KR20170041697A - 이중특이적 cd33 및 cd3 결합 단백질 - Google Patents

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로리 쿤켈
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Abstract

인간 CD33에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 및 특히 인간 CD33 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 단백질이 본원에 기재된다. 또한, CD33 및 CD33에 결합하는 이중특이적 탠덤 디아바디, 및 CD33+ 암, 질환 및 병태, 예컨대 급성 골수성 백혈병(AML)의 면역요법을 위한 이들의 용도가 본원에 기재되어 있다.

Description

이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질{BISPECIFIC CD33 AND CD3 BINDING PROTEINS}
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2014년 7월 1일에 출원된 미국 가출원 제62/019,795호; 2015년 2월 3일에 출원된 미국 가출원 제62/111,470호의 이익을 주장하며; 2015년 3월 9일에 출원된 미국 정규출원 제14/642,497호의 계속출원이며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 통합되어 있다.
서열 목록
본원은 그 전체가 본원에 참고로 통합되어 있는 서열 목록을 포함한다. 2015년 6월 30일에 생성된 서열 목록 파일은 45375-704.601_SL.txt로 명명되며 147,965 바이트 크기이다.
급성 골수성 백혈병(AML)은 성인 및 어린이에서 급성 백혈병이다. CD33은 AML에서 대부분의 골수아세포(myeloblast) 상에서 발현된다. 일부 보고에서, CD33은 초기 다중계통 골수계 전구세포(early multilineage myeloid progenitor)에 국한되며 정상적인 만능 조혈모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)에는 없다.
발명의 요약
인간 CD33에 특이적으로 결합하는 결합 단백질, 및 인간 CD33 및 인간 CD3에 특이적으로 결합하는 이중특이적 결합 단백질이 본원에 제공된다. 또한 많은 이중특이적 CD33/CD3 결합 단백질, 예를 들어, 탠덤 디아바디(tandem diabody)를 생성하기 위한 항-CD33 가변 도메인 및 항-CD3 가변 도메인이 본원에 제공된다. 또한 CD33 및 CD3에 결합하는 이중특이적 탠덤 디아바디 및 급성 골수성 백혈병(AML) 및 다른 혈액암(hematologic malignancy), 장애 또는 병태의 면역 요법을 위한 이들의 용도가 본원에 추가로 제공된다.
특히, 인간뿐만 아니라 시노몰구스 원숭이 CD33 모두에 결합을 나타내는 결합 단백질이 제공된다. 이들 CD33/CD3 탠덤 디아바디가 AML 환자로부터의 자가 T-세포뿐만 아니라 건강한 공여자로부터의 폴리클론 CD3+ T-세포를 재유도하여 낮은 E:T 세포 비율로 CD33+ AML 세포를 효과적으로 용해시킬 수 있음이 실시예에서 입증된다. CD33+ 표적 세포 및 T-세포 모두의 존재에 의존하는 이 과정에서, 재유도된 T-세포는 CD25 및 CD69의 유도에 의해 나타난 바와 같이 활성화되고, 자극되어 증식한다. 이들 탠덤 디아바디의 항-AML 효과는 E:T 세포 비율뿐만 아니라 사용된 항체의 농도에 의존적인 것으로 나타났다. 탠덤 디아바디는 4가(tetravalent)이며 CD33을 위한 2개의 결합 부위 및 CD3을 위한 2개의 결합 부위를 갖는다. 본원에 기재된 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 특정한 특징은 이들이 각 항원, 즉 CD33 및 CD3에게 결합능(avidity)을 부여하는 2가 결합의 결과로서 강력하고 효율적인 세포자멸(apoptosis)을 촉진한다는 점이다.
요약하면, 본원에 기술된 상기 제공된 CD33/CD3 결합 단백질, 특히 탠덤 디아바디는 시험관내에서 CD33+ 백혈병 세포 및 일차 AML 세포의 강력한 세포용해를 유도한다. 탠덤 디아바디의 항체 포맷인 이중특이적 CD33/CD3 결합 단백질의 예는 세포주, 일차 AML 세포에서 그리고 AML 세포주 및 환자 유래의 일차 AML 세포를 갖는 생체내 모델에서 생체내에서 세포용해 활성을 입증한다. 이것은 엄격한 AML PDX 모델에서 특히 주목할만한 높은 생체내 활성을 나타낸다. 또한, 탠덤 디아바디의 항체 포맷에서 이중특이적 CD33/CD3 결합 단백질의 예는 새롭게 진단된, 재발된 및 난치 환자를 포함하는, AML의 모든 단계의 환자로부터의 샘플에서 생체외에서 세포용해 활성을 입증한다.
더욱이, 본원에 기재된 이들 CD33/CD3 결합 단백질은 약 4시간 이내에 CD33 발현 세포의 유의미한 용해를 달성할 수 있다. 따라서 CD33/CD3 결합 단백질은 낮은 효과기: 표적(E:T) 비율로 높은 세포 독성뿐만 아니라 세포 표면상에서 낮은 CD33 밀도로 높은 세포독성을 나타낸다. 또한, 본원에 기재된 CD33/CD3 결합 단백질은 인간 단백질에 대해 강력한 CD33 및 CD3 결합 친화성을 나타낼 뿐만 아니라, 예를 들어 5 내지 0.2의 인간:시노몰구스 KD 비율로, 각각의 시노몰구스 원숭이 단백질과 우수한 교차반응성을 나타낸다. 더욱이, 본원에 기재된 CD33/CD3 결합 단백질은 CD33+ 표적 세포의 부재시 사이토카인 방출의 유의미한 유도를 나타내지 않으며, 이는 이들 분자의 안전성 프로파일의 필수 구성요소이다. 더욱이, 본원에 기재된 CD33/CD3 탠덤 디아바디는 간편한 투여를 가능하게 할 8-24시간의 대략적인 범위의 반감기를 갖는 분자의 부류에 속한다.
일 양태에서, 인간 CD33의 에피토프에 특이적으로 결합하는 CD33 결합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 결합 단백질은 인간으로부터 유래된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 결합 부위를 가지며, 상기 경쇄 가변 도메인은 서열번호 21-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 28-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 35-41로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 결합 부위를 가지며, 상기 중쇄 가변 도메인은 서열번호 42-48로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 49-55로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 56-63으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다.
어떤 경우에, 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 21, 28 및 35; 서열번호 22, 29 및 36; 서열번호 23, 30 및 37; 서열번호 24, 31 및 38; 서열번호 25, 32 및 39; 서열번호 26, 33 및 40; 및 서열번호 27, 34 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된다.
어떤 경우에, 중쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 42, 49 및 56; 서열번호 43, 50 및 57; 서열번호 43, 50 및 58; 서열번호 43, 50 및 59; 서열번호 43, 50 및 60; 서열번호 44, 51 및 61; 서열번호 45, 52 및 62; 서열번호 46, 53 및 63; 서열번호 47, 54 및 63; 및 서열번호 48, 55 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
어떤 경우에, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인의 인간 CD33 결합 부위는 서열번호 1 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 3 및 서열번호 13; 서열번호 4 및 서열번호 14; 서열번호 5 및 서열번호 15; 서열번호 6 및 서열번호 16; 서열번호 7 및 서열번호 17; 서열번호 8 및 서열번호 18; 서열번호 9 및 서열번호 19; 및 서열번호 10 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, CD33 에피토프는 인간 CD33의 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)(서열번호 93의 아미노산 잔기 62-70) 내에 있다.
상기 구현예 중 어느 것에서, CD33 결합 단백질은 적어도 하나의 추가의 기능성 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 기능성 도메인은 효과기 세포에 결합하는 효과기 도메인이다. 어떤 경우에, 효과기 도메인은 인간 CD3에 대한 항원 결합 부위를 형성하는 적어도 하나의 항체 가변 중쇄 도메인 및 적어도 하나의 가변 경쇄 도메인을 포함하는 CD3 결합 부위이다.
어떤 경우에, CD3 결합 부위는 STYAMN(서열번호 72)의 CDR1 서열, RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 73)의 CDR2 서열 및 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 74)의 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 다른 경우에, CD3 결합 부위는 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 90)의 CDR1 서열, GTNKRAP(서열번호 91)의 CDR2 서열, 및 ALWYSNL(서열번호 92)의 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
어떤 경우에, CD3 결합 부위는 서열번호 64의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 68의 가변 경쇄 도메인; 서열번호 65의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 69의 가변 경쇄 도메인; 서열번호 66의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 70의 가변 경쇄 도메인; 또는 서열번호 67의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 71의 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
상기 구현예 중 어느 것에서, CD33 결합 단백질은 이량체성 단백질이다. 상기 구현예 중 어느 것에서, CD33 결합 단백질은 다중기능성이다.
어떤 경우에, 다중기능성 CD33 결합 단백질은 CD33 및 CD3에 대해 이중특이성을 가지며, 상기 결합 특이성은 서열번호 2, 12, 65 및 69; 서열번호 3, 13, 65 및 69; 서열번호 4, 14, 65 및 69; 서열번호 5, 15, 65 및 69; 서열번호 1, 11, 64 및 68; 서열번호 2, 12, 64 및 68; 서열번호 2, 12, 66 및 70; 서열번호 4, 14, 66 및 70; 서열번호 5, 15, 66 및 70; 서열번호 3, 13, 64 및 68; 서열번호 3, 13, 67 및 71; 서열번호 4, 14, 64 및 68; 서열번호 5, 15, 64 및 68; 서열번호 7, 17, 64 및 68; 서열번호 6, 16, 64 및 68; 서열번호 6, 16, 67 및 71; 서열번호 8, 18, 64 및 68; 서열번호 9, 19, 64 및 68; 서열번호 9, 19, 67 및 71; 및 서열번호 10, 20, 64 및 68로 이루어진 군으로부터 선택된 CD33 및 CD3에 대한 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인에 의해 제공된다.
또 다른 양태에서, 인간 CD3 및 인간 CD33에 특이적인 이중특이적, 항원-결합 탠덤 디아바디가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 탠덤 디아바디는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 차례로 연결된 적어도 4개의 가변 쇄 도메인을 가지며, 각각의 폴리펩타이드는 인간 CD33에 특이적인 가변 중쇄 도메인; 인간 CD33에 특이적인 가변 경쇄 도메인; 인간 CD3에 특이적인 가변 중쇄 도메인, 및 인간 CD3에 특이적인 가변 경쇄 도메인을 포함하고 각각의 폴리펩타이드에서 상기 4개의 가변 쇄 도메인은 VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3); VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); 또는 VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)의 순서로 펩타이드 링커 L1, L2 및 L3에 의해 차례로 연결된다.
일부 구현예에서, 인간 CD33에 특이적인 VL 도메인은 서열번호 21-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 28-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 35-41로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 CD33에 특이적인 VH 도메인은 서열번호 42-48로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 49-55로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 56-63으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 CD33에 특이적인 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 21, 28 및 35; 서열번호 22, 29 및 36; 서열번호 23, 30 및 37; 서열번호 24, 31 및 38; 서열번호 25, 32 및 39; 서열번호 26, 33 및 40; 및 서열번호 27, 34 및 41로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, 인간 CD33에 특이적인 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3은 서열번호 42, 49 및 56; 서열번호 43, 50 및 57; 서열번호 43, 50 및 58; 서열번호 43, 50 및 59; 서열번호 43, 50 및 60; 서열번호 44, 51 및 61; 서열번호 45, 52 및 62; 서열번호 46, 53 및 63; 서열번호 47, 54 및 63; 및 서열번호 48, 55 및 63으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, CD33에 특이적인 VL 및 VH 도메인은 서열번호 1 및 서열번호 11; 서열번호 2 및 서열번호 12; 서열번호 3 및 서열번호 13; 서열번호 4 및 서열번호 14; 서열번호 5 및 서열번호 15; 서열번호 6 및 서열번호 16; 서열번호 7 및 서열번호 17; 서열번호 8 및 서열번호 18; 서열번호 9 및 서열번호 19; 및 서열번호 10 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, 인간 CD3에 특이적인 VH 도메인은 STYAMN(서열번호 72)의 CDR1 서열, RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 73)의 CDR2 서열 및 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 74) 또는 HGNFGNSYVSYFAY(서열번호 75)의 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 CD3에 특이적인 VL 도메인은 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 90)의 CDR1 서열, GTNKRAP(서열번호 91)의 CDR2 서열, 및 ALWYSNL(서열번호 92)의 CDR3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CD3에 특이적인 VL 및 VH 도메인은 서열번호 64 및 서열번호 68; 서열번호 65 및 서열번호 69; 서열번호 66 및 서열번호 70; 및 서열번호 67 및 서열번호 71로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
일부 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드는 서열번호 2, 12, 65 및 69; 서열번호 3, 13, 65 및 69; 서열번호 4, 14, 65 및 69; 서열번호 5, 15, 65 및 69; 서열번호 1, 11, 64 및 68; 서열번호 2, 12, 64 및 68; 서열번호 2, 12, 66 및 70; 서열번호 4, 14, 66 및 70; 서열번호 5, 15, 66 및 70; 서열번호 3, 13, 64 및 68; 서열번호 3, 13, 67 및 71; 서열번호 4, 14, 64 및 68; 서열번호 5, 15, 64 및 68; 서열번호 7, 17, 64 및 68; 서열번호 6, 16, 64 및 68; 서열번호 6, 16, 67 및 71; 서열번호 8, 18, 64 및 68; 서열번호 9, 19, 64 및 68; 서열번호 9, 19, 67 및 71; 및 서열번호 10, 20, 64 및 68로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 가변 쇄 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커 L1, L2 및 L3은 약 12개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진다. 어떤 경우에, 링커 L1, L2 및 L3은 각각 독립적으로 GGSGGS(서열번호 95), GGSG(서열번호 96) 또는 GGSGG(서열번호 97)이다. 다른 경우에, 링커 L1 및 L3은 GGSGGS(서열번호 95)이고 링커 L2는 GGSG(서열번호 96) 또는 GGSGG(서열번호 97)이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 탠덤 디아바디는 서열번호 98-121로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다. 다른 구현예에서, 이중특이적 탠덤 디아바디는 탠덤 디아바디 01(서열번호 98), 02(서열번호 99), 03(서열번호 100), 04(서열번호 101), 05(서열번호 102), 06(서열번호 103), 07(서열번호 104), 08(서열번호 105), 09(서열번호 106), 10(서열번호 107), 11(서열번호 108), 12(서열번호 109), 13(서열번호 110), 14(서열번호 111), 15(서열번호 112), 16(서열번호 113), 17(서열번호 114), 18(서열번호 115), 19(서열번호 116), 20(서열번호 117), 21(서열번호 118), 22(서열번호 119), 23(서열번호 120), 또는 24(서열번호 121)이다.
일부 구현예에서, 이중특이적, 항원-결합 탠덤 디아바디는 HL-60, KG-1, 및 U-937로부터 선택된 CD33+ 종양 세포 상의 CD33에 대해 10 nM 이하의 결합 KD를 갖는다.
일부 구현예에서, 이중특이적, 항원-결합 탠덤 디아바디는 인간 CD33의 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)(서열번호 93의 아미노산 잔기 62-70) 내에 있는 인간 CD33의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
또 다른 양태에서, 상기 구현예 중 어느 것의 CD33 결합 단백질 또는 이중특이적, 탠덤 디아바디를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, 상기 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다. 또 다른 양태에서, 상기 기재된 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 상기 구현예 중 어느 것의 CD33 결합 단백질 또는 이중특이적, 탠덤 디아바디 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 상기 구현예 중 어느 것의 CD33 결합 단백질 또는 이중특이적, 탠덤 디아바디를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 것, 상기 숙주 세포를 CD33 결합 단백질 또는 이중특이적 탠덤 디아바디가 발현되는 조건 하에 배양하는 것, 및 상기 발현된 CD33 결합 단백질 또는 이중특이적 탠덤 디아바디를 정제하는 것을 포함하는, 상기 구현예 중 어느 것의 CD33 결합 단백질 또는 이중특이적, 탠덤 디아바디를 생산하는 방법이 본원에 제공된다.
또한 상기 구현예 중 어느 것의 이중특이적, 탠덤 디아바디를 CD33+ 암을 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 CD33+ 암의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD33+ 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 전구체 B-세포 림프구성 백혈병, 골수성 육종, 다발성 골수종, 급성 림프종, 급성 림프구성 림프종 또는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)이다. 일부 구현예에서, CD33+ 암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 일부 구현예에서, CD33+ 암은 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, CD33+ 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다.
또한 상기 구현예 중 어느 것의 이중특이적, 탠덤 디아바디를 AML을 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, AML은 반복 유전자 이상을 갖는 AML, 골수이형성증-관련된 변화를 갖는 AML, 치료 관련 골수성 종양, 골수성 육종, 다운 증후군과 관련된 골수성 증식, 모구 형질세포양 수지상세포 종양(Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 또는 달리 분류되지 않은 AML이다. 일부 구현예에서, AML은 AML-M0, AML-M1, AML-M2, AML-M3, AML-M4, AML-M5, AML-M6, 또는 AML-M7이다. 추가 구현예에서, AML은 새롭게 진단되거나, 재발되거나, 또는 난치이다.
또한 상기 구현예 중 어느 것의 이중특이적, 탠덤 디아바디를 MDS를 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 골수성 이형성 증후군(MDS)의 치료 방법이 본원에 제공된다.
또한 상기 구현예 중 어느 것의 이중특이적, 탠덤 디아바디를 MPD를 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 골수증식 질환(MPD)의 치료 방법이 본원에 제공된다.
또한 상기 구현예 중 어느 것의 이중특이적, 탠덤 디아바디를 CMML을 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)의 치료 방법이 본원에 제공된다.
또한 이중특이적, 탠덤 디아바디 상기 구현예 중 어느 것에서의 이중특이적, 탠덤 디아바디를 면역 억제를 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 골수 유래의 억제세포(MDSC)에 의한 면역 억제의 치료 방법이 본원에 제공된다.
상기 치료 방법에서, 어떤 경우에, 상기 방법은 시타라빈, 아자시티딘, 데시타빈, 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신, 이다루비신, 독소루비신, 등), 암사크린, 플루다라빈, 클로파라빈, 클라드리빈, 넬라라빈, 메토트렉세이트, 보르테조밉, 카르필조밉, 멜팔란, 이브루티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 아프레밀라스트, 에피포도필로톡신(예컨대, 에토포사이드, 테니포사이드, 등), 안트라센디온(예컨대, 미톡산트론, 픽산트론, 로속산트론, 피록산트론, 아메탄트론 등), 항-CD20 제제(예컨대, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙 등) 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급된 모든 공개, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 공개, 특허, 또는 특허 출원이 참고로 통합되는 것으로 명시적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 통합된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 상세하게 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 하기 상세한 설명 및 하기 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다:
도　1 CD3/CD33 탠덤 디아바디(TandAb®)의 유전자 구성 및 도메인 순서의 도식적 표현. 탠덤 디아바디는 짧은 펩타이드 링커 L1, L2 및 L3을 통해 연결된 4개의 가변 도메인으로 구성된 단일 폴리펩타이드로서 발현된다. 발현 후, 2개의 단량체성 폴리펩타이드가 비공유적으로 두미(head-to-tail) 결합하여 기능성 동종이량체성 탠덤 디아바디 분자를 형성한다. L1, L2, L3: 링커; VH: 중쇄 가변 도메인; VL: 경쇄 가변 도메인.
