KR20060131892A - 덜 면역원성인 결합 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 이중특이적(bispecific) 결합 분자를 제공하며, 여기서 상기 분자는 적어도 두 도메인을 포함하거나 구성되며, 그에 따라 상기 적어도 두 도메인 중 하나는 특이적으로 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하고 상기 도메인은 항체 유래 경쇄(light chain)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 특정 아미노산 치환을 포함하는 특별히 식별된(identified) 아미노산이고, 제2 도메인은 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소 및/또는 적어도 하나의 추가적인 작동 도메인(effector domain)이거나 또는 이들을 함유한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환(transformed)되거나 또는 형질변환된(transfected) 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 제조 방법 및 본 발명의 이중특이적 결합 분자, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이중특이적(bispecific) 결합 분자를 제공하며, 여기서 상기 분자는 적어도 두 도메인을 포함하거나 구성되며, 그에 따라 상기 적어도 두 도메인 중 하나는 특이적으로 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하고 상기 도메인은 항체 유래 경쇄(light chain)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 특정 아미노산 치환을 포함하는 특별히 식별된(identified) 아미노산이고, 제2 도메인은 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소 및/또는 적어도 하나의 추가적인 작동 도메인(effector domain)이거나 또는 이들을 함유한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환(transformed)되거나 또는 형질변환된(transfected) 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 제조 방법 및 본 발명의 이중특이적 결합 분자, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
몇몇 문헌이 본 명세서의 내용 전반에 인용된다. 여기에 인용된(제조자의 사 양서, 지시사항 등을 포함함) 상기 문헌의 각각은 여기서 참고로 도입된다.
유전 공학의 발달 때문에, 면역 치료는 많은 심각한 질환, 예를 들어 종양성 질환을 치료하는데 사용되고 있다. 그러나, 비-인간 기원으로부터 유래된 항체의 사용은 인간에 대한 치료 요법의 일부로서 사용될 때 다양한 문제점을 가져온다.
첫째로, 비-인간 기원의 항체는 "사이토킨 방출 증후군(CRS)"을 일으킬 수 있다. CRS는 항-CD3 항체의 최초 몇 번의 투여 후 관찰되어 온 임상 증후군이며, CD3에 대해 지시된 많은 항체들이 분열을 촉진한다는 사실과 관련되어 있다. 시험관 내에서, CD3에 대해 지시된 분열촉진 항체들은 T-세포 증식 및 사이토킨 생산을 유도한다. 생체 내에서 이러한 분열 촉진 활성은 항체의 최초 주입 후 초기 시간 내에, 다수의 T-세포-유래의 사이토킨들을 포함하여, 사이토킨들의 대량 방출을 가져온다. CD3-특이적 항체들의 분열 촉진 능력은 단핵세포/대식세포 의존적이며, 이들 세포들에 의한 IL-6 및 IL-1β의 생산과 관련되어 있다. CRS 증후군은 빈번하게 보고된 가벼운 "독감-유사"증후군에서부터 덜 보고된 심각한 "쇼크-유사" 반응(이것은 심장혈관계 및 중추신경계 증상을 포함한다)까지 범위가 넓다. 증후군은 특히 두통, 떨림, 구역/구토, 설사, 복통, 권태감 및 근육/관절의 아픔과 통증, 일반화된 허약(generalized weakness), 심폐 고장(cardiorespiratory events) 뿐 아니라, 신경-정신학적 고장(neuro-psychiatric events)을 포함한다. 심각한 폐부종이 수액 과부하(fluid overload)를 가진 환자들 및 수액 과부하를 가지지 않은 것으로 보이는 환자들에게서 발생하였다. (Chatenoud, 2003 Nat. Rev. Immunol. 3:123-132)
두 번째로, 마우스 항체는 인간 항-마우스 항체(HAMAs;human anti-murine antibody)에 의해 인식되어 체액 면역 반응에 의해 적정약물 투여량(therapeutic window)의 범위를 좁게 만든다(Schroff (1985) Cancer Res.45:879-885, Shawler (1985) J. Immunol. 135:1530-1535). HAMAs는 마우스 항체로 치료하는 2주차에 전형적으로 발생하고, 그들의 의도된 표적에 결합하는 것을 차단하여 마우스 항체들을 중화한다. HAMA 반응은 마우스의 불변(constant)("Fc") 항체 영역들 또는/및 마우스의 가변("V") 영역들의 속성에 의존할 수 있다. 이러한 숙주 반응은 항체의 약동학적 프로필을 극적으로 변경하여, 항체의 급속한 제거를 가져오고 반복된 투여량을 방해한다(Reff, 2002 Cancer Control 9:152-166).
키메라화(chimerization), 완전한 인간 V-영역(V-region)의 제공, 탈면역화(deimmunization) 및 인간화(humanization)의 네 가지 기본적인 항체 전략이 치료적 항체의 면역원성을 다루는 데 채택되어 왔다. 키메라 항체에서, 불변 영역은 면역원성에 대한 중요한 요소에 기여한다는 사실을 근거로 마우스의 불변 영역은 인간의 불변 영역으로 치환된다. 완전한 인간 V-영역을 생성하기 위한 두 가지 접근 이 있으며: 이는 파지 라이브러리(phage library)로부터 인간 항체 V-영역을 선택하는 것과, 마우스의 면역글로불린 유전자가 인간 면역글로불린 유전자로 치환된 유전자삽입(transgenic) 마우스를 제공하는 것이다. 탈면역화에서는, 특이적 면역원성 펩티드가 특정 알고리즘에 따라 감소된 면역원성을 갖거나 또는 면역원성이 없는 펩티드로 변화된다.
일반적으로, 인간화는 비-인간 항체 골격(framework) 서열의 대응하는 인간 서열에 대한 다양한 영역에서의 치환을 수반하며, CDR-이식이 그 예이다. 선행 기술은 항체를 인간화하는 몇 가지 접근을 기재하고 있다. 이러한 방법 중 하나는 외래의 골격으로 CDR의 이식이며, 여기서 한 종으로부터의 CDR들은 인간의 골격으로 이식된다(EP 239400). 그러나, 상기와 같이 인간화된 항체들은 종종 불충분한 결합 친화성의 문제점들을 갖는다(Riechmann, 1988, Nature 332:323-327). 이것은 인간의 골격으로 추가의 돌연변이(mutation)를 도입하여 전술한 접근을 변형함에 의해 극복될 수 있다. 상기 방법이 사용되어 온 예들은 EP469167, EP 971959, EP 940468에 기재되어 있다. 항체를 인간화하기 위한 다른 접근은, 파지 디스플레이(phage display)에 의한 인간화(US 5,565,322) 및 리서페이싱/베니어링(resurfacing/veneering)에 의한 인간화가 있으며, 여기서 항체의 표면 노출된 아미노산이 식별되고 인간의 골격과 유사하거나 동일한 아미노산으로 치환된다(예를 들어. EP 519596, EP 592106 참조).
