos aún adicionales, el sitio de unión a CD3 tiene un dominio de cadena pesada variable que comprende una secuencia de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID NO: 76, 73 y 74 respectivamente, SEQ ID n O: 76, 79 y 74 respectivamente, SEQ ID NO: 76, 80 y 74 respectivamente, SeQ ID NO: 76, 81 y 74 respectivamente, SEQ ID NO: 76, 82 y 74 respectivamente, SEQ ID NO: 76, 83 y 74 respectivamente, SEQ ID NO: 72, 83 y 74 respectivamente, SeQ ID NO: 72, 83 y 85 respectivamente, SeQ ID NO: 76, 83 y 86 respectivamente, SEQ ID NO: 77, 83 y 74 respectivamente, s Eq ID NO: 72, 83 y 87 respectivamente, SEQ ID NO: 78, 73 y 88 respectivamente o SEQ ID NO: 78, 84 y 89 respectivamente.
En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1 de RSSTg Av TTSNy An (SEQ ID NO: 90). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR2 de GTNKRAP (SEQ ID NO: 91). En aspectos adicionales, el sitio de unión a CD3 de una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene un dominio de cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR3 de ALWYSNL (SEQ ID NO: 92). En aspectos aún adicionales, el sitio de unión a CD3 tiene un dominio de cadena ligera variable que comprende una secuencia de CDR1, CD2 y CD3 de SEQ ID NO: 90-92 respectivamente.
En ciertos casos, el sitio de unión a CD3 tiene una alta afinidad por CD3. Alternativamente, en otros casos, la CDR1, CDR2, CDR3 del dominio de cadena pesada, así como el dominio de cadena ligera u, opcionalmente, los dominios de cadena ligera variable y dominios de cadena pesada variable, deriva de otros anticuerpos contra CD3, tales como, por ejemplo UCHT1, muromonab-CD3 (OKT3), otelixizumab (TRX4), teplizumab (MGA031), visilizumab (Nuvion) y similares.
En otro aspecto, en el presente documento se describen proteínas de unión a CD33, así como las proteínas de unión a CD33 y CD3 biespecíficas, que son humanizadas o completamente humanas, es decir, de origen humano.
Según la invención, una proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica tiene una de las combinaciones citadas en la reivindicación 1, que proporciona especificidad de CD33 y CD3 por dominios de cadena ligera y pesada variables para CD33 y CD3.
Variantes conservadas de secuencias de CDR y dominios de cadena pesada y ligera
En aspectos alternativos de la divulgación, los dominios de cadena pesada y ligera incorporan homólogos o variantes inmunológicamente activos de las secuencias de CDR descritas en el presente documento. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, una secuencia de CDR en un dominio de cadena pesada o ligera que se une a CD33 o CD3 es similar a, pero no idéntico a, la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 21-63 o 72­ 92. En ciertos casos, una secuencia de variante de CDR tiene una identidad de secuencia de 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 % o 80 % en comparación con la secuencia de SEQ ID NO: 21-63 o 72-90 y que es inmunológicamente activa.
En casos adicionales, una secuencia de variante de CDR incorpora 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones conservadas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas incluyen sustituciones de aminoácidos que sustituyen un aminoácido dado con otro aminoácido de características similares e incluyen además, entre los aminoácidos alifáticos, intercambio de alanina, valina, leucina e isoleucina; intercambio de los restos hidroxilo serina y treonina, intercambio de los restos ácidos aspartato y glutamato, sustitución entre los restos amida asparagina y glutamina, intercambio de los restos básicos lisina y arginina, y sustituciones entre los restos aromáticos fenilalanina y tirosina.
En otros casos más, una secuencia de variante de CDR incorpora sustituciones que potencian las propiedades de la CDR, tales como aumento en la estabilidad, resistencia a proteasas y/o afinidades de unión por CD33 o CD3.
En otros casos, una secuencia de variante de CDR se modifica para cambiar restos no críticos o restos en regiones no críticas. Los aminoácidos que no son críticos se pueden identificar por métodos conocidos, tales como maduración por afinidad, recorrido de CDR, mutagénesis dirigida al sitio, cristalización, resonancia magnética nuclear, marcado por fotoafinidad o mutagénesis de barrido de alanina.
En aspectos alternativos adicionales de la divulgación, las proteínas de unión a CD33 y CD3 comprenden dominios de cadena pesada y ligera que son homólogos o variantes inmunológicamente activos de secuencias de dominio de cadena pesada y ligera proporcionadas en el presente documento. Por consiguiente, en algunos aspectos de la divulgación, una proteína de unión a CD33 y CD3 comprende una secuencia de dominio de cadena pesada o ligera que es similar a, pero no idéntica a, la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 1-20 o 64-71. En ciertos casos, una secuencia de dominio de cadena pesada o ligera de variante tiene una identidad de secuencia de 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 % o 80 % en comparación con la secuencia de SEQ ID NO: 1-20 o 64-71 y que es inmunológicamente activa.
En casos adicionales, una secuencia de dominio de cadena pesada o ligera de variante incorpora 1, 2, 3, 4 o 5 sustituciones conservadas de aminoácidos. Las sustituciones conservativas incluyen sustituciones de aminoácidos que sustituyen un aminoácido dado con otro aminoácido de características similares e incluyen además, entre los aminoácidos alifáticos intercambio de alanina, valina, leucina e isoleucina; intercambio de los restos hidroxilo serina y treonina, intercambio de los restos ácidos aspartato y glutamato, sustitución entre los restos amida asparagina y glutamina, intercambio de los restos básicos lisina y arginina, y sustituciones entre los restos aromáticos fenilalanina y tirosina.
En otros casos más, una secuencia de dominio de cadena pesada o ligera de variante incorpora sustituciones que potencian las propiedades de la CDR, tales como aumento en la estabilidad, resistencia a proteasas y/o afinidades de unión por CD33 o CD3.
En otros casos, una secuencia de dominio de cadena pesada o ligera de variante se modifica para cambiar restos no críticos o restos en regiones en regiones no críticas. Los aminoácidos que no son críticos se pueden identificar por métodos conocidos, tales como maduración por afinidad, recorrido de CDR, mutagénesis dirigida al sitio, cristalización, resonancia magnética nuclear, marcado por fotoafinidad o mutagénesis de barrido de alanina.
Diacuerpos biespecíficos y en tándem de CD33 y CD3
En otro aspecto, una proteína de unión a CD33 o la proteína de unión a CD33 y CD3 biespecífica es un dímero, es decir, comprende dos polipéptidos con sitios de unión al antígeno para CD33 y CD3.
También se proporciona en el presente documento en otro aspecto una proteína de unión a CD33 y CD3 dimérica y biespecífica en el formato de un diacuerpo en tándem (TandAb®). Dichos diacuerpos en tándem se construyen uniendo cuatro dominios de unión variables del anticuerpo (dos dominios de cadena pesada variable (VH) y dos dominios de cadena ligera variable (VL) en una construcción génica única (Figura 1) que permite la homodimerización. En dichos diacuerpos en tándem, la longitud del conector es tal que previene el emparejamiento intramolecular de los dominios variables de manera que la molécula no se pueda plegar de nuevo en sí misma para formar un diacuerpo de una sola cadena, sino que más bien sea forzada a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena. Los dominios también están dispuestos de forma que los dominios VH y VL correspondientes se emparejen durante esta dimerización. Tras la expresión de una construcción génica única, dos cadenas de polipéptidos idénticas se pliegan cabeza con cola formando un homodímero funcional no covalente de aproximadamente 105 kDa (Figura 1). A pesar de la ausencia de enlaces covalentes intermoleculares, el homodímero es altamente estable una vez formado, sigue intacto y no vuelve a la forma monomérica.
Los diacuerpos en tándem tienen varias propiedades que proporcionan ventajas con respecto a los anticuerpos monoclonales tradicionales y otras moléculas biespecíficas más pequeñas. Los diacuerpos en tándem solo contienen dominios variables de anticuerpo y, por tanto, se contempla que carecen de efectos secundarios o interacciones no específicas que se puedan asociar con un resto Fc. Por ejemplo, los receptores de Fc que pueden unirse a dominios Fc se encuentran en numerosos tipos de células, tales como glóbulos blancos (por ejemplo, basófilos, linfocitos B, eosinófilos, linfocitos citolíticos espontáneos, neutrófilos y similares) o células de Kuppfer. Debido a que los diacuerpos en tándem permiten la unión bivalente a cada uno de CD33 y CD3, la avidez es la misma que la de una IgG. El tamaño de un diacuerpo en tándem, de aproximadamente 105 kDa, es más pequeño que el de una IgG, que puede permitir la penetración tumoral potenciada. Sin embargo, este tamaño está muy por encima del umbral renal para la depuración de primer paso, que ofrece una ventaja farmacocinética en comparación con formatos biespecíficos más pequeños basados en dominios de unión a anticuerpo o armazones no de anticuerpo. Además, los diacuerpos en tándem son ventajosos con respecto a otras proteínas de unión biespecífica, tales como moléculas BiTE o DART, basándose en estas propiedades farmacocinéticas y de avidez que dan como resultado semividas intrínsecas más largas y rápida citotoxicidad. Los diacuerpos en tándem se expresan bien en células hospedadoras, por ejemplo, células CHO de mamífero. Se contempla que el sólido proceso de fabricación aguas arriba y aguas abajo está disponible para los diacuerpos en tándem.