도　2 CD3 인게이징(engaging) 탠덤 디아바디 및 그의 작용 방식. 탠덤 디아바디는 CD3에의 결합을 통해 세포독성 T-세포를 인게이징할 수 있는 4가 이중특이적 단백질이다. 탠덤 디아바디는 4개의 결합 도메인 중 2개를 이용하여 CD33+ 종양 세포에 결합하고 다른 2개의 결합 도메인을 이용하여 CD3에 결합한다. 이 T-세포/표적 세포 결합(가교) 사건은 T-세포의 활성화를 촉진하고 이후에 ADCC를 통해 종양 세포의 파괴를 촉진한다.
도　3 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 도메인 순서 변이체. 탠덤 디아바디를 인코딩하는 유전자 서열 내의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 도메인 순서의 변화는 상기 분자의 내부 또는 외부에 위치한 CD33 및 CD3 특이성을 갖는 항체의 생산을 가능하게 한다. 도메인 특이성, 신호 서열(ss) 및 링커(L1, L2, L3)의 위치 및 친화성 태그(His) 뿐만 아니라 5'- 및 3'-말단이 표시되어 있다.
도　4 양성 농축된(positively enriched) 건강한 공여자 T-세포 대 음성 선택된 건강한 공여자 T-세포의 비교. KG-1a 세포를, 표시된 바와 같이 1:1 또는 3:1의 E:T 세포 비율로 10 pM(대략 1 ng/mL) 및 25 pM(대략 2.5 ng/mL)의 10개의 선택된 탠덤 디아바디 중 하나 및 음성 선택된 건강한 공여자 T-세포 또는 양성 선택된 건강한 공여자 T-세포 중 하나와 함께 배양하였다. 48시간 후, 세포 수를 결정하고 세포독성을 DAPI 염색으로 평가하였다. 결과가 중복 웰에서 수행된 3개의 독립적인 실험으로부터 죽은 세포의 백분율(상부 패널) 및 특정 세포독성의 백분율(하부 패널)에 대해 평균±SEM으로 나타나 있다.
도　5 분석 전략. 각각 탠덤 디아바디-유도된 세포독성을 결정하기 위해 추구된 전략을 예시하는, 1개의 건강한 공여자 T-세포 분취량 및 1개의 대표적인 AML 세포주(HL-60) 및 일차 AML 표본(AMP002)으로부터의 산점도 및 히스토그램 플롯. FSC, 전방 산란; SSC, 측방 산란.
도　6 CD33+ AML 세포주에서 세포독성 분석의 스크리닝. 모(Parental) HL-60(A,B) 및 KG-1a(C,D) 세포를 표시된 바와 같이 1:1(A,C) 또는 5:1(B,D)의 E:T 세포 비율로 10 pM(대략 1 ng/mL) 및 25 pM(대략 2.5 ng/mL)의 22개의 CD33/CD3 탠덤 디아바디 분자 중 하나 또는 비-결합 대조군 탠덤 디아바디(00) 및 건강한 공여자 T-세포와 함께 배양하였다. 48시간 후, 세포 수를 결정하고 세포독성을 DAPI 염색으로 평가하여 약물-특이적 세포독성을 정량하였다. 결과가 중복 웰에서 수행된 3개의 독립적 실험으로부터 DAPI+ 세포의 백분율에 대해 평균±SEM으로 나타나 있다. 세포독성이 특이적 세포독성의 백분율로 표시되었을 때 정성적으로 유사한 결과가 얻어졌다.
도　7 연구를 위한 일차 AML 표본의 선택. 분석을 위해 총 일차 인간 AML 표본으로부터 동결된 분취량을 수득하였다. 해동시 AML 아세포(blast)의 백분율을 CD45/측방-산란 특성에 기초하여 유세포 분석에 의해 결정하였다. 살아있는/죽은 세포 마커로서 DAPI를 이용하는 유세포 분석을 통해 해동시 뿐만 아니라 사이토카인-함유 액체 배양(탠덤 디아바디 분자 또는 건강한 공여자 T-세포의 부가 없이)에서 48시간 후 표본의 생존력을 결정하였다. 해동 후 뿐만 아니라 48시간 후 생존력 결과가 모든 표본에 대해 도시되어 있으며, 이는 >58% AML 아세포를 가지고 있었다. 사각형: 해동시에 >50%의 생존력 뿐만 아니라 최종 분석에 포함된 사이토카인-함유 액체 배양에서 48시간 후에 >50%의 생존력을 나타낸 일차 AML 표본.
도　8 일차 AML 표본에서 탠덤 디아바디-유도된 세포독성. 일차 AML 표본을 부가된 건강한 공여자 T-세포가 없는(A) 또는 표시된 바와 같이 1:3(B) 또는 1:1(C)의 E:T 세포 비율로 건강한 공여자 T-세포를 갖는 2.5 pM(대략 250 pg/mL), 10 pM(대략 1 ng/mL), 및 25 pM(대략2.5 ng/mL)의 9개의 탠덤 디아바디 분자 중 하나와 함께 배양하였다. 48시간 후, 세포 수를 결정하고 세포독성을 DAPI 염색으로 평가하여 약물-특이적 세포독성을 정량하였다. 결과가 중복 웰에서 수행된 특이적 세포독성의 백분율에 대해 평균±SEM으로 나타나 있다.
도　9A는 인간 CD33의 세포외 도메인의 서열(aa 18 - 259)(서열번호 93)이다;
도 9B는 탠덤 디아바디 1의 완전한 서열(서열번호 98)이다;
도 9C는 탠덤 디아바디 2의 완전한 서열(서열번호 99)이다;
도 9D는 탠덤 디아바디 3의 완전한 서열(서열번호 100)이다;
도 9E는 탠덤 디아바디 4의 완전한 서열(서열번호 101)이다;
도 9F는 탠덤 디아바디 5의 완전한 서열(서열번호 102)이다;
도 9G는 탠덤 디아바디 6의 완전한 서열(서열번호 103)이다;
도 9H는 탠덤 디아바디 7의 완전한 서열(서열번호 104)이다;
도 9I는 탠덤 디아바디 8의 완전한 서열(서열번호 105)이다;
도 9J는 탠덤 디아바디 9의 완전한 서열(서열번호 106)이다;
도 9K는 탠덤 디아바디 10의 완전한 서열(서열번호 107)이다;
도 9L은 탠덤 디아바디 11의 완전한 서열(서열번호 108)이다;
도 9M은 탠덤 디아바디 12의 완전한 서열(서열번호 109)이다;
도 9N은 탠덤 디아바디 13의 완전한 서열(서열번호 110)이다;
도 9O는 탠덤 디아바디 14의 완전한 서열(서열번호 111)이다;
도 9P는 탠덤 디아바디 15의 완전한 서열(서열번호 112)이다;
도 9Q는 탠덤 디아바디 16의 완전한 서열(서열번호 113)이다;
도 9R은 탠덤 디아바디 17의 완전한 서열(서열번호 114)이다;
도 9S는 탠덤 디아바디 18의 완전한 서열(서열번호 115)이다;
도 9T는 탠덤 디아바디 19의 완전한 서열(서열번호 116)이다;
도 9U는 탠덤 디아바디 20의 완전한 서열(서열번호 117)이다;
도 9V는 탠덤 디아바디 21의 완전한 서열(서열번호 118)이다;
도 9W는 탠덤 디아바디 22의 완전한 서열(서열번호 119)이다;
도 9X는 탠덤 디아바디 23의 완전한 서열(서열번호 120)이다;
도 9Y는 탠덤 디아바디 24의 완전한 서열(서열번호 121)이다. 밑줄친 서열은 링커 L1, L2 및 L3을 나타낸다.
도　10 NOD/scid 마우스에서 HL-60 세포의 성장에 대한 탠덤 디아바디 16 및 12의 효과. 면역결핍 NOD/scid 마우스의 8개의 실험군에 0일에 4x106 HL-60 세포의 현탁액을 피하 주사하여 이종이식하였다. 주사 전에, HL-60 세포를 건강한 공여자로부터의 3x106 정제된 T-세포와 혼합하였다. 종양 세포 및 T-세포로 이식된 실험군의 모든 동물에게 표시된 3개의 상이한 투여 수준(0.1 μg, 1 μg, 및 10 μg)으로 비히클(대조군) 또는 탠덤 디아바디 16 또는 12을 0, 1, 2, 3 및 4일에 정맥내 볼루스로 투여하였다. 효과기 세포 및 비히클을 처리하지 않은 하나의 군은 부가적인 음성 대조군으로서 사용하였다.
도　11 AML 이종이식 모델에서 탠덤 디아바디 16의 항-종양 활성. NOD/scid 마우스에게 아치사량을 조사하고(2 Gy), 4x106 HL-60 세포를 피하 접종하였다. 9일에, 동물에게 항-asialo GM1 토끼 Ab의 단일 볼루스 주사를 투여하였다. 10일에 종양이 50-150 mm3(평균 73 ± 11 mm3)의 부피에 도달하면, 동물을 3개의 처리군으로 할당하였다. 그룹 2 및 3(n = 8)에게 1.5x107 의 확장되고 활성화된 인간 T-세포를 복강내로 주사하였다. 13일부터 21일까지(qdxd9) 동물에게 측면 꼬리 정맥 내로 탠덤 디아바디 16(그룹 3) 또는 비히클 중 하나(그룹 1 및 그룹 2)를 투여하였다.
도　12 5 μg(0.25 mg/kg) 또는 50 μg(2.5 mg/kg) CD33/CD3 탠덤 디아바디 12 및 16의 처리 후 38일에 NSG 마우스의 골수(BM) 및 비장에서 인간 AML 아세포의 상대량(A) 및 절대수(B)
도 13 CD33/CD3 탠덤 디아바디 16-매개된 표적 세포 용해의 동력학(kinetics). 1x104 칼세인-표지된 HL-60 표적 세포를 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 또는 5시간 동안 탠덤 디아바디 16의 연속 희석물 존재하에 또는 항체 없이(w/o) 25:1의 E:T 비율로 효과기 세포로서 일차 인간 T-세포와 함께 배양하였다. 각 시점에, 용해된 표적 세포로부터 방출된 형광성 칼세인을 사용하여 특이적 용해를 계산하였다. 3회 반복의 평균 및 SD가 플롯팅되어 있다.
도 14 CD33/CD3 탠덤 디아바디 16에 대한 EC50의 동력학 및 특이적 용해 값. EC50 값(검정색 원) 및 탠덤 디아바디 16-매개된 표적 세포 용해(빈 사각형)를 비-선형 회귀/S자형 용량-반응에 의해 상기 표시된 배양 시간에 칼세인-방출 세포독성 분석에서 결정하고, 플롯팅하였다.
도 15 새롭게 진단된, 재발된 및 난치 AML 환자 샘플에서 세포독성 활성.
제1 양태에 따르면, 적어도 CD33, 바람직하게는 인간 CD33에 대해 특이성을 갖는 결합 단백질이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 인간 및 시노몰구스 CD33에 대해 특이성을 가지며, 즉 교차-반응성이다. 일부 구현예에서, 이들 교차-반응성 결합 단백질은 인간 및 시노몰구스 CD33에 유사한 친화성으로 결합한다.
CD33은, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)의 아세포와 같은, 골수성 세포 상에서 발현된다. CD33, 예컨대 인간 CD33에 특이적인 항체의 단리를 위해, 항체 라이브러리가 스크리닝될 수 있다. 예를 들어 IgM 파아지 디스플레이 라이브러리는, 예를 들어, 인간 CD33(도　9A, 서열번호 93)의 세포외 도메인의 아미노산 1-243을 함유하는 재조합 CD33-Fc 융합 단백질을 이용하여 스크리닝될 수 있다.
일부 구현예에서 CD33 결합 단백질은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 포함하는 적어도 하나의 CD33 결합 부위를 갖는다. 경쇄 가변 도메인은 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고 중쇄 가변 도메인은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 구현예에서 이들 경쇄 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 표 1에 나타난 인간 CDR 서열(서열번호 21-41)로부터 선택된다. 어떤 경우에, 경쇄 CDR1은 서열번호 21-27로부터 선택된다. 어떤 경우에, 경쇄 CDR2는 서열번호 28-34로부터 선택된다. 어떤 경우에, 경쇄 CDR3은 서열번호 35-41로부터 선택된다.
일부 구현예에서 이들 중쇄 CDR(중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3)은 표 2에 나타난 인간 CDR 서열(서열번호 42-63)로부터 선택된다. 어떤 경우에, 중쇄 CDR1은 서열번호 42-48로부터 선택된다. 어떤 경우에, 중쇄 CDR2는 서열번호 49-55로부터 선택된다. 어떤 경우에, 중쇄 CDR3은 서열번호 56-63으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 경쇄 및 중쇄 CDR은 각각의 가변 도메인의 주변 프레임워크 서열 없이 선택되며, 이는 다른 면역글로불린 또는 공통 프레임워크 영역으로부터의 프레임워크 서열을 포함하고, 선택적으로 다른 적합한 프레임워크 서열에 의해 추가로 돌연변이되고/거나 대체된다. 그러므로 일부 구현예에서 경쇄 CDR1이 서열번호 21이고; 경쇄 CDR2이 서열번호 28이며 경쇄 CDR3이 서열번호 35인 경쇄 가변 도메인을 포함하는 CD33 결합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 CDR1이 서열번호 22이고; 경쇄 CDR2가 서열번호 29이며 경쇄 CDR3이 서열번호 36인 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 CDR1이 서열번호 23이고; 경쇄 CDR2가 서열번호 30이며 경쇄 CDR3이 서열번호 37인 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 CDR1이 서열번호 24이고; 경쇄 CDR2가 서열번호 31이며 경쇄 CDR3이 서열번호 38인 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 CDR1이 서열번호 25이고; 경쇄 CDR2가 서열번호 32이며 경쇄 CDR3이 서열번호 39인 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 CDR1이 서열번호 26이고; 경쇄 CDR2가 서열번호 33이며 경쇄 CDR3이 서열번호 40인 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 경쇄 CDR1이 서열번호 27이고; 경쇄 CDR2가 서열번호 34이며 경쇄 CDR3이 서열번호 41인 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
또한 일부 구현예에서, 중쇄 CDR1이 서열번호 42이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 49이며 중쇄 CDR3이 서열번호 56인 중쇄 가변 도메인을 포함하는 CD33 결합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 43이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 50이며 중쇄 CDR3이 서열번호 57인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 43이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 50이며 중쇄 CDR3이 서열번호 58인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 43이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 50이며 중쇄 CDR3이 서열번호 59인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 43이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 50이며 중쇄 CDR3이 서열번호 60인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 44이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 51이며 중쇄 CDR3이 서열번호 61인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 45이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 52이며 중쇄 CDR3이 서열번호 62인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 46이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 53이며 중쇄 CDR3이 서열번호 63인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 47이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 54이며 중쇄 CDR3이 서열번호 63인 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 중쇄 CDR1이 서열번호 48이고; 중쇄 CDR2가 서열번호 55이며 중쇄 CDR3이 서열번호 63인 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
추가 구현예에서, CD33 결합 단백질은 표 3에 나타낸 아미노산 서열 서열번호 1-10으로부터 선택된 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 추가 구현예에서, CD33 결합 단백질은 표 4에 나타낸 아미노산 서열 서열번호 11-20으로부터 선택된 가변 중쇄 도메인을 포함한다. 추가 구현예에서, CD33 결합 단백질은 표 3에 나타낸 아미노산 서열 서열번호 1-10으로부터 선택된 가변 경쇄 도메인 및 표 4에 나타낸 아미노산 서열 서열번호 11-20으로부터 선택된 가변 중쇄 도메인을 포함한다.
용어 "결합 단백질"은 항원 결합 특성을 갖는 면역글로불린 유도체, 즉, 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 지칭한다. 결합 단백질은 항체의 가변 도메인 또는 이의 단편을 포함한다. 각각의 항원-결합 도메인은 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 즉, 면역글로불린, 가변 중쇄 도메인(VH) 및 항체 가변 경쇄 도메인(VL)에 의해 형성되는 반면, 가변 중쇄 도메인(VH)은 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고; 가변 경쇄 도메인(VL)은 경쇄 상보성 결정 영역(CDR): CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 본원의 일부 구현예에 따른 결합 단백질은 면역글로불린 불변 도메인이 없다. 일부 경우에, 항원 결합 부위를 형성하는 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은, 예컨대 펩타이드 링커에 의해 서로 공유 연결되거나, 또는 다른 경우에, 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 서로 비공유적으로 결합되어 항원 결합 부위를 형성한다. 용어 "결합 단백질"은 또한 항체 단편 또는 항체 유도체를 지칭하며, 이는, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 단일-쇄 Fv, 탠덤 단일-쇄 Fv(scFv)2, 이중특이적 T-세포 관여자(BiTE®), 이중 친화성 재표적화 항체(DART™), 디아바디 및 탠덤 디아바디(TandAb®)를 포함한다. 더욱이, 어떤 경우에, 결합 단백질은 CD33에 대해 다가(multivalent), 즉 2, 3개 이상의 결합 부위를 갖는다.
