MXPA06009253A - Moleculas de enlace menos inmunogenicas. - Google Patents
Moleculas de enlace menos inmunogenicas.Info
- Publication number
- MXPA06009253A MXPA06009253A MXPA06009253A MXPA06009253A MXPA06009253A MX PA06009253 A MXPA06009253 A MX PA06009253A MX PA06009253 A MXPA06009253 A MX PA06009253A MX PA06009253 A MXPA06009253 A MX PA06009253A MX PA06009253 A MXPA06009253 A MX PA06009253A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- acid sequence
- amino acid
- nucleic acid
- bispecific
- seq
- Prior art date
Links
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims abstract description 123
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 97
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 88
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 45
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 44
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 42
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 41
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 35
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 25
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 24
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 23
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 20
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 18
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 16
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 claims description 14
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 claims description 7
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 7
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 7
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 7
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 230000009831 antigen interaction Effects 0.000 claims description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 102100028757 Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Human genes 0.000 claims description 4
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 claims description 4
- 101000916489 Homo sapiens Chondroitin sulfate proteoglycan 4 Proteins 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 4
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 claims description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 claims description 2
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100036305 C-C chemokine receptor type 8 Human genes 0.000 claims description 2
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 claims description 2
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 claims description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 claims description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010009685 Cholinergic Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 241000689227 Cora <basidiomycete fungus> Species 0.000 claims description 2
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 claims description 2
- 101710144543 Endosialin Proteins 0.000 claims description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000716063 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914324 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914321 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 claims description 2
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 claims description 2
- 101000628547 Homo sapiens Metalloreductase STEAP1 Proteins 0.000 claims description 2
- 101001133081 Homo sapiens Mucin-2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000972284 Homo sapiens Mucin-3A Proteins 0.000 claims description 2
- 101000972286 Homo sapiens Mucin-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000972282 Homo sapiens Mucin-5AC Proteins 0.000 claims description 2
- 101000972276 Homo sapiens Mucin-5B Proteins 0.000 claims description 2
- 101000972273 Homo sapiens Mucin-7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000617725 Homo sapiens Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 claims description 2
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100026712 Metalloreductase STEAP1 Human genes 0.000 claims description 2
- 102000036436 Metzincins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007161 Metzincins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 claims description 2
- 102100034263 Mucin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022497 Mucin-3A Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022693 Mucin-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022496 Mucin-5AC Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022494 Mucin-5B Human genes 0.000 claims description 2
- 102100022492 Mucin-7 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 claims description 2
- KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N O-(N-acetyl-alpha-D-galactosaminyl)-L-threonine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O KUIFHYPNNRVEKZ-VIJRYAKMSA-N 0.000 claims description 2
- 102100022019 Pregnancy-specific beta-1-glycoprotein 2 Human genes 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 claims description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 claims description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 claims description 2
- SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N alpha-L-Fucp-(1->2)-beta-D-Galp-(1->4)-[alpha-L-Fucp-(1->3)]-beta-D-GlcpNAc Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)O[C@H]2[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O2)O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O SRHNADOZAAWYLV-XLMUYGLTSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 2
- 125000002446 fucosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O1)C)* 0.000 claims description 2
- 101150026046 iga gene Proteins 0.000 claims description 2
- QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N n-[(2r,3r,4s,5r)-4,5,6-trihydroxy-1-oxo-3-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 2
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 2
- 102100034573 Desmoglein-4 Human genes 0.000 claims 1
- 101710183213 Desmoglein-4 Proteins 0.000 claims 1
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 102100023123 Mucin-16 Human genes 0.000 claims 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 210000005267 prostate cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 21
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 17
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 17
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 13
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 6
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- -1 glucosyl phosphatidyl inositol Chemical class 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IWRJCMQFEMXOML-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-6-(2-hydroxyethyl)-2,2,5,7-tetramethyl-3h-inden-1-one Chemical compound CC1=C(CCO)C(C)=C2C(=O)C(C)(C)CC2=C1O IWRJCMQFEMXOML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 206010016803 Fluid overload Diseases 0.000 description 2
- 239000012541 Fractogel® Substances 0.000 description 2
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 241000255985 Trichoplusia Species 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N (2r,3r,6s)-3-[[(3s)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2h-pyran-2-carboxylic acid Chemical compound O1[C@@H](C(O)=O)[C@H](NC(=O)C[C@@H](N)CCN(C)C(N)=N)C=C[C@H]1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-GIFSMMMISA-N 0.000 description 1
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010043685 GPI-Linked Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000003741 Gastrointestinal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 201000001431 Hyperuricemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 108700029942 Megaloblastic Anemia due to Dihydrofolate Reductase Deficiency Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100261636 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) trpB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028817 Nausea and vomiting symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100035362 Phosphomannomutase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101100124346 Photorhabdus laumondii subsp. laumondii (strain DSM 15139 / CIP 105565 / TT01) hisCD gene Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 208000004337 Salivary Gland Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061934 Salivary gland cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127174 UCHT1 Drugs 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000013103 analytical ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000026900 bile duct neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N blasticidin-S Natural products O1C(C(O)=O)C(NC(=O)CC(N)CCN(C)C(N)=N)C=CC1N1C(=O)N=C(N)C=C1 CXNPLSGKWMLZPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J calcium;potassium;sodium;2-hydroxypropanoic acid;sodium;tetrachloride Chemical compound [Na].[Na+].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cl-].[K+].[Ca+2].CC(O)C(O)=O ZEWYCNBZMPELPF-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000002802 cardiorespiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000015806 constitutional megaloblastic anemia with severe neurologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N eflornithine Chemical compound NCCCC(N)(C(F)F)C(O)=O VLCYCQAOQCDTCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000000198 fluorescence anisotropy Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 101150113423 hisD gene Proteins 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000013198 immunometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000002313 intestinal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000684 melanotic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 150000002895 organic esters Chemical class 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 101150081616 trpB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111232 trpB-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001173 tumoral effect Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Virology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Adhesives Or Adhesive Processes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
La presente invencion proporciona una molecula biespecifica de enlace, en donde dicha molecula comprende o consiste por lo menos de dos dominios en los cuales uno de dichos por lo menos dos dominios se enlaza especificamente a/interactua con el complejo CD3 humano y dicho dominio comprende una secuencia de aminoacidos de una cadena ligera derivada de anticuerpos, en donde dicha secuencia de aminoacidos es una secuencia de aminoacidos particularmente identificada, que comprende sustituciones de aminoacido especificas y un segundo dominio es o contiene por lo menos un sitio adicional de interaccion del antigeno y/o por lo menos un dominio efector adicional. La invencion proporciona ademas moleculas de acido nucleico que codifican las moleculas biespecificas de enlace de la invencion, vectores que comprenden dichas moleculas de acido nucleico y celulas huesped transformadas o transfectadas con dichos vectores. Ademas, la invencion se refiere a un metodo para la produccion de moleculas biespecificas de enlace de la invencion, vectores que comprenden dichas moleculas de acido nucleico y celulas huesped transformadas o transfectadas con dichos vectores. Ademas, la invencion se refiere a un metodo para la produccion de moleculas biespecificas de enlace de la invencion y las composiciones que comprenden las moleculas biespecificas de enlace de la invencion, las moleculas de acido nucleico de la invencion o las celulas huesped de la invencion.
Description
MOLÉCULAS DE ENLACE MENOS INMUNOGENICAS
Campo de la Invención La presente invención proporciona una molécula biespecífica de enlace, en donde dicha molécula comprende o consiste de por lo menos dos dominios en los cuales uno de dichos por lo menos dos dominios se enlaza específicamente a/interactúa con el complejo CD3 humano y dicho dominio comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera derivada de anticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos particularmente identificada que comprende sustituciones de aminoácido específicas y un segundo dominio es o contiene por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno y/o por lo menos un dominio efector adicional. La invención además proporciona moléculas de ácido nucleico gue codifican las moléculas biespecíficas de enlace de la invención, vectores que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico y células huésped transformadas o transfectadas con dichos vectores. Además, la invención se refiere a un método para la producción de moléculas biespecíficas de enlace de la invención y composiciones que comprenden las moléculas biespecíficas de enlace de la invención, las moléculas de ácido nucleico de la invención o las células huésped de la invención.
ANTECEDENTES A través de todo el texto de esta especificación se citan diversos documentos. Cada uno de los documentos citados en la presente (incluyendo cualquier especificación, instrucciones, etc. del fabricante) se incorporan en la presente mediante referencia. Desde que se inició el desarrollo de la ingeniería genética, la terapia inmune se ha utilizado para tratar una variedad de serias enfermedades, e.g. enfermedades tumorosas. Sin embargo, el uso de anticuerpos derivados de fuentes no humanas conduce a varios problemas cuando se utilizan como una parte de un régimen terapéutico en humanos . En primer lugar, los anticuerpos de fuente no humana pueden causar el "síndrome de liberación de citosina (CRS)". El CRS es un síndrome clínico, el cual se ha observado después de la administración de las primeras dosis de anticuerpos anti-CD3 y se relaciona con el hecho de que muchos anticuerpos dirigidos contra CD3 son mitógenos. In vitro, los anticuerpos mitógenos dirigidos contra CD3 inducen la proliferación de células T y la producción de citosina. In vivo esta actividad mitógena lleva a la liberación a gran escala de citocinas, incluyendo muchas citocinas derivadas de células T, dentro de las horas iniciales después de la primera inyección de anticuerpo. La capacidad mitógena de los anticuerpos CD3-específicos es dependiente de monocitos/macrofagocitos e involucra la producción de IL-6 e IL-lß por medio de estas células. Los síntomas del CRS varían desde síntomas leves "semejantes a la influenza" reportados frecuentemente, hasta reacciones severas "semejantes al choque" reportadas menos frecuentemente (las cuales pueden incluir manifestaciones cardiovasculares y del sistema nervioso central) . Los síntomas incluyen, entre otros, cefalea, temblor, náusea/vómito, diarrea, dolor abdominal, malestar y dolores y malestares musculares/articulares, debilidad generalizada, eventos cardiorrespiratorios asi como eventos neuropsiquiátricos . Se ha presentado edema pulmonar severo en pacientes con sobrecarga de líquidos y en aquellos que parecieron no tener una sobrecarga de líquidos. (Chatenoud, 2003 Nat. Rev. Im unol. 3:123-132). En segundo lugar, los anticuerpos murinos se reconocieron por medio de una respuesta humana inmune humoral de anticuerpos anti-múrido (HAMAs) que derivó en un pequeño intervalo terapéutico (Schroff (1985) Cáncer Res .45 : 879-885, Shawler (1985) J. Immunol . 