Los diacuerpos en tándem biespecíficos de CD33 y CD3 descritos en el presente documento se diseñan para permitir el direccionamiento específico de células tumorales CD33+ reclutando linfocitos T citotóxicos. Esto mejora la ADCC (la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo) en comparación con los anticuerpos de longitud completa dirigidos a un único antígeno y que no son capaces de reclutar directamente linfocitos T citotóxicos. A diferencia, acoplando moléculas de CD3 expresadas específicamente en estas células, el diacuerpo en tándem puede reticular los linfocitos T citotóxicos con células tumorales CD33+ en un modo altamente específico, aumentando así significativamente el potencial citotóxico de dichas moléculas. Este mecanismo se expone brevemente en la Figura 2. El diacuerpo en tándem muestra ADCC fuerte, específica y eficiente. Se informa que los linfocitos T pueden desempeñar una función en controlar el crecimiento tumoral. Por ejemplo, se mostró que la presencia de linfocitos T citotóxicos en tumores colorrectales, así como ganglios linfáticos de pacientes con LNH, se correlacionaba con un mejor desenlace clínico. Además, se ha demostrado el potencial de las terapias diseñadas para inducir respuestas de linfocitos T para vacunas contra melanoma, así como el anticuerpo dirigido contra CTLA-4, un regulador negativo de la activación de linfocitos T. Los diacuerpos en tándem descritos en el presente documento se acoplan a linfocitos T citotóxicos por unión a CD3 expresado en la superficie, que forma parte del receptor de linfocitos T. La unión simultánea de este diacuerpo en tándem a CD3 y a CD33 expresada sobre la superficie de células tumorales particulares provoca la activación de linfocitos T y media en la posterior lisis de la célula tumoral (Figura 2).
Por tanto, en un aspecto adicional es un diacuerpo en tándem multiespecífico. En algunos aspectos, un diacuerpo en tándem multiespecífico tiene especificidades por dos, tres o más epítopes diferentes, en donde dos o más epítopes pueden ser de la misma diana de antígeno o de diferentes dianas de antígeno. En ciertas realizaciones, el diacuerpo en tándem multiespecífico es biespecífico y tetravalente, es decir, comprende cuatro sitios de unión al antígeno. Dicho diacuerpo en tándem biespecífico según la invención se une con dos sitios de unión al antígeno a CD3 humano y con otros dos sitios de unión al antígeno a CD33 humano, es decir, el diacuerpo en tándem se une bivalentemente a cada antígeno.
En algunos aspectos, un , diacuerpo en tándem de unión al antígeno biespecífico es específico de CD33 humano y CD3 humano, en donde dicho diacuerpo en tándem comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, teniendo cada polipéptido al menos cuatro dominios de cadena variables unidos uno después del otro, en donde cada polipéptido comprende
(i) un dominio de cadena pesada variable (VH) específico de CD33 humano;
(ii) un dominio de cadena ligera variable (VL) específico de CD33 humano;
(iii) un dominio VH específico de CD3 humano, y
(iv) un dominio VL específico de CD3 humano.
En realizaciones particulares, un diacuerpo en tándem biespecífico se une específicamente a un epítope de CD33 humano que está dentro de 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) (restos de aminoácidos 62-70 de SEQ iD NO: 93) de CD33 humano. En particular casos, dicho diacuerpo en tándem comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, teniendo cada polipéptido al menos cuatro dominios de cadena variables unidos uno después del otro, en donde cada polipéptido comprende
(i) un dominio de cadena pesada variable específico de un epítope de CD33 humano que está dentro de 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) (restos de aminoácidos 62-70 de SEQ ID NO: 93) de CD33 humano;
(ii) un dominio de cadena ligera variable específico de un epítope de CD33 humano que está dentro de 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) (restos de aminoácidos 62-70 de SEQ ID NO: 93) de CD33 humano;
(iii) un dominio de cadena pesada variable específico de CD3 humano, y
(iv) un dominio de cadena ligera variable específico de CD3 humano.
En otras realizaciones, en el presente documento se describen diacuerpos en tándem de CD33/CD3 que tienen una afinidad por CD33 en células CD33+ con una Kd de 10 nM o menos, 5 nM o menos, 1 nM o menos, o 0,5 nM o menos. Las células CD33+ se pueden seleccionar de células tumorales tales como, por ejemplo, HL-60 o KG-1.
En una realización adicional, un diacuerpo en tándem de CD33/CD3 descrito en el presente documento se une a CD3 y en ciertos casos a la cadena épsilon de CD3 en células CD3+, particularmente linfocitos T, con una Kd de 10 nM o menos, 5 nM o menos o 2 nM o menos.
Según la invención, cada polipéptido de un diacuerpo en tándem biespecífico comprende una de las siguientes combinaciones de los cuatro dominios de cadena variable: combinación (a)-(f) citada en la reivindicación 1.
Como se usa en el presente documento, ''dímero'' se refiere a un complejo de dos polipéptidos. En ciertas realizaciones, los dos polipéptidos se asocian no covalentemente entre sí, en particular con la condición de que no exista enlace covalente entre los dos polipéptidos. En ciertos casos, los dos polipéptidos tienen asociaciones covalentes, tales como enlaces disulfuro que se forman para ayudar en la estabilización del dímero. En ciertas realizaciones, el dímero es homodímero, es decir, comprende dos polipéptidos idénticos. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de restos de aminoácidos unidos por enlaces amida. El polipéptido es, en ciertos casos, una proteína de fusión de una sola cadena, que no está ramificada. En el polipéptido, los dominios variables de anticuerpo se unen uno después del otro. El polipéptido, en otros casos, puede tener restos de aminoácidos contiguos, además de los restos de extremo N y/o extremo C de dominio variable. Por ejemplo, dichos restos de aminoácidos contiguos pueden comprender una secuencia de identificación, en algunos casos en el extremo C, que se contempla que es útil para la purificación y detección del polipéptido.
En un aspecto, cada polipéptido del diacuerpo en tándem biespecífico comprende cuatro dominios variables, una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) de una proteína de unión a CD3, así como una cadena ligera variable (VL) y una cadena pesada variable (VH) de una proteína de unión a CD33. En ciertos aspectos, se unen cuatro dominios variables por conectores peptídicos L1, L2 y L3 y en algunos casos se disponen desde el extremo N al C del siguiente modo:
Orden de dominios:
(1) VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); o
(2) VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3); o
(3) VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); o
(4) VH(CD33)-L1 -VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33).
La longitud de los conectores influye en la flexibilidad del diacuerpo en tándem de unión al antígeno según estudios informados. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la longitud de los conectores peptídicos L1, L2 y L3 es tal que los dominios de un polipéptido se pueden asociar intermolecularmente con los dominios de otro polipéptido para formar el diacuerpo en tándem de unión al antígeno dimérico. En ciertas realizaciones, dichos conectores son "cortos", es decir, consisten en 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 restos de aminoácidos. Así, en ciertos casos, los conectores consisten en aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos. En el caso de 0 restos de aminoácidos, el conector es un enlace peptídico. Dichos conectores cortos favorecen la dimerización intermolecular de los dos polipéptidos por unión y formación de sitios de unión al antígeno correctos entre los dominios de cadena ligera variable del anticuerpo y los dominios de cadena pesada variable del anticuerpo de diferentes polipéptidos. El acortamiento del conector hasta aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos, en general, previene que dominios adyacentes de la misma cadena de polipéptidos interaccionen intramolecularmente entre sí. En algunas realizaciones, estos conectores consisten en aproximadamente 3 a aproximadamente 10, por ejemplo 4, 5 o 6 restos de aminoácidos contiguos.
Con respecto a la composición de aminoácidos de los conectores, se seleccionan péptidos que no interfieren con la dimerización de los dos polipéptidos. Por ejemplo, los conectores que comprenden restos glicina y serina proporcionan, en general, resistencia a proteasas. La secuencia de aminoácidos de los conectores se puede optimizar, por ejemplo, por métodos de presentación en fagos para mejorar la unión al antígeno y el rendimiento de producción del dímero de polipéptido de unión al antígeno. Los ejemplos de conectores peptídicos adecuados para un diacuerpo en tándem en algunas realizaciones son: GGs Gg S (SEQ ID NO: 95), GGSG (SEQ ID NO: 96) o GGs Gg (SEQ ID NO: 97).
Los ejemplos no limitantes de los diacuerpos en tándem que se describen en el presente documento son los diacuerpos en tándem que tienen un dominio VL y VH anti-CD33, un dominio VL y VH anti-CD3, orden de dominios y conector según la Tabla 7.
Tabla 7: Diacuerpos en tándem CD33/CD3 a modo de ejemplo (TandAb)
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En algunos aspectos de la divulgación,
un diacuerpo en tándem es el diacuerpo en tándem 01 (SEQ ID NO: 98), 02 (SEQ ID NO: 99), 03 (SEQ ID NO: 100), 04 (SEQ ID NO: 101), 05 (SEQ ID NO: 102), 06 (SEQ ID NO: 103), 07 (SEQ ID NO: 104), 08 (SEQ ID NO: 105), 09 (SEQ ID NO: 106), 10 (SEQ ID NO: 107), 11 (SEQ ID NO: 108), 12 (SEQ ID NO: 109), 13 (SEQ ID NO: 110), 14 (SEQ ID NO: 111), 15 (SEQ ID NO: 112), 16 (SEQ ID NO: 113), 17 (SEQ ID NO: 114), 18 (SEQ ID NO: 115), 19 (SEQ ID NO: 116), 20 (SEQ ID NO: 117), 21 (SEQ ID NO: 118), 22 (SEQ ID NO: 119), 23 (SEQ ID NO: 120) o 24 (SEQ ID NO: 121) como se representa en la Figura 9B a 9Y.
La proteína de unión a CD33 y la proteína de unión a CD33/CD3 biespecífica (por ejemplo, diacuerpo en tándem biespecífico de CD33/CD3) descritas en el presente documento se produce, en algunas realizaciones, expresando polinucleótidos que codifican el polipéptido del diacuerpo en tándem que se asocia con otro polipéptido idéntico para formar el diacuerpo en tándem de unión al antígeno. Por tanto, otro aspecto es un polinucleótido, por ejemplo ADN o ARN, que codifica el polipéptido de un diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento.
El polinucleótido se construye por métodos conocidos, tales como combinando los genes que codifican al menos cuatro dominios variables de anticuerpo ya sean separados por conectores peptídicos o, en otras realizaciones, directamente unidos por un enlace peptídico, en una única construcción genética operativamente unida a un promotor adecuado, y opcionalmente un terminador de la transcripción adecuado, y que lo expresa en bacterias u otro sistema de expresión apropiado tal como, por ejemplo, células CHO. Dependiendo del sistema de vectores y el hospedador utilizados, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, que incluyen promotores constitutivos e inducibles. El promotor se selecciona de forma que conduzca la expresión del polinucleótido en la célula hospedadora respectiva.