표 1 항-CD33 가변 경쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열
CDR 서열 식별자 경쇄 CDR 서열
CDR1 서열번호 21 GGNNIGSTTVH
서열번호 22 SGSRSNIGSNTVN
서열번호 23 SGSSSNIGSNTVN
서열번호 24 TGSSSNIGAGYDVH
서열번호 25 SGSSSNIGSNIVN
서열번호 26 SGSSSNIGSNTVK
서열번호 27 SGSSSNIGDNVVN
CDR2 서열번호 28 DDNERPS
서열번호 29 GNNQRPS
서열번호 30 SDNQRPS
서열번호 31 GNSNRPS
서열번호 32 SNNQRPS
서열번호 33 SNNQRSS
서열번호 34 STNKRPS
CDR3 서열번호 35 QVWDSGSDH
서열번호 36 ATWDDSLIG
서열번호 37 ATWDDSLNG
서열번호 38 QSYDSSLSD
서열번호 39 AAWDDSLKG
서열번호 40 AAWDDSLNG
서열번호 41 AAWDDSLSA
표 2 항-CD33 가변 중쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열
CDR 서열 식별자 중쇄 CDR 서열
CDR1 서열번호 42 SNYGIH
서열번호 43 TSYDIN
서열번호 44 TSYYMH
서열번호 45 TSYWIG
서열번호 46 SSYAIS
서열번호 47 SSYGIS
서열번호 48 DSYAIS
CDR2 서열번호 49 LISYDGNKKFYADSVKG
서열번호 50 WMNPNSGNTGFAQKFQG
서열번호 51 GIINPSGGSTSYAQKFQG
서열번호 52 IIYPGDSDTRYSPSFQG
서열번호 53 GIYPIFGSANYAQKFQG
서열번호 54 GIIPIFGSAHYAQKFQG
서열번호 55 GIIPIFGSAHYSQKFQG
CDR3 서열번호 56 DRLESAAFDY
서열번호 57 DRANTDFSYGMDV
서열번호 58 DRAVTDYYYGMDV
서열번호 59 DRANTDYSFGMDV
서열번호 60 DRANTDYSLGMDV
서열번호 61 DVVPAAIDYYGMDV
서열번호 62 HKRGSDAFDI
서열번호 63 EYYYDSSEWAFDI
표 3 모든 항-CD33 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열(가변 경쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 굵은체로 밑줄쳐 있음)
항-CD33 클론 서열 식별자 가변 경쇄 ( VL ) 도메인 서열
01 서열번호 1 SYELTQPPSVSVAPGQTAMITC GGNNIGSTTVH WYQQKPGQAPVLVVY DDNERPS GIPERFSGSNSGSTATLTINRVEAGDEADYYC QVWDSGSDH VVFGGGTKLTVL
02 서열번호 2 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY GNNQRPS GVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYC ATWDDSLIG WVFGGGTKLTVL
03 서열번호 3 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY GNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC ATWDDSLIG WVFGGGTKLTVL
04 서열번호 4 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY GNNQRP SGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC ATWDDSLIG WVFGGGTKLTVL
05 서열번호 5 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSRSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY GNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC ATWDDSLIG WVFGGGTKLTVL
06 서열번호 6 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNTVN WYQQLPGTAPKLLIY SDNQRPS GVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSDDEADYYCATWDDSLNGAVFGGGTKLTVL
07 서열번호 7 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISC TGSSSNIGAGYDVH WYQQLPGTAPKLLIY GNSNRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYC QSYDSSLSD VVFGGGTKLTVL
08 서열번호 8 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNIVN WYQQLPGTAPKLLIY SNNQRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLKG YVFGGGTKLTVL
09 서열번호 9 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNTVK WYQQLPGTAPKLLIY SNNQRSS GVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLNG YVFGGGTKLTVL
10 서열번호 10 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGDNVVN WYQQLPGTAPKLLIY STNKRPS GVPDRFSGSKSGSSASLAISGLQSEDEADYYC AAWDDSLSA YVFGGGTKLTVL
표 4 항-CD33 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열(가변 중쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 굵은체로 밑줄쳐 있음)
항-CD33 클론 서열 식별자 가변 중쇄 ( VH ) 도메인 서열
01 서열번호 11 QVQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSF SNYGIH WVRQAPGKGLEWVA LISYDGNKKFYADSVKG RFAISRDTSKNTVDLQMTSLRPEDTAVYYCAK DRLESAAFDY WGQGTLVTVSS
02 서열번호 12 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYDIN WVRQAPGQGLEWMG WMNPNSGNTGFAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR DRANTDFSYGMDV WGQGTLVTVSS
03 서열번호 13 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYDIN WVRQAPGQGLEWMG WMNPNSGNTGFAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR DRAVTDYYYGMDV WGQGTLVTVSS
04 서열번호 14 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYDIN WVRQAPGQGLEWMG WMNPNSGNTGFAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR DRANTDYSFGMDV WGQGTLVTVSS
05 서열번호 15 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYDIN WVRQAPGQGLEWMG WMNPNSGNTGFAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR DRANTDYSLGMDV WGQGTLVTVSS
06 서열번호 16 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TSYYMH WVRQAPGQGLEWM GIINPSGGSTSYAQKFQG RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR DVVPAAIDYYGMDV WGQGTTVTVSS
07 서열번호 17 QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSF TSYWIG WVRQMPGKGLEWMG IIYPGDSDTRYSPSFQG QVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCAR HKRGSDAFDI WGQGTTVTVSS
08 서열번호 18 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIYPIFGSANYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EYYYDSSEWAFDI WGQGTLVTVSS
09 서열번호 19 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF SSYGIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGSAHYAQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR EYYYDSSEWAFDI WGQGTLVTVSS
10 서열번호 20 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTF DSYAIS WVRQAPGQGLEWMG GIIPIFGSAHYSQKFQG RVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREYYYDSSEWAFDIWGQGTLVTVSS
일부 구현예에서, CD33에게 특이성을 부여하는 결합 단백질은 표 3 및 표 4에 나타낸 인간 CD33 결합 부위를 형성하는 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인의 하기 조합 중 하나로부터 선택된다. 비제한적인 예는 (i)　서열번호 1 및 서열번호 11, (ii)　서열번호 2 및 서열번호 12, (iii)　 서열번호 3 및 서열번호 13, (iv) 서열번호 4 및 서열번호 14, (v) 서열번호 5 및 서열번호 15, (vi) 서열번호 6 및 서열번호 16, (vii) 서열번호 7 및 서열번호 17, (viii) 서열번호 8 및 서열번호 18, (ix) 서열번호 9 및 서열번호 19, 및 (x) 서열번호 10 및 서열번호 20을 포함한다.
또한 CD33에 대해 특이성을 가질 뿐만 아니라, 적어도 하나의 추가의 기능성 도메인을 갖는 결합 단백질이 본원에 기재되어 있다. 추가의 구현예에서, 적어도 하나의 추가의 기능성 도메인은 효과기 도메인이다. "효과기 도메인"은 효과기 세포에 특이적인 항체의 결합 부위를 포함하고, 이는 세포독성, 식균작용(phagocytosis), 항원 제시, 사이토카인 방출을 자극하거나 촉발할 수 있다. 그러한 효과기 세포는, 예를 들어, 비제한적으로, T-세포이다. 특히, 효과기 도메인은 T-세포 상의 항원, 예컨대, 인간 CD3에 대한 항원 결합 부위를 형성하는 적어도 하나의 항체 가변 중쇄 도메인 및 적어도 하나의 가변 경쇄 도메인을 포함한다.
따라서, 일부 구현예에서, CD33 결합 단백질은 다중기능성이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 다중기능성은 결합 단백질이 두 가지 이상의 상이한 생물학적 기능을 나타내는 것을 의미한다. 예를 들어, 상이한 생물학적 기능은 상이한 항원에 대한 상이한 특이성이다. 어떤 경우에, 다중기능성 CD33 결합 단백질은 다중특이적이며, 즉 CD33 및 하나 이상의 추가 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다. 어떤 경우에, 결합 단백질은 CD33 및 CD3에 대해 특이성을 갖는 이중특이적이다. 그러한 이중특이적 결합 단백질은, 예를 들어, 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM의 이중특이적 단일클론 항체, 디아바디, 단일-쇄 디아바디(scDb), 탠덤 단일 쇄 Fv(scFv)2, 예를 들어 이중특이적 T-세포 관여자(BiTE®), 이중 친화성 재표적화 항체(DART™), 탠덤 디아바디(TandAb®), 및 플렉시바디(flexibody)를 포함한다.
어떤 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 인간 CD3에 대해 특이성을 가지며, 일부 경우에, 시노몰구스 CD3에 대해 특이성을 갖는다. 그러한 결합 부위의 예는 표 5에 나타낸 서열(서열번호 64-67)로부터의 VH 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 표 6에 나타낸 서열(서열번호 68-71)로부터의 VL 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 폴리펩타이드이다. 어떤 경우에, CD3 결합 부위는 서열번호 64의 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 68의 가변 경쇄 도메인의 조합이다. 어떤 경우에, CD3 결합 부위는 서열번호 65의 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 69의 가변 경쇄 도메인의 조합이다. 어떤 경우에, CD3 결합 부위는 서열번호 66의 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 70의 가변 경쇄 도메인의 조합이다. 어떤 경우에, CD3 결합 부위는 서열번호 67의 가변 중쇄 도메인 및 서열번호 71의 가변 경쇄 도메인의 조합이다.
표 5 항-CD3 가변 중쇄 도메인의 아미노산 서열(가변 중쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 굵은체로 밑줄쳐 있음)
항-CD3 VH 도메인 서열
서열번호 64
CD3-01		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRQAPGKGLEWVG RIRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR HGNFGNSYVSYFAY WGQGTLVTVSS
서열번호 65
CD3-02		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRQAPGKGLEWVG RIRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
서열번호 66
CD3-03		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRQAPGKGLEWVG RIRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
서열번호 67
CD3-04		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF STYAMN WVRQAPGKGLEWVG RIRSKYNNYATYYADSVKD RFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCAR HGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSS
표 6 항-CD3 가변 경쇄 도메인의 아미노산 서열(가변 경쇄 CDR1 , CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열이 굵은체로 밑줄쳐 있음)
항-CD3 VL 도메인 서열
서열번호 68
CD3-01		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGKAPKALIG GTNKRAP GVPSRFSGSLIGDKATLTISSLQPEDFATYYC ALWYSNL WVFGQGTKVEIK
서열번호 69
CD3-02		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGKAPKGLIG GTNKRAP GVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC ALWYSNL WVFGQGTKVEIK
서열번호 70
CD3-03		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGKAPKGLIG GTNKRAP GVPSRFSGSLIGDKATLTISSLQPEDFATYYC ALWYSNL WVFGQGTKVEIK
서열번호 71
CD3-04		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RSSTGAVTTSNYAN WVQQKPGKAPKGLIG GTNKRAP GVPSRFSGSLIGTDFTLTISSLQPEDFATYYC ALWYSNL WVFGQGTKVEIK
추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 STYAMN(서열번호 72)의 CDR1 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 73)의 CDR2 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 74)의 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 HGNFGNSYVSYFAY(서열번호 75)의 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, CD3 결합 부위는 각각 서열번호 72-74의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, CD3 결합 부위는 각각 서열번호 72, 73 및 75의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다.
추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 NTYAMN(서열번호 76), NTYAMH(서열번호 77) 및 NKYAMN(서열번호 78)로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 RIRNKYNNYATYYADSVKD(서열번호 79), RIRNKYNNYATEYADSVKD(서열번호 80), RIRSKYNNYATEYAASVKD(서열번호 81), RIRNKYNNYATEYAASVKD(서열번호 82), RIRSKYNNYATYYADSVKG(서열번호 83) 및 RIRSKYNNYATEYADSVKS(서열번호 84)로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 HGNFGDSYVSWFAY(서열번호 85), HGNFGNTYVSWFAY(서열번호 86), HGNFGCSYVSWFAY(서열번호 87), HGNFGNSYISYWAY(서열번호 88) 및 HGNFGNSYVSFFAY(서열번호 89)로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다.
추가 구현예에서, CD3 결합 부위는 각각 서열번호 76, 73 및 74, 각각 서열번호 76, 79 및 74, 각각 서열번호 76, 80 및 74, 각각 서열번호 76, 81 및 74, 각각 서열번호 76, 82 및 74, 각각 서열번호 76, 83 및 74, 각각 서열번호 72, 83 및 74, 각각 서열번호 72, 83 및 85, 각각 서열번호 76, 83 및 86, 각각 서열번호 77, 83 및 74, 각각 서열번호 72, 83 및 87, 각각 서열번호 78, 73 및 88 또는 각각 서열번호 78, 84 및 89의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 가변 중쇄 도메인을 갖는다.
추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 90)의 CDR1 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 GTNKRAP(서열번호 91)의 CDR2 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질의 CD3 결합 부위는 ALWYSNL(서열번호 92)의 CDR3 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 갖는다. 추가 구현예에서, CD3 결합 부위는 각각 서열번호 90-92의 CDR1, CD2 및 CD3 서열을 포함하는 가변 경쇄 도메인을 갖는다.
어떤 경우에, CD3 결합 부위는 CD3에 대해 높은 친화성을 갖는다. 대안적으로, 다른 경우에, 중쇄 도메인 뿐만 아니라 경쇄 도메인, 또는 선택적으로, 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인으로부터의 CDR1, CDR2, CDR3은 다른 CD3 항체, 예를 들어 UCHT1, 무로모납-CD3(OKT3), 오텔릭시주맙(TRX4), 테플리주맙(MGA031), 비실리주맙(Nuvion) 등으로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, CD33 결합 단백질 뿐만 아니라 인간화되거나 완전한 인간인, 즉 인간 기원의 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질은 CD33 및 CD3에 대한 가변 경쇄 및 중쇄 도메인에 의해 CD33 및 CD3 특이성을 제공하는 하기 조합 중 하나를 가지며, 이는 비제한적으로 하기를 포함한다: (i)　서열번호 2, 12, 65 및 69, (ii)　서열번호 3, 13, 65 및 69, (iii)　 서열번호 4, 14, 65 및 69, (iv) 서열번호 5, 15, 65 및 69, (v) 서열번호 1, 11, 64 및 68, (vi) 서열번호 2, 12, 64 및 68, (vii) 서열번호 2, 12, 66 및 70, (viii) 서열번호 4, 14, 66 및 70, (ix) 서열번호 5, 15, 66 및 70, 및 (x) 서열번호 3, 13, 64 및 68, (xi) 서열번호 3, 13, 67 및 71, (xii) 서열번호 4, 14, 64 및 68, (xiii) 서열번호 5, 15, 64 및 68, (xiv) 서열번호 7, 17, 64 및 68, (xv) 서열번호 6, 16, 64 및 68, (xvi) 서열번호 6, 16, 67 및 71, (xvii) 서열번호 8, 18, 64 및 68, (xviii) 서열번호 9, 19, 64 및 68; (xix) 서열번호 9, 19, 67 및 71, 및 (xx) 서열번호 10, 20, 64 및 68.
CDR 서열 및 중쇄 및 경쇄 도메인의 보존된 변이체
대안적인 구현예에서, 중쇄 및 경쇄 도메인은 본원에 기재된 CDR 서열의 면역학적 활성 동족체 또는 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, CD33 또는 CD3에 결합하는 중쇄 또는 경쇄 도메인 내의 CDR 서열은 서열번호 21-63 또는 72-92에 묘사된 아미노산 서열에 유사하나 동일하지는 않다. 어떤 경우에, CDR 변이체 서열은 서열번호 21-63 또는 72-90의 서열과 비교하여 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80%의 서열 동일성을 가지며 면역학적 활성이다.
추가의 경우, CDR 변이체 서열은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존된 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 치환은 주어진 아미노산을 유사한 특징의 또 다른 아미노산으로 치환하는 아미노산 치환을 포함하며, 지방족 아미노산 중에서, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신의 교환; 하이드록실 잔기 세린 및 트레오닌의 교환, 산성 잔기 아스파테이트 및 글루타메이트의 교환, 아마이드 잔기 아스파라긴 및 글루타민 사이의 치환, 염기성 잔기 리신 및 아르기닌의 교환, 및 방향족 잔기 페닐알라닌 및 티로신 중에서의 대체를 추가로 포함한다.
추가 경우에, CDR 변이체 서열은, 예컨대 안정성, 프로테아제에 대한 내성 및/또는 CD33 또는 CD3에 대한 결합 친화성의 증가와 같이, CDR 특성을 향상시키는 치환을 포함한다.
다른 경우에, CDR 변이체 서열은 중요하지 않은 잔기 또는 중요하지 않은 영역 내의 잔기를 변화시키도록 변형된다. 중요하지 않은 아미노산은 공지된 방법, 예컨대 친화성 성숙, CDR 워킹(walking), 부위-지향적 돌연변이발생, 결정화, 핵 자기 공명, 광친화성 표지, 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이발생에 의해 확인될 수 있다.
추가의 대안적인 구현예에서, CD33 및 CD3 결합 단백질은 본원에 제공된 중쇄 및 경쇄 도메인 서열의 면역학적 활성 동족체 또는 변이체인 중쇄 및 경쇄 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, CD33 및 CD3 결합 단백질은 서열번호 1-20 또는 64-71에 묘사된 아미노산 서열과 유사하나 동일하지 않은 중쇄 또는 경쇄 도메인 서열을 포함한다. 어떤 경우에, 변이체 중쇄 또는 경쇄 도메인 서열은 서열번호 1-20 또는 64-71의 서열과 비교하여 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 또는 80%의 서열 동일성을 가지며 면역학적 활성이다.
추가 경우에, 변이체 중쇄 또는 경쇄 도메인 서열은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 보존된 아미노산 치환을 포함한다. 보존적 치환은 주어진 아미노산을 유사한 특성의 또 다른 아미노산으로 치환하는 아미노산 치환을 포함하며, 지방족 아미노산 중에서 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신의 교환; 하이드록실 잔기 세린 및 트레오닌의 교환, 산성 잔기 아스파테이트 및 글루타메이트의 교환, 아마이드 잔기 아스파라긴 및 글루타민 사이의 교환, 염기성 잔기 리신 및 아르기닌의 교환, 및 방향족 잔기 페닐알라닌 및 티로신 중에서의 대체를 추가로 포함한다.
추가 경우에, 변이체 중쇄 또는 경쇄 도메인 서열은 안정성, 프로테아제에 대한 내성 및/또는 CD33 또는 CD3에 대한 결합 친화성의 증가와 같이 CDR의 특성을 향상시키는 치환을 포함한다.
다른 경우에, 변이체 중쇄 또는 경쇄 도메인 서열은 중요하지 않은 잔기 또는 중요하지 않은 영역 내의 잔기를 변화시키도록 변형된다. 중요하지 않은 아미노산은 공지된 방법, 예컨대 친화성 성숙, CDR 워킹(walking), 부위-지향적 돌연변이발생, 결정화, 핵 자기 공명, 광친화성 표지, 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이발생에 의해 확인될 수 있다.
CD33 및 CD3 이중특이적 및 탠덤 디아바디
또 다른 양태에서, CD33 결합 단백질 또는 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질은 이량체이며, 즉 CD33 및 CD3에 대한 항원 결합 부위를 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 탠덤 디아바디(TandAb®)의 포맷의 이량체성 및 이중특이적 CD33 및 CD3 결합 단백질이 본원에 제공된다. 그러한 탠덤 디아바디는 동종-이량체화를 가능하게 하는 단일 유전자 작제물(도　1) 내에 4개의 항체 가변 결합 도메인(2개의 중쇄 가변 도메인(VH) 및 2개의 경쇄 가변 도메인(VL))을 연결함으로써 제작된다. 그러한 탠덤 디아바디에서 링커 길이는 분자가 그 자체로 다시 폴딩되어 단일-쇄 디아바디를 형성하는 것이 아니라 오히려 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 이룰 수 밖에 없도록 가변 도메인의 분자내 쌍형성을 방지하는 길이이다. 상기 도메인들은 또한 상응하는 VH 및 VL 도메인이 이 이량체 동안 쌍을 이루도록 정렬된다. 단일 유전자 작제물로부터 발현 후, 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄는 두미(head-to-tail)로 폴딩되어 대략 105 kDa의 기능성 비-공유적 동종 이량체를 형성한다(도 1). 분자내 공유 결합의 부재에도 불구하고, 동종 이량체는 일단 형성되면 매우 안정하며, 온전한 상태를 유지하고, 단량체성 형태로 되돌아가지 않는다.