135:1530-1535). Los HAMAs se generan típicamente durante la segunda semana de tratamiento con el anticuerpo terapéutico de múrido y neutralizan los anticuerpos murinos al bloquear la unión con su objetivo pretendido. La respuesta HAMA puede depender de las regiones constantes de anticuerpos murinos ("Fc") o/y de la naturaleza de las regiones variables de múrido ("V") . Esta respuesta del huésped altera dramáticamente el perfil farmacocinético del anticuerpo, que se deriva en una rápida depuración del anticuerpo y evita la dosificación repetida (Ref., 2002 Cáncer control 9:152-166). SUMARIO Se han adaptado cuatro estrategias básicas de anticuerpo para abordar la inmunogenicidad de los anticuerpos terapéuticos; quimerización, suministro de regiones-V completamente humanas, desinmunización y humanización. En los anticuerpos quiméricos, las regiones constantes de múrido se remplazan con regiones constantes humanas sobre la base de que la región constante contribuye con un componente significante a la inmunogenicidad. Hay dos procedimientos para generar regiones V completamente humanas: seleccionar regiones V de anticuerpos humanos de una biblioteca de fagos y proporcionar ratones transgénicos que tienen sus propios genes de inmunoglobulina remplazados con genes de inmunoglobulina humana. En la desinmunización, los péptidos inmunogénicos específicos se cambian con unos que tienen inmunogenicidad reducida o sin inmunogenicidad, de acuerdo con algoritmos específicos. En general, la humanización transmite sustituciones de secuencias de sistema de anticuerpos no humanos en la región variable de secuencias humanas correspondientes, como por ejemplo es el caso del injerto de CDR. La técnica anterior describe diversos procedimientos para humanizar los anticuerpos. Uno de estos métodos es el injerto de CDR dentro del sistema extraño, en donde las CDRs de una especie se injertan en los sistemas humanos (EP 239400) . Sin embargo, tales anticuerpos humanizados tienen frecuentes problemas de insuficiente afinidad de enlace (Riechmann, 1988, Nature 332:323-327). Esto se puede superar por la modificación del abordaje mencionado arriba al introducir mutaciones adicionales dentro de los sistemas humanos. Los ejemplos en donde tal método se ha utilizado se describen en EP469167, EP971959, EP 940468. Otros procedimientos para humanizar anticuerpos son la humanización por medio de la exposición de fagos /EU 5,565,322) y humanización por medio de recubrimiento/enchapado, en donde los aminoácidos del anticuerpo expuestos a la superficie se identifican y sustituyen con aminoácidos similares o idénticos a los sistemas humanos (ver e.g. EP519596, EP 592106). El CD3 humano denota un antígeno que se expresa sobre las células T como parte del complejo multimolecular de células T y el cual consiste de tres diferentes cadenas: CD3-e, CD3-d, CD3-?. El agrupamiento de CD3 sobre la células T, e.g., por anticuerpos anti-CD3 inmovilizados ocasiona una activación de células T similar a la del acoplamiento del receptor de células T, pero independiente de su especificidad típica del clon; (ver WO 99/54440 o Hoffman (1985) J. Immunol . 135:5-8). Los anticuerpos que reconocen específicamente el antígeno CD3 se describen en la técnica anterior, e.g., en Traunecker, EMBO J 10 (1991), 3655-9 y Kipriyanov, Int. J. Cáncer 77 (1998), 763-772. Finalmente, los anticuerpos dirigidos contra CD3 han sido propuestos en el tratamiento de una variedad de enfermedades. Estos anticuerpos o construcciones de anticuerpo actúan como agentes depletores de células T o como agentes mitógenos, según se expuso en EP 1 025 854. Los anticuerpos híbridos de humano/roedor que se unen específicamente al complejo de antígeno CD3 se exponen en WO 00/05268 y se proponen como agentes inmunosupresores, por ejemplo para el tratamiento de episodios de rechazo posteriores al transplante de los aloinj ertos renales, sépticos y cardiacos. WO 03/04648 expone un anticuerpo biespecífico dirigido contra CD3 y a un antígeno de cáncer de ovario. Además, Kufer (1997) Cáncer Immunol Immunother 45:193-7 se relaciona con un anticuerpo biespecífico específico de CD3 y EpCAM para el tratamiento del cáncer mínimo residual. Se han hecho diversos intentos para humanizar un anticuerpo que se una a CD3. EU 5,929,212, EU 5,859,205, WO 91/09968, WO 91/09967 y Adair, 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48 describen un método de humanización de OKT3 de anticuerpo monoclonal CD3 anti-humano de múrido, en el cual las CDRs de ratón (donante) se injertan dentro de sistemas humanos (receptor) y los residuos de aminoácido del donante se introducen en los sistemas. EU 6,407,213 y WO 92/22653 describen un anticuerpo UCHTl humanizado, en el cual un número mínimo de CDR de múrido y residuos FR se han introducido en el contexto de las secuencias de dominio variable humanas de consenso, como se requiere para lograr la afinidad de enlace del antígeno y las propiedades biológicas comparables con el anticuerpo original de múrido. Ejemplos adicionales de anticuerpos CD3 humanizados son EP 0626390 (OKT3), EU 5,885,573 (OKT3), EU 5,834,597 (OKT3), EU 5,585,097 (YTH 12.5) y EU2002131968 (YTH 12.5). Sin embargo, se ha observado que las construcciones de anticuerpo humanizadas derivadas de OKT3 en el formato de moléculas biespecíficas de enlace tienen actividades específicas reducidas, tales como la capacidad de inducir una señal por medio de la unión a/interacción con CD3. Por ende, el problema técnico que subyace a la invención fue proporcionar medios y métodos para el abastecimiento de compuestos derivados de anticuerpos altamente eficientes que pudieran ser útiles en el tratamiento de enfermedades humanas con efectos secundarios reducidos. ?n particular, la reducción de los efectos secundarios se logra, cuando se inducen los efectos secundarios por medio de la inmunogenicidad del compuesto y dan producen una reducción de la actividad del compuesto. La solución a dicho problema técnico se logra al proporcionar las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones. Consecuentemente, la presente invención se relaciona con una molécula biespecífica de enlace, en la cual dicha molécula comprende o consiste de por lo menos dos dominios, (a) en los cuales uno de dichos por lo menos dos dominios específicamente se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano, en el cual dicho dominio comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera derivada de anticuerpo, en la cual dicha secuencia de aminoácidos es (i) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la
SEQ ID NO: 1; (iii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos en hibridación con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (ii) bajo condiciones rigurosas; y (iv) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (ii) y (iii) con la condición de que las secuencias de aminoácidos de acuerdo con (i) con (iv) comprendan sustituciones de aminoácido en las regiones CDR de la cadena ligera en las posiciones L24, L54 y L96 de acuerdo con el sistema Kabat; y (b) en el cual un segundo dominio es o contiene por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno y/o por lo menos un dominio efector adicional. DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones El término "unido a/interactúa con" como se utiliza en el contexto con la presente invención define una unión/interacción de por lo menos dos "sitios de interacción del antígeno" con cada uno. El término "sitio de interacción del antígeno" define, de acuerdo con la presente invención, un motivo de un polipéptido que muestra la capacidad de interacción específica con un antígeno específico o un grupo específico de antígenos. Dicha unión/interacción también se entiende que define un "reconocimiento específico". El término "reconoce específicamente" significa de acuerdo con esta invención que la molécula del anticuerpo es capaz de interactuar específicamente con y/o unirse a por lo menos dos aminoácidos de cada una de las moléculas objetivo humanas como se define en la presente. Los anticuerpos pueden reconocer, interactuar y/o unirse a diferentes epítopes sobre la misma molécula objetivo. Dicho término se relaciona con la especificidad de la molécula del anticuerpo, i.e. a su capacidad para discriminar entre las regiones específicas de la molécula objetivo humana como se define en la presente. La interacción específica del sitio de interacción del antígeno con su antígeno específico podría ocasionar un inicio de una señal, e.g. debido a la inducción de un cambio de la conformación del antígeno, una oligomerización del antígeno, etc. Por lo tanto, los motivos específicos en la secuencia de aminoácidos del sitio de interacción del antígeno son un resultado de su estructura primaria, secundaria o terciaria, así como el resultado de las modificaciones secundarias de dicha estructura. El término "interacción específica" como se utiliza de acuerdo con la presente invención se entiende que define que el dominio específico CD3 de la molécula biespecífica de enlace de la invención no o esencialmente no tiene una reacción cruzada con (poli) éptidos de estructuras similares. La reactividad cruzada de un panel de moléculas de enlace bajo investigación se puede probar, por ejemplo, por medio de la evaluación de la unión de dicho panel de moléculas de enlace de cadena única bajo condiciones convencionales (ver e.g., Harlow y Lañe, Antibodies : A Laboratory Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y üsing Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) con el (poli)péptido de interés así como con un número de (poli) péptidos más o menos estrechamente relacionados (estructuralmente y/o funcionalmente) . Estos métodos pueden comprender, entre otros, estudios de enlace, estudios de bloqueo y competencia con moléculas estructuralmente y/o funcionalmente relacionadas estrechamente. Estos estudios de enlace también comprenden análisis FACS, resonancia de plasmón superficial
(SPR, e.g., con BIAcore®), ultracentrifugado analítico, calorimetría por concentración isotérmica, anisotropía por fluorescencia, espectrofluoroscopia o por ensayos de enlace de ligandos radiomarcados. Consecuentemente, los ejemplos de la interacción específica de un sitio de interacción del antígeno con un antígeno específico pueden comprender la especificidad de un ligando por su receptor. Dicha definición comprende particularmente la interacción de ligandos que inducen una señal después de unirse con su receptor específico. Ejemplos de los ligandos correspondientes comprenden citocinas las cuales interactúan/se unen con/a sus receptores específicos de citosina. Otro ejemplo de dicha interacción, la cual también es comprendida particularmente por dicha definición es la interacción de un determinante antigénico (epítope) con un sitio de enlace antigéníco de un anticuerpo. Dicha interacción también se caracterizó por ninguna o esencialmente por la ausencia de reactividad cruzada por parte del sitio de enlace antigénico de un anticuerpo con otros epítopes de estructuras similares. Se entendió que la definición del término "unirse a/interactuar con" comprende una unión/interacción del dominio de enlace a/con epítopes lineales así como una unión a/interacción con epítopes de configuración, los cuales también se pueden designar como epítope estructural o epítope discontinuo. La definición de los epítopes correspondientes se conoce en el campo. Dichos epítopes e.g., pueden consistir de dos regiones de las moléculas objetivo humanas o partes de estas. En el contexto de esta invención, un epí-tope de configuración se define por dos o más secuencias discretas de aminoácido separadas en la secuencia primaria que aparecen juntas sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se dobla a la proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 y Laver, (1990) Cel 61, 553-6) . El término "epítope discontinuo" se entiende particularmente en el contexto de la invención para definir los epítopes no lineales que se juntan a partir de los residuos de porciones distantes de la cadena de polipéptidos. Estos residuos aparecen juntos sobre la superficie de la molécula cuando el polipéptido se dobla en una estructura tridimensional para constituir un epítope de configuración/estructural . Las moléculas de enlace de la presente invención también ' se contemplan - para unirse específicamente a/interactuar por lo menos con un dominio de enlace con un epítope (s) de configuración compuesto de y/o que comprende por lo menos dos regiones del complejo CD3 humano o compuesto de/que comprende componentes individuales como CD3-e, CD3-d y CD3-?, y/o combinaciones de dichos componentes tales como CD3-e / CD3-d o CD3-e / CD3-?. Además, se contempla que dicho epítope (s) de configuración/estructural descrito en la presente comprenden partes individuales/regiones/extensiones de por lo menos dos regiones de un solo componente del complejo CD3 humano, preferentemente por lo menos dos partes/regiones/extensiones de CD3-e, aún más preferentemente del dominio extracelular de CD3-e. Como se definió en la presente, arriba, un segundo dominio de la molécula biespecífica de enlace de la invención se enlaza a por lo menos un sito adicional de interacción del antígeno y/o por lo menos a un dominio efector adicional. El término "dominio efector" caracteriza en el contexto de la presente invención un dominio de la molécula de la invención que inicia un efecto biológico tal como la inducción de una señal de estimulación primaria o secundaria, la inducción de un efecto citotóxico (que incluye señales inductoras de apoptosis) o que tienen meramente la capacidad de unirse específicamente a/interactuar con un sitio específico de interacción del antígeno. "Efecto citotóxico" también comprende la citotoxicidad celular ejercida por las células T. En conformidad, la molécula biespecífica de enlace de la invención se caracteriza por lo menos por dos especificidades diferentes . La especificidad se puede determinar experimentalmente por medio de métodos conocidos en el campo y los métodos se exponen y describen en la presente. Tales métodos comprenden, pero no están limitados a pruebas Western de inmunotransferencia, ELISA, RÍA, ECL, IRMA y rastreos de péptidos . El término "CDR" como se emplea en la presente se relaciona con la "región determinante complementaria", la cual es bien conocida en el campo. Las CDRs son partes de las inmunoglobulinas que determinan la especificidad de dichas moléculas y hacen contacto con un ligando específico. Las CDRs son la parte más variable de la molécula y contribuyen a la diversidad de estas moléculas. Hay tres regiones CDR CDRl, CDR2 y CDRe en cada dominio V. CDR-H caracteriza una región CDR de una cadena pesada variable y CDR-L se relaciona con una región CDR de una cadena ligera variable. La H significa la cadena pesada variable y la L significa la cadena ligera variable. Las regiones CDR de una región derivada de Ig se pueden determinar como se describe en Kabat (1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edic, NIH Publication no. 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.), Chothia (1987; J. Mol. Biol.. 196, 901-917) y Chothia (1989; Nature, 342, 877-883). El "sistema Kabat" significa en el contexto de la presente invención el estándar para numerar los residuos en una forma consistente de acuerdo con Kabat (1991; Sequences of Proteins of Immunological Jnterest, 5a. Edic, NIH publicación no. 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.) y Chothia (1987; J. Mol. Biol.. 196, 901-917) . Este sistema de numeración lo utilizan ampliamente los especialistas calificados y se basa en la variabilidad de la secuencia y anillos tridimensionales de la región de dominio variable que son importantes en la actividad de la unión del antígeno. Todos los residuos de las cadenas ligeras o cadenas pesadas tienen distintas posiciones Kabat; i.e. el sistema de numeración Kabat se aplica a CDRs así como a sistemas. Las posiciones de residuos específicos de cualquier anticuerpo se pueden numerar de acuerdo con Kabat. El sistema de numeración y las posiciones Kabat de residuos específicos de anticuerpos se indican en http: //ww .bioinf . org.uk/abs . Por ejemplo, la posición L24 como se menciona en la invención significa el residuo 24 en la cadena ligera de acuerdo con el sistema Kabat. En conformidad, L54 y L96 se refieren a las posiciones 54 y 96 en la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con el sistema Kabat . Las reglas para identificar las regiones CDR de las cadenas VH y VL de acuerdo con Kabat se muestran en ww . bionf . org . uk/abs y en la Tabla 1. Tabla 1. Identificación de las CDRs en la cadena pesada regiones CDR- H) y en la cadena ligera (regiones CDR-L)