인간 CD3는 다분자 T-세포 복합체의 일부로서 T-세포 상에 발현되는 항원을 나타내고, 세 개의 상이한 체인들인 CD3-ε, CD3-δ 및 CD3-γ로 구성된다. 예를 들면, 고정화된 항-CD3 항체들에 의한 T-세포 상의 CD3의 군집 형성(Clustering)은, T-세포 수용체의 진입 기전(engagement)과 유사하지만 클론-전형적인 특이성과 무관한 T-세포 활성을 가져온다(WO 99/54440 또는 Hoffman (1985) J. Immunol. 135:5-8 참조).
CD3 항원을 특이적으로 인식하는 항체들은 선행 기술, 예를 들면, Traunecker, EMBO J 10 (1991), 3655-9 및 Kipriyanov, Int.J. Cancer 77 (1998), 763-772 에 기재되어 있다. 최근에, 다양한 질환의 치료에, CD3에 대해 지시되는 항체들이 제안되어 오고 있다. 이러한 항체들 또는 항체 구조체들은, 유럽특허 1 025 854에 기재된 바와 같이, T-세포 제거제(depleting agent) 또는 분열촉진제(mitogenic agent)로서 작용한다. 인간 CD3 항원 복합체에 특이적으로 결합하는 인간/설치류 하이브리드 항체들은 WO 00/05268에 기재되어 있고, 예를 들어 신장 이식, 감염(septic) 및 심장 동종이식(cardiac allografts)에 수반하는 거부 반응 치료용 면역억제제로 제안되었다. WO 03/04648는 CD3 및 난소암 항원에 대해 지시된 이중특이적 항체를 기술하고 있다. 또한, Kufer (1997) Cancer Immunol Immunother 45:193-7 는 미세 잔류 암(minimal residual cancer) 치료용의 CD3 및 EpCAM에 특이적인 이중특이적 항체에 관한 것이다.
CD3에 결합하는 항체를 인간화하기 위한 몇 가지 시도들이 수행되어 왔다. US 5,929,212, US 5,859,205, WO 91/09968, WO 91/09967 및 Adair, 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48은 마우스 항-인간 CD3 단일클론 항체 OKT3에 대한 인간화 방법을 기재하고 있고, 여기서 마우스(공급자) CDRs은 인간(수용자) 골격으로 이식되며 또한 공급자의 아미노산 잔기들은 골격 내로 도입된다. US 6,407,213 및 WO 92/22653는 인간화된 UCHT1 항체를 기재하고 있으며, 여기서 마우스 모 항체(parent antibody)에 필적하는 항원-결합 친화성 및 생물학적 특성을 달성하기 위해 필요한 최소한의 수의 마우스 CDR 및 FR 잔기가 일치하는 인간의 가변 도메인 서열의 컨텍스트(context)에 도입된다. 인간화된 CD3 항체의 추가적인 예들은 EP 0626390 (OKT3), US 5,885,573 (OKT3), US 5,834,597 (OKT3), US 5,585,097 (YTH 12.5) 및 US2002131968 (YTH 12.5)를 들 수 있다.
그러나, 이중특이적 결합 분자의 형태에 있는 OKT3으로부터 유래된 인간화된 항체 구조체들은 CD3와 결합/상호작용을 통해 신호를 유도하는 능력과 같은 특이적 활성이 감소되는 것이 관찰되었다.
따라서, 본 발명의 기술적 과제는 부작용의 감소와 함께 인간의 질환의 치료에 유용한 매우 효율적인 항체-유래의 화합물을 제공하기 위한 수단 및 방법을 제 공하는 것이다. 특히, 부작용의 감소가 목표이며, 여기서 상기 부작용은 화합물의 면역원성에 의해 유도되고 화합물의 활성의 감소를 가져온다.
상기 기술적 과제의 해결은 특허청구범위에 기재된 실시형태를 제공함에 의해 달성된다.
따라서, 본 발명은 이중특이적 결합 분자에 관한 것이며, 여기서 상기 분자는 적어도 두 도메인을 포함하거나 두 도메인으로 구성되고,
(a) 여기서 상기 두 도메인의 적어도 하나는 특이적으로 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하고, 여기서 상기 도메인은 항체 유래 경쇄(light chain)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 서열은
(i) 서열식별번호 2의 아미노산 서열;
(ii) 서열식별번호 1에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열;
(iii) 엄격한 조건 하에서 (ii)에서 정의된 바와 같은 핵산 서열의 상보성 가닥(complementary strand)과 하이브리드하는(hybridizing) 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및
(iv) (ii) 및 (iii) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로 디제너레이트된(degenerated) 핵산 서열로 인코드된 아미노산 서열이며,
단, (i) 내지 (iv)에 따른 아미노산 서열은 Kabat 시스템에 따른 L24, L54 및 L96의 위치에서 경쇄의 CDR 영역에 있는 아미노산 치환체를 포함하고; 또한
(b) 여기서 제2 도메인은 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소 및/또는 적어도 하나의 추가적인 작동 도메인(effector domain)이거나 또는 이들을 함유한다.