탠덤 디아바디는 전통적인 단일클론 항체 및 그 외 더 작은 이중특이적 분자에 비해 이점을 제공하는 많은 특성을 갖는다. 탠덤 디아바디는 항체 가변 도메인만을 함유하므로 Fc 모이어티와 연관될 수 있는 부작용 또는 비-특이적 상호작용이 결여된 것으로 고려된다. 예를 들어, Fc 도메인에 결합할 수 있는 Fc 수용체는 많은 세포 유형, 예컨대 백혈구 세포(예컨대, 호염기구, B-세포, 호산구, 자연 사멸 세포, 호중구 등) 또는 쿠퍼(Kuppfer) 세포 상에서 발견된다. 탠덤 디아바디는 CD33 및 CD3 각각에 2가 결합할 수 있기 때문에, 결합능은 IgG와 동일하다. 대략 105 kDa의 탠덤 디아바디의 크기는 IgG보다 더 작으며, 이는 향상된 종양 침투를 가능하게 할 수 있다. 그러나 이 크기는 초회 통과 제거(first-pass clearance)를 위한 신장 역치보다 훨씬 높아, 항체-결합 도메인 또는 비-항체 스캐폴드를 기반한 더 작은 이중특이적 포맷에 비해 약동학적 이점을 제공한다. 더욱이, 탠덤 디아바디는 더 긴 고유 반감기 및 빠른 세포독성을 야기하는 이 약동학적 및 결합능 특성을 기초로 BiTE 또는 DART 분자와 같은 다른 이중특이적 결합 단백질보다 더 유익하다. 탠덤 디아바디는 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 CHO 세포에서 잘 발현된다. 강력한 상류 및 하류 제조 공정이 탠덤 디아바디에 이용가능하다는 것이 고려된다.
본원에 기재된 CD33 및 CD3 이중특이적 탠덤 디아바디는 세포독성 T-세포를 동원함으로써 CD33+ 종양 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하도록 설계된다. 이것은 단 하나의 항원을 지향하고 세포독성 T-세포를 직접 동원할 수 없는 전장 항체와 비교하여 ADCC(항체 의존적 세포-매개된 세포독성)를 개선한다. 대조적으로, 이들 세포 상에서 특이적으로 발현된 CD3 분자에 결합함으로써, 탠덤 디아바디는 매우 특이적인 방식으로 CD33+ 종양 세포를 세포독성 T-세포와 교차결합시킬 수 있고, 이로써 상기 분자의 세포독성 잠재능을 유의미하게 증가시킨다. 이 기전은 도 2에 개괄되어 있다. 탠덤 디아바디는 강하고, 특이적이며, 효과적인 ADCC를 나타낸다. T-세포가 종양 성장을 제어하는 역할을 할 수 있다고 보고되어 있다. 예를 들어, NHL 환자로부터의 림프절 뿐만 아니라 결장 종양에서의 세포독성 T-세포의 존재는 더 우수한 임상 결과와 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 더욱이, T-세포 반응을 유도하도록 설계된 요법의 잠재능이 흑색종 백신뿐만 아니라 T-세포 활성화의 음성 조절자인 CTLA-4에 대한 항체에 대해 입증되었다. 본원에 기재된 탠덤 디아바디는 표면-발현된 CD3에의 결합을 통해 세포독성 T-세포에 결합하며, 이는 T-세포 수용체의 일부를 형성한다. 이 탠덤 디아바디가 특정 종양 세포의 표면 상에 발현된 CD3 및 CD33에 동시에 결합하는 것은 T-세포 활성화를 야기하고 종양 세포의 후속 용해를 매개한다(도　2).
그러므로, 추가 양태는 다중특이적 탠덤 디아바디이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 탠덤 디아바디는 2, 3개 이상의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 가지며, 2개 이상의 에피토프는 동일한 항원 표적 또는 상이한 항원 표적일 수 있다. 어떤 구현예에서 다중특이적 탠덤 디아바디는 이중특이적이고 4가이며, 즉 4개의 항원-결합 부위를 포함한다. 그러한 이중특이적 탠덤 디아바디는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 이용하여 인간 CD3 및 인간 CD33에 결합하며, 어떤 경우에, 탠덤 디아바디는 2개의 항원-결합 부위를 이용하여 인간 CD3에 결합하고 2개의 다른 항원-결합 부위를 이용하여 인간 CD33에 결합하며, 즉 탠덤 디아바디는 각각의 항원에 2가로 결합한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 항원-결합 탠덤 디아바디는 인간 CD33 및 인간 CD3에 특이적이며, 상기 탠덤 디아바디는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 차례로 연결된 적어도 4개의 가변 쇄 도메인을 가지며, 각각의 폴리펩타이드는
(i) 인간 CD33에 특이적인 가변 중쇄(VH) 도메인;
(ii) 인간 CD33에 특이적인 가변 경쇄(VL) 도메인;
(iii) 인간 CD3에 특이적인 VH 도메인, 및
(iv) 인간 CD3에 특이적인 VL 도메인
을 포함한다.
특정 구현예에서, 이중특이적 탠덤 디아바디는 인간 CD33의 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)(서열번호 93의 아미노산 잔기 62-70) 내에 있는 인간 CD33의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정한 경우에, 상기 탠덤 디아바디는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 차례로 연결된 적어도 4개의 가변 쇄 도메인을 가지며, 각각의 폴리펩타이드는
(i) 인간 CD33의 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)(서열번호 93의 아미노산 잔기 62-70) 내에 있는 인간 CD33의 에피토프에 특이적인 가변 중쇄 도메인;
(ii) 인간 CD33의 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)(서열번호 93의 아미노산 잔기 62-70) 내에 있는 인간 CD33의 에피토프에 특이적인 가변 경쇄 도메인;
(iii) 인간 CD3에 특이적인 가변 중쇄 도메인, 및
(iv) 인간 CD3에 특이적인 가변 경쇄 도메인
을 포함한다.
다른 구현예에서, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.5 nM 이하의 KD로 CD33+ 세포 상의 CD33에 대해 친화성을 갖는 CD33/CD3 탠덤 디아바디가 본원에 기재된다. CD33+ 세포는, 예를 들어, HL-60 또는 KG-1과 같은 종양 세포로부터 선택될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 CD33/CD3 탠덤 디아바디는 CD3에 결합하며, 어떤 경우에, 10 nM 이하, 5 nM 이하 또는 2 nM 이하의 KD로, CD3+ 세포, 특히 T-세포 상의 CD3의 엡실론 쇄에 결합한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 탠덤 디아바디의 각각의 폴리펩타이드는 4개의 가변 쇄 도메인의 하기 조합 중 하나를 포함한다: (i)　서열번호 2, 12, 65 및 69, (ii)　서열번호 3, 13, 65 및 69, (iii)　 서열번호 4, 14, 65 및 69, (iv) 서열번호 5, 15, 65 및 69, (v) 서열번호 1, 11, 64 및 68, (vi) 서열번호 2, 12, 64 및 68, (vii) 서열번호 2, 12, 66 및 70, (viii) 서열번호 4, 14, 66 및 70, (ix) 서열번호 5, 15, 66 및 70, 및 (x) 서열번호 3, 13, 64 및 68, (xi) 서열번호 3, 13, 67 및 71, (xii) 서열번호 4, 14, 64 및 68, (xiii) 서열번호 5, 15, 64 및 68, (xiv) 서열번호 7, 17, 64 및 68, (xv) 서열번호 6, 16, 64 및 68, (xvi) 서열번호 6, 16, 67 및 71, (xvii) 서열번호 8, 18, 64 및 68, (xviii) 서열번호 9, 19, 64 및 68; (xix) 서열번호 9, 19, 67 및 71, 및 (xx) 서열번호 10, 20, 64 및 68.
본원에 사용된 바와 같이, "이량체"는 2개의 폴리펩타이드의 복합체를 지칭한다. 어떤 구현예에서, 상기 2개의 폴리펩타이드는, 특히 상기 2개의 폴리펩타이드 사이에 공유 결합이 없다는 단서 하에, 서로 비공유적으로 결합한다. 어떤 경우에, 2개의 폴리펩타이드는 이량체의 안정화를 돕기 위해 형성되는 디설파이드 결합과 같은 공유 결합을 갖는다. 어떤 구현예에서, 이량체는 동종이량체성이며, 즉 2개의 동일한 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "폴리펩타이드"는 아미드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭한다. 폴리펩타이드는, 어떤 경우에, 분지되지 않은 단일 쇄 융합 단백질이다. 폴리펩타이드에서, 가변 항체 도메인은 차례로 연결된다. 폴리펩타이드는, 다른 경우에, 가변 도메인 N-말단 및/또는 C-말단 잔기 외에도 연속된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 그러한 연속된 아미노산 잔기는, 일부 경우에 C-말단에 태그(Tag) 서열을 포함할 수 있고, 이는 폴리펩타이드의 정제 및 검출에 유용한 것으로 고려된다.
일 양태에서, 이중특이적 탠덤 디아바디의 각각의 폴리펩타이드는 4개의 가변 도메인인 CD3 결합 단백질의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH) 뿐만 아니라 CD33 결합 단백질의 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)를 포함한다. 어떤 구현예에서, 4개의 가변 도메인은 펩타이드 링커 L1, L2 및 L3에 의해 연결되고 일부 경우에 하기와 같이 N-말단에서부터 C-말단으로 배열된다:
도메인 순서:
(1) VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3); 또는
(2) VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3); 또는
(3) VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); 또는
(4) VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33).
링커의 길이는 보고된 연구에 따르면 항원-결합 탠덤 디아바디의 유연성(flexibility)에 영향을 미친다. 따라서, 일부 구현예에서, 펩타이드 링커 L1, L2 및 L3의 길이는 하나의 폴리펩타이드의 도메인이 또 다른 폴리펩타이드의 도메인과 분자내로 결합하여 이량체성 항원-결합 탠덤 디아바디를 형성할 수 있도록 하는 길이이다. 어떤 구현예에서, 그러한 링커는 "짧으며", 즉 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 아미노산 잔기로 이루어진다. 따라서, 어떤 경우에, 링커는 약 12개 이하의 아미노산 잔기로 이루어진다. 0개의 아미노산 잔기의 경우, 링커는 펩타이드 결합이다. 그러한 짧은 링커는 상이한 폴리펩타이드의 항체 가변 경쇄 도메인 및 항체 가변 중쇄 도메인 사이의 항원-결합 부위를 결합시키고 형성함으로써 2개의 폴리펩타이드의 분자내 이량체화를 돕는다. 링커를 약 12개 이하의 아미노산 잔기로 단축시키는 것은 일반적으로 동일한 폴리펩타이드 쇄의 인접 도메인들이 서로 분자내 상호작용하는 것을 방지한다. 일부 구현예에서, 이들 링커는 약 3 내지 약 10, 예를 들어 4, 5 또는 6개의 연속적인 아미노산 잔기로 이루어진다.
링커의 아미노산 조성과 관련하여, 펩타이드는 2개의 폴리펩타이드의 이량체화를 방해하지 않도록 선택된다. 예를 들어, 글리신 및 세린 잔기를 포함하는 링커는 일반적으로 프로테아제 내성을 제공한다. 링커의 아미노산 서열은, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩타이드 이량체의 항원 결합 및 생산 수율을 개선하는 파아지-디스플레이 방법에 의해 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서 탠덤 디아바디에 적합한 펩타이드 링커는 GGSGGS(서열번호 95), GGSG(서열번호 96), 또는 GGSGG(서열번호 97)이다.
본원에 기재된 탠덤 디아바디의 비제한적인 예는 표 7에 따른 항-CD33 VL 및 VH 도메인, 항-CD3 VL 및 VH 도메인, 도메인 차수 및 링커를 갖는 탠덤 디아바디이다.
표 7 예시적인 CD33/CD3 탠덤 디아바디 ( TandAbs )
탠덤
디아바디 		항-CD33 도메인 항-CD3 도메인 도메인
차수 		링커
VL VH VH VL L1/L3 L2
01 서열번호 2 서열번호 12 서열번호 65 서열번호 69 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSG( 서열번호 96)
02 서열번호 3 서열번호 13 서열번호 65 서열번호 69 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSG( 서열번호 96)
03 서열번호 4 서열번호 14 서열번호 65 서열번호 69 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSG( 서열번호 96)
04 서열번호 5 서열번호 15 서열번호 65 서열번호 69 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSG( 서열번호 96)
05 서열번호 4 서열번호 14 서열번호 65 서열번호 69 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSGG( 서열번호 97)
06 서열번호 5 서열번호 15 서열번호 65 서열번호 69 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSGG( 서열번호 97)
07 서열번호 1 서열번호 11 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS( 서열번호 95) GGSGGS( 서열번호 95)
08 서열번호 2 서열번호 12 서열번호 64 서열번호 68 3 GGSGGS (서열번호 95) GGSGGS (서열번호 95)
09 서열번호 2 서열번호 12 서열번호 66 서열번호 70 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
10 서열번호 4 서열번호 14 서열번호 66 서열번호 70 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
11 서열번호 5 서열번호 15 서열번호 66 서열번호 70 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
12 서열번호 3 서열번호 13 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
13 서열번호 3 서열번호 13 서열번호 67 서열번호 71 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
14 서열번호 2 서열번호 12 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
15 서열번호 4 서열번호 14 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
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18 서열번호 7 서열번호 17 서열번호 64 서열번호 68 2 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
19 서열번호 6 서열번호 16 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
20 서열번호 6 서열번호 16 서열번호 67 서열번호 71 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
21 서열번호 8 서열번호 18 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
22 서열번호 9 서열번호 19 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
23 서열번호 9 서열번호 19 서열번호 67 서열번호 71 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
24 서열번호 10 서열번호 20 서열번호 64 서열번호 68 1 GGSGGS (서열번호 95) GGSG (서열번호 96)
일부 구현예에서, 탠덤 디아바디는 도 9B 내지 9Y에 묘사된 바와 같은 탠덤 디아바디 01(서열번호 98), 02(서열번호 99), 03(서열번호 100), 04(서열번호 101), 05(서열번호 102), 06(서열번호 103), 07(서열번호 104), 08(서열번호 105), 09(서열번호 106), 10(서열번호 107), 11(서열번호 108), 12(서열번호 109), 13(서열번호 110), 14(서열번호 111), 15(서열번호 112), 16(서열번호 113), 17(서열번호 114), 18(서열번호 115), 19(서열번호 116), 20(서열번호 117), 21(서열번호 118), 22(서열번호 119), 23(서열번호 120), 또는 24(서열번호 121)이다.
본원에 기재된 CD33 결합 단백질 및 CD33/CD3 이중특이적 결합 단백질(예컨대, CD33/CD3 이중특이적 탠덤 디아바디)은, 일부 구현예에서, 또 다른 동일한 폴리펩타이드와 결합하여 항원-결합 탠덤 디아바디를 형성하는 탠덤 디아바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시킴으로써 생산된다. 그러므로, 또 다른 양태는 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 DNA 또는 RNA이다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 공지된 방법에 의해, 예컨대 펩타이드 링커에 의해 분리되거나 또는 다른 구현예에서 펩타이드 결합에 의해 직접 연결된, 적어도 4개의 항체 가변 도메인을 인코딩하는 유전자를, 적합한 프로모터, 및 선택적으로 적합한 전사 종결자에 작동가능하게 연결된 단일 유전적 작제물로 조합하고, 이를 박테리아 또는 다른 적절한 발현 시스템, 예컨대 CHO 세포에서 발현시킴으로써 제작된다. 이용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 항시적 및 유도성 프로모터를 포함하는 많은 적합한 전사 및 번역 요소가 사용될 수 있다. 프로모터는 각각의 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 구동하도록 선택된다.
일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터 내로 삽입되며, 이는 추가 구현예에 해당한다. 이 재조합 벡터는 공지된 방법에 따라 제작될 수 있다.
상기 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하고 발현하는 다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 이용될 수 있다. E. coli에서의 발현을 위한 발현 벡터의 예는 pSKK(Le Gall et al., J Immunol Methods. (2004) 285(1):111-27)이거나 또는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 pcDNA5(Invitrogen)이다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는, 일부 구현예에서, 상기 기재된 폴리펩타이드를 인코딩하는 벡터를 숙주 세포 내로 도입하고 상기 숙주 세포를 폴리펩타이드 쇄가 발현되고, 단리될 수 있고, 선택적으로 추가로 정제될 수 있는 조건 하에 배양함으로써 생산된다.
다른 양태에서, 본원에 기재된 CD33 결합 단백질 또는 CD33/CD3 이중특이적 결합 단백질(예컨대, CD33/CD3 이중특이적 탠덤 디아바디)은 변형을 갖는다. 전형적인 변형은, 비제한적으로, 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 약물 접합, 가교결합, 사이클화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교결합의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마 카복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 공정, 인지질, 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 셀레늄화(selenoylation), 황산화, 아르기닐화(arginylation)와 같은 단백질에 아미노산의 전달-RNA 매개된 부가, 및 유비퀴틴화(ubiquitination)를 포함한다. 추가 구현예에서, CD33 결합 단백질 또는 CD33/CD3 이중특이적 결합 단백질은 리더 또는 분비 서열 또는 폴리펩타이드의 정제를 위한 서열과 같은 부가적인 아미노산을 이용하여 변형된다.
다른 양태에서, 항원-결합 탠덤 디아바디, CD33 결합 단백질, 항원 결합 탠덤 디아바디의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 이 벡터에 의해 혈질전환된 숙주 세포 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는, 비제한적으로, 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않으며 투여되는 환자에게 비독성인 임의의 담체를 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 본 기술분야에 널리 알려져 있으며, 인산 완충 식염액, 물, 유화액, 예컨대 유중수 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균액 등을 포함한다. 그러한 담체는 종래의 방법에 의해 제형화될 수 있고 적합한 용량으로 대상에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 멸균이다. 이들 조성물은 또한 보조제, 예컨대 보존제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제를 포함함으로써 보장될 수 있다.
CD33 및 CD3에 대해 높은 친화성 결합을 갖는 이중특이적 CD33/CD3 결합 단백질은 상당히 많은 일차 AML 표본에서 매우 활성이며, 이는 이들 분자가 최소한의 CD33 발현의 경우에도, 전체 세포유전학/분자 질환 범위에 걸쳐 인간 AML에 대해 활성일 수 있다는 것을 제시한다. 중요하게도, 약물-특이적 세포독성은 또한 잔여 자가 T-세포의 존재시에도 관찰되며 건강한 공여자 T-세포의 제어된 양을 부가함으로써 유의미하게 증가된다(실시예 6 참고).
CD33/CD3 이중특이적 결합 단백질, 특히 탠덤 디아바디는 시험관내에서 CD33+ 백혈병 세포의 강력한 세포용해를 유도할 수 있다. 상기 데이터는 CD33 및 CD3 모두에 대한 높은 친화성 결합이 이중특이적 단백질-유도된 T-세포 활성화 및 항-AML 효능을 최대화한다는 것을 가리킨다. 높은-친화성 CD33/CD3-유도된 이중특이적 결합 단백질, 예컨대 본원에 기재된 탠덤 디아바디는 시험관내에서 일차 AML 에서 세포용해 활성을 나타낸다. 따라서, 이들 이중특이적 결합 단백질 및 탠덤 디아바디는 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 다른 혈액암, 예를 들어, 골수성 이형성 증후군(MDS) 또는 골수증식 질환(MPD)의 치료를 위한 치료적 접근에 적합하다.