En algunos aspectos, el polinucleótido se inserta en un vector, preferentemente un vector de expresión, que representa un aspecto adicional. Este vector recombinante se puede construir según métodos conocidos.
Se puede utilizar una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedador para contener y expresar el polinucleótido que codifica el polipéptido del diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito. Los ejemplos de vectores de expresión para la expresión en E. coli son pSKK (Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1 ):111 -27) o pcDNA5 (Invitrogen) para la expresión en células de mamífero.
Así, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento, en algunos aspectos, se produce introduciendo un vector que codifica el polipéptido como se ha descrito anteriormente en una célula hospedadora y cultivando dicha célula hospedadora en condiciones por las cuales las cadenas de polipéptidos se expresan, se pueden aislar y, opcionalmente, purificar más.
En otros aspectos, la proteína de unión a CD33 o la proteína de unión a CD33/CD3 biespecífica (por ejemplo, diacuerpo en tándem biespecífico de CD33/CD3) descrita en el presente documento tiene una modificación. Las modificaciones típicas incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, fijación covalente de flavina, fijación covalente de un resto hemo, fijación covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, fijación covalente de un lípido o derivado de lípido, fijación covalente de fosfatidilinositol, conjugación de fármacos, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclajes con GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenilación, sulfatación, adición mediada por ARN de transferencia de aminoácidos a proteínas tales como arginilación, y ubiquitinación. En realizaciones adicionales, la proteína de unión a CD33 o la proteína de unión a CD33/CD3 biespecífica se modifica con aminoácidos adicionales, tales como una secuencia conductora o secretora o una secuencia para la purificación del polipéptido.
En otros aspectos, en el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de unión a CD33, un diacuerpo en tándem de unión al antígeno, un vector que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido del diacuerpo en tándem de unión al antígeno o una célula hospedadora transformada por este vector y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye, pero no se limita a, cualquier vehículo que no interfiera con la eficacia de la actividad biológica de los componentes y que no sea tóxico para el paciente al que se administra. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen disoluciones de solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles etc. Dichos vehículos se pueden formular por métodos convencionales y se pueden administrar al sujeto a una dosis adecuada. Preferentemente, las composiciones son estériles. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, emulsionantes y dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede garantizar por la inclusión de diversos antibacterianos y antifúngicos.
Las proteínas de unión a CD33/CD3 biespecíficas con unión de alta afinidad a CD33 y CD3 son altamente activas en un gran número de especímenes primarios de LMA, sugiriendo que estas moléculas podrían ser activas contra LMA humana en todo el espectro de enfermedad citogenética/molecular, incluso en casos de expresión mínima de CD33. Es interesante que también se observa citotoxicidad específica de fármaco en presencia de linfocitos T autólogos residuales y aumenta significativamente mediante la adición de cantidades controladas de linfocitos T de donante sano (véase el Ejemplo 6).
Las proteínas de unión a CD33/CD3 biespecíficas, en particular los diacuerpos en tándem, pueden inducir la potente citólisis de células leucémicas CD33+ in vitro. Los datos indican que la unión de alta afinidad a tanto CD33 como CD3 maximiza la activación inducida por proteínas biespecíficas de linfocitos T y la eficacia anti-LMA. Las proteínas de unión biespecíficas dirigidas a CD33/CD3 de alta afinidad, tales como los diacuerpos en tándem descritos en el presente documento, muestran actividad citolítica en LMA primaria in vitro. Así, estos proteínas de unión biespecífica y los diacuerpos en tándem son adecuados para un enfoque terapéutico para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (LMA) u otros tumores malignos hematológicos, por ejemplo, síndrome de displasia mieloide (SDM) o enfermedad mieloproliferativa (EMP).
Por tanto, en el presente documento se proporcionan métodos en donde el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento anteriormente se administra en una dosis eficaz a un sujeto, por ejemplo, un paciente, para el tratamiento de un cáncer CD33+ (por ejemplo leucemia mieloide aguda (LMA)), enfermedad o afección. Los cánceres CD33+ incluyen, pero no se limitan a, leucemias agudas tales como leucemia mieloide aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA) que incluye leucemia linfoblástica de precursores de linfocitos B, sarcoma mieloide, mieloma múltiple, linfomas agudos tales como linfoma linfoblástico agudo, leucemia mielomonocítica crónica y similares. Las enfermedades y afecciones de CD33+ incluyen estados inmunosupresores o entornos atribuidos por células supresoras derivadas de mieloide (CSDM) en ciertos cánceres e inflamación crónica.
En algunas realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de leucemia mieloide aguda (LMA). En ciertas realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de un subtipo de leucemia mieloide aguda.
El sistema de clasificación franco-anglo-estadounidense divide la LMA en ocho subtipos: LMA-M0 (mínimamente diferenciada), LMA-M1 (sin maduración), LMA-M2 (con maduración granulocítica), LMA-M3 (leucemia promielocítica o promielocítica aguda), LMA-4 (leucemia mielomonocítica aguda), LMA-M5 (leucemia monoblástica aguda o monocítica), LMA-M6 (leucemia eritroide aguda) y LMA-M7 (leucemia megacarioblástica aguda). En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de LMA-M0, LMA-M1, LMA-M2, LMA-M3, LMA-M4, LMA-M5, LMA-M6 o LMA-M7.
El esquema de clasificación de LMA de la OMS clasifica la LMA según los siguientes subtipos: LMA con anomalías genéticas recurrentes, LMA con cambios relacionados con mielodisplasia, neoplasias mieloides relacionadas con la terapia, sarcoma mieloide, proliferaciones mieloides relacionadas con síndrome de Down, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas y LMA no clasificada de otro modo. En ciertos otros casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de LMA con anomalías genéticas recurrentes, LMA con cambios relacionados con mielodisplasia, neoplasias mieloides relacionadas con la terapia, sarcoma mieloide, proliferaciones mieloides relacionadas con síndrome de Down, neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas o LMA no clasificada de otro modo.
En algunas otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de una LMA recién diagnosticada, recurrente o resistente al tratamiento.
En realizaciones adicionales, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de un trastorno de la sangre preleucémico tal como síndrome displásico mieloide (SDM) o enfermedad mieloproliferativa (EMP). En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de SDM. En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de EMP.
En otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de mieloma múltiple. En realizaciones adicionales, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para el tratamiento de leucemia mielomonocítica crónica (LMMC).
En otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para inhibir o eliminar células supresoras derivadas de mieloides (CSDM). Las CSDM expresan altamente en exceso CD33 en ciertos tejidos enfermos aislados y poseen fuertes actividades inmunosupresoras. En ciertos cánceres humanos (CD33+ así como no CD33+), las CSDM proliferan y se activan para suprimir respuestas CD4+ específicas de tumor de linfocitos T e inducir células Treg, que permite que el tumor o cáncer florezca en un microentorno. En inflamación crónica, las CSDM se expanden supuestamente y se encuentran en sitios de inflamación para suprimir la función inmunitaria de linfocitos T. En otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para tratar una afección asociada a CSDM. En aún otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para tratar supresión inmunitaria. En aún otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para tratar inflamación suprimida por CSDM. En aún otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para tratar una respuesta inmunitaria reducida provocada por CSDM. En aún otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para tratar angiogénesis, invasión tumoral o metástasis de cánceres que son promovidos por CSDM. En aún otras realizaciones, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno como se describe en el presente documento se administra para tratar un cáncer o tumor que se potencia, incrementa, agrava o aumenta por CSDM.
El diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se contempla para su uso como un medicamento. La administración se efectúa por diferentes formas, por ejemplo por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. En algunas realizaciones, la vía de administración depende del tipo de terapia y el tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. La pauta posológica será determinada por el médico adjunto y otros factores clínicos. Las dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, que incluyen el tamaño del paciente, el área superficial del cuerpo, edad, sexo, el compuesto particular a administrar, el tiempo y la vía de administración, el tipo de terapia, la salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente. Una "dosis eficaz" se refiere a cantidades del principio activo que son suficientes para afectar la evolución y la intensidad de la enfermedad, que conducen a la reducción o remisión de dicha patología. Se puede determinar una "dosis eficaz" útil para tratar y/o prevenir LMA usando métodos conocidos.
En realizaciones adicionales, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con una terapia habitual para cánceres, enfermedades o afecciones CD33+. Las terapias habituales incluyen quimioterapias, inmunoterapias, terapias hormonales, radiación, cirugía, terapias génicas y similares. En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con una terapia habitual para LMA. En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con citarabina, azacitidina, decitabina, una antraciclina (por ejemplo, daunorubicina, idarubicina, doxorubicina y similares), amsacrina, fludarabina, clofarabina, cladribina, nelarabina, metotrexato, bortezomib, carfilzomib, melfalán, ibrutinib, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, apremilast, una epipodofilotoxina (por ejemplo, etopósido, tenipósido y similares), una antracenodiona (por ejemplo, mitoxantrona, pixantrona, losoxantrona, piroxantrona, ametantrona y similares), un agente anti-CD20 (por ejemplo, rituximab, ocrelizumab, ofatumumab o combinaciones de los mismos). En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con citarabina (ara-C). En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con azacitidina. En ciertos casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con decitabina. En casos adicionales, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con una antraciclina (por ejemplo, daunorubicina, idarubicina, doxorubicina y similares). En otros casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con un inhibidor del punto de regulación (por ejemplo, inhibidor de PD-1, inhibidor de CTLA-4 y similares). En aún otros casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con una epipodofilotoxina (por ejemplo, etopósido, tenipósido y similares). En aún otros casos, el diacuerpo en tándem de unión al antígeno descrito en el presente documento se administra en combinación con una antracenodiona (por ejemplo, mitoxantrona, pixantrona, losoxantrona, piroxantrona, ametantrona y similares).
Los siguientes ejemplos ilustran aún más las realizaciones descritas sin limitar el alcance de la invención.