본 발명의 내용에 사용된 "~에 결합/~와 상호작용"이라는 용어는 적어도 두 개의 "항원-상호작용-장소"가 서로 결합/상호작용하는 것을 정의한다. 본 발명에 따른, "항원-상호작용-장소"는 특정 항원 또는 특정 항원군과 특이적으로 상호작용하는 능력을 보이는 폴리펩티드의 모티프(motif)를 정의한다. 상기 결합/상호작용은 또한 "특이적 인식"을 정의하는 것으로 이해된다. "특이적으로 인식함"이란 용어는 본 발명에 따르면, 여기서 정의된 각각의 인간 표적 분자들의 적어도 두 개의 아미노산에 항체분자가 특이적으로 상호작용 및/또는 결합할 수 있는 것을 의미한다. 항체들은, 동일한 표적분자 상의 다른 에피토프들을 인식, 상호작용 및/또는 결합할 수 있다. 상기 용어는 항체 분자의 특이성에 관한 것이며, 즉, 여기서 정의된 인간 표적 분자의 특정 영역들을 분별하는 능력에 관한 것이다. 항원-상호작용-장소의 특정 항원과의 특이적 상호작용은, 예를 들어 항원의 구조의 변화, 항원의 올리고머화(oligomerization) 등의 유도에 기인하여, 신호의 개시를 가져올 수 있다. 따라서, 항원-상호작용-장소의 아미노산 서열에 있는 특이적 모티프는 그들의 1차, 2차 또는 3차 구조의 결과뿐 아니라 상기 구조의 2차 변형의 결과이다.
본 발명에서 사용된 "특이적 상호작용"이란 용어는, 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 CD3 특이적 도메인이 유사한 구조체들의 (폴리)펩티드들과 상호-작용하지 않거나, 또는 본질적으로 상호-작용하지 않음을 정의하는 것으로 이해된다. 조사 중인 결합 분자의 패널의 상호작용은 예를 들어, 종래의 조건 하에서(예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 and Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999. 참조) 관심 있는 (폴리)펩티드뿐만 아니라 다수의 더 또는 덜(구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련된 (폴리)펩티드에 대한 단일-쇄 결합 분자의 상기 패널의 결합을 측정함에 의해 테스트할 수 있다. 이러한 방법들은 특히, 구조적 및/또는 기능적으로 밀접하게 관련된 분자들의 결합 연구분야, 차단 및 경쟁 연구분야를 포함할 수 있다. 이러한 결합 연구분야들은 또한 FACS 분석, 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR, 예를 들면, BIAcore®로), 분석적 초원심분리, 등온 적정 열량측정법, 형광 비등방성, 형광 분광법 또는 방사성 표지 리간드 결합 분석을 포함한다. 그에 따라, 항원-상호작용-장소의 특이적 항원에 대한 특이적 상호작용의 예들은 그 수용체에 대한 리간드의 특이성을 포함할 수 있다. 상기 정의는 특히 그 특이적 수용체에 결합 즉시 신호를 유도하는 리간드들의 상호작용을 포함한다. 대응하는 리간드들의 예들로는 그 특이적 사이토킨-수용체들과 상호작용/결합하는 사이토킨들을 포함한다. 또한 특히 상기 정의에 포함되는, 상기 상호작용의 또다른 예는 항체의 항원 결합 부위와 항원 결정인자(에피토프)의 상호작용이다. 상기 상호작용은 또한 항체의 항원 결합 부위가 유사한 구조의 다른 에피토프들과는 상호-반응성이 없거나 또는 본질적으로 상호-반응성이 없음을 특징으로 한다.
용어 "결합/상호작용"의 정의는 결합 도메인이 선형 에피토프와 결합/상호작용하는 것뿐만 아니라, 또한 구조적 에피토프 또는 불연속 에피토프로 지시될 수 있는 입체형체(conformational) 에피토프와 결합/상호작용하는 것을 포함하는 것으로 이해된다. 대응하는 에피토프의 정의는 기술분야에서 공지이다. 상기 에피토프는 예를 들어 인간 표적 분자 또는 그 일부의 두 영역으로 구성될 수 있다. 본 발명에서, 입체형체 에피토프는 폴리펩티드가 원래의 단백질로 접히는(folded) 경우에 분자의 표면상에서 만나는 일차 서열에서 분리된 두 개 이상의 불연속(discrete) 아미노산 서열로 정의된다 (Sela, (1969) Science 166, 1365 및 Laver, (1990) Cell 61, 553-6).
용어 "불연속 에피토프"는 본 발명에서 폴리펩티드 쇄의 원격 부분으로부터의 잔기들로 조합되는 비-선형 에피토프를 의미한다. 이들 잔기는 폴리펩티드 쇄가 삼차원 구조로 접혀서 입체형체 에피토프를 구성하는 경우에 표면상에서 만난다.
본 발명의 결합 분자는 또한 인간 CD3 복합체의 적어도 두 영역으로 이루어지거나 및/또는 이를 포함하거나, 또는 CD3-ε, CD3-δ 및 CD3-γ와 같은 개별 요소 및/또는 CD3-ε/CD3-δ 또는 CD3-ε/CD3-γ등의 상기 요소들의 조합로 이루어지거나/포함하는 입체형체 에피토프(들)를 가진 적어도 하나의 결합 도메인에 특이적으로 결합하거나/이와 상호작용하도록 고안된다. 또한, 여기에 기재된 상기 입체형태/구조적 에피토프(들)은 인간 CD3 복합체의 단일 요소의 적어도 두 영역의 개별 부위/영역/스트레치(stretch)를, 바람직하게는 CD3-ε의 적어도 두 부위/영역/스트레치를, 더욱 바람직하게는 CD3-ε의 세포외 도메인의 부위/영역/스트레치를 포함하는 것으로 고안된다.
전술한 바와 같이 본 발명의 이중특이성 결합 분자의 제2 도메인은 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소 및/또는 적어도 하나의 추가적인 작동 도메인에 결합한다. 본 발명에서 용어 "작동 도메인(effector domain)"은 1차 또는 2차 자극 신호의 유도, 세포독성 효과(신호를 유도하는 세포자멸사를 포함)의 유도와 같은 생물학적 효과를 개시하거나 또는 드물게 특이적 항원-상호작용-장소와 특이적으로 결합/상호작용하는 능력을 갖는 본 발명의 분자의 도메인을 특징으로 한다. "세포독성 효과(cytotoxic effect)"는 또한 T 세포에 의해 발휘된 세포의 세포독성을 포함한다. 그에 따라, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 적어도 두 개의 상이한 특이성을 특징으로 한다.
특이성은 기술분야에서 알려진 방법 및 여기에 기재되고 상세히 설명된 방법들에 의해 실험적으로 측정할 수 있다. 이러한 방법은 여기에 제한되지 않지만, 웨스턴 블롯, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-테스트 및 펩티드 스캔을 포함한다.