그러므로, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디가 CD33+ 암(예컨대 급성 골수성 백혈병(AML)), 질환 또는 병태의 치료를 위해, 대상, 예컨대 환자에게 효과적인 용량으로 투여되는 방법이 본원에 제공된다. CD33+ 암은, 비제한적으로 급성 백혈병, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 전구체 B-세포 림프구성 백혈병을 포함하는 급성 림프구성 백혈병(ALL), 골수성 육종, 다발성 골수종, 급성 림프종, 예컨대 급성 림프구성 림프종, 만성 골수단구성 백혈병 등을 포함한다. CD33+ 질환 및 병태는 특정 암 및 만성 염증에서 골수 유래의 억제세포(MDSC)에 의해 기인한 면역 억제 상태 또는 환경을 포함한다
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 급성 골수성 백혈병(AML)의 치료를 위해 투여된다. 어떤 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 급성 골수성 백혈병 서브타입의 치료를 위해 투여된다.
프랑스-미국-영국 분류 시스템은 AML을 8개의 서브타입으로 나눈다: AML-M0(최소 분화), AML-M1(미성숙), AML-M2(과립구 성숙), AML-M3 (전골수성 또는 급성 전골수성 백혈병), AML-4(급성 골수단구성 백혈병), AML-M5(급성 단모구성 또는 단구성 백혈병), AML-M6(급성 적혈구계 백혈병), 및 AML-M7(급성 거핵모구성 백혈병). 어떤 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 AML-M0, AML-M1, AML-M2, AML-M3, AML-M4, AML-M5, AML-M6, 또는 AML-M7의 치료를 위해 투여된다.
WHO AML 분류체계는 AML을 하기 서브타입에 따라 체계화한다: 반복 유전자 이상을 갖는 AML, 골수이형성증-관련된 변화를 갖는 AML, 치료 관련 골수성 종양, 골수성 육종, 다운 증후군과 관련된 골수성 증식, 모구 형질세포양 수지상세포 종양(Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 및 달리 분류되지 않은 AML. 어떤 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 반복 유전자 이상을 갖는 AML, 골수이형성증-관련된 변화를 갖는 AML, 치료 관련 골수성 종양, 골수성 육종, 다운 증후군과 관련된 골수성 증식, 모구 형질세포양 수지상세포 종양, 또는 달리 분류되지 않은 AML의 치료를 위해 투여된다.
일부 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 새롭게 진단된, 재발된 또는 난치 AML의 치료를 위해 투여된다.
추가 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 골수성 이형성 증후군(MDS) 또는 골수증식 질환(MPD)과 같은 전백혈병 혈액 장애의 치료를 위해 투여된다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MDS의 치료를 위해 투여된다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MPD의 치료를 위해 투여된다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 다발성 골수종의 치료를 위해 투여된다. 추가 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)의 치료를 위해 투여된다.
다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 골수 유래의 억제세포(MDSC)를 억제하거나 제거하기 위해 투여된다. MDSC는 어떤 단리된 병든 조직에서 CD33을 고도로 과발현하고 강한 면역억제 활성을 갖는다. 어떤 인간 암(CD33+ 뿐만 아니라 비-CD33+)에서, MDSC는 증식하고 활성화되어 종양-특이적 CD4+ T-세포 반응을 억제하고 Treg 세포를 유도하여, 종양 또는 암이 미세환경에서 잘 자라게 한다. 만성 염증에서, MDSC는 보고에 따르면 염증 부위에서 확장되고 발견되어 T 세포 면역 기능을 억제한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MDSC와 연관된 병태를 치료하기 위해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 면역 억제를 치료하기 위해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MDSC에 의해 억제되는 염증을 치료하기 위해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MDSC에 의해 야기되는 감소된 면역 반응을 치료하기 위해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MDSC에 의해 촉진되는 혈관형성, 종양 침윤, 또는 암의 전이를 치료하기 위해 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 탠덤 디아바디는 MDSC에 의해 향상되거나, 증대되거나, 악화되거나, 증가되는 암 또는 종양을 치료하기 위해 투여된다.
본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 약제로서 사용하기 위한 것으로 고려된다. 투여는 다양한 방식에 의해, 예컨대 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 투여 경로는 요법의 종류 및 약제학적 조성물에 함유된 화합물의 종류에 좌우된다. 투여요법은 주치의 및 다른 임상 인자에 의해 결정될 것이다. 어느 한 환자에 대한 투여량은, 환자의 크기, 체 표면적, 연령, 성별, 투여될 특정 화합물, 투여 시간 및 경로, 요법의 종류, 일반 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함하는 많은 인자에 좌우된다. "효과적인 용량"은 질환의 경과 및 중증도에 영향을 미쳐 그러한 병리학의 감소 또는 차도를 야기하는데 충분한 활성 성분의 양을 지칭한다. AML을 치료하고/거나 예방하는데 유용한 "효과적인 용량"은 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
추가 구현예에서, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 CD33+ 암, 질환 또는 병태에 대한 표준 요법과 조합하여 투여된다. 표준 요법은 화학요법, 면역요법, 호르몬 요법, 방사선, 수술, 유전자 요법 등을 포함한다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 표준 AML 요법과 조합하여 투여된다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 시타라빈, 아자시티딘, 데시타빈, 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신, 이다루비신, 독소루비신, 등), 암사크린, 플루다라빈, 클로파라빈, 클라드리빈, 넬라라빈, 메토트렉세이트, 보르테조밉, 카르필조밉, 멜팔란, 이브루티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 아프레밀라스트, 에피포도필로톡신(예컨대, 에토포사이드, 테니포사이드, 등), 안트라센디온(예컨대, 미톡산트론, 픽산트론, 로속산트론, 피록산트론, 아메탄트론 등), 항-CD20 제제(예컨대, 리툭시맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙), 또는 이의 조합과 조합하여 투여된다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 시타라빈(ara-C)과 조합하여 투여된다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 아자시티딘과 조합하여 투여된다. 어떤 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 데시타빈과 조합하여 투여된다. 추가의 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 안트라사이클린(예컨대, 다우노루비신, 이다루비신, 독소루비신, 등)과 조합하여 투여된다. 다른 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 체크포인트 억제제(예컨대, PD-1 억제제, CTLA-4 억제제 등)과 조합하여 투여된다. 또 다른 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 에피포도필로톡신(예컨대, 에토포사이드, 테니포사이드, 등)과 조합하여 투여된다. 또 다른 경우에, 본원에 기재된 항원-결합 탠덤 디아바디는 안트라센디온(예컨대, 미톡산트론, 픽산트론, 로속산트론, 피록산트론, 아메탄트론 등)과 조합하여 투여된다.
하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않으면서 기재된 구현예를 더 예시한다.
실시예
실시예 1
단일-쇄 Fv 항체를 인코딩하는 DNA 발현 작제물의 클로닝
E. coli에서 항-CD33 단일-쇄 Fv(scFv) 항체의 박테리아 발현을 위해, 모든 분자의 DNA 코딩 서열을 박테리아 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 주변 세포질로의 항체 분비 및 정제를 용이하게 하기 위하여 모든 발현 작제물을 각각 N-말단 신호 펩타이드 및 C-말단 헥사-히스티딘(6xHis)-태그 (서열번호 122) 에 대한 코딩 서열을 함유하도록 설계하였다. 모든 항-CD33 scFv 클론으로부터의 VL 및 VH-도메인의 아미노산 서열이 표 3 및 표 4에 나타나 있다.
E. coli 에서 재조합 항-CD33 scFv 항체의 발현
재조합 scFv 항체를 E. coli 주변세포질에서 가용성 분비된 단백질로서 발현하였다. 첫 단계에서, 암피실린이 보충된 작은 배지 배양물에 형질전환된 박테리아를 접종하고 28℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후, 암피실린이 보충된 제2 배지를 부가하여 광학 밀도를 조정하고, 600 nm에서 0.6 - 0.8 범위의 광학 밀도에 도달할 때까지 28℃에서 한번 더 배양하였다. 50 μM IPTG를 부가하고 최대 16시간 동안 21-28℃ 및 200 rpm에서 배양물을 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 배양 후, 세포를 펠렛화하고(30분, 4℃, 7500 rpm), 추가 공정시까지 -20℃에서 보관하였다.
항-CD33 단일-쇄 Fv 항체의 정제
세포 펠렛을 완충제에 재현탁시키고 서서히 교반하면서 실온에서 30분간 배양하여 수득한 박테리아 세포 배양물을 원심분리한 후, E. coli 주변세포질로부터 재조합 scFv를 추출하였다. 세포를 펠렛화하고 재조합 단백질을 함유한 상층액을 남겨두었다. 상기 과정을 한번 더 반복한 후 상층액을 모아 초음파처리에 의해 균질화하였다. 균질물을 희석하고, 낮은 농도의 이미다졸을 보충하고, 미리팩킹된 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 기저선에 도달할 때까지 세척한 다음, 결합된 단백질을 이미다졸 완충제로 용리시켰다. 항체 함유 분획을 모은 다음 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제하였다. 마지막으로, 단백질 용리물을 한외여과에 의해 농축하고 보관 완충제에 대해 투석하였다. 낮은 pH 처리(37℃에서 20-24시간 동안 pH 3.0에서 배양) 후, 샘플을 트리스를 이용하여 중화하였다. 정제된 단백질을 사용시까지 -80℃에서 분취량으로서 보관하였다.
실시예 2
탠덤 디아바디(TandAb®)를 인코딩하는 DNA 발현 작제물의 클로닝
CHO 세포에서 이중특이적 탠덤 디아바디의 발현을 위해, 모든 분자의 코딩 서열을 포유동물 발현 벡터 시스템 내로 클로닝하였다. 실시예 1의 항-CD33 scFv 도메인을 사용하여 항-CD3 scFv 도메인과 조합된 CD33/CD3 탠덤 디아바디를 제작하였고, 도메인은 표 7 및 도 3에 나타난 바와 같이 조직되었다. 요약하면, 펩타이드 링커에 의해 분리된 항-CD33 VH 및 VL 도메인(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH)을 인코딩하는 유전자 서열을 합성하고 서브클로닝하였다. 수득된 작제물을 링커 서열 내에 위치한 Bam HI 제한 부위를 이용하여 절단하여 별개의 VH 및 VL 코딩 서열을 생성하였다. 그리고 나서, 이들 VH 및 VL 단편을 항-CD3의 VH 및 VL 도메인(VH-링커-VL 또는 VL-링커-VH)을 인코딩하는 DNA 단편과 라이게이션(ligation)하여 최종 작제물을 생성하였다. CD33/CD3 탠덤 디아바디의 도메인 차수 변이체 1 내지 3이 도 3에 나타나 있다. 항체 분비 및 정제를 용이하게 하기 위하여 모든 발현 작제물을 각각 N-말단 신호 펩타이드 및 C-말단 헥사히스티딘(6xHis)-태그에 대한 코딩 서열 (서열번호 122) 을 함유하도록 설계하였다.
안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 탠던 디아바디의 발현
CHO-K1 차이니즈 햄스터 난소 세포의 파생물(ATCC, CCL-61)(Kao and Puck, Proc. Natl. Acad Sci USA 1968;60(4):1275-81)인 CHO 세포 발현 시스템(Flp-In®, Life Technologies)을 사용하였다. 부착성 세포를 Life Technologies에 의해 제공된 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 서브배양하였다.
현탁 성장에 적응시키기 위해, 세포를 조직 배양 플라스크에서 떼내어 무혈청 배지에 넣었다. 현탁-적응된 세포를 10% DMSO를 갖는 배지에서 동결보존하였다.
분비된 탠덤 디아바디를 안정적으로 발현하는 재조합 CHO 세포주를 현탁-적응된 세포의 형질감염에 의해 생성하였다. 항생제 하이그로마이신(Hygromycin) B를 이용한 선택 동안 생존 세포 밀도를 1주에 2회 측정하고, 세포를 원심분리하고 0.1x106 생존 세포/mL의 최대 밀도로 신선한 선택 배지에 재현탁하였다. 탠덤 디아바디를 안정적으로 발현하는 세포 집단(pool)은 세포가 쉐이크 플라스크 내의 표준 배양 배지로 옮겨지는 시점인 2-3주의 선택 후에 회복되었다. 재조합 분비된 단백질의 발현을 단백질 겔 전기영동 또는 유세포 분석법을 수행함으로써 확인하였다. 안정적인 세포 집단을 DMSO 함유 배지에서 동결보존하였다.
탠덤 디아바디를 세포 배양 상층액 내로의 분비에 의해 안정적으로 형질감염된 CHO 세포주의 10일 유가 배양(fed-batch culture)에서 생산하였다. 세포 배양 상층액을 전형적으로 >75%의 배양 생존력으로 10일 후 채취하였다. 샘플을 2일마다 생산 배양으로부터 수집하고, 세포 밀도 및 생존력을 평가하였다. 채취일에, 세포 배양 상층액을 추가 사용 전에 원심분리 및 진공 여과에 의해 청징하였다.
세포 배양 상층액에서 단백질 발현 역가 및 산물 온전성(product integrity)을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
탠덤 디아바디의 정제
탠덤 디아바디를 2단계 과정으로 CHO 세포 배양 상층액으로부터 정제하였다. His6-태그된 (서열번호 122) 작제물을 1단계에서 Ni-NTA Superflow 크로마토그래피에 둔 다음, 2단계에서 Superdex 200 상에서 분취 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 두었다. 용리된 탠덤 디아바디를 이들의 동종이량체(탠덤 디아바디) 함량에 대해 규명하고 만약 동종이량체 함량이 90% 이상이면 모았다. 마지막으로, 모은 샘플을 완충제-교환하고 한외여과에 의해 >1 mg/mL의 전형적인 농도로 농축하였다. 최종 샘플의 순도 및 균일성(전형적으로 >90%)을 환원 및 비-환원 조건하에 SDS PAGE 후, 각각 항-His-Tag 항체를 이용한 면역블롯팅 뿐만 아니라 분석적 SEC에 의해 평가하였다. 정제된 단백질을 사용시까지 -80℃에서 분취량으로 보관하였다.
CD33/CD3 탠덤 디아바디의 폴리펩타이드가 표 7 및 도　3에 나타나 있다. 각각의 탠덤 디아바디는 2개의 동일한 폴리펩타이드로 이루어져 있다(도　1). 두 가지 외측 링커 L1 및 L3은 6개의 아미노산 GGSGGS(서열번호 95)로 구성된 반면, 중심 펩타이드 링커 2는 각각 서열 GGSG(서열번호 96), GGSGG(서열번호 97), 또는 GGSGGS(서열번호 95)로 길이가 다양하였다(4-6 아미노산).
일련의 항-CD33 가변 도메인 및 항-CD3 가변 도메인을 이용하여, 형질감염된 세포주에서 안정적으로 생산될 수 있고 체온에서뿐만 아니라 반복된 동결/해동 사이클 후에 안정성을 유지할 수 있는 상당히 많은 탠덤 디아바디 분자를 생성하였다. 추가 개발 및 임상전 독성학 연구를 용이하게 하기 위해, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD33 모두에 대해 결합을 나타내는 탠덤 디아바디 분자를 선택하는데 역점을 두었다. 완전한 아미노산 서열의 예가 각각 도 9M, 9O 및 9Q에 탠덤 디아바디 12(서열번호 109), 14(서열번호 111) 및 16(서열번호 113)의 단일-쇄에 대해 나타나 있다. 이 예에서 상기 구조에 대한 가변 도메인 및 이들의 링커의 순서는 하기와 같다: VL (CD3)-L1-VH (CD33)-L2-VL (CD33)-L3-VH (CD3).
실시예 3
유세포 분석법에 의한 항체 친화성의 결정
세포를 100 μL의 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 연속 희석물과 함께 배양하였다. FACS 완충제로 3회 세척한 후, 세포를 얼음 상에서 45분 동안 동일한 완충제 중의 0.1 mL의 10 μg/mL 마우스 단일클론 항-His 항체와 함께 배양하였다. 2차 세척 사이클 후, 세포를 전과 동일한 조건하에 0.1 mL의 15 μg/mL FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 배양하였다. 대조군으로서, 세포를 항-His IgG와 함께 배양한 후 항-CD33 탠덤 디아바디 없이 FITC-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 배양하였다. 그리고 나서, 세포를 다시 세척하고 죽은 세포를 배제하기 위해 2 μg/mL 프로피듐 아이오다이드(PI)를 함유하는 0.2 mL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 1x104 살아있는 세포의 형광성을 MXP 소프트웨어를 이용한 Beckman-Coulter FC500 MPL 유세포분석기(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany) 또는 Incyte 소프트웨어를 이용한 Millipore Guava EasyCyte 유세포분석기(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 이용하여 측정하였다. 세포 샘플의 평균 형광 강도를 CXP 소프트웨어(Beckman-Coulter, Krefeld, Germany) 또는 Incyte 소프트웨어(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)를 이용하여 계산하였다. 2차 및 3차 시약 단독으로 염색된 세포의 형광 강도값을 뺀 후, 상기 값을 GraphPad Prism(윈도우용 버전 6.00, GraphPad Software, La Jolla California USA)의 1-부위 결합에 대한 식(쌍곡선)을 이용하여 KD 값을 계산하는데 사용하였다.
탠덤 디아바디를 인간 CD3+ 및 CD33+ 세포 및 시노몰구스 CD3+ 및 CD33+ 세포에 대한 이들의 결합 친화성을 시험하였다. 선택된 탠덤 디아바디에 대한 예시적인 결합 데이터가 표 8에 요약되어 있다:
표 8 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 CD3 및 CD33 결합 특징
TandAb T 세포 상에서 K D [nM] HL -60 상에서 K D [nM] KG-1 상에서 K D [nM] U-937 상에서 K D [nM] K D 비율 cynoCD33/ huCD33 HL -60 상 에서EC 50 [pM]
01 94.2 0.6 0.9 7.1 0.7 1.9
02 69.8 0.2 0.3 0.9 1.1 0.5
03 81.9 1.1 1.8 8.9 0.6 3.6
04 79.3 0.5 0.5 1.7 1.1 1.8
05 69.5 1.0 1.2 6.2 0.8 2.7
06 86.3 0.4 0.5 1.6 0.8 1.6
07 49.7 13.7 47.9 47.1 45.8 17.8
08 2.4 0.3 0.5 1.8 0.6 1.8
09 2.4 0.5 0.3 2.2 1.0 6.8
10 1.9 0.5 1.0 1.7 0.8 7.0
11 2.6 0.3 0.5 0.6 1.2 5.9
12 1.5 0.3 0.9 0.5 1.7 1.3
13 55.7 0.2 0.3 0.5 1.6 1.1
14 2.1 0.3 0.3 1.2 1.0 1.6
15 1.3 0.4 0.3 0.9 1.1 1.8
16 2.1 0.3 0.2 0.3 1.4 1.5
17 3.3 5.0 52.5 24.4 1.9 18.4
18 1.9 3.4 16.3 15.1 3.1 6.3
19 6.3 2.8 3.6 5.4 37.3 5.7
20 143.8 4.1 7.0 7.2 33.8 10.0
21 2.1 9.7 25.1 80.2 0.9 7.6
22 4.1 0.7 2.0 8.6 0.6 3.2
23 97.2 0.4 1.0 5,1 1.9 2.8
24 2.3 5.6 12.4 39.5 1.8 9.6
#KD 비율 시아노 CD33 / 인간 CD33을 각각 시노몰구스 CD33 및 인간 CD33을 발현하는 CHO 세포 상에서 측정된 KD 값에 기초하여 계산하였다.