De acuerdo con esta invención, una región de sistema se relaciona con una región en el dominio V (dominio VH o VL) de inmunoglobulinas y receptores de células T que proporciona un andamiaje de proteína para las regiones que determinan la complementaridad hipervariable (CDRs) que hacen contacto con el antígeno. En cada dominio V, hay cuatro regiones de sistema designadas FR1, FR2, FR3 y FR4. El sistema 1 abarca la región de la terminal N del dominio V hasta que se inicia CDRl, el sistema 2 se relaciona con la región entre CDRl y CDR2, el sistema 3 abarca la región entre CDR2 y CDR3 y el sistema 4 significa la región desde el fin de CDR3 hasta la C-terminal del dominio V; ver, entre otros, Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5a ed. Por tanto, las regiones del sistema abarcan todas las regiones fuera de las regiones CDR en los dominios VH o VL. La persona experta en la materia está fácilmente en posición de deducir desde una secuencia dada las regiones del sistema y las CDRs; ver Kabat (1991) Seguences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edic., NIH publicación no. 91-3242 Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U., Chothia (1987). J. Mol. Biol.. 196, 901-917 y Chothia (1989) Nature, 342, 877-883) . De acuerdo con la presente invención "moléculas biespecíficas de enlace" son (poli) péptidos que necesariamente se unen específicamente con un dominio al complejo CD3 humano y/o sus componentes individuales. El término " (poli) péptido" como se utiliza en la presente describe un grupo de moléculas que comprenden el grupo de péptidos, así como el grupo de polipéptidos. El grupo de péptidos consiste de moléculas con hasta 30 aminoácidos, el grupo de polipéptidos consiste de moléculas que consisten de más de 30 aminoácidos. Más preferentemente, dichas "moléculas biespecíficas de enlace" son seleccionadas del grupo de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, derivativos de anticuerpo, péptidos específicos de enlace y proteínas específicas de enlace. Dichos fragmentos de anticuerpo son conocidos en el campo y comprometen, pero no están limitados a fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv y los semejantes. Los derivativos de anticuerpo comprenden pero no están limitados a anticuerpos marcados/fragmentos de anticuerpo. Así como moléculas de anticuerpo químicamente modificadas/fragmentos de anticuerpo. Como se detallará abajo, los derivativos de anticuerpos preferidos particularmente en el contexto de esta invención son scFv's. Un dominio de la molécula biespecífica de enlace de la invención se deriva de un anticuerpo CD3 con injerto de CDR humanizado. El término "humanizado" como se utiliza en la presente en el contexto con anticuerpos y construcciones de anticuerpo se puede definir como sustitución de secuencias no humanas con secuencias humanas correspondientes. Esto se puede lograr por el injerto de CDRs de múrido dentro del sistema humano o por el reemplazo de aminoácidos únicos de múrido en el sistema con aminoácidos únicos humanos en la posición correspondiente. El término humanización, como se utilizó en la invención abarca adicionalmente la introducción de mutaciones adicionales a fin de mejorar la unión o la actividad citotóxica de la proteína. Estas mutaciones adicionales no necesariamente necesitan ser reemplazos de los residuos de múrido a residuos humanos. Los métodos para la sustitución de aminoácidos y, particularmente, de aminoácidos en posiciones específicas por aminoácidos específicamente seleccionados en una secuencia dada de aminoácido son conocidos por el experto en la materia y representan métodos estándar de laboratorio. Un ejemplo de tal método es mutagénesis cebadora (Sambrook et al. 1989). Sorprendentemente se ha encontrado que las construcciones de anticuerpo específicos CD3 humanizados que comprenden sustituciones adicionales de aminoácido en las CDRs de la cadena ligera, como se describen en la presente arriba, en el contexto de moléculas biespecíficas de enlace tienen actividad citotóxica. Estas moléculas tienen la capacidad de inducir la muerte celular en las células objetivo. En contraste, las construcciones de anticuerpo específicos CD3 humanizadas descritas en la técnica, e.g. en Adair, 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:42-48, muestran una capacidad significativamente deteriorada para inducir la muerte celular en las células objetivo cuando dichas construcciones se expresan en el contexto de las moléculas biespecíficas de enlace definidas arriba. En particular, la molécula biespecífica de la invención muestra la unión significante a sus epítopes específicos (ver Ejemplo 4, Fig. 2) y alta actividad citotóxica (Ejemplo 6, Fig. 6) . El CD3 biespecífico humanizado de la invención con sustituciones en las CDRs de la cadena ligera de la parte de enlace de CD3 muestra un valor EC50 de 50 pg/ml mientras que el valor EC50 de la constucción biespecífica de anticuerpo que comprende el OKT3 humanizado se describe en Adair, 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48 es 195 pg/ml. Debido al cuádruple incremento en la actividad citotóxica la molécula biespecífica de la invención se puede utilizar efectivamente en actividades terapéuticas. Además, el abastecimiento de una molécula biespecífica humanizada que tiene actividad citotóxica alta demuestra una importante ventaja en el campo médico ya que se necesitan bajas cantidades de molécula biespecífica de la invención para alcanzar el efecto terapéutico para los pacientes. Por ende, las moléculas biespecíficas de la invención proporcionan una importante ventaja sobre los anticuerpos de la técnica anterior, cuando se da tratamiento a los pacientes ya que muestra al mismo tiempo una actividad citotóxica alta y son menos inmunogénicas debido a la humanización. Por lo tanto, ellas ofrecen un claro adelanto en el campo médico. La 'molécula biespecífica de enlace de la invención difiere de las moléculas humanizadas descritas en la técnica por medio de las tres sustituciones de aminoácido, descritas arriba, en las CDRs de las cadenas ligeras. Debido a que los anticuerpos se unen a/interactúan con sus antígenos específicos por medio de fuerzas intramoleculares que son afectadas por las secuencias particulares de aminoácido de las CDRs, una persona experta en la material no habría sustituido los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la región CDR a fin de incrementar la actividad biológica del anticuerpo. En cambio, la persona experta habría retenido la secuencia CDR original de múrido. Por lo tanto, es sorprendente que la molécula biespecífica de enlace de la invención tenga tal actividad citotóxica alta. Se prefiere particularmente que el dominio que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano se caracterice por tener una serina en la posición L24, una valina en la posición L54 y una leucina en la posición L96. La posición L24 significa la posición 24 en la cadena ligera como se describe en Kabat (1991; Sequences of Proteins of
Immunologícal Interest, 5a edic., NIH publicación no. 91-3242
Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.) y Chothia
(1987; J. Mol. Biol.. 196, 901-91) y en http: //ww .bioinf. org.uk/abs . De forma similar, las posiciones L54 y L96 representan los residuos 54 y 96, respectivamente, de la cadena ligera como lo describen Kabat y Chothia. La molécula biespecífica de enlace de la invención se caracteriza además en una modalidad que dicha región CDR de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NOs: 4,6 u 8 o codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NOs: 3, 5 o 7. Se contempla por medio de la invención que el dominio que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano es un scFv.
El término "scFv" (Fv de cadena única) es bien entendido en el campo. Los ScFv' s se prefieren en el contexto de esta invención, debido a su pequeño tamaño y a la posibilidad de una producción recombinante de estos derivativos de anticuerpo. Además se contempla que el dominio de la molécula biespecífica de enlace de la invención que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (cadena ligera de la molécula de enlace CD3 humanizada de la invención) o es codifica por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO : . Preferentemente la molécula de enlace de la invención es una molécula de enlace, en la cual el dominio que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos como se describió en la SEQ ID NO. : 14 o codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13. Además se contempló por medio de la invención que la molécula biespecífica de enlace es una molécula de enlace, en la cual el segundo dominio es por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno específico para una o más molécula (s) de superficie celular. El término "molécula de superficie celular" como se utiliza en la presente denota a las moléculas que se presentaron o/y se anexaron en/a la superficie de una célula. Los ejemplos de dichas moléculas de superficie celular son proteínas de membrana y transmembrana (incluyendo variantes modificadas tales como variantes glucosiladas) , moléculas adheridas a dichas proteínas o a la superficie celular así como mitades glucosiladas tales como por ejemplo glucolípidos . La adhesión se debe entender como efectuada preferentemente por medio de una proteína integral de membrana, una proteína ligada a GPI (ligada a glucosilo fosfatidilo inositol) , una mitad proteinácea o no-proteinácea unida covalentemente o no-covalentemente a otra molécula acarreadora tal como las mitades de azúcar o mitades de gangliósido. Preferentemente dicha molécula (s) de superficie celular es/son (a) molécula (s) específicas de tumor. Una molécula específica de tumor, es un antígeno de superficie celular asociada a un tumor que se encuentra ya sea exclusivamente sobre las células del tumor o se sobreexpresan sobre las células de tumor en comparación con células no malignas. Los antígenos de superficie celular asociadas a tumor se pueden expresar no sólo sobre las células tumorales si no sobre las células/tejido que son/es no esenciales para la supervivencia o que se pueden resurtir por medio de células troncales que no expresan el antígeno de superficie celular asociado con el tumor. Además, el antígeno de superficie celular asociado con el tumor se puede expresar sobre células malignas y células no malignas, pero es más accesible por medio de un agente terapéutico de interés sobre células malignas. Ejemplos de antígenos de superficie celular asociados con el tumor sobre-expresados son HER- 2/NEU, Receptor-EGF, HER-3 y HER-4. Un ejemplo del antígeno de superficie celular asociado con el tumor que es específico de tumor es EGFRV-III. Un ejemplo de un antígeno de superficie celular asociado con el tumor que se presenta en una célula que no es esencial para la supervivencia es PSMA. Ejemplos de antígenos de superficie celular asociados con el tumor que se presentan en células que se resurten son CD19, CD20 y CD33. Un ejemplo de antígeno de superficie celular asociado con el tumor que es más accesible en un estado maligno que en un estado no maligno es EpCAM. Preferentemente, dicho segundo dominio que es por lo menos uno además del sitio de interacción del antígeno es una región derivada de anticuerpo que comprende una secuencia polipeptidica que corresponde a por lo menos una región variable de un anticuerpo. Más preferentemente, dicho segundo dominio es un scFv adicional. Un formato molecular de la invención que se prefiere particularmente proporciona una construcción de polipéptido en el formato de una construcción de anticuerpo biespecífico de cadena única en la cual la región derivada de anticuerpo comprende una región VH y una región VL. Las regiones VH y VL se pueden ordenar de cualquier manera. El término "construcción de anticuerpo biespecífico de cadena única" se relaciona con una construcción que comprende un dominio que consiste de (por lo menos una) cadena ligera variable, como se define arriba, capaz de interactuar específicamente con/unirse a CD3 humano/complejo CD3 humano y comprende un segundo dominio que consiste de (por lo menos una) región (es) ariable (o partes de esta) como se define arriba, capaz de interactuar específicamente con/unirse a un antigeno adicional. Una parte de una región variable puede ser por lo menos una CDR ("Región Determinante Complementaria") , más preferentemente por lo menos la región CDR3. Dichos dos dominios/regiones en la construcción de anticuerpo de cadena única están preferiblemente conectados covalentemente uno con otro como una cadena única. Esta conexión se puede efectuar ya sea directamente (dominiol interactuando con CD3-dominio2 interactuando con el antígeno adicional o dominiol interactuando con el antígeno adicional-dominio2 interactuando con CD3) o a través de una secuencia de enlace polipeptídico adicional (dominiol-secuencia de enlace-dominio2 o dominio2-secuencia de enlace-dominiol) . En el caso de gue se utilice un enlazador, este enlazador es preferentemente de una longitud y secuencia suficiente para asegurar que cada uno del primero y segundo dominio pueda, independientemente uno de otro, retener sus especificidades diferenciales de enlace. Más preferentemente y como se documentó en los ejemplos anexos, la construcción de anticuerpo biespecífico de cadena única" es un Fv biespecífico de cadena única (bscFv) . El formato molecular de las moléculas biespecíficas de cadena única se conocen en el campo y se describen e.g., en WO99/54440, Mack, J. Immunol (1997), 158, 3965-3970, Mack PNAS, (1995), 92, 7021-7025; Kufer, Cáncer Immunol . Immunother . , (1997, 45, 193-197; Lóffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103; Brühl, Immunol . , (2001), 166, 2420-2426.' . Ejemplos particulares de tales construcciones de anticuerpo biespecíficas de cadena única de la invención se proporcionan en la presente, abajo, y se ilustran en los ejemplos anexos. De acuerdo con la invención son moléculas biespecíficas de enlace, en las cuales dicho segundo dominio se enlaza específicamente a/interactúa con un antígeno seleccionado del grupo que consiste de EpCAM, CCR5, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, EFGR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC,. MUC5B, MUC7, bhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, gangliósido GD3, 9-0-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GMl, Poli SA, GD2, Carboanhidrasa IX (MN/CA IX) , CD44v6, Hedghog Sónico (Shh) , Wue-1, Antígeno Celular Plasmático, IgE (unido a membrana), Proteoglicano de Sulfato de Condroitina de Melanoma (MCSP) , CCR8, precursor TNF-alfa, STEAP, mesotelina, Antígeno A33, Antígeno de Célula Germinal Prostática (PSCA), Ly-6 desmoglina 4, neoepítipe E-cadherina, Receptor de Acetilcolina Fetal, CD25, marcador Cal9-9, marcador Ca-125 y Receptor de Sustancia Inhibidora de Mülleriana (MIS) tipo II, sTn (antígeno tn sialilado; TAG-72) , FAP (antígeno de activación de fibroblasto) , endosialina, EGFRvIII, L6, SAS, CD63, antígeno-TF, antígeno Cora, CD7, CD22, Iga, Igß, gplOO, MT-MMPs, antígeno-Fl9 y C0-29. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención dicho segundo dominio se enlaza específicamente a/interactúa con la molécula CD19. Se contempla particularmente que la molécula biespecífica de enlace de la invención que se enlaza específicamente a/interactúa con CD3 y la molécula CD19 se caracteriza en que dicho segundo dominio comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: •
(a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO. : 16 o 18; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO. : 15 o 17; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) bajo condiciones rigurosas de hibridación; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c) . Más preferentemente, la molécula biespecífica de enlace comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO. : 20; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO. : 19; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de . una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) bajo condiciones rigurosas de hibridación; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c) . Dicha molécula biespecífica de enlace es preferentemente una construcción de scFv biespecífica, en la cual un primer scFv se enlaza específicamente a/interactúa con CD3 y un segundo scFv se enlaza específicamente a/interactúa con CD19. De acuerdo con una modalidad preferida de la invención dicho segundo dominio se enlaza específicamente a/interactúa con la molécula EpCAM. Se contemplan particularmente que la molécula biespecífica de enlace de la invención que se enlaza específicamente a/interactúa con CD3 y la molécula EpCAM se caracteriza en que dicho segundo dominio comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO.: 22, 24, 26, 28, 30 o 32. (b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO.: 21, 23, 25, 27, 29 o 31; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) bajo condiciones rigurosas de hibridación; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótido de cualquiera de (b) y (c) . Más preferentemente, la molécula biespecífica de enlace comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO. : 34 o 36; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ
ID NO. : 33 o 35; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico como se define en (b) bajo condiciones rigurosas de hibridación; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c) . Dicha molécula biespecífica de enlace es preferentemente una construcción de scFv biespecífica, en la cual un primer scFv se enlaza específicamente a/interactúa con CD3 y un segundo scFv se enlaza específicamente a/interactúa con EpCAM. Además se prefiere que dicho por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno de la molécula biespecífica de enlace de la invención sea humanizada. En una modalidad adicional, la invención abarca una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula biespecífica de enlace de la invención, definida arriba. Preferentemente, dicha secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de la SEQ ID NOs.: 20, 34 o 36; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ADN seleccionada del grupo de la SEQ ID NOs. : 19, 33 o 35; (c) una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos como se define en (b) bajo condiciones rigurosas de hibridación; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína derivada de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o (b) por medio de sustitución, supresión y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a) o (b) ; (e) una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos es por lo menos 60%, preferentemente 70%, más preferentemente 80%, particularmente preferentemente 90%, aún más preferentemente 95% y lo más preferentemente 99% idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de (a) o (b) ; (f) una secuencia de nucleótidos que se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (a) a (e) . El término "Hibridación" como se utiliza en la presente se refiere a los polinucleótidos que son capaces de hibridarse con la cadena complementaria de la secuencia de ácido nucleico citada o a partes de esta o a la secuencia citada de ácido nucleico o partes de esta. Por lo tanto, dicha . secuencia de ácido nucleico puede ser útil como sonda en el análisis Northern o Southern de inmunotransferencia, de las preparaciones de ARN o ADN, respectivamente, o se pueden utilizar como cebadores de oligonucleótido en análisis PCR dependientes de su tamaño respectivo. Preferentemente, dichos polinucleótidos de hibridación comprenden por lo menos 10, más preferentemente por lo menos 15 nucleótidos mientras que un polinucleótido de hibridación de la presente invención que se utilizará como una sonda preferentemente comprende por lo menos 10, más preferentemente por lo menos 200 o más preferentemente por lo menos 500 nucleótidos. Es bien conocido en el campo cómo efectuar experimentos de hibridación con moléculas de ácido nucleico, i.e. la persona experta en la materia sabe qué condiciones de hibridación tiene que utilizar de acuerdo con la presente invención. Tales condiciones de hibridación se mencionan en los libros de texto normales tales como Sambrook et al (loe cit.) y otros manuales estándar de laboratorio conocidos por la persona experta en la materia o como se citaron arriba. Preferentemente de acuerdo con las presentes invenciones son los polinucleótidos que son capaces de hibridarse con los polinucleótidos de la invención o partes de estos, bajo condiciones rigurosas de hibridación. "Condiciones rigurosas de hibridación" se refiere, i.e., a una incubación durante la noche a 42° C en una solución que comprenda 50% de formamida, 5x SSC (750 M NaCI, 75 mM de citrato de sodio), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5x solución de Denhardt, 10% sulfato de dextrano y 20 µg/ml desnaturalizado, ADN de esperma dividido de salmón, seguido por lavado de los filtros en 0.1 x SSC a 65° C aproximadamente. También se contemplan las moléculas de ácido nucleico que se hibridan con los polinucleótidos de la invención en condiciones menos rigurosas de hibridación. Los cambios en la rigurosidad de la hibridación y la detección de la señal se logran principalmente a través de la manipulación de la concentración de formamida (porcentajes más bajos de formamida dan como resultado que sea menos riguroso) ; condiciones salinas, o temperatura. Por ejemplo, las condiciones menos rigurosas incluyen una incubación durante la noche a 37° C en una solución que comprenda 6x SSPE (20X SSPE = 3M NaCI; 0.2M NaH2po4; 0.02M EDTA, pH 7.4 ) , 0.5% SDS, 30% formamida, 100 µg/ml de ADN con bloqueo de esperma de salmón; seguido por lavados a 50° C con 1 X SSPE, 0.1% SDS. Además, para lograr que sea aún menos riguroso, los lavados que se efectúen después de la hibridación rigurosa se pueden efectuar en concentraciones más altas de sal (e.g. 5x SSC) . Es importante destacar que las variaciones en las condiciones anteriores se pueden lograr a través de la inclusión y/o sustitución de reactivos bloqueantes alternativos utilizados para suprimir la base en los experimentos de hibridación. Los reactivos bloqueadores típicos incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, Heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado, y formulaciones registradas que se encuentran disponibles en el mercado. La inclusión de reactivos bloqueantes específicos puede requerir la modificación de las condiciones de hibridación descritas arriba, debido a problemas con compatibilidad. Las moléculas de ácido nucleico citadas pueden ser, e.g., ADN, cADN, ARN o ADN o ARN producidos sintéticamente o una molécula de ácido nucleico quimérico producida recombinantemente o mezclas de quimeras de esta que comprenden cualquiera de aquellos polinucleótidos ya sea solos o combinados.
Es evidente para la persona experta en la materia que se pueden añadir secuencias reguladoras a la molécula de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, promotores, que aumentan la transcripción y/o secuencias que favorecen que se pueda emplear la expresión inducida del polinucleótido de la invención. Un sistema inducible apropiado es por ejemplo la expresión del gen regulada por tetraciclina, como se describe, e.g., por Gossen y Bujard (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89 (1992), 5547-5551) y Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62), o un sistema de expresión de gen inducible por dexametasona como se describe, e.g., por Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519. Además, se contempla para propósitos adicionales que las moléculas de ácido nucleico pueden contener, por ejemplo, uniones tioestér y/o análogos de nucleótido. Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácido nucleico contra las endo- y/o exonucleasas en la célula. Dichas moléculas de ácido nucleico se pueden transcribir por medio de un vector apropiado que contiene un gen quimérico que favorece la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula. A este respecto, también se tiene que entender que dicho polinucleótido se puede utilizar para procedimientos de "llegar al gen" o "terapéutica génica". En otra modalidad dichas moléculas de ácido nucleico están marcadas. Los métodos para la detección de los ácidos nucleicos son bien conocidos en el campo, e.g., análisis Southern y Northern de inmunotransferencia, PCR o extensión del cebador. Esta modalidad puede ser útil para los métodos de escrutinio para verificar la introducción exitosa de las moléculas de ácido nucleico descritas arriba durante los procedimientos de genterapéuticos . Dicha molécula (s) de ácido nucleico puede ser una molécula quimérica de ácido nucleico producida de forma recombinante, que comprenda cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas antes ya sea solas o en combinación. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico es parte de un vector. La presente invención, por lo tanto, también se relaciona con un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Muchos vectores apropiados son conocidos por aquellos expertos en biología molecular, la elección del cual dependerá de la función deseada e incluye plásmidos, cósmidos, viruses, bacteriófagos y otros vectores que se utilizan convencionalmente en la ingeniería genética. Los métodos que son bien conocidos por los expertos en la materia se pueden utilizar para construir varios plásmidos y vectores; ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (loe cit.) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención se pueden reconstituir en liposomas para la administración a las células objetivo. Como se discute abajo en detalles adicionales, se utilizó un vector de clonación para aislar las secuencias individuales de ADN. Las secuencias relevantes se pueden transferir al interior de vectores de expresión en donde se requiere la expresión de un polipéptido particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores típicos de expresión incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT. Preferentemente dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora unida operativamente a dicha secuencia de ácido nucleico codificando construcciones de anticuerpo de cadena única definidos en la presente. Tales secuencias reguladoras (elementos de control) son del conocimiento del técnico y pueden incluir un promotor, un cásete de empalme, codón de iniciación de traducción, sitio de traducción e inserción para introducir un inserto dentro del vector. Preferentemente, dicha molécula de ácido nucleico se enlaza operativamente a dichas secuencias de control de expresión con lo que permite la expresión en las células eucarióticas o procarióticas.
Se contempla que dicho vector es una vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico que codifica una molécula biespecífica de enlace de la invención. El término "secuencia reguladora" se refiere a secuencias de ADN que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias de codificación a los que están ligados. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En los procariotas, las secuencias de control generalmente incluyen un sitio ribosomal de enlace, promotor y terminadores. En los eucariotas generalmente las secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunas instancias, aumentadores, transactivadores o factores de transcripción. El término "secuencia de control" está pensado para incluir, en un mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también puede incluir componentes ventajosos adicionales. El término "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición en la cual los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su forma pretendida. Una secuencia de control "unido operablemente" a una secuencia de codificación está ligada de tal forma que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. En el caso de que la secuencia de control sea un promotor, es obvio para un experto que se utilice preferentemente ácido nucleico de doble banda. Por lo tanto, el vector citado es preferentemente un vector de expresión. Un "vector de expresión" es una construcción que se puede utilizar para transformar un huésped seleccionado y proporciona la expresión de una secuencia de codificación en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden, por ejemplo, ser vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. La expresión comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico preferentemente dentro de un mARN traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en los procariotas y/o en las células eucarióticas son bien conocidos para los expertos en la materia. En el caso de las células eucarióticas, normalmente comprenden promotores que aseguran la iniciación de la transcripción y opcionalmente señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y estabilización del transcrito. Los posibles elementos reguladores permiten la expresión en células huésped procarióticas que comprenden, e.g., el PL, lac, trp o promotor tac en E. coli y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucarióticas son el promotor AOXl o GAL1 en levadura o el promotor-RSV, CMV-, SV40- (virus del sarcoma de Rous), aumentador de CMV, aumentador de SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y otros animales. Además de los elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción tales como los elementos reguladores también podrían comprender las señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, en dirección anterógrada del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión utilizado las secuencias líderes capaces de dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo dentro del medio, se podría añadir a la secuencia de codificación de la secuencia de ácido nucleico citada y son bien conocidos en el campo; también ver, e.g., ejemplo 3 anexo. La secuencia (s) líder está (están) encerrada en la fase apropiada con secuencias de traducción, iniciación y -terminación y preferentemente una secuencia líder capaz dé dirigir la secreción de la proteína traducida, o una porción de ésta, dentro del espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación con N-terminal que imparte las características deseadas, e.g., estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado; ver supra. En este contexto, los vectores apropiados de expresión son conocidos en el campo tal como vector de expresión cADN Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADNl, pcADN3 (In- vitrogene) , pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 y Raum et al. Cáncer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORTl (GIBCO BRL) . Preferentemente, las secuencias de control de expresión serán sistemas eucarióticos promotores en vectores capaces de transformar o transfectar las células huésped eucarióticas, pero también se pueden utilizar las secuencias de control de los huéspedes procarióticos. Una vez que el vector se ha incorporado dentro del huésped apropiado, el huésped se mantiene bajo condiciones apropiadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y, como se deseaba, la colección y purificación de la molécula biespecífica de enlace de la invención puede seguir; ver, e.g., los ejemplos anexos. Un sistema alternativo de expresión que se podría utilizar para expresar una proteína de interacción en el ciclo celular es un sistema de insecto. En un sistema tal, se utiliza un virus polihedrosis nuclear Autographa calif ornica (AcNPV) como un vector para expresar los genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas Trichoplusia . La secuencia de codificación de una molécula de ácido nucleico citada se podría clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de polihedrina y colocar bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de dicha secuencia de codificación producirá el gen de polihedrina inactivo y producir virus recombinante que carece de recubrimiento con proteína. Los viruses recombinantes se utilizan entonces para infectar las células S . frugiperda o larvas Trichoplusia en los que se expresa la proteína de la invención (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 91(1994), 3224-3227).. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir aumentadores de transcripción así como de traducción. Ventajosamente, los vectores de la invención descritos arriba comprenden un marcador seleccionable y/o calificable. Los genes marcadores seleccionables útiles para la selección de las células transformadas y, e.g., tejido de planta y plantas son bien conocidos para los expertos en la materia y comprenden, por ejemplo, resistencia antimetabolito como la base de selección de dhfr, lo cual confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci.
Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, el cual confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, Canamicina y paromicina
(Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e higro, el cual confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32
(1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, es decir trpB, el cual permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, el cual permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85 (1988), 8047);
manosa-6-fosfato isomerasa el cual permite que las células utilicen mañosa (WO 94/20627) y ODC (ornitina decarboxilasa) el cual confiere resistencia al inhibidor de onitina decarboxilasa, 2- (diflurometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. ) o deaminasa de Aspergillus terreus la cual confiere resistencia a la Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biothechnol. Biochem. 59 (1995) , 2336-2338) . Los marcadores calificables útiles también son conocidos por los expertos en la materia y están disponibles comercialmente. Ventajosamente, dicho marcador es una luciferasa de codificación génica (Giacomin, Pl . Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína verde fluorescente (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o ß-glucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). La modalidad es particularmente útil para el escrutinio simple y rápido de las células, tejidos y organismos que contienen un vector citado. Como se describió arriba, la molécula de ácido nucleico citado se puede utilizar sola o como parte de un vector para expresar la molécula biespecífica de enlace de la invención en células, por, e.g., purificación, pero también para propósitos de tratamiento génico. Las moléculas de ácido nucleico o vectores que contienen la secuencia (s) de ADN codifican alguna de las moléculas biespecíficas de enlace de la invención descritas arriba se introduce en las células que a cambio producen el polipéptido de interés. El tratamiento génico, el cual se basa en la introducción de genes terapéuticos dentro de las células por medio de técnicas ex vivo o in-vivo es una de las aplicaciones más importantes de transferencia génica. Los vectores apropiados, métodos o sistemas de administración de genes para el tratamiento génico in vitro o in vivo se describen en la literatura y son conocidos por ' la persona experta en la materia; ver, e.g., Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534- 539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma,
• Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811
(1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243- 51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO
97/00957, EU 5,580,859; EU 5,589,466; o Schaper, Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Las moléculas de ácido nucleico citadas y vectores se pueden diseñar para la introducción directa o para la introducción por medio de liposomas o vectores virales (e.g., adenoviral, retroviral) dentro de la célula. Preferentemente, dicha célula es una linea de célula germinativa, célula embriónica u óvulo o derivadas de estos, más preferentemente dicha célula es una Célula Germinal. Un ejemplo de una Célula Germinal embriónica puede ser, entre otros, una Célula Germinal como se describe en, Nagy, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90 (1993), 8424-8428. La invención también le proporciona a un huésped transformado o transfectado un vector de la invención. Dicho huésped se puede producir por la introducción de dicho por lo menos uno de los vectores de la invención descritos arriba o por lo menos una de las moléculas de ácido nucleico de la invención descritas arriba, dentro del huésped. La presencia de dicho por lo menos un vector o por lo menos una molécula de ácido nucleico en el huésped puede mediar la expresión de un gen que codifica las construcciones de anticuerpo de cadena única descritas arriba. La molécula de ácido nucleico o vector de la invención descritos arriba que se introduce en el huésped también se puede integrar dentro del genoma del huésped o se puede mantener de forma extracromosómica. El huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariótica. El término "procariota" tiene por objetivo incluir todas las bacterias que se pueden transformar o transfectar con moléculas de ADN o ARN para la expresión de una proteína de la invención. Los huéspedes procarióticos pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. Typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis . El término "eucariótico" tiene por objetivo incluir levadura, células más altas de plantas, insectos y preferentemente de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, la proteína codificada por el polinucleótido de la presente invención puede ser glucosilado o puede ser no glucosilado. Especialmente preferido es el uso de un plásmido o un virus que contiene la secuencia de codificación del polipéptido de la invención y se fusiona genéticamente a este marcador FLAG en la N-terminal y/o marcador His/His-tag en la C-terminal. preferentemente, la longitud de dicho marcador FLAG/tag-FLAG es de - aproximadamente 4 a 8 aminoácidos, más preferentemente 8 aminoácidos. Un polinucleótido descrito arriba se puede utilizar para transformar o transfectar al huésped utilizando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente a quienes tienen un conocimiento normal de la materia. Además, los métodos para preparar genes unidos operablemente, fusionados, y los expresa en e.g., células de mamífero y bacterias son bien conocidos en el campo (Sambroook, loe cit.). Preferentemente, dicho huésped es una bacteria o un insecto, célula micótica, de planta o animal. Se contempla particularmente que el huésped citado puede ser una célula de mamífero. Las células huésped particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma como SP2/0 o NS/0. Como se ilustró en los ejemplos anexos, se prefieren particularmente las células CHO como huésped. Más preferiblemente, dicha célula huésped es una célula humana o línea celular humana, e.g., por c6 (Cross, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163/168). En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona entonces con un proceso para la producción de .molécula biespecífica de enlace de la invención que comprende el cultivo de una célula y/o el huésped de la invención bajo condiciones apropiadas para • la expresión/favorecer la expresión de la molécula biespecífica de enlace y aislar/recuperar la molécula biespecífica de enlace a partir de la célula o del cultivo/medio de cultivo. Los huéspedes transformados se pueden cultivar en termentadores y se cultivan de acuerdo con las técnicas conocidas en el campo para lograr el crecimiento celular óptimo. El polipéptido de la invención se puede aislar, entonces, a partir de medio de cultivo, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y purificación de, e.g., los polipéptidos de la invención pueden ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que involucran el uso de los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, e.g., contra un marcador del polipéptido de la invención o como se describe en los ejemplos anexos. Las condiciones para el cultivo de un huésped que permite la expresión son conocidas en el campo por depender del sistema huésped y de sistema de expresión/vector utilizado en tal proceso. Los parámetros que se deben modificar a fin de lograr condiciones que permiten la expresión de un polipéptido recombinante son conocidos en el campo. Por lo tanto, la persona experta en la materia puede determinar las condiciones apropiadas, en ausencia del aporte inventivo adicional. Una vez que se expresó, la molécula biespecífica de enlace de la invención se puede purificar de acuerdo con los procedimientos estándar del campo, que incluyen la precipitación de sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y los semejantes; ver, Scopes, "Protein Purif ication" , Springer-Verlag, N.Y. (1982). Sustancialmente, los polipéptidos puros de por lo menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad se prefieren y los que tienen más del 98 a 99% de homogeneidad son más preferidos, para usos farmacéuticos. Una vez purificadas, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, la molécula biespecífica de enlace de la invención se puede utilizar entonces terapéuticamente (incluyendo extracorporalmente) o en el desarrollo o ejecución de los procedimientos de ensayo. Además, los ejemplos de los métodos para la recuperación de la molécula biespecífica de enlace de la invención a partir de un cultivo se describen en detalle en los ejemplos anexos. Además, la invención proporciona para una composición que comprende una molécula biespecífica de enlace de la invención o una molécula biespecífica de enlace como se produce por medio del proceso expuesto arriba, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector o un huésped de la invención. Dicha composición puede, opcionalmente, también comprender un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de 'activación para las células efectoras inmunes. Más preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica adicional que comprende, opcionalmente, formulaciones apropiadas de vehículo, estabilizadores y/o excipientes. A la luz de la presente invención, dichos "compuestos proteináceos" proporcionan una señal de activación para las células efectoras inmunes pueden ser, e.g., una señal de activación para las células T. Los formatos preferidos de compuestos proteináceos comprenden anticuerpos biespecíficos y fragmentos o derivativos de estos, e.g. scFv biespecífico. Preferentemente, dicha señal de activación para las células T se puede proporcionar por medio del receptor de células T (TCR) , más preferentemente por medio de la molécula CD3 de TCR. Los compuestos proteináceos pueden comprender, pero no están limitados a, scFv' s específicos de CD3, scFv's específicos del receptor de células T o superantígenos . Los superantígenos se unen directamente a ciertas subfamilias de regiones variables del receptor de células T en forma independiente de MHC, con lo que se media así la señal primaria de activación para las células T. El compuesto proteináceo también puede proporcionar una señal de activación de una célula efectora inmune que no es una célula T. Ejemplos de las células efectoras inmunes que no son células T comprenden, entre otros, las células B y células NK. De acuerdo con esta invención, el término
"composición farmacéutica" se relaciona con una composición para la administración a un paciente, preferentemente un paciente humano. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende una composición para administración parenteral, transdérmica, intraluminal, intra arterial, intratecal o por inyección directa dentro del tejido o tumor. Se contempla particularmente que dicha composición farmacéutica se administra a un paciente por medio de infusión o inyección. La administración de composiciones apropiadas pueden ser efectuadas por medio de diferentes vías, e.g., por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La composición farmacéutica de la presente invención puede además comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de los vehículos farmacéuticos apropiados son bien conocidos en el campo e incluyen soluciones salinas amortiguadas de fosfato , agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden tales vehículos se pueden formular por medio de métodos convencionales bien conocidos. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar al sujeto' en una dosis apropiada. El régimen de dosis se determinará al acudir al médico y por los factores clínicos. Como es bien sabido en los campos médicos, las dosis para cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de la superficie corporal, edad, el compuesto particular que se va a administrar, sexo, hora y vía de administración, salud general y otras drogas que se administrarán concurrentemente. En general, el régimen como una administración regular de la composición farmacéutica debería ser en el rango de unidades de 1 µg a 5 g al día. Sin embargo, una dosis más preferida para infusión continua podría estar en el rango de unidades de 0.01 µg a 2 mg, preferentemente 0.01 µg 1 mg, más preferentemente 0.01 µ a 100 µg, aún más preferentemente 0.01 µg a 50 µg y lo más preferentemente 0.01 µg a 10 µg por kilogramo de peso corporal por hora. Las dosis particularmente preferidas se citan aquí, abajo. El progreso se puede monitorear por medio de la evaluación periódica. Las dosis variarán, pero una dosis preferida para administración intravenosa de ADN es desde aproximadamente 106 a 1012 copias de la molécula de ADN. Las composiciones de la invención se pueden administrar localmente o sistemáticamente. La administración generalmente será por vía parenteral, e.g., intravenosa; el ADN también se puede administrar .dirigido al sitio objetivo, e.g., por medio de administración biolística a un sitio objetivo interno o externo o por medio de catéter hasta un sitio en una arteria. Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen solución salina y medio amortiguado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen resurtidores de líquidos y nutrientes, resurtidores de electrolitos (tales como los basados en la dextrosa de Rínger) y los semejantes. Los conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y los semejantes. Además, la composición farmacéutica de la presente invención podría comprender vehículos proteináceos, como e.g., albúmina sérica o inmunoglobulina, preferentemente de origen humano. Se contempla que la composición farmacéutica de la invención podría comprender, además de las moléculas de enlace CD3 proteináceos o moléculas de ácido nucleico o vectores que codifican las mismas (como se describe en esta invención, agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso al que está destinada la composición farmacéutica. Tales agentes podrían ser drogas que actúan sobre el sistema gastrointestinal, drogas que actúan como citostático, drogas que previenen la hiperuricemia, drogas que inhiben las inmunorreacciones (e.g., corticoesteroides) , drogas que actúan sobre el sistema circulatorio y/o agentes tales como moléculas co-estimuladoras de células T o citocinas conocidas en el campo. Posibles indicaciones para la administración de la composición (es) de la invención son enfermedades tumorales, cánceres, especialmente cánceres epiteliales/carcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel no melanótico, cánceres de vías genitourinarias, e.g., cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de cervix y cáncer de riñon, cáncer pulmonar, cáncer gástrico, cáncer del intestino delgado, cáncer hepático, cáncer de páncreas, cáncer de vesícula biliar, cánceres del conducto biliar, cáncer de esófago, cáncer de glándulas salivales y cáncer de la glándula tiroidea u otras enfermedades tumorosas como los tumores hematológicos, melanomas, gliomas, sarcomas, e.g. osteosarcomas . Las indicaciones adicionales para la administración de la composición (es) de la invención son enfermedades proliferativas, enfermedades inflamatorias, trastornos inmunológicos, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades virales, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedades de injerto versus-huésped o enfermedades de huésped-versus-injerto. La composición de la invención como se describe arriba también puede ser una composición diagnóstica que además comprende, opcionalmente, medios y métodos para la detección de enfermedades proliferativas, enfermedades tumorosas, enfermedades inflamatorias, trastornos inmunológicos, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades virales, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedades de injerto-versus-huésped o enfermedades de huésped-versus-injerto.
Las moléculas biespecíficas específicas de enlace de la invención también son apropiadas para su uso en inmunoensayos en los cuales se pueden utilizar en fase líquida o unidas a un vehículo en fase sólida. Ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar el polipéptido de la invención e.g., para propósitos de diagnóstico son inmunoensayos competitivos y no competitivos ya sea en un formato directo o indirecto. Los ejemplos de tales inmunoensayos son él ensayo de in unoabsorción ligado a enzimas (ELISA) , inmunoensayo por enzimas (EIA) , radioinmunoensayo (RÍA) , el ensayo en sandwich (ensayo inmunométrico) , el ensayo de inmunotransferencia dot blot y Western. Los ensayos adicionales, que se pueden utilizar para detectar las moléculas biespecíficas de enlace e.g., en ensayos diagnósticos son ensayos con base en FACS, ensayos citotóxicos (Cr51, liberación de fluorescencia) o ensayos de liberación de colorante. Las' moléculas biespecíficas específicas de enlace de la invención se pueden unir a muchos vehículos diferentes y se utilizan para aislar células unidas específicamente a dichos polipéptidos. Entre los ejemplos de vehículos bien conocidos se incluye vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nilón, amilosas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser ya sea soluble o insoluble, e.g., como granulos, para los propósitos de la invención. Dicha composición diagnóstica se puede enviar en uno o más contenedores que comprenden, opcionalmente (a) amoriguador (es) , soluciones de almacén y/o reactivos residuales o materiales requeridos para la conducción de los propósitos médicos o científicos. Además, las partes de la composición diagnóstica de la invención se pueden empacar individualmente en viales o frascos o en combinación dentro de contenedores o unidades de multicontenedores . Para los técnicos con un conocimiento normal de la
' ateria puede haber muchas marcas y métodos para marcar diferentes. Ejemplos de los tipos de marcas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen enzimas, radiosiótopos, metales coloidales, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes y compuestos bioluminiscentes. En una modalidad más preferida de la presente invención, se contempla el uso de una molécula biespecífica de enlace de la invención o una molécula de enlace producida por medio de un proceso de la invención, de un vector o de un huésped de la invención para la preparación de una composición farmacéutica. Dicha composición farmacéutica se puede emplear en la prevención, tratamiento o mejoría de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumorosa, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedades de injerto-versus-huésped o enfermedades de huésped-versus-inj erto . La invención también se relaciona con un método para la prevención, tratamiento o mejoría de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumorosa, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedad de injerto-versus-huésped o enfermedad de huésped-versus-inj erto. que comprenden la administración de una cantidad efectiva de una molécula biespecífica de enlace de ' la invención o una molécula de enlace producida por medio de un proceso de la invención, de un vector o de un huésped de la invención a un sujeto que necesite de tal prevención, tratamiento o mejoría. Preferentemente, dicho sujeto es un humano. Además se contempla que el método de tratamiento comprende además la administración de una cantidad efectiva de un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunes . Preferentemente, dicho compuesto proteináceo se administra simultáneamente o no simultáneamente con una molécula biespecífica de enlace de la invención o como se produce por medio del proceso de la invención, una molécula de ácido nucleico, un vector o un huésped de la invención. Finalmente, la invención proporciona un equipo que comprende la molécula biespecífica de enlace de la invención o como se produce por medio del proceso de la invención, una molécula de ácido nucleico, un vector o un huésped de la invención. Dicho equipo es particularmente útil en la preparación de la composición' farmacéutica de la presente invención y puede, entre otros, consistir de un contenedor útil para inyecciones o infusiones. Ventajosamente, el equipo de la presente invención además comprende, opcionalmente (a) amortiguador (es) , soluciones de almacén y/o reactivos residuales o materiales requeridos para la conducción de propósitos médicos o científicos. Además, partes del equipo de la invención se pueden empacar individualmente en viales o frascos o en combinación en contenedores o unidades de multicontenedores . El equipo de la presente invención se puede utilizar ventajosamente, entre otros, para llevar a cabo el método de la invención y se podría emplear en una variedad de aplicaciones que se refieren en la presente, e.g., como herramientas de investigación o herramientas médicas. La manufactura de los equipos sigue preferiblemente procedimientos estándar que son del conocimiento de la persona experta en la materia. Estas y otras modalidades son expuestas y las abarca la descripción y ejemplos de la presente invención. Literatura adicional relacionada con alguno de los anticuerpos, métodos, usos y compuestos que se emplearán de acuerdo con la presente invención pueden ser localizar en bibliotecas públicas o bases de datos, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos de "Medline", disponible en la internet, se puede utilizar, por ejemplo bajo http: //www.ncbi . nl . nih. gov/PubMed/medline .html . Bases de datos adicionales y direcciones, tales como http : //www. ncbi . nlm. nih . gov/, http. : //www. infobiogen. fr/, http : //www. mi . chbiology/research tools .html, http : //www. tigr . o g/ , son conocidas a la persona experta en la materia y también se pueden obtener utilizando, e.g., http: //www. lycos . com o http : //www. google . com. Las figuras muestran: Figura 1. A) la secuencia de nucleótidos y de aminoácido de la cadena ligera de anticuerpo anti-CD3 y la cadena pesada (SEQ ID Nos.: 9-12); B) la secuencia de nucleótidos y aminoácido del anticuerpo biespecífico anti-CD19xhum. anti-CD3 (SEQ ID NO.:19, 20); C) la secuencia de nucleótidos y de aminoácido del anticuerpo biespecífico ant-EpCAM (5-10) x hum. anti-CD3 (SEQ ID NO.:35, 36); D) la secuencia de nucleótidos y de aminoácido del anticuerpo biespecífico anti-EpCAM (3-1 x hum. Anti-CD3 (SEQ ID NO.: 33,34).