여기서 사용된 용어 "CDR"은 "상보 결정 영역(complementary determining region)"에 관한 것이며, 이는 당 기술분야에 잘 알려져 있다. CDR은 상기 분자의 특이성을 결정하고 특이적 리간드와 접촉하게 하는 면역글로불린의 일부이다. CDR은 분자의 가장 가변적인 부위이며, 이러한 분자들의 다양성에 기여한다. 각 V 도메인에는 3개의 CDR 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3이 있다. CDR-H는 가변 중쇄(heavy chain)의 CDR 영역을 나타내고, CDR-L은 가변 경쇄(light chain)의 CDR 영역이다. H는 가변 중쇄를 의미하고 L은 가변 경쇄를 의미한다. Ig-유래된 영역의 CDR 영역은, Kabat (1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987; J. Mol. Biol. 196, 901-917) 및 Chothia (1989; Nature, 342, 877-883) 에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
"Kabat 시스템"은 본 발명에서 Kabat (1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human services) 및 Chothia (1987; J. Mol. Biol. 196, 901-917)에 따라 일관된 방식으로 잔기의 번호를 매기기 위한 기준을 의미한다. 이러한 번호매기기 시스템은 당업자에 의해 광범위하게 사용되며 항원 결합 활성에서 중요한 가변 도메인 영역의 3차원 루프(loop) 및 서열 가변성(variability)에 기초를 둔다. 경쇄 또는 중쇄의 모든 잔기는 개개의 Kabat 위치를 가진다; 즉, Kabat 번호매기기 시스템은 CDRs 뿐 아니라 골격에도 적용된다. 임의의 항체의 특정 잔기의 위치는 Kabat에 따라 번호를 매길 수 있다. 번호매기기 시스템 및 항체들의 특정 잔기의 Kabat 위치는 http://www.bioinf.org.uk/abs에 나타나 있다. 예를 들면, Kabat 시스템에 따라 본 발명에서 언급된 위치 L24는 경쇄에 있는 잔기 24를 의미한다. 그러므로, L54 및 L96는 Kabat 시스템에 따라 항체의 경쇄에 있는 위치 54 및 96을 나타낸다.
Kabat 시스템에 따라 VH 및 VL 쇄의 CDR 영역을 식별하기 위한 규칙은 www.bioinf.org.uk/abs 및 표 1에 나타나 있다.
본 발명에 따라, 골격 영역은 항원과 접촉하도록 고변이(hypervariable) 상보 결정 영역(CDR)에 대한 단백질 골격을 제공하는, 면역글로불린 및 T-세포 수용체의 V 도메인(VH 또는 VL 도메인) 내의 영역에 관한 것이다. 각각의 V 도메인에는, FR1, FR2, FR3 및 FR4로 지정된 네 개의 골격 영역이 있다. 골격 1은 V 도메인의 N-말단로부터 CDR1의 시작까지의 영역을 둘러싸고, 골격 2는 CDR1 및 CDR2 사이의 영역에 관한 것이고, 구조 3은 CDR2 및 CDR3 사이의 영역을 둘러싸고, 골격 4는 CDR3의 끝에서부터 V 도메인의 C-말단까지의 영역을 의미한다; 특히 Janeway, Immunobiology, Garland Publishing, 2001, 5th ed. 를 참조한다. 그러므로, 골격 영역은 VH 또는 VL 도메인 내의 CDR 영역 바깥의 모든 영역을 둘러싼다.
당업자는 손쉽게 주어진 서열로부터 골격 영역, 및 CDRs을 추론할 수 있다; Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services, Chothia (1987). J. Mol. Biol. 196, 901-917 및 Chothia (1989) Nature, 342, 877-883 을 참조한다.
본 발명에 따라 "이중특이적 결합 분자"는 인간 CD3 복합체 및/또는 그 개별 요소에 대해 하나의 도메인과 반드시 특이적으로 결합하는 폴리(펩티드)이다. 여기서 사용된 용어 "폴리(펩티드)"는 펩티드의 그룹, 및 폴리펩티드의 그룹을 포함하는 분자의 그룹을 나타낸다. 펩티드의 그룹은 30개까지의 아미노산을 가진 분자로 구성되며, 폴리펩티드의 그룹은 30개 이상의 아미노산으로 구성된 분자로 구성된다. 가장 바람직하게는 상기 "이중특이적 결합 분자"는 항체, 항체 단편(fragment), 항체 유도체, 특이적 결합 펩티드 및 특이적 결합 단백질의 그룹으로부터 선택된다. 상기 항체 단편은 당업계에 공지이며, 여기에 한정되는 것은 아니지만, Fab-단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 등을 포함한다. 항체 유도체는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 표지된 항체들/항체 단편뿐만 아니라 화학적으로 변형된 항체들/항체 단편을 포함한다. 이하에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 문맥에서 특히 바람직한 항체의 유도체는 scFv's 이다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자의 한 도메인은 인간화된 CDR-이식된 CDR-항체로부터 유도된다. 항체들 및 항체 구조체와 함께 본 발명의 문맥에서 사용된 용어 "인간화된"은 비-인간 서열이 대응하는 인간 서열로 치환된 것으로 정의될 수 있다. 이것은 마우스 CDRs을 인간 골격으로 이식하는 것 또는 대응하는 위치에서 골격에 있는 단일 마우스 아미노산을 단일 인간 아미노산으로 치환하는 것에 의해 달성할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 인간화는 단백질의 결합 또는 세포독성 활성을 개선하기 위한 추가적인 돌연변이의 도입을 또한 포함한다. 이러한 추가적인 돌연변이가 반드시 마우스 잔기를 인간 잔기로 치환하는 것일 필요는 없다.
아미노산 및, 특히 주어진 아미노산 서열에서 특정적으로 선택된 아미노산에 의해 특정 위치에 있는 아미노산을 치환하기 위한 방법은 당업계에 공지이며 표준 실험 방법에 나타나 있다. 그러한 방법의 한 예는 프라이머 돌연변이유발(primer mutagenesis)이다(Sambrook et al. 1989).
이중특이적 결합 분자의 컨텍스트에서, 전술한 바와 같이, 경쇄의 CDRs에 추가의 아미노산 치환을 포함하는 인간화된 CD3 특이적 항체 구조체는 세포독성 활성을 갖는다는 것이 놀랍게도 발견되었다. 이러한 분자들은 표적 세포에서 세포 사멸을 유도하는 능력을 갖는다. 이와 대조적으로 예를 들면, Adair, 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48에 기술된, 인간화된 CD3 특이적 항체 구조체는, 상기 구조체가 전술한 이중특이적 결합 분자의 컨텍스트에 발현되었을 때 표적 세포에서 세포 사멸을 유도하는 매우 손상된 능력을 보인다.