Figure pct00001
KD 비율 hu CD3 / hu CD33을 Jurkat 세포(hu CD3) 상에서 측정된 KD 값 및 3개의 인간 CD33+ 종양 세포주(HL-60, KG-1, U937)의 평균 KD에 기초하여 계산하였다.
CD3 결합 친화성 및 교차반응성을 CD3+ Jurkat 세포(Moldenhauer 박사, DKFZ Heidelberg에 의해 제공됨; 인간 급성 T-세포 백혈병) 및 시노몰구스 CD3+ HSC-F 세포주(JCRB, cat.:JCRB1164) 상에서의 역가 및 유세포분석 실험에서 평가하였다. CD33 결합 및 교차반응성을 인간 CD33+ 종양 세포주: HL-60(DSMZ, cat.:ACC 3, 인간 B 세포 전구체 백혈병), U-937(DSMZ, cat.: ACC5; 인간 조직구 림프종), 및 KG-1(DSMZ, cat.:ACC14; 급성 골수성 백혈병) 상에서 평가하였다. 교차반응성의 KD 비율을 재조합 인간 또는 재조합 시노몰구스 항원 중 하나를 발현하는 CHO 세포주 상에서 결정된 KD 값을 이용하여 계산하였다.
탠덤 디아바디는 1 nM 미만의 시험된 대부분의 종양 세포주 상의 인간 CD33+ 에 대해 상대적으로 높은 친화성을 나타내었다. 인간 CD3에 대한 친화성은 2 nM 이하인 것으로 결정되었다.
실시예 4
세포독성 분석
세포독성 분석을 위해, 표준 조건하에 배양된 표적 세포를 채취하고, 세척하고, PKH67 녹색 형광 세포 링커 미니 키트에서 제공된 희석제 C에 2x107 세포/mL의 밀도로 재현탁하였다. 그리고 나서, 상기 세포 현탁액을 동일한 부피의 이중 농축된 PKH67-표지액과 혼합하고 RT에서 2-5분간 배양하였다. 동일한 부피의 FCS를 부가하고 1분간 배양함으로써 염색 반응을 수행하였다. 상기 표지된 표적 세포를 완전 RPMI 배지를 이용하여 세척한 후, 세포를 계수하고 완전 RPMI 배지에 2x105 세포/mL의 밀도로 재현탁하였다. 그리고 나서, 2x104 표적 세포를 200 μL/웰의 총 부피로, 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰 내에 상기 표시된 탠덤 디아바디의 증가하는 농도의 존재하에, 5:1의 E:T 비율로 효과기 세포로서 농축된 인간 T-세포와 함께 시딩하였다. 항체의 부재하에 T-세포에 의한 표적의 자연적인 세포 죽음 및 사멸을 각 플레이트 상에서 적어도 삼반복으로 결정하였다. 원심분리 후, 분석 플레이트를 5% CO2를 갖는 습한 공기 중에서 37℃에서 표시된 기간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양물을 FACS 완충제로 1회 세척한 다음 2 μg/mL PI가 보충된 150 μL FACS 완충제에 재현탁시켰다. 살아있는 표적 세포의 절대량을 Beckman-Coulter FC500 MPL 유세포분석기(Beckman-Coulter) 또는 Millipore Guava EasyCyte 유세포분석기(Merck Millipore)를 이용하여 PKH67를 이용한 양성 녹색 염색 및 PI에 대한 음성 염색에 의해 측정하였다. 측정된 남아있는 살아있는 표적 세포를 기초로, 특이적 세포 용해의 백분율을 하기 식에 따라 계산하였다: [1-(살아있는 표적의 수(샘플)/살아있는 표적의 수(자연적))] x 100%. S자형 용량 반응 곡선 및 EC50 값을 GraphPad 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀/4-매개변수 논리 적합에 의해 계산하였다. 주어진 항체 농도에 대해 수득된 용해 값을 사용하여 Prism 소프트웨어를 이용한 4 매개변수 논리 적합 분석에 의해 S자형 용량-반응 곡선을 계산하였다.
EC50 값을 5:1의 비율로 효과기 세포로서 농축된 인간 T-세포를 이용하여 CD33+ U-937(DSMZ, cat.: ACC5; 인간 조직구 림프종) 표적 세포 상에서 20-24시간 분석에서 결정하였다. 일부 탠덤 디아바디를 또한 CD33+ KG-1(DSMZ, cat.:ACC14; 급성 골수성 백혈병) 및 HL-60 표적 세포 상에서 세포독성 분석에서 또한 시험하였다. 구체적으로, HL-60 세포를 CD33의 상대적으로 높은 세포 표면 발현(임의적 MFI [평균±SEM]: 3,133±215; n=3)을 갖는 AML의 모델로서 선택하였고, KG-1a를 매우 제한된 CD33 발현(임의적 MFI: 277±11; n=3)을 갖는 AML의 모델로서 선택하였다. 선택된 탠덤 디아바디에 대한 예시적인 세포독성 데이터가 표 9에 요약되어 있다. HL-60 세포주에 대한 부가적인 세포독성은 표 8의 마지막 컬럼에 나타나 있다.
표 9 상이한 CD33 + 종양 세포주에 대한 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 시험관내 효력(potency)
탠덤
디아바디 		인간 CD33 + 표적 세포주 상에서의 EC 50 [pM ( pg /mL)]
HL-60 U-937 KG-1 평균
12 1.3 (137) 0.8 (84) 1.2 (126) 1.1 (116)
14 1.6 (168) 3.6 (378) 2.6 (273) 2.6 (273)
16 1.5 (158) 1.9 (200) 1.8 (189) 1.7 (179)
EC50 값을 20-24시간 동안 배양된 표시된 표적 세포주 상에서 5:1의 E:T 비율로 효과기 세포로서 일차 인간 T-세포를 이용한 FACS-기반의 세포독성 분석에서 결정하였다. 각각의 탠덤 디아바디를 적어도 2개의 독립적인 실험에서 각 종양 세포주 상에서 시험하였다. 평균값이 제시되어 있다.
실시예 5
48시간에 인간 CD33+ AML 세포주에서 추가적인 세포독성 스크리닝 실험
상기 기재된 바와 같이, 유의미한 세포독성이 24시간 정도로 초기에 검출되었으나, 더 높은 수준의 독성은 48시간에 검출될 수 있다. 이후 분석을 위해 48시간 시점을 선택하였다. 탠덤 디아바디-유도된 세포독성에 대한 T-세포 선택의 영향을 시험하였다. 이를 달성하기 위해, 건강한 지원자 공여자로부터의 자극되지 않은 PBMC를 수득하고, CD3+ 세포를 CD3 마이크로비드의 사용을 통한 간단한 "양성 농축(positive enrichment)" 뿐만 아니라 CD14, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123, 및 CD235a에 대한 항체의 마이크로비드 칵테일을 통한 더 복잡한 "음성 선택(negative selection)"에 의해 단리하였다. 도　4에 묘사된 바와 같이, 탠덤 디아바디-유도된 세포독성은 양성 선택된 T-세포보다 음성 선택된 건강한 공여자 T-세포에서 더 컸다. 그러나, 개별적인 탠덤 디아바디의 상대적인 세포독성 활성은 T-세포 선택 방법에 의해 영향을 받지 않았다. 그러므로, 이후 분석을 양성 농축된 건강한 공여자 T-세포로 수행하였다.
자극되지 않은 단핵 세포를 프레드 후친슨 암 연구 센터(FHCRC) 기관 심의 위원회(Institutional Review Board)에 의해 승인된 연구 프로토콜 하에 FHCRC 조혈 세포 프로세싱 코어(Core Center of Excellence)에 의한 백혈구분리반출법(leukapheresis)을 통해 건강한 성인 지원자로부터 수집하였다. T-세포를 CD3 마이크로비드("양성 농축") 또는 Pan T-세포 단리 키트("음성 선택"; 두 가지 모두 Miltenyi Biotec, Auburn, CA사 제품)를 통한 자기 세포 분류(magnetic cell sorting)를 통해 농축한 다음, 분취량으로 동결하고 액체 질소에 보관하였다. 해동된 세포 분취량을 제조사의 지침에 따라 3 μM CellVue Burgundy(eBioscience, San Diego, CA)로 표지하였다. 정제된 PBMC를 다양한 농도의 탠덤 디아바디 분자의 존재하에 배양하였다.
약물-유도된 세포독성의 정량을 위해 세포를 상이한 E:T 세포 비율로, 실시예 4에서와 같이, 37℃(5% CO2 및 공기에서)에서 배양하였다. 24-72시간 후, 비-생존 세포를 검출하는 DAPI를 이용하여 세포수 및 약물-유도된 세포독성을, LSRII 세포분석기(BD Biosciences)를 이용하여 결정하고 FlowJo로 분석하였다. AML 세포를 전방/측방 산란 특성 및 건강한 공여자 T-세포가 부가된 실험에서 CellVue Burgundy에 대한 음성에 의해 확인하였다(도 5). 약물-유도된 특이적 세포독성이 % 세포독성 = 100 x (1 - 살아있는 표적 세포처리됨/살아있는 표적 세포대조군)으로 제시되어 있다. 세포독성 분석 결과가 평균값 ± 평균의 표준편차(SEM)로 제시되어 있다. 스피어만 비모수적 상관관계(Spearman nonparametric correlation)를 사용하여 연속 샘플 특징 간의 상관관계를 계산하였다. 모든 P-값은 양측(two-sided)이다. 통계학적 분석을 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
건강한 공여자 T-세포의 부재시, CD33/CD 탠덤 디아바디 중 어느 것도 T-세포의 부재시 AML 세포주에 대해 어떤 주목할만한 세포독성 효과를 발휘하지 않았고, 이는 이들의 세포독성 효과를 위해 T-세포가 절대적으로 필요하다는 것을 확인시켜준다(데이터 나타나 있지 않음). T-세포의 존재시, 탠덤 디아바디-유도된 특이적 세포독성의 정도는 탠덤 디아바디의 농도 뿐만 아니라 E:T 세포 비율에 의존적이었다. CD33/CD3-지향된 탠덤 디아바디 분자 및 하나의 대조군 탠덤 디아바디(00) 간의 직접적인 비교는 HL-60 세포(도　6A/B 및 표 10) 및 KG-1a 세포(도　6C/D 및 표 10) 모두에서 항체-유도된 세포독성의 상당한 차이를 나타내었고, 결과는 반복 실험에서 재현가능성이 높았다. 전반적으로, 탠덤 디아바디-유도된 세포독성의 정도는 일차 인간 T-세포 상의 CD3에 대한 결합 친화성과 상관관계가 있었다(25 pM (대략 2.5 ng/mL) 및 E:T=5:1에서 KG-1a 세포에서의 세포독성의 경우: r=-0.542, p=0.009; 25 pM 및 E:T=5:1에서 HL-60 세포에서의 세포독성의 경우: r=-0.391, p=0.07). 탠덤 디아바디 12, 14, 16은 HL-60 및 KG-1a 세포 모두에 대해 세포독성이 매우 높았다.
표 10 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 CD25 및 CD69 유도 및 48시간에 세포독성
탠덤 디아바디 1 CD3 K D (nM)
인간 T-세포 		CD33 K D (nM)
HL -60 세포 		CD25 유도
EC 50 (pM) 2 		CD69 유도
EC 50 (pM) 2 		PBMC에서 T 세포 증식 EC 50 (pM) 3 세포독성
HL -60 세포
( % ± SEM ) 4 		세포독성
KG-1a 세포
( % ± SEM ) 4
15 1.3 0.4 6 7 7 82.9 ± 3.7 80.2 ± 1.9
12 1.5 0.3 6 3 2 84.7 ± 2.3 85.6 ± 1.6
10 1.9 0.5 10 6 6 48.0 ± 2.4 78.6 ± 2.3
14 2.1 0.3 10 7 6 86.0 ± 0.4 69.8 ± 5.7
21 2.1 9.7 ND 225 500 12.4 ± 1.0 0.0 ± 0.2
24 2.3 5.6 ND 57 264 24.5 ± 1.9 1.1 ± 0.2
09 2.4 0.5 11 7 9 43.2 ± 15.8 74.6 ± 3.2
11 2.6 0.3 11 5 6 52.7 ± 8.1 84.7 ± 1.4
17 3.3 5.0 30 114 30 4.2 ± 0.2 0.7 ± 0.4
22 4.1 0.7 10 4 7 74.2 ± 7.4 44.4 ± 5.3
16 5.1 0.3 1 2 3 86.0 ± 1.4 81.3 ± 1.5
19 6.3 2.8 9 5 6 79.4 ± 3.5 83.8 ± 2.9
07 49.7 13.7 134 65 50 6.3 ± 3.3 2.1 ± 0.7
13 55.7 0.2 30 22 23 70.4 ± 2.5 1.3 ± 0.4
05 69.5 1 116 74 74 23.8 ± 6.9 0.3 ± 0.3
02 69.8 0.2 42 27 4 80.9 ± 3.6 4.6 ± 2.1
04 79.3 0.5 94 62 44 24.1 ± 4.0 0.7 ± 0.8
03 81.9 1.1 117 87 63 13.1 ± 3.6 0.0 ± 0.5
06 86.3 0.4 39 21 48 45.7 ± 6.4 1.4 ± 0.2
01 94.2 0.6 92 91 89 8.0 ± 1.6 0.4 ± 0.4
23 97.2 0.4 41 17 37 73.7 ± 2.6 1.5 ± 0.3
20 143.8 4.1 98 75 38 31.2 ± 3.9 1.1 ± 0.3
1 탠덤 디아바디(TandAbs)는 CD3 친화성이 증가하는 순서로 열거되어 있음.
2 CD25 및 CD69 유도는 미분획된 PBMC 배양에서 24시간 후 측정됨.
3 CD33+ 세포가 존재하는 미분획된 PBMC에서 CD33/CD3 탠덤 디아바디에 의해 유도된 T 세포 증식.
4 중복 웰에서 수행된 3개의 독립적 실험으로부터 5:1의 E:T 세포 비율로 건강한 공여자 T-세포의 존재하에 25 pM의 탠덤 디아바디 농도에서 DAPI+ 세포의 48시간 후 세포독성(%).
ND: 검출가능한 CD25 활성화가 없음
실시예 6
일차 인간 AML 표본에서 탠덤 디아바디의 추가 규명
이들 후보의 세포독성 특성의 포괄적인 규명을 위해, AML 환자의 표본을 FHCRC 표본 저장소(repository)로부터 상기 연구를 위해 얻었다.
AML 성인 환자의 치료전("진단") 말초 혈액 또는 골수 표본으로부터의 피콜-단리된 단핵 세포의 동결된 분취량을 FHCRC에서의 저장소로부터 얻었다. AML을 정의하는 2008 WHO 기준(Vardiman et al.; Blood. 2009; 114(5):937-951) 및 세포유전학 위험을 지정하는 엄정한 영국 의료 연구 위원회(MRC) 기준(Grimwalde et al.; Blood. 2010;116(3):354-365)을 사용하였다. 환자들은 FHCRC 기관 심의 위원회(Institutional Review Board)에서 승인한 프로토콜 하에 연구 목적을 위해 자신의 생체 표본을 수집하고 사용하는데 대해 서면 동의를 제공하였다. 임상 데이터는 건강 보험 이전 및 책임법(Health Insurance Portability and Accountability Act) 규정에 따라 익명화(de-identify)하였다. 해동 후, 세포를 CD33(클론 P67.6; PE-Cy7-접합됨), CD3(클론 SK7; PerCP-접합됨), CD34(클론 8G12; APC-접합됨; 모두 BD Biosciences, San Jose, CA 제품), 및 CD45(클론 HI30; APC-eFluor®780-접합됨; eBioscience)를 인식하는 직접 표지된 항체로 염색하였다. 비생존 세포를 확인하기 위해, 샘플을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색하였다. 적어도 10,000건을 Canto II 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 수득하였고, DAPI-세포를 FlowJo(Tree Star, Ashland, OR)를 이용하여 분석하였다.
해동 후, 표본은 CD45/측방-산란 특성에 기초한 유세포 분석법에 의해 결정된 바와 같이, >58% AML 아세포를 가지고 있었다. 표본은 해동 후 바로 >50% 생존 세포를 가지고 있었고 사이토카인-함유 액체 배양에서 48시간 후 >50% 생존 세포를 가지고 있었다(도　7). 환자의 중위 연령은 58.1세(범위: 23.9-76.2)였고; 세포유전학 질병 위험은 2명이 호의적, 18명이 중간, 7명이 부정적이었다. NPM1, FLT3, 및 CEBPA의 돌연변이 상태에 대한 정보는 불완전하였으나, 하나의 샘플은 CEBPA double -mutant인 것으로 공지되었고, 또 다른 샘플은 NPM1 pos/FLT3 - ITD neg인 것으로 공지되었다. 연구된 표본에서 골수성 아세포 및 CD3+ T-세포의 중위 백분율은 각각 86.1%(범위: 58.4-97.0%) 및 2.0%(범위: 0-11.9%)이었고, 배양 48시간 후 중위 샘플 생존력은 80.1%(범위: 53.6-93.6%)였다. 환자 중 15명은 새롭게 진단된 AML을 가진 반면, 12명은 표본 수집 시점에 재발된 질환(n=7) 또는 난치 질환(n=5)을 가지고 있었다. 표 11에 요약된 바와 같이, 골수성 아세포 상의 CD33 발현, 자가 T-세포의 양, 골수성 아세포의 비율, 및 배양 생존력에 대해, 새롭게 진단된 AML을 갖는 환자 표본의 기본적인 특징은 재발된/난치 질환과 유사하였다.
AML 표본 배양에 탠덤 디아바디 분자를 부가하는 것은 보통 정도의 용량-의존적 세포독성(도　8A)을 야기하였고, 이는 활성 AML을 갖는 환자 표본 내에 함유된 자가 T-세포가 백혈병 세포를 용해하는데 관여할 수 있음을 입증한다. 건강한 공여자 T-세포의 존재시, 개별적인 탠덤 디아바디의 세포독성 활성은 약물 용량 및 E:T 세포 비율(도　8B/C)에 분명히 의존적이었다. 그러나, 탠덤 디아바디의 높은 활성은 AML 아세포 상에 매우 낮은 CD33 발현을 갖는 일부 표본에서도 관찰되었다. 탠덤 디아바디 분자 중에서, 12는 가장 활성인 것으로 보였는데, 그것이 낮은 농도(2.5 pM(대략 250 ng/mL)에서 가장 높은 세포 독성을 가지고 있었고, 덜 두드러진 정도로, 또한 E:T=1:3 및 E:T=1:1 모두에서 10 pM(대략 1 ng/mL))에서 세포독성을 가지고 있었기 때문이다.