Figura 2. El análisis FACS de la afinidad de enlace de diferentes construcciones con CD3 y CD19 o EpCAM. El análisis FACS de la unión CD3 se llevó a cabo con células Jurkat CD3 positivas . A) construcción de anticuerpo biespecífico anti-CD19x hum. Anti-CD3 (SEQ ID
NO.:20). Se mostró la unión a CD19 con células Nalmd CD19 positivas.; B) construcción de anticuerpo biespecífico anti- EpCAM (3-l)xhum.anti-CD3 (SEQ ID NO.:34);. Se mostró la unión a EpCAM con células KatoIII EpCAM positivas.; C) la construcción de anticuerpo biespecífico anti-EpCAM (5-10) x hum. anti-CD3 (SEQ ID NO.:36). Se mostró la unión a EpCAM con células KatoIII EpCAM positivas. Un cambio a la derecha muestra la unión. Figura 3: El patrón de elución del anticuerpo biespecífico anti-CD19x hum. anti-CD3 que contiene fracciones de proteína a partir de una columna Zn-Quelante Fractogel®. La alta adsorción a 280 nm a partir de 50-350 ml de tiempo de retención se debió a la proteína no unida en el flujo de la columna. La flecha en la cresta a 617.44 ml indica la construcción biespecífica humanizada que contiene fracción de proteína que se utilizó o que además se purificó. Figura 4 : El patrón de elusión de una columna de filtración en gel Sephadex S20®. La cresta de proteína a 82.42 mol que contiene anticuerpo biespecífico contra anti~CD19xhum. anti-CD3 corresponde a un peso molecular de ca. 52kD. Las fracciones se colectaron a partir de 40-20 mol de tiempo de retención. Figura 5 : A) el análisis SDS-PAGE de fracciones de proteína de anticuerpo biespecífico anti-CD19X hum. anti-CD3. Ruta M: marcador de peso molecular, ruta 1: supernatante de cultivo celular; ruta 2: eluente IMAC; ruta 3: máximo agregado de filtración en gel; ruta 4: anticuerpo biespecífico purificado anti-CD19xhum. anti-CD3; B) Análisis Western de inmunotransferencia de anticuerpo biespecífico purificado anti-CDl9xhum. anti-CD3 Ruta M: marcador de peso molecular, ruta 1: supernatante de cultivo celular; ruta 2: Eluente IMAC; ruta 3: máximo agregado de filtración en gel; ruta 4: anticuerpo biespecífico purificado anti-CD19 x hum. anti-CD3 que se obtuvo de la filtración en gel. Figura 6 : El ensayo de citotoxicidad de anticuerpo biespecífico anti-CD19x hum. anti-CD3 (SEQ ID NO.:20). Las células NALM-6 se utilizaron como células objetivo y Células T CD4 positivas CB15 como células efectoras en una proporción E:T de 1:10.
La invención se describirá ahora por referencia a los siguientes ejemplos biológicos que son meramente ilustrativos y que no se construirán como una limitación de la extensión de la presente invención. Ejemplo 1 Generación de anticuerpo humanizado especifico del antigeno CD3 La localización de las CDRs de 0KT3 de anticuerpo específico CD3 se determinó con referencia a Kabat, EA, et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest . 5a. Edición. 3 vols. .Bethesda, MD: Institutos Nacionales de Salud. Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, 1991:2597. NIH publicación no. 91-3242. Las regiones del sistema humano elegidas para recibir las CDRs transplantadas fueron KOL y REÍ de las cadenas pesada y ligera respectivamente. Las estructuras de estas proteínas se han solucionado cristalográficamente (REÍ: Palm(1975) Hoppe Seylers Z Physiol Chem 356, 167-191, KOL: Schmidt (1983) Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364, 713-747) . Un número de residuos adicionales de múrido se introdujeron dentro de los sistemas de la región variable humana, de acuerdo con Adair 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48. Estos residuos que han sido cambiados son importantes para retener la especificidad del antígeno. Se introdujeron mutaciones adicionales en la CDRl, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera. Las secuencias CDR de OKT humanizado y CD3 humanizado mejorado de la invención se muestran en la Tabla 2. La secuencia de la molécula de enlace CD3 mejorada humanizada se muestra en la Figura 1A; SEQ ID No.9-12. Tabla 2. Las CDRs de la cadena ligera de 0KT3 de anticuerpo específico CD3.
Ejemplo 2 Construcción de un anticuerpo de cadena única biespecifico con parte anti-CD3 Ejemplo 2.1 Construcción de anticuerpos biespec ficos de cadena única anti-CDl9xanti-CD3 con parte humanizada anti-CD3. El ADN que codifica el scFv del anticuerpo humanizado resultante se obtuvo por síntesis génica y después se sujetó a fusión genética con un scFv específico de CD19 para obtener un anticuerpo biespecífico de cadena única (Fig IB, SEQ ID NO.: 19, 20). El anticuerpo biespecífico de cadena única ' se sub-clonó con las enzimas de restricción EcoRI y Salí dentro del vector de expresión de mamífero pEF- DHFR. Ejemplo 2.2 Construcción de anticuerpos biespecíficos de cadena única anti-EpCA xanti-CD3 con parte anti-CD3 humanizada Además de las construcciones biespecíficas descritas en el Ejemplo 1.1 se construyeron dos anticuerpos adicionales biespecíficos de cadena única con diferentes especificidades tumorales. La especificidad CD19 del anti-CDS anti~CD19xhum. biespecífico. se remplazó por dos anticuerpos EpCAM seleccionados 5-10 y 3-1. Por lo tanto, se obtuvieron dos construcciones de anticuerpo de cadena única biespecífica específica de EpCAM anti-EpCAM (5-10) hu . anti-CDS (SEQ ID NO.:35, 36) y anti-EpCAM (3-1) xhum. anti-CD3 (SEQ ID NO. : 33, 34) Ejemplo 3. Expresión de los anticuerpos biespecificos de cadena única con parte anti-CD3 humanizada Las construcciones anti-CD19xhum. anti-CD3 y anti-EpCAMxhum. anti-CD3 (SEQ ID 19, 20, 33, 34, 35, 36) se expresaron por medio de transfección estable dentro de células de ovario de hámster Chino (CHO) con deficiencia DHFR, como lo describe Mack, M. Et al (1995) Proc Nati Acad Sci EUA 92, 7021-7025. La transfección del vector de expresión se llevó a cabo después del tratamiento de las células con fosfato de calcio (Sambrook et al. 1989).
E emplo 4. Análisis FACS de la actividad de enlace de los anticuerpos biespecíficos de cadena única con parte anti-CD3 humanizada A fin de probar la funcionalidad con respecto a la capacidad de enlace, se llevó a cabo un análisis FACS. Ejemplo 4.1 Análisis de flujo de enlace citométrica del anticuerpo biespecífico anti-CDl9xhum. anti-CD3. Se utilizaron células Nalm 6 CD19 positivas
(leucemia precursora de células B humanas) y células Jurkat CD3 positivas (leucemia de- células T humana) . Se incubaron 200,000 células Nalm 6 y '200, 000 células Jurkat con 50 µl de supernatante de cultivo celular puro de células CHO transfectadas con el polipéptido específico anti-CD19xhum. anti-CD3, durante 30 min, sobre hielo. Las células se lavaron dos veces en PBS. Luego la unión de la construcción se detectó por medio de su Marcador Histidina en la C-terminal con un anticuerpo Penta His de múrido (diluido 1:20 en 50 µl de PBS con 2% de FCS; Qiagen) seguido por una etapa de lavado y un anticuerpo específico Fc gamma conjugado con Ficoeritrina (Dianova) , diluido 1:100 en 50 µl de PBS con 2% de FCS (Figura 2A, línea gruesa) . Como control negativo se utilizó medio de cultivo celular fresco en lugar de supernatante de cultivo celular (Figura 2. línea delgada).
Las células se analizaron por citometría de flujo en un FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg) . La tinción FACS y la medición de la intensidad de la fluorescencia se efectuaron como se describe en los Protocolos Actuales en Inmunología (Current Protocols in Immunology) (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y Strober, Wiley-Interscience, 2002). La actividad de enlace de la molécula biespecífica de enlace se comparó con la actividad de enlace del anticuerpo biespecífico de control correspondiente con la parte OKT3 humanizada como se describió en una técnica anterior. Como se muestra en la Fig. 2, tanto OKT3 anti-Cdl9 xhum. como anti-CD3 anti-CD19xhum. (OKT3 hum. mejorado) se unieron bien a CD19 y CD3. Ejemplo 4.2 Análisis de flujo de enlace citométrica del anticuerpo biespecifico anti-CD3 anti-EpCA xhum. Para probar las capacidades de enlace de los anticuerpos biespecíficos EpCAM específicos se repitió el ensayo como se describió en el Ejemplo 4.1 con las siguientes modificaciones: en lugar de células Nalm 6 se utilizaron células Kato III EpCAM positivas (línea celular de carcinoma de estómago; ATCC HTB-103) y se aplicaron los supernatantes de las células CHO transfectadas con anticuerpos EpCAM biespecíficos. Los resultados de los ensayos de enlace EpCAM se muestran en las Figs. 2B y 2C. Se utilizó como control un anticuerpo biespecífico correspondiente con 0KT3 humanizado como se describe en la técnica anterior. Como se muestra en las Figs. 2B y 2C, la construcción biespecífica que comprende anti-CD3 humanizado (SEQ ID Nos. 34, 36) de la invención muestra una unión mucho mejor que las construcciones con 0KT3 humanizado. Ejemplo 5. Purificación de las construcciones biespecíficas con la parte anti-CD3 humanizada mejorada. A fin de purificar el anti-CD3 anti-CD19xhum de construcciones biespecíficas de cadena única se cultivaron células CHO con transfección estable en frascos de rodillo, con medio DMEM de CHO modificado HiClone® (HiQ) durante 7 días antes de la cosecha. Las células se removieron por centrifugación y el supernatante, que contiene la proteína expresada se almacenó a -20° C. Para la cromatografía se utilizó Akta FPLC System® (Pharmacia) y Unicorn Software. Todos los químicos fueron de grado de investigación y se adquirieron en Sigma (Deisenhofen, Alemania) o Merck (Darmstadt, Alemania) . Las proteínas de construcción biespecíficas humanizadas de cadena única se aislaron en un proceso de purificación de dos fases incluyendo cromatografía por afinidad de metal inmovilizado (IMAC) y filtración en gel.- La IMAC (cromatografía por afinidad de metal inmobilizado) se efectuó utilizando una columna Fractogel® (Pharmacia) que se cargó con ZnCI2 de acuerdo con el protocolo de los fabricantes . La columna se equilibró con amortiguador A2 (20 mM de fosfato de sodio pH 7.5, 0.4 M Nací) y el supernatante de cultivo celular (50 ml) se aplicó a la columna (10 ml) con una tasa de flujo de 3 ml/min. La columna se lavó con amortiguador A2 para remover la muestra no unida. La proteína unida se eluyó utilizando un gradiente de amortiguador B2 de dos pasos (20 mM de fosfato de sodio pH 7.5, 0.4 m NaCI, 0.5 M de Imidazol) Paso 1: 20% de amortiguador B2 en volúmenes de lOcolumnas; Paso 2: 100% de amortiguador B2 en volúmenes de 10 columnas. Las fracciones de proteína eluída a partir del paso del 100% se mezclaron para su purificación adicional. (Figura 3). La cromatografía de filtración por gel se efectuó en una columna Sephadex S200 HiPrep® (Pharmacia) equilibrada con PBS (Gibco) . Las muestras de proteína eluída (tasa de flujo Iml (min) se sujetaron a análisis SDS-PAGE y Western de inmunotransferencia para detección. La columna se calibró previamente para la determinación del peso molecular (equipo marcador del peso molecular, Sigma MW (GF-200) . (Fig. 4) . Las concentraciones de proteína de las construcciones purificadas se determinaron utilizando colorante para ensayo de proteína (Micro BCA, Pierce) e IgG (Biorad) como proteína estándar. Las producciones de proteína se muestran en la Tabla 2. Todas las construcciones podrían ser purificadas a partir de supernatantes de cultivo celular. Los rendimientos comparables de proteína purificada se obtuvieron para antí-CD3 anti-CDl9xhum. (16 µg/ml) y OKT3anti-CD19xhum. (13.6 µg/ml). El producto purificado tuvo un peso molecular de 52 kDa bajo condiciones nativas según se determinó por medio de filtración en gel en PBS. El SDS-PAGE de la proteína biespecífica purificada se efectuó en geles preformados de 4-12% Bis Tris
(Invitrogen) . La preparación de muestra y la aplicación fueron de acuerdo con el protocolo del fabricante. El peso molecular se determinó con estándar de proteina MultiMark® (Invitrogen) . El gel se tiñó con Coomassie coloidal (protocolo Invitrogen) mostrando una banda en 52 kDA. Se demostró que pureza de la proteína es >95%. El análisis Western de inmunotransferencia se efectuó con una membrana Optitran Ba-S83® e Invitrogen Blot Module® de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Los anticuerpos utilizados fueron Penta His (Quiagen) y fosfatasa alcalina de cabra anti-ratón (AP) (Sigma) , la solución para tinción fue BCIP/NBT (Sigma) . La proteína biespecífica humanizada se detectó por medio de inmunotransferencia Western mostrando una banda 52kD (Fig. 5B) correspondiente a la proteína biespecífica purificada en el gel SDS coloreado con Coomassie (Fig. 5A) . Ejemplo 6 Bioactividad de anticuerpos biespec ficos con parte anti-CD3 humanizada A fin de certificar la alta actividad citotóxica de los anticuerpos biespecíficos construidos se efectuaron los siguientes ensayos. Ejemplo 6.1 Anticuerpo biespecífico anti-CD3 anti-CD19x hum.