특히, 본 발명의 이중특이적 분자는 그 특이적 에피토프에 대한 유의한(significant) 결합(실시예 4, 도 2 참조) 및 높은 세포독성 활성(실시예 6, 도 6 참조)을 보인다. Adair, 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48에 기재된 인간화된 OKT3을 포함하는 이중특이적 항체 구조체의 EC50값은 195pg/ml인 반면, CD3 결합 부위의 경쇄의 CDRs에서 치환된 본 발명의 이중특이적 인간화된 CD3은 50pg/ml의 EC50값을 보인다. 세포독성 활성에서의 4배 증가에 기인하여 본 발명의 이중특이적 분자는 치료적 활성에서 유효하게 사용될 수 있다. 또한, 환자에 대한 치료적 효과에 도달하기 위해 본 발명의 이중특이적 분자의 적은 양이 요구되기 때문에, 높은 세포독성 활성을 가진 인간화된 이중특이적 분자의 제공은 의학 분야에서 주요 장점을 보인다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 분자는 높은 세포독성 활성 및 인간화에 기인한 낮은 면역원성을 동시에 보이기 때문에, 환자를 치료할 때 이들은 공지 기술의 항체들에 비해 중요한 장점을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 이중특이적 분자는 의학 분야에서 명백한 개선을 제공한다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자는 전술한 경쇄의 CDRs에서 3개의 아미노산 치환체에 의해, 기술분야에 기재된 인간화된 분자들과 구별된다.
CDRs의 특정 아미노산 서열에 의해 영향받는 분자간 힘을 통해 항체들은 그 특이적 항원에 결합/상호작용하기 때문에, 당업자는 항체의 생물학적 활성을 증가시키기 위해서 CDR 영역의 아미노산 서열에서 아미노산을 치환하지 않았다. 대신 당업자는 원래의 마우스 CDR 서열을 유지하였다. 그러므로, 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 그러한 높은 세포독성 활성을 갖는 것은 놀라운 것이다.
인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하는 도메인이 위치 L24에 세린, 위치 L54에 발린 및 위치 L96에 류신을 갖는 것을 특징으로 하는 것은 특히 바람직하다. 위치 L24는 Kabat (1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH publication no. 91-3242 U.S. Department of Health and Human services) 및 Chothia (1987; J. Mol. Biol. 196, 901-917) 및 http://www.bioinf.org.uk/abs에 기재된 바와 같이 경쇄에 있는 위치 24를 의미한다. 유사하게, 위치 L54 및 L96은 각각 Kabat 및 Chothia에 의해 기재된 바와 같이 경쇄의 잔기 54 및 96을 나타낸다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자는 추가로 경쇄의 상기 CDR 영역이 서열식별번호:4, 6 또는 8의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:3, 5 또는 7의 핵산 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 포함하는 한 실시형태를 특징으로 한다.
본 발명에 의해 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하는 도메인은 scFv인 것이 고안된다.
용어 "scFv" (단일-쇄 Fv)는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. scFv는 그 작은 크기 및 이러한 항체 유도체를 재조합으로 생산하는 가능성에 기인하여, 본 발명에서 바람직하다.
인간 CD3 복합체와 결합/상호작용하는 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 도메인은 서열식별번호:10(본 발명의 인간화된 CD3 결합 분자의 경쇄)의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성되거나 또는 서열식별번호:9의 핵산 서열에 의해 인코드되는 것이 추가로 고안된다.
바람직하게는 본 발명의 결합 분자는 인간 CD3 복합체와 결합/상호작용하는 도메인이 서열식별번호:14로 나타낸 아미노산 서열 또는 서열식별번호:13의 핵산 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성된다.
본 발명에 의하면 이중특이적 결합 분자는, 상기 제2 도메인이 하나 이상의 세포 표면 분자(들)에 대해 특이적인 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소인, 결합분자인 것이 추가로 고안된다.
여기서 사용된 용어 "세포 표면 분자"는 세포의 표면상에 존재하거나 또는/및 부착된 분자를 나타낸다. 상기 세포 표면 분자들에 대한 예로는 막 및 막횡단 단백질(변형된 변이체, 예를 들어 글리코실화된(glycosylated) 변이체), 상기 단백질 또는 세포 표면 등에 부착되는 분자뿐 아니라 예를 들면 당지질과 같은 당화된 모이어티(moiety)들이 있다. 부착은 바람직하게는 내재 막 단백질, GPI-링크된(glycosyl phosphatidyl inositol-linked) 단백질, 당 모이어티 또는 강글리오시드(ganglioside) 모이어티 등의 다른 운반 분자에 공유 또는 비공유로 결합된 단백질성(proteinaceous) 또는 비-단백질성 모이어티에 의해 영향받는 것으로 이해된다. 바람직하게는 상기 세포 표면 분자(들)은 종양-특이적 분자(들)이다. 종양-특이적 분자는 비-악성 세포에 비교하여 오직 종양 세포상에서만 발견되거나 또는 종양 세포상에서 과잉발현되는(overexpressed) 종양-관련 세포 표면 항원이다. 종양-관련 세포 표면 항원은 종양 세포 상에서뿐만 아니라 생존에 필수적이 아니거나 또는 종양-관련 세포 표면 항원을 발현하지 않는 줄기세포에 의해 보충될 수 있는 세포/조직상에서도 발현될 수 있다. 또한, 종양-관련 세포 표면 항원은 악성 세포 및 비-악성 세포 상에서 발현될 수 있지만 악성 세포에 관심 있는 치료제에 의해 더욱 접근하기 쉽다. 과잉-발현된 종양-관련 세포 표면 항원의 예들은 HER-2/neu, EGF-수용체, HER-3 및 HER-4이다. 종양 특이적인 종양-관련 세포 표면 항원의 한 예는 EGFRV-III이다. 생존에 필수적이 아닌 세포 상에 나타나는 종양-관련 세포 표면 항원의 한 예는 PSMA이다. 보충되는 세포 상에 나타나는 종양-관련 세포 표면 항원의 예들은 CD19, CD20 및 CD33이다. 비-악성 상태에서보다 악성 상태에서 더 접근하기 쉬운 종양-관련 세포 표면 항원의 예는 EpCAM이다.