CD33/CD3 탠덤 디아바디는 환자 성별, 연령, 질환 단계(새롭게 진단된, 재발된, 난치), CD33 발현의 정도 및 세포유전학 위험의 측면에서 다양한 대표적인 AML 환자 혈액 샘플에서 스크리닝되어 왔다(표 11). 두드러지게도, 많은 조사된 탠덤 디아바디(예컨대, 02, 08, 09, 11, 12, 14, 16, 19, 22 및 23)는 도 15에 나타난 바와 같은 질병 범위에 걸쳐 거의 모든 환자 샘플에서 매우 활성이었다. 더욱이, 활성의 정도 및 범위는 새롭게-진단된, 재발된 및 난치 환자를 포함하는 AML의 모든 단계에서 유사하다.
표 11: 일차 AML 표본의 특징
모든 환자
(n=27) 		새롭게 진단된
AML(n=15) 		재발된/난치
AML(n=12)
중위 연령(범위), 세 58.1(23.9-76.2) 64.0(40.2-76.2) 44.4(23.9-67.4)
세포유전학/분자적 위험
호의적
중간
CEBPA double -mutant
NPM1 pos / FLT3 - ITD neg
NPM1 pos / FLT3 - ITD pos 또는 NPM1 neg / FLT3 - ITD pos
부정적
2
18
1
1
10
7
2
10
1
--
5
3
--
8
--
1
5
4
표본 공급원
골수
말초 혈액
11
16
4
11
7
5
중위 % 아세포(범위) 86.1(58.4-97.0) 86.1(66.7-95.5) 86.7(58.4-97.0)
아세포 상에서 중위 CD33 발현(범위) 849(5-5,356) 849(5-5,356) 788(7-2,242)
중위 % T-세포(범위) 2.0(0-11.9) 1.6(0-11.9) 2.1(0.7-8.7)
48시간에 중위 % 생존력(범위) 80.1(53.6-93.6) 76.0(53.6-93.6) 83.5(63.9-93.1)
실시예 7
상이한 수준의 CD33을 발현하는 다양한 기원의 상이한 CD33 + 세포주에 대한 CD33/CD3 탠덤 디아바디 12 및 탠덤 디아바디 16의 효력(potency) 및 효능(efficacy)
CD33/CD3 탠덤 디아바디의 효력 및 효능이 표적 세포 상의 CD33 밀도에 좌우되는지 평가하기 위해, 다양한 인간 CD33+ 종양 세포주 및 재조합 인간 CD33를 발현하는 CHO 세포를 대상으로 QIFIKIT 정량 키트 및 항-CD33 mAb WM53을 이용하여 이들의 CD33 발현에 대해 시험하였다. 표 12의 결과는 종양 세포주 상의 CD33 밀도가 ~1300 SABC(standardized antibody binding capacity) 및 ~46000 SABC 사이의 범위였음을 보여준다. CHO-CD33 세포 상의 발현은 ~197000 SABC였고, 종양 세포주보다 실질적으로 더 높았다. 시험된 모든 CD33+ 세포주를 CD33/CD3 탠덤 디아바디 12 및 탠덤 디아바디 16의 연속 희석물의 존재하에 5:1의 효과기 대 표적 비율로 효과기 세포로서 인간 T-세포를 이용한 적어도 3개의 독립적인 FACS-기반의 세포독성에서 표적 세포로서 사용하였다. 각 분석에서, EC50 및 탠덤 디아바디-매개된 용해 값을 비선형 회귀에 의해 계산하였다. 상기 결과는 12 및 16의 효력(EC50 값) 또는 효능(% 용해) 중 어느 것도 표적 세포의 표면 상의 CD33 밀도와 상관관계가 없다는 것을 입증한다.
주목할만하게도, 적어도 12 및 16은 1500 SABC 미만의 매우 낮은 CD33 밀도를 갖는 SEM과 같은 세포에 대해서도 세포독성 활성을 나타낸다.
표 12 CD33/CD3 탠덤 디아바디 12 및 탠덤 디아바디 16의 CD33 표적 세포 표면 발현 및 세포독성 효력
세포주
 CD33 밀도 [SABC]
 12 16
EC50 [pM] EC50 [pM]
평균 SD 평균 SD 평균 SD
CHO-CD33 196990 28053 11.8 11.2 24.0 19.5
HL-60 45948 4478 1.4 0.5 1.6 0.4
KG-1 42828 6923 1.0 0.6 1.9 2.0
KASUMI-1 25922 6484 1.3 0.6 2.4 1.4
THP-1 22065 415 1.9 0.2 6.0 1.2
RPMI-8226 19931 2604 14.0 17.8 2.8 2.0
U-937 17669 4593 0.9 0.1 1.3 0.6
K562 13789 2156 4.5 1.3 4.8 2.7
BV-173 8518 1231 1.4 0.6 3.2 1.6
SEM 1306 144.2 2.2 0.5 5.1 3.0
CD33+ 세포주 상에서 표준화된 항체 결합능(SABC)을 QIFIKIT 및 항-CD33 mAb WM53을 이용하여 결정하였다. 표적 세포 용해를 다시 유도한 탠덤 디아바디 12 및 탠덤 디아바디 16의 EC50 값을 5:1의 E:T 비율로 효과기 세포로서 인간 일차 T-세포 및 20-24시간 배양을 이용한 FACS-기반의 세포독성 분석에서 결정하였고; CD33-발현 CHO 세포를 이용한 분석을 40-48시간 동안 배양하였다. 적어도 3개의 독립적인 분석의 평균 및 SD가 나타나 있다.
실시예 8
T-세포의 TandAb -활성화 및 AML 세포의 시험관내 사멸
TandAb를 정제된 인간 T 세포 및 VPD-450-표지된 인간 CD33+ 백혈병 세포주, KG-1, 또는 CD33- 인간 ALL 세포주, G2(E:T 5:1)와 함께 배양하였다. 유세포 분석법을 사용하여 TandAb에 의한 표적 세포 용해를 평가하였다(10-15 내지 10-8M; 24시간, 37℃).
TandAb 12, 16, 및 19와 인간 T 세포와의 배양은 KG-1 세포를 효율적으로 용해시켰다(각각 IC50 ~0.01, 0.5, 및 5 pM). 최대 40%의 T 세포가 활성화되어(CD25+) 세포독성 활성이 상승하였다. 무관한 표적 00(>10-7 M)을 갖는 대조군 TandAb는 시험관내에서 KG-1의 유의미한 사멸을 야기하지 않았다. 별도로, 16은 KG-1 세포의 용해를 유도한 반면(IC50 = 5 x 10-12M), 1 x 10-8M은 CD33-G2 세포에 대해 효과가 없었다. 상기 결과는 T 세포가 CD33/CD3 TandAb에 의해 CD33+ 백혈병 세포(KG-1) 및 일차 CD33+ AML 아세포에 표적화될 때 활성화되고 강력하게 종양 세포를 용해시킨다는 것을 보여준다.
실시예 9
에피토프 맵핑
CD33-결합 에피토프를 확인하기 위해 상이한 CD33 결합 모이어티를 함유하는 탠덤 디아바디를 CLIPS 기술(Pepscan)을 이용하여 에피토프 맵핑하였다.
CLIPS 기술은 펩타이드의 단일 루프, 이중-루프, 삼중 루프, 시트-유사 폴드, 나선-유사 폴드, 및 이의 조합으로의 구조화를 용이하게 하여, 표적 분자의 비연속적 에피토프를 맵핑할 가능성을 제공한다.
7000개가 넘는 독립적인 펩타이드의 어레이를 합성하고, 펩타이드에 대한 각 항체의 결합을 ELISA에서 시험하였다.
탠덤 디아바디 12, 14, 16 및 22는 인간 CD33의 첫 번째 Ig 유사 도메인 내의 구간 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)에 결합한다. 각각의 아미노산 구간이 도　9A에 밑줄로 굵은체로 나타나 있다. 탠덤 디아바디 01, 02, 04, 06, 08, 09, 13 및 23은 탠덤 디아바디 12, 14 16 및 12와 동일한 CD33 결합 도메인(서열번호 2 및 12, 3 및 13, 5 및 15, 9 및 19)을 공유하므로, 이들 탠덤 디아바디 역시 이 에티토프에 결합한다는 것이 고려된다.
실시예 10
예방적 생체내 종양 모델에서 용량-반응
인간 T-세포를 이용하여 재구성된 NOD/scid 마우스에서의 예방적 HL-60 종양 이종이식 모델에서 탠덤 디아바디 12 및 16을 상이한 용량 수준에서 비교한다. 용량-반응을 달성하기 위해, 10, 1 및 0.1μg(0.5, 0.05, 및 0.005 mg/kg)의 3개의 용량 수준을 선택하였다.
면역결핍 NOD/scid 마우스의 8개의 실험군을 4x106 HL-60 세포의 현탁액을 이용한 피하 주사에 의해 이종이식하였다. 주사 전, 세포를 음성 선택을 이용하여 연층(buffy coat)(건강한 공여자)으로부터 단리된 3x106 T-세포와 혼합하였다.
T 세포의 잠재적 공여자 가변성을 설명하기 위해, 각각의 실험군을 단지 하나의 개별 공여자의 T 세포를 받는 3개의 코호트(cohort)로 세분하였다. 종양 세포 및 T-세포로 이식된 실험군의 모든 동물에게 표시된 바와 같은 3개의 상이한 용량 수준으로(0.1 μg, 1 μg, 및 10 μg) 비히클(대조군) 또는 16 또는 12를 0, 1, 2, 3 및 4일(qdxd5)에 정맥내 볼루스로 투여하였다. 효과기 세포 및 비히클 처리가 없는 하나의 군을 부가적인 대조군으로서 사용하였다. 표 13은 그룹 할당 및 투여 스케줄을 요약한다.
그룹 처리 용량 세포 농도 / 동물 코호트 스케줄
(iv) 		n
1 비히클 --- 4x106 HL-60 4
2 비히클 --- 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
3 16 10 μg 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
4 16 1 μg 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
5 16 0.1 μg 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
6 12 10 μg 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
7 12 1 μg 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
8 12 0.1 μg 4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포
4x106 HL-60 + 3x106 T-세포		 코호트 1
코호트 2
코호트 3		 0, 1, 2, 3, 4일 3
3
3
HL-60 이종이식 모델에서 생체내 용량-반응 연구를 위한 처리군. 대조군 내의 모든 동물들은 신뢰성 있게 종양을 발달시켰고 균일한 종양 성장을 나타내었다. T-세포의 존재는 종양 발달에 영향을 미치지 않았다. 비히클-처리된 대조군에서 T-세포의 존재시 또는 부재시에 HL-60 성장 차이가 관찰되지 않았다.
두 시험 품목의 처리는 분명한 용량-의존적 항-종양 효과를 밝혀내었다(도 10). 2가지 탠덤 디아바디 사이에서 실질적인 차이가 발견되지 않았다. 도　10의 평균 종양 부피의 플롯팅은 처리군의 대부분이 완료되었을 때 29일로 제한되었다. 상기 연구를 45일까지 계속하였고, 동물의 종양없는 생존을 관찰하였다. 10 또는 1 μg의 16으로 처리된 군에서, 9마리 중 6마리가 관찰 기간 말기에 종양이 없었고, 10 μg의 12를 받은 9마리 중 5마리는 45일에 종양이 없었다. 1마리의 동물은 1 μg의 12로 처리될 때 종양이 없는 상태로 남아있었다.
대조군 내의 모든 동물들은 신뢰성 있게 종양을 발달시켰고 균일한 종양 성장을 나타내었다. 탠덤 디아바디 중 하나의 처리는 용량-의존적 항-종양 효과를 나타내었고, 29일까지 2개의 탠덤 디아바디 사이에 실질적인 차이가 발견되지 않았다.
연장된 관찰(45일) 후에만 검출가능한 차이가 관찰되었으며, 이때 저용량군과 대조군은 이미 큰 종양 성장으로 인해 종료되었다. 16으로 처리된 그룹은 더 종양이 없는 동물을 가지고 있었다.
실시예 11
확립된 종양 모델
16을 이용하는 미리-확립된 HL-60 종양을 갖는 NOD/scid 마우스에서의 이종이식 모델을 개발하여 개념 증명(proof of concept)을 입증하였다.
요약하면, 암컷 면역-결핍 NOD/scid 마우스에게 아치사량으로 조사하고(2 Gy) 4x106 HL-60 세포를 피하 접종하였다. 9일에, 쥣과 자연 살해(NK) 세포를 결실시키기 위해 상기 동물에게 항-asialo GM1 토끼 항체(Wako, Neuss, Germany)의 단일 볼루스 주사를 투여하였다. 10일에, 종양이 50-150 mm3(평균 73 ± 11 mm3) 사이의 부피에 도달할 때, 동물을 3개의 처리군으로 할당하였다. 그룹 2 및 3(각각 8마리 동물)에게 1.5x107 활성화된 인간 T-세포를 복강내로 주사하였다. 주사 전, T-세포를 음성 선택을 이용하여 연층(buffy coat)(건강한 공여자)으로부터 단리하였다. T-세포를 제조사의 사양에 따라(Miltenyi Biotech) T-세포 활성화 / 확장 키트를 이용하여 확장 및 활성화하였다. 잠재적인 공여자 가변성을 다루기 위해, 그룹 2 및 3을 개별적인 공여자로부터의 확장 및 활성화된 T-세포를 받는 2개의 코호트로 세분하였다. 각각의 코호트에게 단지 하나의 개별적인 T-세포 공여자로부터의 T-세포를 투여하였다.
표 14 확립된 HL -60 이종이식 모델에 대한 처리군.
그룹 동물(n) 접종된 세포 코호트 처리
0일, sc. 10일, ip. 13일 내지 21일, 매일 1회
1 5 4x106 HL-60 비히클(iv)
2 4
4		 4x106 HL-60
4x106 HL-60		 1.5x107 T-세포(공여자 1)
1.5x107 T-세포(공여자 2)		 1
2		 비히클(iv)
3 4
4		 4x106 HL-60
4x106 HL-60		 1.5x107 T-세포(공여자 1)
1.5x107 T-세포(공여자 2)		 1
2		 TandAb 16(iv)　50 μg
13일에 시작하여, 그룹 3의 동물들은 105 mm3 의 평균 종양 부피를 나타내었고, 50 μg 탠덤 디아바디 16의 총 9개의 정맥내 용량으로 처리하였다(qdx9d). 표 14는 그룹 할당 및 투여 스케줄을 예시한다. 그룹 1 및 2는 비히클로만 처리하였다. 체중 및 종양 부피를 27일까지 결정하였다.
모든 동물은 신뢰성 있게 종양을 발달시켰고, 이는 6일에 감지할 수 있었다. 비히클-처리군 1 및 2(HL-60) 동물의 평균 종양 부피는 27일의 연구 종료시까지 지속적으로 증가하였다(도　11). HL-60 종양 세포 외에도 일차 활성화된 인간 T-세포를 받은 그룹 2 동물에서, 평균 종양 부피는 그룹 1(HL-60 단독)과 비교하여 더 빠르게 증가하였다.
인간 T-세포의 존재하에 탠덤 디아바디 16(50 μg/동물; 2.5 mg/kg)을 이용한 13일 내지 21일(qdxd9)의 반복된 정맥내 처리(그룹 3)는 그룹 1 및 그룹 2 대비 종양 성장을 빠르게 지연시켰다. 탠덤 디아바디 16은 비히클-처리된 대조군(그룹 2)과 비교하여 약 4-5일까지 그룹 3에서 종양 성장을 지연시켰다. 6일 내지 27일의 기간에 통계학적으로 유의미한 차이가 22일(p<0.05), 23일(p<0.01) 및 27일(p<0.01)에 그룹 2(HL-60, T-세포, 비히클) 및 그룹 3(HL-60, T-세포, 16) 사이에서 확인되었다(본페로니(Bonferroni) 사후검정을 통한 2원 반복 측정 ANOVA). 그룹 1에서 종양의 비정상적인 느린 성장으로 인해 그룹 1 및 그룹 3 간에 통계학적으로 유의미한 차이가 존재하지 않았다.
상이한 공여자로부터의 T-세포를 받은 한 그룹 내의 코호트 1 및 코호트 2에서 종양 발달을 비교할 때, T-세포 활성에 대한 공여자 가변성이 관찰되지 않았다(표 14 참고).
실시예 10은 미리 확립된 HL-60 종양(AML) 및 복강내로 이식된 인간 T-세포를 갖는 NOD/scid 마우스에서의 이종이식 모델이 성공적으로 개발되었음을 보여준다. 단일 용량 수준의 탠덤 디아바디 16의 반복 투여는 각각의 비히클-처리된 대조군과 비교하여 통계학적으로 유의한 종양 성장 지연을 야기한다. 상기 생성된 데이터는 CD33/CD3 BiTE™을 이용한 유사한 연구에 대해 공개된 결과와 대등하다(Aigner et al., 2012; Leukemia, 2013, Apr;27(5):1107-15).
실시예 12
NSG 마우스에서의 AML PDX 모델에서 CD33/CD3 탠덤 디아바디의 효능
2-4% CD3+ T-세포를 함유한 CD33+ 백혈병을 갖는 AML 환자의 동결보존된 세포를 사용하여 NSG 마우스에서 AML PDX 모델을 확립하였다. 조사된(250 cGy) NSG 마우스에 종양 세포를 1시간 주사 후, C2개의 정맥내 용량 중 하나(50 μg 또는 5 μg; n= 8 마우스/그룹)로 CD33/CD3 탠덤 디아바디, 16 또는 12를 200 μL 볼루스로 주사하였다. 이후 4일 각각에 탠덤 디아바디를 추가로 주사하였다. 마우스를 매주 1회 체중을 잰 후, 38일에 희생시켜 유세포분석법(huCD33, huCD34, huCD45, muCD45, huCD14, huCD3, huCD4, huCD8, 및 7AAD)에 의한 분석을 위해 말초 혈액, 골수, 및 비장을 수집하였다. 상기 결과가 도　12에 나타나 있다.
도　12는 처리되지 않은 마우스가 38일 후 골수 및 비장에서 상당한 양의 인간 아세포를 가지고 있었음을 보여준다. 대조적으로, 탠덤 디아바디 12 또는 16를 매일 정맥내 주사로 처리한 마우스는 골수 및 비장에서 실질적으로 더 낮은 수의 인간 AML 아세포를 나타내었다. CD33/CD3 탠덤 디아바디의 강한 항-AML 효과가 두 용량 수준(5 및 50 μg/주사)에서 관찰되었다.