EJEMPLO 1
Clonación de construcciones de expresión de ADN que codifican anticuerpos Fv de una sola cadena
Para la expresión bacteriana de anticuerpos Fv de una sola cadena (scFv) anti-CD33 en E. coli, se clonaron secuencias codificantes de ADN de todas las moléculas en un vector de expresión bacteriano. Todas las construcciones de expresión se diseñaron para contener secuencias codificantes para un péptido señal de extremo N y marca de hexahistidina (6xHis) de extremo C (SEQ ID NO: 122) para facilitar la secreción de anticuerpos en el periplasma y la purificación, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VL y VH de todos los clones scFv anti-CD33 se muestran en la Tabla 3 y Tabla 4.
Expresión de anticuerpos scFv anti-CD33 recombinantes en E. coli
Se expresaron anticuerpos scFv recombinantes como proteínas secretadas solubles en el periplasma de E. coli. En una primera etapa se inoculó un cultivo pequeño de medio complementado con ampicilina con bacterias transformadas y se incubó durante 16 h a 28 °C. Posteriormente, se ajustó la densidad óptica añadiendo un segundo medio complementado con ampicilina y se incubó una vez más a 28 °C hasta que se alcanzó una densidad óptica en el intervalo de 0,6 - 0,8 a 600 nm. Se indujo la expresión de proteínas mediante la adición de IPTG 50 pM y la incubación de cultivos a 21-28 °C y 200 rpm durante hasta 16 h. Después de la incubación, se sedimentaron las células (30 min, 4 °C, 7500 rpm) y se guardaron a -20 °C hasta el posterior procesamiento.
Purificación de anticuerpos Fv de una sola cadena anti-CD33
Se extrajeron scFv recombinantes de periplasma de E. coli después de la centrifugación de cultivos de células bacterianas resuspendiendo sedimentos de células en tampón e incubación durante 30 min a temperatura ambiente con agitación suave. Se sedimentaron las células y se mantuvieron los sobrenadantes que contenían las proteínas recombinantes. El procedimiento se repitió una vez más antes de que se reunieran los sobrenadantes y se homogeneizaran por ultrasonicación. Se diluyeron los homogeneizados, se complementaron con bajas concentraciones de imidazol y se cargaron en una columna de cromatografía de afinidad por metal (IMAC) inmovilizada previamente rellena (GE Healthcare). La columna se lavó hasta que se alcanzó el nivel inicial y entonces se eluyó la proteína unida con un tampón de imidazol. Se reunieron las fracciones que contenían el anticuerpo y posteriormente se purificaron por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Finalmente, se concentraron los eluatos de proteína por ultrafiltración y se dializaron contra tampón de almacenamiento. Posterior al tratamiento a bajo pH (incubación a pH 3,0 durante 20-24 h a 37 °C), las muestras se neutralizaron usando Tris. Las proteínas purificadas se conservaron como alícuotas a -80 °C hasta uso.
EJEMPLO 2
Clonación de construcciones de expresión de ADN que codifican diacuerpos en tándem (TandAb®)
Para la expresión de diacuerpos en tándem biespecíficos en células CHO, se clonaron secuencias codificantes de todas las moléculas en un sistema de vector de expresión de mamífero. Se usaron los dominios de scFv anti-CD33 del Ejemplo 1 para construir diacuerpos en tándem de CD33/CD3 en combinación con un dominio de scFv anti-CD3, con dominios organizados como se muestra en la Tabla 7 y la Figura 3. En resumen, se sintetizaron y se subclonaron las secuencias de genes que codifican dominios VH y VL de anti-CD33 separados por un conector peptídico (VHconector-VL o VL-conector-VH). Se digirió la construcción resultante para generar secuencias codificantes de VH y VL separadas que utilizan un sitio de restricción Bam HI situado dentro de la secuencia conectora. Estos fragmentos VH y VL se ligaron entonces con un fragmento de ADN que codificaba los dominios VH y VL anti-CD3 (VH-conector-VL o VL-conector-VH) dando la construcción final. Las variantes de órdenes de dominios 1 a 3 de diacuerpos en tándem de CD33/CD3 se muestran en la Figura 3. Todas las construcciones de expresión se diseñaron para contener secuencias codificantes para un péptido señal de extremo N y una marca de hexahistidina (6xHis) de extremo C (SEQ ID NO: 122) para facilitar la secreción y purificación de anticuerpos, respectivamente.
Expresión de los diacuerpos en tándem en células CHO transfectadas establemente
Se usó un sistema de expresión de células CHO (Flp-In®, Life Technologies), un derivado de células de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC, CCL-61) (Kao y Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81). Las células adherentes se subcultivaron según protocolos habituales de cultivo celular proporcionados por Life Technologies.
Para la adaptación al crecimiento en suspensión, las células se desprendieron de los matraces de cultivo de tejido y se dispusieron en medio sin suero. Se criopreservaron las células adaptadas a la suspensión en medio con 10 % de DMSO.
Se generaron líneas celulares CHO recombinantes que expresan establemente diacuerpos en tándem secretados por transfección de células adaptadas a la suspensión. Durante la selección con el antibiótico higromicina B se midieron densidades celulares viables dos veces a la semana, y se centrifugaron las células y se resuspendieron en medio de selección recién preparado a una densidad máxima de 0,1x106 células viables/mL. Se recuperaron conjuntos de células que expresan establemente los diacuerpos en tándem después de 2-3 semanas de selección, momento en el que las células se transfirieron a medio de cultivo habitual en matraces con agitación. Se confirmó la expresión de proteínas secretadas recombinantes realizando electroforesis en gel de proteína o citometría de flujo. Los conjuntos de células estables se criopreservaron en medio que contenía DMSO.
Se produjeron diacuerpos en tándem en los cultivos de 10 días de lotes alimentados de líneas celulares CHO transfectadas establemente por secreción en el sobrenadante de cultivo celular. Los sobrenadantes de cultivo celular se recogieron después de 10 días a viabilidades de cultivo de normalmente >75 %. Las muestras se recogieron de los cultivos de producción cada dos días y se evaluaron la densidad celular y la viabilidad. En el día de la recogida, los sobrenadantes de cultivo celular se purificaron por centrifugación y filtración a vacío antes del uso posterior.
Se analizaron por SDS-PAGE la expresión de títulos de proteínas y la integridad de productos en sobrenadantes de cultivo celular.
Purificación de diacuerpos en tándem
Se purificaron los diacuerpos en tándem a partir de sobrenadantes de cultivo de células CHO en un procedimiento de dos etapas. Se sometieron las construcciones marcadas con His6 (SEQ ID NO: 122) a cromatografía en Superflow con Ni-NTA en una primera etapa, seguido por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) preparativa en Superdex 200 en una segunda etapa. Se caracterizaron los diacuerpos en tándem eluidos con respecto a su contenido de homodímero (diacuerpo en tándem) y se reunieron si el contenido de homodímero era 90 % o más alto. Finalmente, se intercambiaron de tampón las muestras reunidas y se concentraron por ultrafiltración hasta una concentración típica de >1 mg/mL. Se evaluaron la pureza y la homogeneidad (normalmente >90 %) de las muestras finales por SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, seguido por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-marca de His, así como por SEC analítica, respectivamente. Las proteínas purificadas se conservaron en alícuotas a -80 °C hasta su uso.
Se muestran polipéptidos de diacuerpos en tándem de CD33/CD3 en la Tabla 7 y la Figura 3. Cada diacuerpo en tándem consiste en dos polipéptidos idénticos (Figura 1). Ambos conectores L1 y L3 externos contuvieron seis aminoácidos GGSGGS (SEQ ID NO: 95), mientras que el conector peptídico central 2 varió en longitud (4-6 aminoácidos) con las secuencias GGSG (SEQ ID NO: 96), GGSGG (SEQ ID NO: 97) o GGSGGS (SEQ ID NO: 95), respectivamente.
Usando una serie de dominios variables anti-CD33 y dominios variables anti-CD3 se generó un gran número de moléculas de diacuerpo en tándem que podrían ser establemente producidas en líneas celulares transfectadas y que mantuvieron la estabilidad a temperatura corporal, así como después de los ciclos repetidos de congelación/descongelación. Para facilitar el posterior desarrollo y estudios de toxicología preclínica, se puso énfasis en la selección de moléculas de diacuerpo en tándem que mostraron unión a tanto CD33 humano como de macaco cangrejero. Se muestran ejemplos de secuencias de aminoácidos completas para la cadena sencilla de los diacuerpos en tándem 12 (SEQ ID NO: 109), 14 (SEQ ID NO: 111) y 16 (SEQ ID NO: 113) en las Figuras 9M, 9O y 9Q, respectivamente. En este ejemplo, el orden de los dominios variables y sus conectores para las estructuras es: VL (CD3)-L1 -VH (CD33)-L2-VL (CD33)-L3-VH (CD3).
EJEMPLO 3
Determinación de la afinidad de anticuerpos por citometría de flujo
Se incubaron células con 100 pL de diluciones sucesivas de diacuerpos en tándem de CD33/CD3. Después de lavar tres veces con tampón FACS, las células se incubaron con 0,1 mL de 10 pg/mL de anticuerpo monoclonal anti-His de ratón en el mismo tampón durante 45 min sobre hielo. Después de un segundo ciclo de lavado, las células se incubaron con 0,1 mL de 15 pg/mL de anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón conjugada con FITC en las mismas condiciones que antes. Como control, las células se incubaron con la IgG anti-His, seguido por los anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón conjugada con FITC sin diacuerpos en tándem anti-CD33. Entonces se lavaron nuevamente las células y se resuspendieron en 0,2 mL de tampón FACS que contenía 2 pg/mL de yoduro de propidio (PI) para excluir células muertas. Se midió la fluorescencia de 1x104 células vivas usando un citómetro de flujo FC500 MPL de Beckman-Coulter usando el software MXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemania) o un citómetro de flujo Guava EasyCyte de Millipore usando el software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemania). Se calcularon las intensidades medias de fluorescencia de las muestras de células usando el software CXP (Beckman-Coulter, Krefeld, Alemania) o el software Incyte (Merck Millipore, Schwalbach, Alemania). Después de restar los valores de intensidad de fluorescencia de las células teñidas con los reactivos secundarios y terciarios solos, se usaron los valores para el cálculo de los valores de Kd con la ecuación para unión en un sitio (hipérbola) de GraphPad Prism (versión 6.00 para Windows, GraphPad Software, La Jolla California, EE. UU.).