바람직하게는, 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소인 상기 제2 도메인은 항체의 적어도 하나의 가변 영역에 대응하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항원-유래의 영역이다. 더욱 바람직하게는, 상기 제2 도메인은 추가적인 scFv이다. 본 발명의 특히 바람직한 분자 형태는 이중특이적 단일 쇄 항체 구조체의 형태에 있는 폴리펩티드 구조체를 제공하며 여기서 항체-유래의 영역은 하나의 VH 및 하나의 VL 영역을 포함한다. VH 및 VL 영역은 어떠한 배열로도 배열될 수 있다.
용어 "이중특이성 단일 쇄 항체 구조체"는 전술한 바와 같이 인간 CD3/인간 CD3 복합체와 특이적으로 상호작용/결합할 수 있는 (적어도 하나의) 가변 경쇄로 구성된 하나의 도메인을 포함하고 또한 전술한 바와 같이 추가의 항원과 특이적으로 상호작용/결합할 수 있는 (적어도 하나의) 가변 영역(들)(또는 그 일부)으로 구성된 제2 도메인을 포함하는 구조체에 관한 것이다. 가변 영역의 일부는 적어도 하나의 CDR("상보 결정 영역(Complementary Determining Region)")이며, 가장 바람직하게는 적어도 CDR3 영역이다. 단일 쇄 항체 구조체에 있는 상기 두 도메인/영역은 바람직하게는 단일 쇄로서 서로 공유로 연결된다. 이러한 연결은 직접(CD3과 상호작용하는 도메인 1-추가의 항원과 상호작용하는 도메인 2 또는 추가의 항원과 상호작용하는 도메인 1-CD3와 상호작용하는 도메인 2) 또는 추가의 폴리펩티드 링커 서열(도메인 1-링커 서열-도메인 2 또는 도메인2-링커 서열-도메인 1)을 통해 영향받을 수 있다. 링커가 사용되는 경우에, 이러한 링크는 바람직하게는 제1 및 제2 도메인 각각이, 상호 독립적으로, 그들의 차별적인 결합 특이성을 보유할 수 있는 것을 확보하기에 충분한 길이 및 서열의 것이다. 가장 바람직하고 첨부한 실시예들에 자세히 설명한 바와 같이, "이중특이적 단일 쇄 항체 구조체"는 이중특이적 단일 쇄 Fv (bscFv)이다. 이중특이적 단일 쇄 분자들의 분자 형태는 기술 분야에 공지이며 예를 들어 WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197;Loffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103; Bruhl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426에 기재되어 있다. 그러한 본 발명의 이중특이적 단일 쇄 항체 구조체에 대한 특별한 예들은 이하에 제공되며 첨부한 실시예에서 자세히 설명된다.
본 발명에 따르면 이중특이적 결합 분자이며, 여기서 상기 제2 도메인은 EpCAM, CCR5, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1 (점액소), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, bhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보(Globo) H, 푸코실(fucosyl) GM1, 폴리 SA, GD2, 카르보안하이드라아제(Carboanhydrase) IX (MN/CA IX), CD44v6, 음파 고슴도치(Sonic Hedgehog)(Shh), Wue-1, 혈장 세포 항원, (막-결합)IgE, 흑색종 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메소텔린(mesothelin), A33 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), Ly-6 데스모글레인(desmoglein) 4, E-카드헤린 네오에피토프(cadherin neoepitope), 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 표지, CA-125 표지 및 뮐러관 억제 물질 (MIS) 수용체 타입 II, sTn (시알화(sialylated) Tn 항원; TAG-72), FAP (피브로블라스트 활성화 항원), 엔도시아린(endosialin), EGFRvIII, L6, SAS, CD63, TF-항원, 코라(Cora) 항원, CD7, CD22, Igα, Igβ, gp100, MT-MMPs, F19-항원 및 CO-29로 구성된 그룹으로부터 선택되는 항원과 특이적으로 결합/상호작용한다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에 따르면 상기 제2 도메인은 CD19 분자와 특이적으로 결합/상호작용한다.
CD3 및 CD19 분자와 특이적으로 결합/상호작용하는 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 상기 제2 도메인이 다음 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성됨을 특징으로 하는 것이 특별히 고안된다:
(a) 서열식별번호:16 또는 18에 대응하는 아미노산 서열 ;
(b) 서열식별번호:15 또는 17에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열 ;
(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 (hybridizing) 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및
(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
더욱 바람직하게는, 이중특이적 결합 분자는 다음의 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다:
(a) 서열식별번호:20에 대응하는 아미노산 서열 ;
(b) 서열식별번호:19에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열 ;
(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및
(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
상기 이중특이적 결합 분자는 바람직하게는 이중특이적 scFv 구조체이고, 그에 따라 제1 scFv는 CD3와 특이적으로 결합/상호작용하고 제2 scFv는 CD19와 특이적으로 결합/상호작용한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면 상기 제2 도메인은 EpCAM 분자와 특이적으로 결합/상호작용한다.
CD3 및 EpCAM 분자와 특이적으로 결합/상호작용하는 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 상기 제2 도메인이 다음 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성됨을 특징으로 하는 것이 특별히 고안된다:
(a) 서열식별번호:22, 24, 26, 28, 30 또는 32에 대응하는 아미노산 서열 ;
(b) 서열식별번호:21, 23, 25, 27, 29 또는 31에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열 ;
(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및
(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
더욱 바람직하게는, 이중특이적 결합 분자는 다음의 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 구성된다:
(a) 서열식별번호:34 또는 36에 대응하는 아미노산 서열 ;
(b) 서열식별번호:33 또는 35에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열 ;
(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및
(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
상기 이중특이적 결합 분자는 바람직하게는 이중특이적 scFv 구조체이고, 그에 따라 제1 scFv는 CD3와 특이적으로 결합/상호작용하고 제2 scFv는 EpCAM과 특이적으로 결합/상호작용한다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자의 상기 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소는 인간회되는 것이 더욱 바람직하다.