(SEQ ID NO. : 20) Las células objetivo NALM-6 (1.5x107) se marcaron con 10 µM de calceína AM (Sondas Moleculares) durante 30 min a 37° C en medio de cultivo celular. Después de dos lavados en medio de cultivo celular, se contaron y mezclaron las células con células T CB15 CD4-positivas . La mezcla de células objetivo efectoras resultantes contenían 2 xlO5 células Nalm6 y 2 x 106 células CB15 por ml (proporción E:T de 1:10). Los anticuerpos se diluyeron en RPMI/10% de FCS a la concentración requerida. Se añadieron 50µl de esta solución a la suspensión celular y se incubaron a 37° C/5% de C02 durante 2 horas. Después de la reacción citotóxica, el colorante liberado en el medio de incubación se cuantificó en un lector de fluorescencia y se comparó con la señal de fluorescencia de una reacción de control en donde el compuesto citotóxico estaba ausente (control negativo) y una reacción en donde la señal de fluorescencia se determinó en células totalmente lisadas (durante 10 min en 1% de saponina) como control positivo. Sobre la base de estas lecturas, la citotoxicidad específica se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: [Fluorescencia (Muestra) - Fluorescencia (Control)] como control positivo : [Fluorescencia (Lisis Total) - Fluorescencia (Control)] x 100. Las curvas sigmoidales de respuesta a la dosis Tienen típicamente valores R2 >0.97 de acuerdo con las determinaciones que se obtuvieron por Prism - software
(GraphPad Software Inc., San diego, EUA). Los valores EC50 calculados por medio del programa de análisis se utilizaron para la comparación de bioactividad. La citotoxicidad del anticuerpo biespecífico contra CD19 y CD3 con parte CD3 humanizada se muestra en la Figura 6. Un anticuerpo biespecífico correspondiente con un 0KT3 humanizado como se describió en el técnica anterior se utilizó como un control. En el formato biespecífico, el CD3 biespecífico mejorado humanizado (anti~CD3 hum.) (SEQ ID NO. 20) ha incrementado claramente la actividad citotóxica (valor EC50 50 pg/ml) comparado con el 0KT3 humanizado, como se describe en Adair (valor EC50 195 pg/ml) . Por lo tanto, estos resultados demuestran la principal ventaja de la unión del anticuerpo humanizado mejorado con el CD3 de la invención.
Debido al incremento de aproximadamente el cuádruple en la actividad citotóxica del CD3 humanizado mejorado en el formato biespecífico, esta molécula es altamente provechosa para aplicaciones terapéuticas. Basándose en la más fuerte actividad citotóxica se requieren cantidades más bajas de proteína para el tratamiento que las de las moléculas de la técnica anterior. Por lo tanto, cuando se trata a los pacientes las moléculas biespecíficas de la invención proporcionan una importante ventaja sobre los anticuerpos de la técnica anterior, debido a que muestran al mismo tiempo una alta actividad citotóxica y son menos inmunogénicas debido a la humanización. Por lo tanto, ofrecen un avance en el campo médico.
Claims (31)
- REIVINDICACIONES 1. Una molécula biespecífica de enlace, en la cual dicha molécula comprende o consiste de por lo menos dos dominios, (a) en donde uno de dichos por lo menos dos dominios se enlaza específicamente a/interactúa con el complejo
- CD3 humano, en donde dicho dominio comprende una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera derivada de anticuerpo, en donde dicha secuencia de aminoácidos - es (i) una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; (ii) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO.: 1; (iii) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de nucleótidos que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico, según se definió en (ii) bajo condiciones rigurosas; y (iv) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (ii) y (iii) con la condición de que las secuencias de aminoácidos de acuerdo con (i) a (iv) comprenden sustituciones de aminoácido en las regiones CDR de la cadena ligera en las posiciones L24, L54 y L96 de acuerdo con el sistema Kabat; y (b) en donde un segundo dominio es o contiene por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno y/o por lo menos un dominio efector adicional. 2. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 1, en la cual el dominio que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano se caracteriza por tener una serina en la posición L24, una valina en la posición L54 y una leucina en la posición L96.
- 3. la molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región CDR de dicha cadena ligera comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Nos: 4, 6 u 8 o codificada por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID Nos: 3, 5 o 7.
- 4. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el dominio que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano es un scFv.
- 5. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho dominio el cual se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o se codifica por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 9.
- 6. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el dominio que se enlaza a/interactúa con el complejo CD3 humano comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEQ ID NO.: 14 o se codifica por una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 13.
- 7. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho segundo dominio es por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno, específico para una o más molécula (s) de superficie celular.
- 8. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicha una o más molécula (s) de superficie celular es/son molécula (s) específica de tumor.
- 9. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en donde dicho segundo dominio es un scFv adicional.
- 10. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde dicho segundo dominio se enlaza específicamente a/interactúa con un antígeno seleccionado del grupo que consiste de EpCAM, CCR5, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (mucina), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, bhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, GD3 de gangliósido, 9-0-Acetil-GD3, GM2, Globo H, fucosil GMl, Poli SA, GD2, Carboanhidrasa IX (MN/CA IX), CD44v6, Sonic Hedgehog (Shh), Wue-1, Antígeno de Célula Plasmática; (con unión de membrana) IgE, Proteoglicano de Sulfato de Condroitina de Melanoma (MCSP) , CCR8, precursor TNF-alfa, STEAP, mesotelina, Antígeno A33, Antígeno de Célula Germinal de Próstata (PSCA) , desmogleína 4 de Ly-6, neoepítope de E-cadherina, Receptor de Acetilcolina Fetal, CD25, marcador CA19-9, marcador CA-125 y Receptor de Sustancia Inhibidora de Mülleriana (MIS) tipo II, sTn (antígeno Tn sialilado; TAG-72) , FAP (antígeno de activación de fibroblasto), endosialina, EGFRvIII, L6, SAS, CD63, antígeno-TF, antígeno Cora, CD7, CD22, Iga; Igß, gplOO, MT-MMPs, antígeno-Fl9 y CO-2'9.
- 11. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho segundo dominio comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO: 16 o 18; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO. : 15 o 17; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico, según se definió en (b) bajo condiciones de hibridación rigurosas; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c)
- 12. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha molécula comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de : (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO: 20; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO. : 21; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico, según se definió en (b) bajo condiciones de hibridación rigurosas; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c)
- 13. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 10, en donde dicho segundo dominio comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de: (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO: 22, 24, 26, 28, 30, 32; (b) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO.: 21, 23, 25, 27, 29, 31; .(c) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que se híbrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico, según se definió en (b) bajo condiciones de hibridación rigurosas; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c)
- 14. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicha molécula comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de : (a) una secuencia de aminoácidos que corresponde a la SEQ ID NO: 34, 36 (b) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la SEQ ID NO. : 33, 35; (c) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de ácido nucleico, según se definió en (b) bajo condiciones de hibridación rigurosas; y (d) una secuencia de aminoácidos codificada por medio de una secuencia de ácido nucleico la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (b) y (c)
- 15. La molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 11 o 13, en donde dicho por lo menos un sitio adicional de interacción del antígeno se humaniza.
- 16. Una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15.
- 17. la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 comprende una secuencia de nucléotido seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucléotido que codifica la forma madura de una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo de las SEQ ID NOs: 20, 34, 36; (b) una secuencia de nucléotido que comprende o consiste de una secuencia de ADN seleccionada del grupo de la SEQ ID NO. : 19, 33, 35; (c) una secuencia de nucléotido que se hibrida con la cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos según se definió en (b) bajo condiciones de hibridación rigurosas; (d) una secuencia de nucléotido que codifica una proteína derivada de la proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de (a) o . (b) por medio de sustitución, supresión y/o adición de uno o varios aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por medio de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b) ; (e) una secuencia de nucléotido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos por lo menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos codificada por medio de la secuencia de nucleótidos de (a) o (b); (f) una secuencia de nucleótidos la cual se degenera como resultado del código genético a una secuencia de nucleótidos de cualquiera de (a) a (e) .
- 18. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16 o 17.
- 19. El vector de la reivindicación 18, el cual comprende además una secuencia de ácido nucleico la cual es una secuencia reguladora unida operablemente a dicha secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 16 o 17.
- 20. El vector de la reivindicación 18 o 19, en donde el vector es un vector de expresión.
- 21. Un huésped transformado o transfectado con un vector, de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20.
- 22. Un proceso para la producción de una molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, dicho proceso comprende el cultivo de un huésped de la reivindicación 21 bajo condiciones que permiten la expresión de la molécula biespecífica de enlace y recuperación de la molécula biespecífica de enlace producida a partir del cultivo.
- 23. Una composición que comprende una molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o como se produjo por el proceso de la reivindicación 22, una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o 17, un vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o un huésped de la reivindicación 21 y, opcionalmente, un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunes .
- 24. La composición de la reivindicación 23 la cual es una composición farmacéutica que comprende además formulaciones apropiadas de vehículos, estabilizadores y/o excipientes .
- 25. la composición de la reivindicación 23, la cual es una composición diagnóstica que comprende además medios y métodos para la detección de enfermedades proliferativas, enfermedades tumorosas, enfermedades inflamatorias, trastornos inmunológicos, enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, enfermedades virales, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedades de injerto-versus-huésped o enfermedades de huésped-versus-injerto. -
- 26. El uso de la molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de 'las reivindicaciones 1 a 15 o según se produzca por medio del proceso de la reivindicación 22, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o 17, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o el huésped de la reivindicación 21 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, tratamiento o mejoría de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumorosa, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, una enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedades de injerto-versus- huésped o enfermedad de huésped-versus-injerto.
- 27. Un método para la prevención, tratamiento o mejoría de una enfermedad proliferativa, una enfermedad tumorosa, una enfermedad inflamatoria, un trastorno inmunológico, una enfermedad autoinmune, una enfermedad infecciosa, enfermedad viral, reacciones alérgicas, reacciones parasíticas, enfermedades de injerto-versus-huésped o enfermedades de huésped-versus-injerto en un sujeto que necesite de esto, dicho método comprende la etapa de administración de una cantidad efectiva de la molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o según se produjo por medio del proceso de la reivindicación 22, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o 17, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o el huésped de l reivindicación 21.
- 28. El método de la reivindicación 27, en donde dicho sujeto es un humano.
- 29. El método de la reivindicación 27 o 28 que comprende además la administración de un compuesto proteináceo capaz de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunes.
- 30. El método de la reivindicación 29, en donde dicho compuesto proteináceo se administra simultáneamente o no simultáneamente con la molécula biespecífica de enlace, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o según se produjo por medio del proceso de la reivindicación 22, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o 17, el vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o el huésped de la reivindicación 21.