Se probaron los diacuerpos en tándem para sus afinidades de unión a células CD3+ y CD33+ humanas y células CD3+ y CD33+ de cangrejero. Los datos de unión a modo de ejemplo para los diacuerpos en tándem seleccionados se resumen en la Tabla 8:
Tabla 8: Características de unión a CD3 y CD33 de diacuerpos en tándem de CD33/CD3:
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#Se calculó la relación de Kd CD33 cangrejero / CD33 humano basándose en los valores de Kd medidos en células CHO que expresan CD33 de cangrejero y CD33 humano, respectivamente. * Se calculó la relación de Kd CD3 hu / CD33 hu basándose en los valores de Kd medidos en células Jurkat (CD3hu) y las Kd medias de tres líneas de células tumorales CD33+ humanas (HL-60, KG-1, U937).
Se evaluó la afinidad de unión a CD3 y la reactividad cruzada en los experimentos de valoración y de citometría de flujo en células Jurkat CD3+ (proporcionadas por Dr. Moldenhauer, DKFZ Heidelberg; leucemia aguda humana de linfocitos T) y la línea celular HSC-F CD3+ de cangrejero (JCRB, cat.:JCRB1164). Se evaluó la unión a CD33 y la reactividad cruzada en las líneas de células tumorales CD33+ humanas: HL-60 (DSMZ, cat.: ACC 3, leucemia humana de precursores de linfocitos B), U-937 (DSMZ, cat.: ACC5; linfoma histiocítico humano) y KG-1 (DSMZ, cat.:ACC14; leucemia mieloide aguda). Se calculó la relación de Kd de reactividad cruzada usando los valores de Kd determinados en las líneas celulares CHO que expresan o antígenos humanos recombinantes o de cangrejero recombinantes.
Los diacuerpos en tándem presentaron una afinidad relativamente alta por CD33+ humano en la mayoría de las líneas de células tumorales probadas por debajo de 1 nM. Se determinó que las afinidades por CD3 humano eran iguales o inferiores a 2 nM.
EJEMPLO 4
Ensayo de citotoxicidad
Para el ensayo de citotoxicidad, se recogieron células diana cultivadas en condiciones normales, se lavaron y se resuspendieron en diluyente C, proporcionado en el minikit PKH67 Green Fluorescent Cell Linker, a una densidad de 2x107 células/mL. Entonces se mezcló la suspensión de células con un volumen igual de una disolución de marcado de PKH67 doblemente concentrada y se incubó durante 2-5 min a TA. Se realizó la reacción de tinción añadiendo un volumen igual de FCS e incubando durante 1 min. Después de lavar las células diana marcadas con medio completo RPMI, se contaron las células y se resuspendieron hasta una densidad de 2x105 células/mL en medio completo RPMI. Entonces se sembraron 2x104 células diana junto con linfocitos T humanos enriquecidos como células efectoras en una relación E:D de 5:1, en presencia de concentraciones crecientes de los diacuerpos en tándem indicados en pocillos individuales de una placa de microtitulación, en un volumen total de 200 gL/pocillo. Se determinó la muerte celular espontánea y la destrucción de dianas por linfocitos T en ausencia de anticuerpos para al menos tres duplicados en cada placa. Después de la centrifugación, las placas de ensayo se incubaron durante los periodos de tiempo indicados a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5 % de CO2. Después de la incubación, los cultivos se lavaron una vez con tampón FACS y luego se resuspendieron en 150 gL de tampón FACS complementado con 2 gg/mL de PI. Se midió la cantidad absoluta de células diana vivas por una tinción verde positiva con PKH67 y tinción negativa para PI usando un citómetro de flujo FC500 MPL de Beckman-Coulter (Beckman-Coulter) o un citómetro de flujo Guava EasyCyte de Millipore (Merck Millipore). Basándose en las células diana vivas restantes medidas, se calculó el porcentaje de lisis celular específica según la siguiente fórmula: [1-(número de dianas vivas(muestra)/número de dianas vivas(espontáneas))] x 100 %. Se calcularon las curvas sigmoides de respuesta a dosis y los valores de CE50 por regresión no lineal/ajuste logístico de 4 parámetros usando el software GraphPad. Se usaron los valores de lisis obtenidos para una concentración dada de anticuerpo para calcular las curvas sigmoides de dosis-respuesta por análisis de ajuste logístico de 4 parámetros usando el software Prism.
Se determinaron valores de CE50 en el ensayo de 20-24 horas en células diana U-937 CD33+ (DSMZ, cat.: ACC5; linfoma histiocítico humano) con linfocitos T humanos enriquecidos como células efectoras a una relación de 5:1. También se probaron algunos de los diacuerpos en tándem en ensayos de citotoxicidad en células diana KG-1 CD33+ (DSMZ, cat.:ACC14; leucemia mieloide aguda) y HL-60. Específicamente, se eligieron células HL-60 como modelo de una LMA con expresión de la superficie celular relativamente alta de CD33 (IMF arbitraria [media ± EEM]: 3,133 ± 215; n=3), y se eligió KG-1 a como modelo de una LMA con expresión de CD33 muy limitada (IMF arbitraria: 277 ± 11; n=3). Los datos de citotoxicidad a modo de ejemplo para diacuerpos en tándem seleccionados se resumen en la Tabla 9. Los datos de citotoxicidad adicionales para las líneas celulares HL-60 se encuentran en la Tabla 8, última columna.
Tabla 9: Potencia in vitro de diacuerpos en tándem de CD33/CD3 en diferentes líneas de células tumorales
CD33+:
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Se determinaron los valores de CE50 en ensayos de citotoxicidad basada en FACS con linfocitos T humanos primarios como células efectoras en una relación E:D de 5:1 en las líneas celulares diana indicadas incubadas durante 20-24 horas. Se probó cada diacuerpo en tándem en cada línea de células tumorales en al menos dos experimentos independientes. Se presentan valores medios.
EJEMPLO 5
Experimentos de cribado de citotoxicidad adicional en líneas celulares de LMA CD33+ humanas en 48 horas
Como se ha descrito anteriormente, ya se detectó citotoxicidad significativa a las 24 horas; sin embargo, se pueden detectar niveles de toxicidad más altos a las 48 horas. Para los ensayos posteriores, se eligió un momento de tiempo de 48 horas. Se probó el impacto de la selección de linfocitos T sobre la citotoxicidad inducida por diacuerpos en tándem. Para realizar esto, se obtuvieron CMSP sin estimular de un donante voluntario sano, y se aislaron células CD3+ tanto por "enriquecimiento positivo" simple por uso de microperlas CD3, así como por "selección negativa" más compleja por una mezcla de microperlas de anticuerpos contra CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123 y CD235a. Como se representa en la Figura 4, la citotoxicidad inducida por diacuerpos en tándem fue mayor con linfocitos T de donante sano negativamente seleccionados que con los linfocitos T positivamente seleccionados. Sin embargo, las actividades citotóxicas relativas de los diacuerpos en tándem individuales no se afectaron por el método de selección de linfocitos T. Por tanto, se realizaron ensayos posteriores con linfocitos T de donante sano positivamente enriquecidos.
Se recogieron células mononucleares no estimuladas de voluntarios adultos sanos por leucaféresis en el Centro de procesamiento de células hematopoyéticas (Centro de excelencia) del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson (FHCRC) siguiendo los protocolos de investigación autorizados por el Comité de ética médica de FHCRC. Se enriquecieron los linfocitos T mediante clasificación de células magnética por o microperlas CD3 ("enriquecimiento positivo") o por el kit Pan T-Cell Isolation ("selección negativa"; ambos de Miltenyi Biotec, Auburn, CA), y luego se congelaron en alícuotas y se conservaron en nitrógeno líquido. Se marcaron alícuotas de células descongeladas con CellVue Burgundy 3 pM (eBioscience, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Se cultivaron CMSP purificadas en presencia de diversas concentraciones de moléculas de diacuerpo en tándem.
Para la cuantificación de la citotoxicidad inducida por fármaco, se incubaron células a 37 °C (en 5 % de CO2 y aire), como en el Ejemplo 4, a diferentes relaciones de células E:D. Después de 24-72 horas, se determinaron los números de células y la citotoxicidad inducida por fármaco, usando DAPI para detectar células no viables, usando un citómetro LSRII (BD Biosciences) y se analizaron con FlowJo. Se identificaron células de LMA por propiedades de dispersión hacia adelante/lateral y, en experimentos donde se añadieron linfocitos T de donante sano, negatividad para el colorante CellVue Burgundy (Figura 5). La citotoxicidad específica inducida por fármaco se presenta como: % de citotoxicidad = 100 x (1 - células diana vivastratadas/células diana vivascontrol). Los resultados de los ensayos de citotoxicidad se presentan como valores medios ± error estándar de la media (EEM). Se usó correlación no paramétrica de Spearman para calcular las correlaciones entre características de muestras continuas. Todos los valores de la p son bilaterales. Se realizaron análisis estadísticos usando el software GraphPad Prism.
En ausencia de linfocitos T de donante sano, ninguno de los diacuerpos en tándem de CD33/CD3 ejerció efecto citotóxico perceptible sobre las líneas celulares de LMA en ausencia de linfocitos T, confirmando el requisito absoluto de linfocitos T para sus efectos citotóxicos (datos no mostrados). En presencia de linfocitos T, el grado de citotoxicidad específica inducida por diacuerpos en tándem dependió de la concentración del diacuerpo en tándem, así como de la relación de células E:D. Las comparaciones directas entre las moléculas de diacuerpo en tándem dirigido a CD33/CD3 y un diacuerpo en tándem de control (00) indicaron diferencias considerables en la citotoxicidad inducida por anticuerpo en tanto las células HL-60 (Figura 6A/B y Tabla 10) como las células KG-1a (Figura 6C/D y Tabla 10), siendo los resultados altamente reproducibles en experimentos repetidos. En general, el grado de citotoxicidad inducida por diacuerpos en tándem se correlacionó con la afinidad de unión para CD3 en linfocitos T humanos primarios (para citotoxicidad en células KG-1 a a 25 pM (aprox. 2,5 ng/mL) y E:D=5:1: r=-0,542, p=0,009; para citotoxicidad en células HL-60 a 25 pM y E:D=5:1: r=-0,391, p=0,07). Los diacuerpos en tándem 12, 14, 16 fueron altamente citotóxicos para tanto las células HL-60 como KG-1a.