추가의 실시형태에서, 본 발명은 상기에서 정의된 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 핵산 서열은 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다:
(a) 서열식별번호:20, 34 또는 36의 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 성숙한 형태를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 ;
(b) 서열식별번호:19, 33 또는 35의 그룹으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하거나 구성된 뉴클레오티드 서열 ;
(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 뉴클레오티드 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 뉴클레오티드 서열; 및
(d) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열의 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결손 및/또는 부가에 의해, (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 단백질로부터 유래된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(e) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70 %, 더 바람직하게는 80 %, 특히 바람직하게는 90 %, 그보다 더 바람직하게는 95 % 및 가장 바람직하게는 99 % 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 뉴클레오티드 서열.
여기서 사용된 "하이브리드하는"이란 용어는, 전술의 핵산 서열의 상보성 가닥 또는 그 일부에 대해 또는 전술의 핵산 서열 또는 그 일부에 대해 하이브리드 형성을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 뜻한다. 그러므로 상기 핵산 서열은 RNA 또는 DNA 제조시 각각, 노던 또는 써던 블롯 분석에서 탐침으로서 유용할 수 있고, 또는 그들의 각각의 크기에 따라 PCR 분석에서 올리고뉴클레오티드 프라이머로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 적어도 10, 더 바람직하게는 적어도 15 뉴클레오티드를 포함하고, 탐침으로 사용될 본 발명의 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 적어도 100, 더 바람직하게는 적어도 200, 또는 가장 바람직하게는 적어도 500 뉴클레오티드를 포함한다.
핵산 분자들과 어떻게 하이브리드 형성 실험을 수행하는지는 기술분야에 잘 알려져 있으며, 즉, 당업자는 본 발명에 따라 어떠한 하이브리드 형성 조건들을 사용하여야 하는지를 알고 있다. 그러한 하이브리드 형성조건은 Sambrook et al. (loc cit.)과 같은 표준 교과서 및 당업자들이 알고 있거나 또는 전술한 바와 같은 다른 표준 실험실 매뉴얼에 실려 있다. 본 발명에 따라 바람직한 것은, 엄격한 하이브리드 형성 조건하에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 또는 그것의 일부분에 하이브리드 형성을 할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다.
"엄격한 하이브리드 형성 조건"은 예를 들어 50% 포름아미드, 5x SSC (750 mM NaCl, 75mM 구연산 나트륨), 50mM 소디움 포스페이트 (pH 7.6), 5x 덴하르드트 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20㎍/ml의 변성되고, 절단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에 42℃에서 하룻밤 배양한 다음, 약 65℃에서 0.1 x SSC 중에서 필터를 세척하는 것을 뜻한다. 또한 더 낮은 엄격 하이브리드 조건에서 본 발명의 폴리뉴클레이티드에 하이브리드하는 핵산 분자가 고안되었다. 하이브리드 형성의 엄격성 및 신호 검출의 변화는 포름아미드 농도 (포름아미드의 더 낮은 백분율은 저하된 엄격성을 가져온다); 염 조건, 또는 온도의 조정을 통하여 주로 달성된다. 예를 들면 더 낮은 엄격성 조건은 6x SSPE (20X SSPE = 3M NaCl; 0.2 NaH2PO4; 0.02M EDTA, pH 7.4), 0.5% SDS, 30% 포름아미드, 100㎍/ml 연어 정액 차단 DNA를 포함하는 용액 중에 37℃에서 하룻밤 배양한 다음; 50℃에서 1 x SSPE, 0.1% SDS로 세척함을 포함한다. 또한, 훨씬 덜한 엄격성을 달성하기 위하여, 엄격한 하이브리드 형성 후에 수행된 세척은 더 높은 염 농도(예, 5X SSC)에서 행할 수 있다. 상기 조건에서 돌연변이들은 하이브리드 형성 실험에서 배경을 억제하는데 사용되는 교대(alternate) 차단제의 도입 및/또는 치환을 통하여 달성할 수 있음을 주목한다. 전형적인 차단제는 덴하르드트 제(Denhardt's reagent, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정액 DNA, 및 상업적으로 이용 가능한 전매 제형을 포함한다. 특이성 차단제의 도입은 적합성의 문제로 인하여 전술한 하이브리드 형성 조건의 변형을 필요로 할 수 있다.
언급된 핵산 분자는 예를 들어 DNA, cDNA, RNA 또는 합성으로 생산된 DNA 또는 RNA, 또는 단독으로 또는 조합으로 이들 폴리뉴클레오티드의 어느 것을 포함하는 재조합으로 생산되는 키메라 핵산 분자 또는 그 키메라의 혼합일 수 있다.
조절 서열들이 본 발명의 핵산 분자에 추가될 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다. 예를 들면, 발명의 폴리뉴클레오티드의 유도된 발현을 허용하는 프로모터, 전사 인헨서 및/또는 서열들이 사용될 수 있다. 적합한 유도가능 시스템은, 예를 들면, 예로서 Gossen 및 Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 5547-5551) 및 Gossen 등 (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62)에 의해 기술된 테트라사이클린-조절되는 유전자 발현, 또는 예로서, Crook (1989) EMBO J. 8, 513-519에 의해 기술된 덱사메타손-유도가능한 유전자 발현 시스템이 있다.
게다가, 추가의 목적의 위해, 핵산 분자들은 예를 들면, 티오에스테르 결합 및/또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다는 것을 예견할 수 있다. 상기 변형은 세포 내의 엔도(endo)- 및/또는 엑소뉴클레아제(exonuclease)에 대한 핵산 분자의 안정화에 유용할 수 있다. 상기 핵산 분자들은, 세포 내에서 상기 핵산 분자의 전사를 가능하게 해주는 키메라 유전자를 포함하는 적절한 벡터에 의해 전사될 수 있다. 이 점에서, 그러한 폴리뉴클레오티드는 "유전자 표적(gene targeting)" 또는 "유전자 치료법적(gene therapeutic)" 접근을 위해 사용할 수 있는 것으로 또한 이해된다. 또 하나의 실시태양에서 상기 핵산 분자가 표지된다. 핵산의 검출방법은 예를 들어 써던 및 노던 블롯(blotting), PCR 또는 프라이머 확장(primer extension)으로 기술 분야에 잘 알려져 있다. 이 실시태양은 유전자 치료법 접근 중에 전술한 핵산 분자의 성공적인 도입을 입증하는 스크리닝 방법에 유용할 수 있다.