- 31. Un equipo que comprende la molécula biespecífica de enlace de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o según se produjo por medio del proceso de la reivindicación 22, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 16 o IX el vector de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 o el huésped de la reivindicación 21.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP04003445 | 2004-02-16 | ||
PCT/EP2005/001573 WO2005077982A1 (en) | 2004-02-16 | 2005-02-16 | Less immunogenic binding molecules |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
MXPA06009253A true MXPA06009253A (es) | 2007-04-18 |
Family
ID=34854553
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
MXPA06009253A MXPA06009253A (es) | 2004-02-16 | 2005-02-16 | Moleculas de enlace menos inmunogenicas. |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8101722B2 (es) |
EP (1) | EP1716178B1 (es) |
JP (1) | JP4762158B2 (es) |
KR (1) | KR20060131892A (es) |
CN (1) | CN1950399A (es) |
AT (1) | ATE477277T1 (es) |
AU (1) | AU2005212830B2 (es) |
BR (1) | BRPI0507649A (es) |
CA (1) | CA2555503C (es) |
DE (1) | DE602005022830D1 (es) |
DK (1) | DK1716178T3 (es) |
IL (1) | IL177337A0 (es) |
MX (1) | MXPA06009253A (es) |
RU (1) | RU2006132669A (es) |
SI (1) | SI1716178T1 (es) |
WO (1) | WO2005077982A1 (es) |
ZA (1) | ZA200606410B (es) |
Families Citing this family (53)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6136311A (en) | 1996-05-06 | 2000-10-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of cancer |
US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
AU2005249396B2 (en) * | 2004-05-05 | 2011-10-20 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Bispecific binding agents for modulating biological activity |
UA97469C2 (uk) | 2005-07-25 | 2012-02-27 | Емерджент Продакт Дівелопмент Сіетл, Елелсі | Гуманізована специфічна до cd37 зв'язувальна молекула імуноглобуліну |
CA2625440C (en) * | 2005-10-11 | 2023-06-13 | Micromet Ag | Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof |
ATE509033T1 (de) | 2006-03-20 | 2011-05-15 | Univ California | Manipulierte anti-prostatastammzellenantigen (psca)-antikörper für krebs-targeting |
SG172698A1 (en) | 2006-06-12 | 2011-07-28 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Single-chain multivalent binding proteins with effector function |
MX2009010611A (es) * | 2007-04-03 | 2010-03-26 | Micromet Ag | Enlazadores biespecificos, especificos para especies. |
CA2698343C (en) | 2007-09-04 | 2018-06-12 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection |
RS51975B (en) | 2008-04-11 | 2012-02-29 | Emergent Product Development Seattle Llc. | CD37 IMMUNOTHERAPEUTIC PRODUCT AND ITS COMBINATION WITH BIFUNCTIONAL CHEMOTHERAPEUTIC AGENTS |
US20100047164A1 (en) * | 2008-04-11 | 2010-02-25 | Duke University | Anti-Tumor Antibodies |
BRPI0919841A2 (pt) * | 2008-10-01 | 2014-11-18 | Micromet Ag | Anticorpo de cadeia unica biespecifico de psmaxcd3, especifico de especies cruzadas |
MX338038B (es) * | 2008-10-01 | 2016-03-30 | Amgen Res Munich Gmbh | Anticuerpo de una sola cadena bis-especifico de pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinaxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 o fapalfaxcd3 de especies cruzadas. |
ES2712732T3 (es) | 2009-02-17 | 2019-05-14 | Cornell Res Foundation Inc | Métodos y kits para el diagnóstico de cáncer y la predicción de valor terapéutico |
EP3511023A1 (en) | 2009-12-02 | 2019-07-17 | Imaginab, Inc. | J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use |
SG189929A1 (en) * | 2010-10-29 | 2013-06-28 | Immunogen Inc | Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof |
US9249217B2 (en) | 2010-12-03 | 2016-02-02 | Secretary, DHHS | Bispecific EGFRvIII x CD3 antibody engaging molecules |
CN103687872A (zh) | 2011-04-22 | 2014-03-26 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | 前列腺特异性膜抗原结合蛋白和相关组合物以及方法 |
CN102898527B (zh) * | 2011-07-25 | 2016-12-21 | 三星电子株式会社 | 融合蛋白、药物组合物及预防或治疗癌症的方法 |
CN102337298B (zh) * | 2011-08-19 | 2013-11-06 | 黄开红 | 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用 |
TWI679212B (zh) * | 2011-11-15 | 2019-12-11 | 美商安進股份有限公司 | 針對bcma之e3以及cd3的結合分子 |
EP2780040A1 (en) | 2011-11-16 | 2014-09-24 | Amgen Inc. | Methods of treating epidermal growth factor deletion mutant viii related disorders |
KR20150004856A (ko) | 2012-04-20 | 2015-01-13 | 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 | Cd3 결합 폴리펩타이드 |
CN104822704B (zh) * | 2012-06-14 | 2020-02-14 | 医疗生物科学有限公司 | 针对分化簇3(cd3)的人源化的抗体 |
WO2014004549A2 (en) | 2012-06-27 | 2014-01-03 | Amgen Inc. | Anti-mesothelin binding proteins |
US9382329B2 (en) | 2012-08-14 | 2016-07-05 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to Trop-2 expressing cells |
MY181648A (en) | 2012-08-24 | 2020-12-30 | Univ California | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis |
EP3107577B1 (en) * | 2014-02-21 | 2024-03-20 | IBC Pharmaceuticals, Inc. | Disease therapy by inducing immune response to trop-2 expressing cells |
US9212225B1 (en) | 2014-07-01 | 2015-12-15 | Amphivena Therapeutics, Inc. | Bispecific CD33 and CD3 binding proteins |
EP2982693A1 (en) | 2014-08-07 | 2016-02-10 | Affimed Therapeutics AG | CD3 binding domain |
US20170058043A1 (en) * | 2014-12-06 | 2017-03-02 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Bispecific antibody for cancer immunotherapy |
KR102654033B1 (ko) * | 2014-12-08 | 2024-04-02 | 1글로브 바이오메디칼 씨오., 엘티디. | 가용성 유니버셜 adcc 증강 합성 융합 유전자 및 펩티드 기술 및 그 용도 |
CN107406515B (zh) * | 2014-12-18 | 2022-11-04 | 生物梅里埃公司 | 合成的双表位化合物 |
CN113968915A (zh) * | 2015-01-26 | 2022-01-25 | 塞勒克提斯公司 | 用于分选/清除工程化的免疫细胞的mAb驱动的嵌合抗原受体系统 |
MX2017010795A (es) | 2015-02-24 | 2018-04-11 | Bioatla Llc | Proteínas biológicas condicionalmente activas. |
US10738118B2 (en) | 2015-05-29 | 2020-08-11 | Amphivena Therapeutics, Inc. | Methods of using bispecific CD33 and CD3 binding proteins |
CN104892765B (zh) * | 2015-06-29 | 2018-04-10 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种抗CD3抗原和Her‑2抗原的双特异性抗体 |
EP3331564A4 (en) | 2015-08-07 | 2019-05-22 | Imaginab, Inc. | AGAINST MOLECULE TREATED ANTIGEN-BONDING CONSTRUCTS |
UA126278C2 (uk) | 2015-09-21 | 2022-09-14 | Аптево Рісьорч Енд Девелопмент Ллс | Поліпептиди, які зв'язують cd3 |
CN109503721B (zh) * | 2016-05-31 | 2023-03-07 | 上海恒润达生生物科技股份有限公司 | 靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途 |
CN106084044A (zh) * | 2016-06-24 | 2016-11-09 | 安徽未名细胞治疗有限公司 | 一种人鼠嵌合抗MESO的全分子IgG抗体及其应用 |
WO2018005519A2 (en) | 2016-06-27 | 2018-01-04 | The Regents Of The University Of California | Cancer treatment combinations |
CN107556388A (zh) * | 2016-06-30 | 2018-01-09 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 抗CD44v6和CD3特异性双靶向抗体、含该双靶向抗体表达盒的微环DNA及应用 |
WO2018147960A1 (en) | 2017-02-08 | 2018-08-16 | Imaginab, Inc. | Extension sequences for diabodies |
KR20240023449A (ko) | 2017-02-08 | 2024-02-21 | 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. | 천연 킬러 세포의 활성화를 위한 다중-특이적 결합 단백질 및 암 치료에서의 그의 치료적 용도 |
US11884732B2 (en) | 2017-02-20 | 2024-01-30 | Dragonfly Therapeutics, Inc. | Proteins binding HER2, NKG2D and CD16 |
JP2020517591A (ja) * | 2017-04-24 | 2020-06-18 | メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター | 抗cd33抗体剤 |
TWI728250B (zh) | 2017-06-21 | 2021-05-21 | 美商基利科學股份有限公司 | 靶向hiv gp120及cd3之多特異性抗體 |
MX2020008336A (es) | 2018-02-08 | 2020-09-21 | Dragonfly Therapeutics Inc | Dominios variables de anticuerpos que se dirigen al receptor nkg2d. |
CN110042127A (zh) * | 2019-04-23 | 2019-07-23 | 北京市心肺血管疾病研究所 | 向心肌细胞递送目标核酸分子的制剂、其制备方法及应用 |
US11434291B2 (en) | 2019-05-14 | 2022-09-06 | Provention Bio, Inc. | Methods and compositions for preventing type 1 diabetes |
CA3182445A1 (en) | 2020-06-11 | 2021-12-16 | Francisco Leon | Methods and compositions for preventing type 1 diabetes |
EP4247850A1 (en) | 2020-11-20 | 2023-09-27 | Simcere Innovation, Inc. | Armed dual car-t compositions and methods for cancer immunotherapy |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US6129914A (en) * | 1992-03-27 | 2000-10-10 | Protein Design Labs, Inc. | Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line |
US5885573A (en) * | 1993-06-01 | 1999-03-23 | Arch Development Corporation | Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies |
AU7467898A (en) * | 1997-04-21 | 1998-11-13 | Arch Development Corporation | Fc receptor non-binding anti-cd3 monoclonal antibodies deliver a partial cr signal and induce clonal anergy |
IL138857A0 (en) | 1998-04-21 | 2001-10-31 | Micromet Ges For Biomedizinisc | Cd19xcd3 specific polypeptides and uses thereof |
JP3803790B2 (ja) * | 2003-02-17 | 2006-08-02 | 株式会社東北テクノアーチ | 新規なダイアボディ型二重特異性抗体 |
US7635472B2 (en) * | 2003-05-31 | 2009-12-22 | Micromet Ag | Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders |
WO2004106383A1 (en) | 2003-05-31 | 2004-12-09 | Micromet Ag | Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for epcam |
-
2005
- 2005-02-16 US US10/588,734 patent/US8101722B2/en active Active
- 2005-02-16 DE DE602005022830T patent/DE602005022830D1/de active Active
- 2005-02-16 ZA ZA200606410A patent/ZA200606410B/en unknown
- 2005-02-16 AT AT05715354T patent/ATE477277T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-02-16 BR BRPI0507649-8A patent/BRPI0507649A/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-02-16 CA CA2555503A patent/CA2555503C/en active Active
- 2005-02-16 RU RU2006132669/13A patent/RU2006132669A/ru not_active Application Discontinuation
- 2005-02-16 CN CNA200580008594XA patent/CN1950399A/zh active Pending
- 2005-02-16 MX MXPA06009253A patent/MXPA06009253A/es unknown
- 2005-02-16 WO PCT/EP2005/001573 patent/WO2005077982A1/en active Application Filing
- 2005-02-16 AU AU2005212830A patent/AU2005212830B2/en active Active
- 2005-02-16 SI SI200531118T patent/SI1716178T1/sl unknown
- 2005-02-16 DK DK05715354.6T patent/DK1716178T3/da active
- 2005-02-16 JP JP2006552576A patent/JP4762158B2/ja active Active
- 2005-02-16 KR KR1020067018976A patent/KR20060131892A/ko not_active Application Discontinuation
- 2005-02-16 EP EP05715354A patent/EP1716178B1/en active Active
-
2006
- 2006-08-07 IL IL177337A patent/IL177337A0/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2005212830B2 (en) | 2011-06-02 |
SI1716178T1 (sl) | 2010-11-30 |
JP4762158B2 (ja) | 2011-08-31 |
US20080213256A1 (en) | 2008-09-04 |
CN1950399A (zh) | 2007-04-18 |
IL177337A0 (en) | 2006-12-10 |
EP1716178B1 (en) | 2010-08-11 |
CA2555503A1 (en) | 2005-08-25 |
CA2555503C (en) | 2018-03-27 |
DE602005022830D1 (de) | 2010-09-23 |
ATE477277T1 (de) | 2010-08-15 |
US8101722B2 (en) | 2012-01-24 |
BRPI0507649A (pt) | 2007-07-10 |
RU2006132669A (ru) | 2008-03-27 |
WO2005077982A1 (en) | 2005-08-25 |
JP2008506353A (ja) | 2008-03-06 |
ZA200606410B (en) | 2007-12-27 |
EP1716178A1 (en) | 2006-11-02 |
KR20060131892A (ko) | 2006-12-20 |
DK1716178T3 (da) | 2010-09-20 |
AU2005212830A1 (en) | 2005-08-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1716178B1 (en) | Less immunogenic binding molecules | |
AU2004283850B2 (en) | Multispecific deimmunized CD3-binders | |
AU2004242847B2 (en) | Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for EpCAM | |
US7635472B2 (en) | Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders | |
ZA200508279B (en) | Pharmaceutical composition comprising a bispecific antibody for epcam |