TABLA 10: Inducción y citotoxicidad de CD25 y CD69 a las 48 h de diacuerpos en tándem de CD33/CD3
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EJEMPLO 6
Caracterización adicional de diacuerpos en tándem en especímenes de LMA humana primaria
Para una caracterización exhaustiva de las propiedades citotóxicas de estos candidatos, se obtuvieron especímenes de pacientes con LMA para los estudios de un depósito de especímenes de FHCRC.
Se obtuvieron alícuotas congeladas de células mononucleares aisladas por Ficoll de especímenes de sangre periférica o de médula ósea pretratamiento ("diagnóstico") de pacientes adultos con LMA de depósitos de FHCRC. Los presentes inventores usaron los criterios de la OMS de 2008 para definir LMA (Vardiman et al.; Blood. 2009; 114(5):937-951) y los criterios mejorados del Consejo de Investigación Médica (MRC) del Reino Unido para asignar riesgo citogenético (Grimwalde et al.; Blood. 2010;116(3):354-365). Los pacientes proporcionaron el consentimiento informado por escrito para la recogida y el uso de sus bioespecímenes para fines de investigación siguiendo los protocolos autorizados por el Comité de ética médica de FHCRC. Se desidentificaron los datos clínicos en cumplimiento de las normas de la Ley de Transferencia y Responsabilidad de Seguro Médico. Después de la descongelación, las células se tiñeron con anticuerpos directamente marcados que reconocían CD33 (clon P67.6; conjugado con PE-Cy7), CD3 (clon SK7; conjugado con PerCP), CD34 (clon 8G12; conjugado con APC; todos de BD Biosciences, San Jose, CA) y CD45 (clon HI30; conjugado con APC-eFluor®780; eBioscience). Para identificar células no viables, se tiñeron las muestras con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Se adquirieron al menos 10.000 acontecimientos en un citómetro de flujo Canto II (BD Biosciences), y se analizaron las células con DAPI usando FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).
Después de la descongelación, los especímenes tuvieron >58 % de blastos de LMA, como se ha determinado por citometría de flujo basada en las propiedades de CD45/dispersión lateral. Los especímenes tuvieron >50 % de células viables inmediatamente después de la descongelación y >50 % de células viables después de 48 horas en cultivo líquido que contiene citocinas (Figura 7). La mediana de la edad de los pacientes fue 58,1 (intervalo: 23,9-76,2) años; el riesgo de enfermedad citogenética fue favorable en 2, intermedio en 18 y adverso en 7. La información sobre el estado de mutación de NPM1, FLT3 y CEBPA fue incompleta; sin embargo, se sabía que una muestra era CEBPAdoblemutante, y otra muestra era NPM1pos/FLT3-ITDneg. La mediana del porcentaje de blastos mieloides y linfocitos T CD3+ en los especímenes estudiados fue 86,1 % (intervalo: 58,4-97,0 %) y 2,0 % (intervalo: 0-11,9 %), respectivamente, y la mediana de la viabilidad de las muestras después de 48 horas en cultivo fue 80,1 % (intervalo: 53,6-93,6 %). Quince de los pacientes tuvieron LMA recién diagnosticada, mientras que 12 o tuvieron enfermedad recidivante (n=7) o resistente al tratamiento (n=5) en el momento de la recogida de especímenes. Como se resume en la Tabla 11, las características básicas de los especímenes de los pacientes con LMA recién diagnosticada fueron similares a las de aquellos con enfermedad recidivante/resistente al tratamiento con respecto a la expresión de CD33 en blastos mieloides, cantidad de linfocitos T autólogos, proporción de blastos mieloides y viabilidad del cultivo.
La adición de moléculas del diacuerpo en tándem a los cultivos de especímenes de LMA produjo citotoxicidad modesta, dependiente de la dosis (Figura 8A), que demostró que los linfocitos T autólogos, contenidos en los especímenes de pacientes con LMA activa, se pueden acoplar a la lisis de células leucémicas. En presencia de linfocitos T de donante sano, la actividad citotóxica de diacuerpos en tándem individuales fue estrictamente dependiente de la dosis de fármaco y la relación de células E:D (Figura 8B/C). Sin embargo, se observó alta actividad de los diacuerpos en tándem incluso en algunos especímenes con expresión muy baja de CD33 en blastos de LMA. Entre las moléculas de diacuerpo en tándem, pareció que 12 eran los más activos, puesto que tuvieron la citotoxicidad más alta a bajas concentraciones (2,5 pM (aprox. 250 ng/mL) y, a un grado menos pronunciado, también 10 pM (aprox. 1 ng/mL)) a tanto E:D=1:3 como E:D=1:1.
Se han seleccionado diacuerpos en tándem de CD33/CD3 en muestras de sangre de pacientes con LMA representativos, que variaron en términos de sexo del paciente, edad, estadio de enfermedad (recién diagnosticada, recidivante, resistente al tratamiento), grado de expresión de CD33 y riesgo citogénico (Tabla 11). Sorprendentemente, varios diacuerpos en tándem examinados (por ejemplo, 02, 08, 09, 11, 12, 14, 16, 19, 22 y 23) fueron altamente activos en casi todas las muestras de paciente en el espectro de enfermedades que se muestra en la Figura 15. Además, el grado y el alcance de la actividad son similares en todos los estadios de LMA, que incluye pacientes recién diagnosticados, recidivantes y resistentes al tratamiento.
TABLA 11. Características de especímenes primarios de LMA
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EJEMPLO 7
Potencia y eficacia del diacuerpo en tándem de CD33/CD3 12 y el diacuerpo en tándem 16 sobre diferentes líneas celulares CD33+ de diverso origen que expresan diferentes niveles de CD33
Para evaluar si la potencia y la eficacia de diacuerpos en tándem de CD33/CD3 dependen de la densidad de CD33 en las células diana, se probaron diversas líneas de células tumorales CD33+ humanas y células CHO que expresaban CD33 humanas recombinante para sus niveles de expresión de CD33 usando el kit de cuantificación QIFIKIT y el mAb anti-CD33 WM53. Los resultados en la Tabla 12 muestran que las densidades de CD33 en las líneas de células tumorales estuvieron en el intervalo entre ~1300 CUAN (capacidad de unión a anticuerpos normalizada) y -46000 CUAN. La expresión en células CHO-CD33 fue -197000 CUAN, sustancialmente superior a en las líneas de células tumorales. Todas las líneas celulares CD33+ probadas se usaron como células diana en al menos 3 ensayos de citotoxicidad basados en FACS independientes con linfocitos T humanos como células efectoras a una relación entre efectoras y diana de 5:1 en presencia de diluciones sucesivas del diacuerpo en tándem de CD33/CD312 y el diacuerpo en tándem 16. En cada ensayo, se calcularon los valores de CE50 y de lisis medida por diacuerpos en tándem por regresión no lineal. Los resultados demuestran que ni la potencia (valores de CE50) ni la eficacia (% de lisis) de 12 y 16 se correlaciona con la densidad de CD33 sobre la superficie de células diana.
Notablemente, al menos 12 y 16 presentan su actividad citotóxica también contra células como SEM con densidades de CD33 muy bajas inferiores a 1500 CUAN.
Tabla 12: Expresión superficial de células diana CD33 y potencia citotóxica del diacuerpo en tándem de CD33/CD3 12 y el diacuerpo en tándem 16:
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Se determinó la capacidad de unión a anticuerpos normalizada (CUAN) en líneas celulares CD33+ usando QIFIKIT y el mAb anti-CD33 WM53. Se determinaron los valores de CE50 para la lisis de células diana redirigida por el diacuerpo en tándem 12 y el diacuerpo en tándem 16 en ensayos de citotoxicidad basados en FACS con linfocitos T primarios humanos como células efectoras en relaciones E:D de 5:1 y 20-24 h de incubación; se incubaron los ensayos con células CHO que expresan CD33 durante 40-48 h. Se muestran la media y la DE de al menos 3 ensayos independientes.
EJEMPLO 8
Activación por TandAb de linfocitos T y destrucción in vitro de células de LMA
Se incubaron TandAb con linfocitos T humanos purificados y una línea celular de leucemia humana CD33+ marcada con VPD-450, KG-1, o la línea celular de LLA humana CD33-, G2 (E:D 5:1). Se usó citometría de flujo para evaluar la lisis de células diana por TandAb (10-15 a 10-8 M; 24 h, 37 °C).
La incubación de TandAb 12, 16 y 19 con linfocitos T humanos lisó eficientemente las células KG-1 (CI50 ~ 0,01,0,5 y 5 pM respectivamente). Se activaron hasta 40 % de linfocitos T (CD25+), aumentando con la actividad citotóxica. Un TandAb de control con una diana irrelevante, 00 (>10-7 M), no dio como resultado destrucción significativa de KG-1 in vitro. Por separado, 16 indujo la lisis de células KG-1 (CI50 = 5 x 10-12 M), mientras que 1 x 10-8 M no tuvo efecto sobre las células CD33-G2. Los resultados indican que los linfocitos T se activan y lisan potentemente las células tumorales cuando se dirigen a células leucémicas CD33+ (KG-1) y blastos CD33+ primarios de LMA por TandAb de CD33/CD3.
EJEMPLO 9
Mapeo de epítopes
Se sometieron a mapeo de epítopes diacuerpos en tándem que contienen diferentes restos de unión a CD33 usando tecnología CLIPS (Pepscan) para identificar epítopes que se unen a CD33.