CD33/CD3 탠덤 디아바디, 12 및 16 모두에 대해 관찰된 항-AML 효과는, 동일한 마우스 모델에서 AML을 표적화하는 CD123/CD3 DART® 항체의 효과보다 훨씬 강하였다(Hussaini et al.:"Targeting CD123 In Leukemic Stem Cells Using Dual Affinity Re-Targeting Molecules(DARTs®) November　15, 2013; Blood: 122(21)). 골수 및 비장에서 거의 모든 AML 아세포를 제거한 CD33/CD3 탠덤 디아바디와 대조적으로, Hussaini 등은 CD123/CD3 DART®가 2.5 및 0.25 mg/kg에서 오직 PDX 모델에서 골수 및 비장 내의 AML 아세포의 수를 50-1000배 감소시켰음을 보고하였고, 저자는 CD123/CD3 DART™ 이 0.5 mg/kg에서 오직 PDX 모델에서 골수 및 비장 내의 AML 아세포의 수를 40-78% 감소시켰음을 추가로 보고하였다.
실시예 13
CD33/CD3 탠덤 디아바디 16- 매개된 표적 세포 용해의 빠른 개시(onset)
CD33/CD3 탠덤 디아바디-매개된 표적 세포 용해의 동력학을 평가하기 위해, 상이한 배양 시간으로 칼세인-방출 세포독성 분석을 수행하였다. 칼세인-표지된 CD33+ HL-60 표적 세포를 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 또는 5시간 동안 25:1의 E:T 비율로 효과기 세포로서 일차 인간 T 세포의 존재하에 탠덤 디아바디 16의 연속 희석물과 함께 배양하였다. 각 시점에, 용해된 표적 세포로부터 방출된 칼세인을 사용하여 비-선형 회귀/S자형 용량-반응을 이용한 EC50 값 및 탠덤 디아바디 16-매개된 표적 세포 용해를 계산하였다. 도 13은 포화 탠덤 디아바디 농도에서 30분 배양 후 40%를 넘는 용해를 갖는 탠덤 디아바디-매개된 표적 세포 용해의 예상치 못한 빠른 개시를 나타낸다. 4시간 배양 후, 90%가 넘는 표적 세포 용해에 도달하였다. 표 15 및 도 14는 30분 내지 5시간의 배양 시간에서 탠덤 디아바디 16에 대해 결정된 EC50 및 특이적 용해 값을 요약한다. 상기 결과는 사용된 분석 조건하에서 2시간 배양 후 최대 효력(가장 낮은 EC50 값)에 도달하였다는 것과 5시간 배양 후 거의 모든 표적 세포가 용해되었음을 추가로 입증한다. 종합해 볼 때, 이들 결과는 CD33/CD3 탠덤 디아바디에 의해 매개된 매우 빠르고, 강력하고 효과적인 표적 세포 용해를 입증한다.
표 15: 탠덤 디아바디 16에 대해 결정된 EC 50 및 용해 값의 동력학
배양 시간 [분] EC50 [pM] 탠덤 디아바디-매개된 용해 [%]
30 4.8 44.1
60 2.5 59.8
120 1.6 75.1
180 1.6 88.8
240 1.5 93.7
300 1.6 97.4
실시예 14
AML 환자에게 CD33/CD3 탠덤 디아바디를 투여하기 위한 개념 증명(proof-of-concept) 임상 시험 프로토콜
급성 골수성 백혈병(AML)을 위한 치료로서 CD33/CD3 탠덤 디아바디 16을 연구하기 위한 1상/II상 임상 시험.
연구 결과:
일차: CD33/CD3 탠덤 디아바디 16의 최대 용인 용량(maximum tolerated dose)
이차: CD33/CD3 탠덤 디아바디 16의 시험관내 반응이 임상 결과와 연관되는지 결정하는 것
I상
최대 용인 용량(MTD)은 상기 시험의 I상 기간에 결정될 것이다.
1.1 최대 용인 용량(MTD)은 상기 시험의 I상 기간에 결정될 것이다.
1.2 적격성(eligibility) 기준을 만족하는 환자는 CD33/CD3 탠덤 디아바디 16에 대한 시험을 시작할 것이다.
1.3 목표는 참가자에게서 심각하거나 다루기 힘든 부작용 없이 안전하게 투여될 수 있는 CD33/CD3 탠덤 디아바디 16의 최대 용량을 확인하는 것이다. 주어진 용량은 이전 연구에 등록된 참가자의 수 및 상기 용량이 얼마나 잘 용인되었는지에 좌우될 것이다. 모든 참가자가 동일한 용량을 받지는 않을 것이다.
II상
2.1 CD33/CD3 탠덤 디아바디 16의 요법이 적어도 20%의 반응률을 야기하는지를 결정하기 위한 목적으로 후속 II상 기간은 MTD로 처리될 것이다.
II상에 대한 일차 결과 --- TCD33/CD3 탠덤 디아바디 16의 요법이 임상 반응(폭발 반응, 작은 반응, 부분적 반응, 또는 완전한 반응)을 달성하는 적어도 20% 환자를 야기하는지 결정하는 것
적격성:
급성 전골수성 백혈병(APL) 환자를 제외한, WHO 기준을 만족하는 말초 혈액 및 골수 분석에 의한 문서화된 AML
일차 유도 화학요법에 난치성인 AML, 재발된 질환을 갖거나, 또는 60세 이상이며 치료 의사에 따라 연령, 수행도, 및 또는 불리한 위험 요인으로 인해 표준 세포독성 요법에 적합하지 않은 환자
연령 ≥ 18세
카노프스키(Karnofsky) 수행도 ≥ 50% 또는 ECOG 수행도 0-2
기대 수명 ≥ 6주
특정 구현예가 본원에 나타나고 기술되었지만, 그러한 구현예는 단지 예로서 제공된다는 것이 본 기술분야의 숙련가에게 자명할 것이다. 많은 변형, 변화, 및 치환이 본 발명을 벗어나지 않으면서 본 기술분야의 숙련가에게 일어날 것이다. 본원에 기재된 구현예에 대한 다양한 대안이 본 구현예를 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하며, 이들 청구범위 및 이들의 등가물의 범위에 속하는 방법 및 구조들이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ELLWANGER, KRISTINA EVNIN, LUKE FOX, JUDITH A. FUCEK, IVICA GUENOT, JEANMARIE KNACKMUSS, STEFAN KUNKEL, LORI LITTLE, MELVYN MOLKENTHIN, VERA RAJKOVIC, ERICH REUSCH, UWE WALL, CLAUDIA WEICHEL, MICHAEL ZHUKOVSKY, EUGENE <120> BISPECIFIC CD33 AND CD3 BINDING PROTEINS <130> 45375-704.601 <140> 14/642,497 <141> 2015-03-09 <150> 62/111,470 <151> 2015-02-03 <150> 62/019,795 <151> 2014-07-01 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Met Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Thr Thr Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Asn Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 2 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Ser Val Leu 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Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ile Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 6 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 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Val Leu 100 105 110 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Lys Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Asp 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Leu Glu Ser Ala Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ala Asn Thr Asp Phe Ser Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Ala Val Thr Asp Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 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Ser Thr Gly Ala 385 390 395 400 Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys 405 410 415 Ala Pro Lys Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val 420 425 430 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr 435 440 445 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu 450 455 460 Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 465 470 475 480 Lys Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His 485 490 <210> 116 <211> 495 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 116 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 20 25 30 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 117 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 20 25 30 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 85 90 95 Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 115 120 125 Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 130 135 140 Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 145 150 155 160 Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr 165 170 175 Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr 180 185 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Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly 305 310 315 320 Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp 325 330 335 Ser Leu Lys Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 340 345 350 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 370 375 380 Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 385 390 395 400 Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr 405 410 415 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg 420 425 430 Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr 435 440 445 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn 450 455 460 Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His 485 490 <210> 119 <211> 494 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 119 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 20 25 30 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 85 90 95 Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 115 120 125 Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Phe Ser Ser Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 145 150 155 160 Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr 165 170 175 Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr 180 185 190 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala 210 215 220 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro 245 250 255 Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly 260 265 270 Ser Asn Thr Val Lys Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys 275 280 285 Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg 290 295 300 Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly 305 310 315 320 Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp 325 330 335 Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 340 345 350 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 370 375 380 Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 385 390 395 400 Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr 405 410 415 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg 420 425 430 Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr 435 440 445 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn 450 455 460 Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser Ala Ala Ala Gly Ser His His His His His His 485 490 <210> 120 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 120 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 20 25 30 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 85 90 95 Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr 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Ser Leu Ala Ile Ser Gly 305 310 315 320 Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp 325 330 335 Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 340 345 350 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 370 375 380 Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 385 390 395 400 Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr 405 410 415 Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg 420 425 430 Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr 435 440 445 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn 450 455 460 Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 465 470 475 480 Val Ser Ser <210> 121 <211> 494 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 121 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 20 25 30 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Ala Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 85 90 95 Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys 115 120 125 Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Phe Asp Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 145 150 155 160 Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ser Ala His Tyr 165 170 175 Ser Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr 180 185 190 Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 195 200 205 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Trp Ala 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Claims (30)

  1. 인간 CD33 및 인간 CD3에 특이적인 이중특이적 항원-결합 탠덤 디아바디(tandem diabody)로서, 상기 탠덤 디아바디는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 폴리펩타이드는 차례로 연결된 적어도 4개의 가변 쇄 도메인을 가지며, 각각의 폴리펩타이드는
    (i) 인간 CD33에 특이적인 가변 중쇄(VH) 도메인;
    (ii) 인간 CD33에 특이적인 가변 경쇄(VL) 도메인;
    (iii) 인간 CD3에 특이적인 VH 도메인, 및
    (iv) 인간 CD3에 특이적인 VL 도메인
    을 포함하고,
    각각의 폴리펩타이드에서, 상기 4개의 가변 쇄 도메인은:
    VL(CD3)-L1-VH(CD33)-L2-VL(CD33)-L3-VH(CD3);
    VH(CD3)-L1-VL(CD33)-L2-VH(CD33)-L3-VL(CD3);
    VL(CD33)-L1-VH(CD3)-L2-VL(CD3)-L3-VH(CD33); 또는
    VH(CD33)-L1-VL(CD3)-L2-VH(CD3)-L3-VL(CD33)
    의 순서로 펩타이드 링커 L1, L2 및 L3에 의해 차례로 연결되는, 이중특이적 항원-결합 탠덤 디아바디.
  2. 제1항에 있어서, 인간 CD33에 특이적인 VL 도메인이 서열번호 21-27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 28-34로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 35-41로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  3. 제1항에 있어서, 인간 CD33에 특이적인 VH 도메인이 서열번호 42-48로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1, 서열번호 49-55로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2 및 서열번호 56-63으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3을 포함하는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  4. 제2항에 있어서, 인간 CD33에 특이적인 VL 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3이
    (i) 서열번호 21, 28 및 35;
    (ii) 서열번호 22, 29 및 36;
    (iii) 서열번호 23, 30 및 37;
    (iv) 서열번호 24, 31 및 38;
    (v) 서열번호 25, 32 및 39;
    (vi) 서열번호 26, 33 및 40; 및
    (vii) 서열번호 27, 34 및 41
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  5. 제3항에 있어서, CD33에 특이적인 VH 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3이
    (i) 서열번호 42, 49 및 56;
    (ii) 서열번호 43, 50 및 57;
    (iii) 서열번호 43, 50 및 58;
    (iv) 서열번호 43, 50 및 59;
    (v) 서열번호 43, 50 및 60;
    (vi) 서열번호 44, 51 및 61;
    (vii) 서열번호 45, 52 및 62;
    (viii) 서열번호 46, 53 및 63;
    (ix) 서열번호 47, 54 및 63; 및
    (x) 서열번호 48, 55 및 63
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  6. 제1항에 있어서, CD33에 특이적인 VL 및 VH 도메인이
    (i) 서열번호 1 및 서열번호 11;
    (ii) 서열번호 2 및 서열번호 12;
    (iii) 서열번호 3 및 서열번호 13;
    (iv) 서열번호 4 및 서열번호 14;
    (v) 서열번호 5 및 서열번호 15;
    (vi) 서열번호 6 및 서열번호 16;
    (vii) 서열번호 7 및 서열번호 17;
    (viii) 서열번호 8 및 서열번호 18;
    (ix) 서열번호 9 및 서열번호 19; 및
    (x) 서열번호 10 및 서열번호 20
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  7. 제1항에 있어서, 인간 CD3에 특이적인 VH 도메인이 STYAMN(서열번호 72)의 CDR1 서열, RIRSKYNNYATYYADSVKD(서열번호 73)의 CDR2 서열 및 HGNFGNSYVSWFAY(서열번호 74) 또는 HGNFGNSYVSYFAY(서열번호 75)의 CDR3 서열을 포함하는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  8. 제1항에 있어서, 인간 CD3에 특이적인 VL 도메인이 RSSTGAVTTSNYAN(서열번호 90)의 CDR1 서열, GTNKRAP(서열번호 91)의 CDR2 서열, 및 ALWYSNL(서열번호 92)의 CDR3 서열을 포함하는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  9. 제1항에 있어서, CD3에 특이적인 VL 및 VH 도메인이
    (i) 서열번호 64 및 서열번호 68;
    (ii) 서열번호 65 및 서열번호 69;
    (iii) 서열번호 66 및 서열번호 70; 및
    (iv) 서열번호 67 및 서열번호 71
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  10. 제1항에 있어서, 각각의 폴리펩타이드가
    (i) 서열번호 2, 12, 65 및 69;
    (ii) 서열번호 3, 13, 65 및 69;
    (iii) 서열번호 4, 14, 65 및 69;
    (iv) 서열번호 5, 15, 65 및 69;
    (v) 서열번호 1, 11, 64 및 68;
    (vi) 서열번호 2, 12, 64 및 68;
    (vii) 서열번호 2, 12, 66 및 70;
    (viii) 서열번호 4, 14, 66 및 70;
    (ix) 서열번호 5, 15, 66 및 70;
    (x) 서열번호 3, 13, 64 및 68;
    (xi) 서열번호 3, 13, 67 및 71;
    (xii) 서열번호 4, 14, 64 및 68;
    (xiii) 서열번호 5, 15, 64 및 68;
    (xiv) 서열번호 7, 17, 64 및 68;
    (xv) 서열번호 6, 16, 64 및 68;
    (xvi) 서열번호 6, 16, 67 및 71;
    (xvii) 서열번호 8, 18, 64 및 68;
    (xviii) 서열번호 9, 19, 64 및 68;
    (xix) 서열번호 9, 19, 67 및 71; 및
    (xx) 서열번호 10, 20, 64 및 68
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 4개의 가변 쇄 도메인을 포함하는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  11. 제1항에 있어서, 링커 L1, L2 및 L3이 약 12개 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  12. 제1항에 있어서, 링커 L1, L2 및 L3이 각각 GGSGGS(서열번호 95), GGSG(서열번호 96) 또는 GGSGG(서열번호 97)로부터 독립적으로 선택되는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  13. 제1항에 있어서, 링커 L1 및 L3이 GGSGGS(서열번호 95)이고 링커 L2가 GGSG(서열번호 96) 또는 GGSGG(서열번호 97)인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  14. 제1항에 있어서, 탠덤 디아바디가 서열번호 98-121로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 것인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  15. 제1항에 있어서, 탠덤 디아바디가 탠덤 디아바디 01(서열번호 98), 02(서열번호 99), 03(서열번호 100), 04(서열번호 101), 05(서열번호 102), 06(서열번호 103), 07(서열번호 104), 08(서열번호 105), 09(서열번호 106), 10(서열번호 107), 11(서열번호 108), 12(서열번호 109), 13(서열번호 110), 14(서열번호 111), 15(서열번호 112), 16(서열번호 113), 17(서열번호 114), 18(서열번호 115), 19(서열번호 116), 20(서열번호 117), 21(서열번호 118), 22(서열번호 119), 23(서열번호 120), 또는 24(서열번호 121)인 이중특이적 탠덤 디아바디.
  16. 제1항에 있어서, 탠덤 디아바디가 HL-60, KG-1 및 U-937로부터 선택되는 CD33+ 종양 세포 상의 CD33에 대해 10 nM 이하의 결합 KD를 갖는 것인 이중특이적 항원-결합 탠덤 디아바디.
  17. 제1항에 있어서, 탠덤 디아바디가 인간 CD33의 62DQEVQEETQ70(서열번호 94)(서열번호 93의 아미노산 잔기 62-70) 내에 있는 인간 CD33의 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 이중특이적 항원-결합 탠덤 디아바디.
  18. 제1항에 따른 이중특이적 탠덤 디아바디를, CD33+ 암을 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 CD33+ 암의 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 CD33+ 암이 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 전구체 B-세포 림프구성 백혈병, 골수성 육종, 다발성 골수종, 급성 림프종, 급성 림프구성 림프종 또는 만성 골수단구성 백혈병(CMML)인 치료 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 CD33+ 암이 급성 골수성 백혈병(AML)인 치료 방법.
  21. 제18항에 있어서, CD33+ 암이 다발성 골수종인 치료 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 CD33+ 암이 급성 림프구성 백혈병(ALL)인 치료 방법.
  23. 제18항에 있어서, 시타라빈, 아자시티딘, 데시타빈, 안트라사이클린, 플루다라빈, 클로파라빈, 클라드리빈, 넬라라빈, 메토트렉세이트, 보르테조밉, 카르필조밉, 멜팔란, 이브루티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 아프레밀라스트, 에피포도필로톡신, 안트라센디온, 항-CD20 제제 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 치료 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 AML이 반복 유전자 이상을 갖는 AML, 골수이형성증-관련된 변화를 갖는 AML, 치료 관련 골수성 종양, 골수성 육종, 다운 증후군과 관련된 골수성 증식, 모구 형질세포양 수지상세포 종양(Blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm), 또는 달리 분류되지 않은 AML인 치료 방법.
  25. 제20항에 있어서, AML이 AML-M0, AML-M1, AML-M2, AML-M3, AML-M4, AML-M5, AML-M6, 또는 AML-M7인 치료 방법.
  26. 제20항에 있어서, AML이 새롭게 진단되거나, 재발되거나, 또는 난치인 치료 방법.
  27. 제20항에 있어서, 시타라빈, 아자시티딘, 데시타빈, 안트라사이클린, 플루다라빈, 클로파라빈, 클라드리빈, 넬라라빈, 메토트렉세이트, 보르테조밉, 카르필조밉, 멜팔란, 이브루티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 아프레밀라스트, 에피포도필로톡신, 안트라센디온, 항-CD20 제제 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 치료 방법.
  28. 제1항에 따른 이중특이적 탠덤 디아바디를, 골수성 이형성 증후군(MDS)을 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 MDS의 치료 방법.
  29. 제28항에 있어서, 시타라빈, 아자시티딘, 데시타빈, 안트라사이클린, 암사크린, 플루다라빈, 클로파라빈, 클라드리빈, 넬라라빈, 메토트렉세이트, 보르테조밉, 카르필조밉, 멜팔란, 이브루티닙, 탈리도미드, 레날리도미드, 포말리도미드, 아프레밀라스트, 에피포도필로톡신, 안트라센디온, 항-CD20 제제 또는 이의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 치료 방법.
  30. 제1항에 따른 이중특이적 탠덤 디아바디를, 면역 억제를 겪고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 골수 유래의 억제세포(MDSC)에 의한 면역 억제의 치료 방법.
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