La tecnología CLIPS facilita la estructuración de péptidos en bucles simples, bucles dobles, bucles triples, pliegues de tipo lámina, pliegues de tipo hélice y combinaciones de los mismos, ofreciendo la posibilidad de mapear epítopes discontinuos de la molécula diana.
Se sintetizó una matriz de más de 7000 péptidos independientes y la unión de cada anticuerpo a los péptidos se probó en un ELISA.
Los diacuerpos en tándem 12, 14, 16 y 22 se unen a la extensión 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) en el primer dominio de tipo Ig de CD33 humano. Las extensiones de aminoácidos respectivas se muestran subrayadas y en negrita en la Figura 9A. Se contempla que los diacuerpos en tándem 01,02, 04, 06, 08, 09, 13 y 23 también se unen a este epítope, ya que estos diacuerpos en tándem comparten los mismos dominios de unión a CD33 (SEQ ID NO: 2 y 12, 3 y 13, 5 y 15, 9 y 19) que los diacuerpos en tándem 12, 1416 y 12.
EJEMPLO 10
Dosis-respuesta en un modelo de tumor profiláctico in vivo
Se comparan los diacuerpos en tándem 12 y 16 en diferentes niveles de dosis en un modelo de xenoinjerto de tumor HL-60 profiláctico en ratones NOD/scid reconstituidos con linfocitos T humanos. Para lograr una dosis-respuesta, se seleccionaron tres niveles de dosis a 10, 1 y 0,1 pg (0,5, 0,05 y 0,005 mg/kg).
Se xenotrasplantaron ocho grupos experimentales de ratones NOD/scid inmunodeficientes por inyección subcutánea con una suspensión de 4x106 células HL-60. Antes de la inyección, las células se mezclaron con 3x106 linfocitos T aislados de capas leucocíticas (donantes sanos) empleando selección negativa. Para explicar la posible variabilidad entre donantes de los linfocitos T, se subdividió cada uno de los grupos experimentales en tres cohortes que recibió cada una linfocitos T de un donante individual solo. Todos los animales de los grupos experimentales trasplantados con células tumorales y linfocitos T recibieron un bolo intravenoso en los días 0, 1, 2, 3 y 4 (qdxd5) de o vehículo (control) o 16 o 12 en tres niveles de dosis diferentes como se indica (0,1 pg, 1 pg y 10 pg). Un grupo sin células efectoras y tratamiento con vehículo sirvió de control adicional. La Tabla 13 resume la asignación de grupos y el programa de administración.
Tabla 13
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Grupos de tratamiento para el estudio de dosis-respuesta in vivo en un modelo de xenoinjerto de HL-60. Todos los animales en los grupos de control desarrollaron de forma fiable un tumor y presentaron crecimiento tumoral homogéneo. La presencia de linfocitos T no tuvo influencia sobre el desarrollo tumoral. No se observó diferencia en el crecimiento de HL-60 en presencia o ausencia de linfocitos T en los grupos tratados con control de vehículo.
El tratamiento con ambos artículos de prueba reveló un claro efecto antitumoral dependiente de la dosis (Figura 10). No se encontró diferencia sustancial entre los dos diacuerpos en tándem. La representación de volúmenes medios de tumor en la Figura 10 se restringió al día 29, cuando la mayoría de los grupos de tratamiento estuvieron completos. El estudio continuó hasta el día 45 y los animales se observaron para supervivencia sin tumores. En los grupos tratados con 10 o 1 pg de 16, 6 de los 9 animales no tuvieron tumor al final del periodo de observación y 5 de los 9 animales que recibieron 10 pg de 12 no tuvieron tumor en el día 45. Un animal siguió sin tumor cuando se trató con 1 pg de 12.
Todos los animales en los grupos de control desarrollaron de forma fiable un tumor y presentaron crecimiento tumoral homogéneo. El tratamiento con cualquiera de los diacuerpos en tándem reveló un efecto antitumoral dependiente de la dosis y no se encontró diferencia sustancial entre los dos diacuerpos en tándem hasta el día 29.
Se observaron diferencias detectables solo después de la observación prolongada (día 45), momento en el que los grupos de dosis baja y de control ya se habían sacrificado debido al crecimiento de tumores grandes. Los grupos tratados con 16 tuvieron más animales sin tumor.
EJEMPLO 11
Modelo de tumor establecido
Se desarrolló un modelo de xenoinjerto en ratones NOD/scid con tumores HL-60 preestablecidos que empleó 16 para demostrar la viabilidad.
En resumen, se irradiaron subletalmente (2 Gy) ratones NOD/scid hembra inmunodeficientes y se inocularon por vía subcutánea con 4x106 células HL-60. En el día 9, los animales recibieron una única inyección en bolo de anticuerpo de conejo anti-asialo GM1 (Wako, Neuss, Alemania) para reducir los linfocitos citolíticos naturales (NK) murinos. En el día 10, cuando el tumor alcanzó un volumen entre 50-150 mm3 (media 73 ± 11 mm3), los animales se asignaron a 3 grupos de tratamiento. Los grupos 2 y 3 (8 animales cada uno) se inyectaron por vía intraperitoneal con 1,5x107 linfocitos T humanos activados. Antes de la inyección, los linfocitos T se aislaron de capas leucocíticas (donantes sanos) empleando selección negativa. Se expandieron los linfocitos T y se activaron con el kit T-Cell Activation / Expansion Kit según la especificación del fabricante (Miltenyi Biotech). Para tratar la posible variabilidad de donantes, los grupos 2 y 3 se subdividieron en dos cohortes, cada una de las cuales recibió linfocitos T expandidos y activados de un donante individual. Cada cohorte recibió linfocitos T de un solo donante individual de linfocitos T.
Tabla 14: Grupos de tratamiento para el modelo de xenoinjerto de HL-60 establecido.
Figure imgf000031_0001
A partir del día 13, los animales en el grupo 3 presentaron un volumen medio del tumor de 105 mm3 y se trataron con un total de 9 dosis intravenosas de 50 pg de diacuerpo en tándem 16 (qdx9d). La Tabla 14 ilustra la asignación de grupos y el programa de administración. Los grupos 1 y 2 solo se trataron con el vehículo. Se determinó el peso corporal y el volumen del tumor hasta el día 27.
Todos los animales desarrollaron de forma fiable un tumor, que fue palpable en el día 6. Aumentó continuamente el volumen medio de los animales del grupo 1 y 2 tratados con vehículo (HL-60) hasta la finalización del estudio en el día 27 (Figura 11). En los animales del grupo 2 que recibieron linfocitos T humanos activados primarios, además de células tumorales HL-60, el volumen medio del tumor aumentó más rápido en comparación con el grupo 1 (HL-60 solo).
El tratamiento intravenoso repetido desde los días 13 a 21 (qdxd9) con diacuerpo en tándem 16 (50 pg/animal; 2,5 mg/kg) en presencia de linfocitos T humanos (grupo 3) retrasó rápidamente el crecimiento tumoral con respecto al grupo 1 y el grupo 2. El diacuerpo en tándem 16 retrasó el crecimiento tumoral en el grupo 3 aproximadamente 4 - 5 días en comparación con el grupo tratado con control de vehículo (grupo 2). Se identificaron diferencias estadísticamente significativas en el periodo de tiempo desde el día 6 hasta el día 27 entre el grupo 2 (HL-60, linfocitos T, vehículo) y grupo 3 (HL-60, linfocitos T, 16) en el día 22 (p<0,05), día 23 (p<0,01) y día 27 (p<0,01) (ANOVA bilateral de medidas repetidas con pruebas a posteriori de Bonferroni). No estuvieron presentes diferencias estadísticamente significativas entre el grupo 1 y el grupo 3 debido a un crecimiento lento poco usual del tumor en el grupo 1.
No se observó variabilidad entre donantes con respecto a la actividad de linfocitos T, cuando se comparó el desarrollo tumoral en la cohorte 1 y la cohorte 2 dentro de un grupo, que recibió los linfocitos T de diferentes donantes (véase la Tabla 14).
El Ejemplo 10 muestra que se desarrolló satisfactoriamente un modelo de xenoinjerto en ratones NOD/scid con un tumor HL-60 preestablecido (LMA) y linfocitos T humanos injertados por vía intraperitoneal. La administración repetida con diacuerpo en tándem 16 a un nivel de dosis única conduce a un retraso estadísticamente significativo en el crecimiento tumoral en comparación con el grupo tratado con control de vehículo respectivo. Los datos generados son comparables a los resultados publicados para un estudio similar con BiTE™ de CD33/CD3 (Aigner et al., 2012; Leukemia, 2013, Apr;27(5):1107-15).
EJEMPLO 12
Eficacia de diacuerpos en tándem de CD33/CD3 en un modelo de XDP de LMA en ratones NSG
Se usaron células criopreservadas de un paciente con LMA cuya leucemia CD33+ contuvo 2-4 % de linfocitos T CD3+ para establecer un modelo de XDP de LMA en ratones NSG. Una hora después de la inyección de células tumorales en ratones NSG irradiados (250 cGy), los diacuerpos en tándem de CD33/CD3, 16 o 12, se inyectaron a cualquiera de dos dosis i.v. (50 pg o 5 pg; n= 8 ratones/grupo) en un bolo de 200 pL. Se realizaron inyecciones adicionales de los diacuerpos en tándem en cada uno de los 4 días siguientes. Los ratones se pesaron una vez a la semana, y posteriormente se sacrificaron en el día 38 para permitir la recogida de sangre periférica, médula ósea y bazo para el análisis por citometría de flujo (CD33hu, CD34hu, CD45hu, CD45mu, CD14hu, CD3hu, CD4hu, CD8hu y 7Aa D). Los resultados se muestran en la Figura 12.
La Figura 12 muestra que los ratones sin tratar tuvieron cantidades sustanciales de blastos humanos en la médula ósea y el bazo después de 38 días. A diferencia, los ratones tratados con inyecciones i.v. diarias de los diacuerpos en tándem 12 o 16 presentaron números sustancialmente más bajos de blastos de LMA humana en la médula ósea y en el bazo. Se observó el fuerte efecto anti-LMA del diacuerpo en tándem de CD33/CD3 a ambos niveles de dosis (5 y 50 pg/inyección).
El efecto anti-LMA observado para ambos diacuerpos en tándem de CD33/CD3, 12 y 16, fue mucho más fuerte que el efecto de un anticuerpo de CD123/CD3 DART® que se dirige a LMA en un modelo de ratón idéntico (Hussaini et al.: "Targeting CD123 In Leukemic Stem Cells Using Dual Affinity Re-Targeting Molecules (DARTs®), 15 de noviembre de 2013; Blood: 122 (21)). A diferencia de los diacuerpos en tándem de CD33/CD3 que eliminaron casi todos los blastos de LMA en médula ósea y bazo, Hussaini et al. informaron que DART® de CD123/CD3 redujo el número de blastos de LMA en la médula ósea y el bazo en el modelo de XDP solo en un factor de 50-1000 a 2,5 y 0,25 mg/kg, los autores informaron además que el DART™ de CD123/CD3 redujo el número de blastos de LMA en médula ósea y bazo en el modelo de XDP solo en 40-78 % a 0,5 mg/kg.
EJEMPLO 13
Aparición rápida de lisis de células diana mediada por diacuerpos en tándem de CD33/CD3 16
Para evaluar la cinética de la lisis de células diana mediada por diacuerpos en tándem de CD33/CD3, se realizaron ensayos de citotoxicidad por liberación de calceína con diferentes tiempos de incubación. Se incubaron las células diana HL-60 CD33+ marcadas con calceína con diluciones sucesivas del diacuerpo en tándem 16 en presencia de linfocitos T humanos primarios como células efectoras en una relación E:D de 25:1 durante 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h o 5 h. En cada momento de tiempo, la calceína que se liberó de las células diana lisadas se usó para calcular el valor de CE50 y la lisis de células diana mediada por el diacuerpo en tándem 16 usando regresión no lineal/dosis-respuesta sigmoide. La Figura 13 muestra una inesperada aparición rápida de la lisis de células diana mediada por diacuerpos en tándem con más de 40 % lisis después de 30 min de incubación a concentraciones de saturación de diacuerpos en tándem. Después de 4 horas de incubación, se alcanzó más del 90 % de lisis de células diana. La Tabla 15 y Figura 14 resumen las CE50 y los valores de lisis específica determinados para el diacuerpo en tándem 16 en los tiempos de incubación entre 30 min y 5 horas. Los resultados demuestran además que en las condiciones de ensayo usadas se alcanzó la máxima potencia (valor de CE50 más bajo) después de 2 horas de incubación y que después de 5 horas de incubación se lisaron casi todas las células diana. En conjunto, estos resultados demuestran una lisis de células diana muy rápida, potente y eficaz mediada por los diacuerpos en tándem de CD33/CD3.
TABLA 15: Cinética de CE 50 y valores de lisis determinados para el diacuerpo en tándem 16
Figure imgf000033_0001
EJEMPLO 14
Protocolo del ensayo clínico de viabilidad para la administración de diacuerpos en tándem de CD33/CD3 a pacientes con LMA
Ensayo clínico de fase I/II para estudiar el diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16 como un tratamiento para leucemia mieloide aguda (LMA).
Resultados del estudio:
Primarios: Dosis máxima tolerada de diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16
Secundarios: Determinar si la respuesta in vitro del diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16 está asociada con la respuesta clínica
Fase I
La dosis máxima tolerada (DMT) se determinará en la sección de fase I del ensayo.
1.1 La dosis máxima tolerada (DMT) se determinará en la sección de fase I del ensayo.
1.2 Participarán en el ensayo del diacuerpo en tándem CD33/CD3 16 los pacientes que cumplan los criterios de elegibilidad.
1.3 El objetivo es identificar la dosis más alta del diacuerpo en tándem de CD33/CD316 que se puede administrar de forma segura sin efectos secundarios intensos o incontrolables en los participantes. La dosis administrada dependerá del número de participantes que se hayan reclutado en el estudio antes y cómo de bien se toleró la dosis. No todos los participantes recibirán la misma dosis.
Fase II
2.1 Una sección de fase II posterior se tratará con la DMT con el objetivo de determinar si la terapia con la terapia del diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16 da como resultado al menos un 20 % de tasa de respuesta.
Resultado primario para la fase II --- Determinar si la terapia del diacuerpo en tándem de CD33/CD3 16 da como resultado al menos 20 % de pacientes que logran una respuesta clínica (respuesta de blastos, respuesta leve, respuesta parcial o respuesta completa).
Elegibilidad:
LMA documentada por análisis de sangre periférica y médula ósea que cumple los criterios de la OMS, excluyendo pacientes con leucemia promielocítica aguda (LPA)
Pacientes con LMA resistente a quimioterapia de inducción primaria, enfermedad recidivante o edad > 60 y no apropiados para terapia citotóxica habitual debido a la edad, estado de rendimiento y/o factores de riesgo adversos según el médico práctico
Edad > 18 años
Estado de rendimiento de Karnofsky > 50 % o estado de rendimiento de ECOG 0-2
Esperanza de vida > 6 semanas

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un diacuerpo en tándem de unión al antígeno biespecífico específico de CD33 humano y CD3 humano, en donde dicho diacuerpo en tándem comprende un primer polipéptido y un segundo polipéptido, teniendo cada polipéptido al menos cuatro dominios de cadena variables unidos uno después del otro, en donde cada polipéptido comprende (i) un dominio de cadena pesada variable (VH) específico de CD33 humano;
(ii) un dominio de cadena ligera variable (VL) específico de CD33 humano;
(iii) un dominio VH específico de CD3 humano, y
(iv) un dominio VL específico de CD3 humano,
en donde cada polipéptido comprende una combinación de cuatro dominios de cadena variables seleccionados del grupo que consiste en
(a) SEQ ID NO: 3, 13, 64 y 68;
(b) SEQ ID NO: 2, 12, 64 y 68;
(c) SEQ ID NO: 4, 14, 64 y 68;
(d) SEQ ID NO: 5, 15, 64 y 68;
(e) SEQ ID NO: 6, 16, 64 y 68; o
(f) SEQ ID NO: 9, 19, 64 y 68;
y en donde en cada polipéptido, los cuatro dominios de cadena variables se unen uno después del otro por conectores peptídicos L1, L2 y L3 en el orden de:
VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3);
VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3);
VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD3 3); o
VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33).
2. El diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1, en donde los conectores L1, L2 y L3 consisten en aproximadamente 12 o menos restos de aminoácidos.
3. El diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1, en donde los conectores L1, L2 y L3 se seleccionan cada uno independientemente de GGSGGS (SEQ ID NO: 95), GGSG (SEQ ID NO: 96) o GGSGG (SEQ ID NO: 97).
4. El diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1, en donde los conectores L1 y L3 son GGSGGS (SEQ ID NO: 95) y el conector L2 es GGSG (SEQ ID NO: 96) o GGSGG (SEQ ID NO: 97).
5. El diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1, en donde los cuatro dominios de cadena variables se unen uno después del otro por conectores peptídicos L1, L2 y L3 en el orden de
VL(CD3)-L1 -VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); y
en donde los conectores L1 y L3 son GGSGGS (SEQ ID NO: 95) y el conector L2 es GGSG (SEQ ID NO: 96) o GGSGG (SEQ ID NO: 97).
6. El diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1, en donde el diacuerpo en tándem es el diacuerpo en tándem 12 (SEQ ID NO: 109), 14 (SEQ ID NO: 111), 15 (SEQ ID NO: 112), 16 (SEQ ID NO: 113), 19 (SEQ ID NO: 116) o 22 (SEQ ID NO: 119).
7. El diacuerpo en tándem de unión al antígeno biespecífico según la reivindicación 1, en donde el diacuerpo en tándem posee KD de unión de 10 nM o menos por CD33 en células tumorales CD33+ seleccionadas de HL-60, KG-1 y U-937.
8. El diacuerpo en tándem de unión al antígeno biespecífico según la reivindicación 1, en donde el diacuerpo en tándem se une específicamente a un epítope de CD33 humano que está dentro de 62DQEVQEETQ70 (SEQ ID NO: 94) (restos de aminoácidos 62-70 de SEQ ID NO: 93) de CD33 humano.
9. Una composición para su uso en el tratamiento de un cáncer CD33+ en un individuo que padece cáncer CD33+, comprendiendo la composición un diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1.
10. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde el cáncer CD33+ es leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfoblástica de precursores de linfocitos B, sarcoma mieloide, mieloma múltiple, linfoma agudo, linfoma linfoblástico agudo o leucemia mielomonocítica crónica (LMMC), opcionalmente en donde el cáncer CD33+ es LMA con anomalías genéticas recurrentes, LMA con cambios relacionados con mielodisplasia, neoplasias mieloides relacionadas con la terapia, sarcoma mieloide, proliferaciones mieloides relacionadas con el síndrome de Down o neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas.
11. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde la LMA se ha diagnosticado recientemente, es recidivante o resistente al tratamiento.
12. La composición para el uso de la reivindicación 9, en donde la composición comprende además citarabina, azacitidina, decitabina, antraciclina, fludarabina, clofarabina, cladribina, nelarabina, metotrexato, bortezomib, carfilzomib, melfalán, ibrutinib, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, apremilast, una epipodofilotoxina, una antracenodiona, un agente anti-CD20 o combinaciones de los mismos.
13. Una composición para su uso en el tratamiento de síndrome displásico mieloide (SDM) en un individuo que padece SDM, comprendiendo la composición un diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1.
14. La composición para el uso de la reivindicación 13, en donde la composición comprende además citarabina, azacitidina, decitabina, una antraciclina, amsacrina, fludarabina, clofarabina, cladribina, nelarabina, metotrexato, bortezomib, carfilzomib, melfalán, ibrutinib, talidomida, lenalidomida, pomalidomida, apremilast, una epipodofilotoxina, una antracenodiona, un agente anti-CD20 o combinaciones de los mismos.
15. Una composición para su uso en el tratamiento de inmunosupresión por células supresoras derivadas de mieloide (CSDM) en un individuo que padece inmunosupresión, que comprende un diacuerpo en tándem biespecífico según la reivindicación 1.
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