상기 핵산 분자(들)은, 전술한 핵산 분자의 어느 것을 단독으로 또는 조합으로 포함하는, 재조합으로 생산된 키메라 핵산분자일 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산분자는 벡터의 일부이다.
따라서 본 발명은 또한 본 발명의 핵산분자를 함유하는 벡터에 관한 것이다.
많은 적합한 벡터는 분자생물학의 당업자들에게 공지되어 있으며, 이들의 선택은 원하는 기능에 따라 달라지고, 이들은 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 유전공학에 통상적으로 사용되는 다른 벡터를 포함한다. 기술 분야의 당업자들에게 공지된 방법들은 다양한 플라스미드 및 벡터를 구성하는데 사용할 수 있다; 예를 들면 Sambrook 등 (loc. cit) 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, 뉴욕 (1989), (1994)에 개시된 기술을 참조한다. 이와는 달리, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적세포에 전달하기 위한 리포솜으로 재구성할 수 있다. 하기에 더욱 상세하게 논의한 바와 같이, 클로닝 벡터는 DNA의 개개 서열을 분리하는데 사용되었다. 관련된 서열은 특정 폴리펩티드의 발현이 필요한 발현벡터로 전달할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 및 pGBT9를 포함한다. 전형적인 발현 벡터는 pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT를 포함한다.
바람직하게 상기 벡터는 여기에 정의된 단일 쇄 항체 구조체를 인코딩하는 상기 핵산 서열에 작동적으로(operably) 연결된 조절서열인 핵산 서열을 포함한다.
이러한 조절서열(제어 요소)은 당업자에게 공지되어 있으며 또한 인서트를 벡터 내에 도입하기 위한 프로모터, 스플라이스 카셋트(splice cassette), 해독(translation) 개시 코돈, 해독 및 삽입 장소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 핵산분자는 진핵 또는 원핵세포에서 발현시키는 상기 발현 조절 서열에 작동적으로(operably) 연결된다.
상기 벡터는 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산분자를 포함하는 발현 벡터인 것이 고안된다.
용어 "조절 서열"은 결착되어 있는(ligated) 코딩서열의 발현을 수행하는데 필요한 DNA 서열을 말한다. 상기 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 원핵생물에서 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 장소 및 종료자(terminator)를 포함한다. 진핵생물에서는 일반적으로 조절서열은 프로모터, 종료자 및 일부 경우에 인헨서, 전사 활성제 또는 전사 인자를 포함한다. 상기 용어 "조절 서열"은 최소한 그의 존재가 발현에 필요한 모든 성분들을 포함하는 것으로 의도되며, 또한 추가의 유리한 성분들을 포함할 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된"(operably linked)은 전술한 성분들이 그들의 의도한 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병렬(juxtaposition)에 관한 것이다.
코딩서열에 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 코딩서열의 발현이 조절서열에 부합하는 조건하에 달성되는 방식으로 결착(ligated)된다. 조절서열이 프로모터인 경우에, 이중-가닥 핵산이 바람직하게 사용되는 것은 당업자에게 자명하다.
따라서 인용된 벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. "발현 벡터"는 선택된 숙주를 변형시키기 위해 사용할 수 있는 구조체이며 또한 선택된 숙주에서 코딩 서열의 발현을 제공한다. 발현 벡터는 예를 들면 클로닝 벡터, 이원 벡터(binary vector) 또는 통합 벡터(integrating vector)일 수 있다. 발현은 바람직하게는 해독 가능한 mRNA로의 핵산분자의 전사를 포함한다. 원핵 및/또는 진핵 세포에서 발현을 보장하는 조절 요소는 당해 기술자들에게 잘 알려져 있다. 진핵 세포의 경우에 이들은 보통 전사의 개시를 보장하는 프로모터 및 선택적으로 전사의 종료 및 전사의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호를 포함한다. 원핵 숙주세포에서 발현시키는 가능한 조절 요소는 예를 들어 E. coli 에서 PL, lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하며 또한 진핵 숙주세포에서 발현시키는 조절요소의 예는 효모에서 AOX1 또는 GAL1 프로모터 또는 포유동물 및 기타 동물세포에서 CMV-, SV40-, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인헨서, SV40-인헨서 또는 글로빈 인트론이다.
전사의 개시에 관여하는 요소 외에도, 이러한 조절 요소는 또한 전사 종료 신호, 예를 들어 SV40-폴리-A 장소 또는 tk-폴리-A 장소, 폴리뉴클레오티드의 하류를 포함할 수 있다. 또한, 사용된 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획에 지시하거나 또는 이를 배지 내에 분비할 수 있는 리더 서열(leader sequence)은 기술된 핵산 서열의 코딩 서열에 첨가할 수 있으며 또한 당해 분야에 잘 알려져 있다; 예를 들어 첨부된 실시예 3을 참조한다. 리더 서열(들)은 세포질 공간 또는 세포외 배지 내로, 바람직하게는 해독된 단백질 또는 그의 일부의 분비를 지시할 수 있는 리더 서열, 및 해독, 개시 및 정지 서열과 함께 적절한 상으로 조합된다. 임의로, 이종 서열(heterologous sequence)은 원하는 특성, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 식별(identification) 펩티드를 포함한 융합 단백질을 인코딩할 수 있다; 상기를 참조한다. 본 명세서에서 적합한 발현 벡터는 당해 분야에 공지되어 있는데, 예를 들어 Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (인-비트로겐), pEF-DHFR 및 pEF-ADA 또는 pEF-neo (Mark 등, PNAS(1995) 92, 7021-7025 및 Raum 등, Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) 또는 pSPORT1 (GIBCO BRL)등이 있다.
바람직하게는, 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질변환 할 수 있는 벡터에서 진핵 프로모터 시스템일 것이다. 그러나 원핵 숙주에 대한 조절 서열이 또한 사용될 수 있다. 벡터가 적절한 숙주내로 도입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현에 적합한 조건하에 유지되며 또한 바람직하게, 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 수집 및 정제가 뒤따를 수 있다; 예를 들어 첨부된 실시예를 참조한다.
세포 사이클 상호작용 단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 또 다른 발현 시스템은 곤충 시스템이다. 하나의 이러한 시스템에서, Autographa californica 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)는 Spodoptera frugiperda 세포 또는 Trichoplusia 유충에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로 사용된다. 기술된 핵산 분자의 코딩 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비필수 영역 내로 클로닝되며 또한 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 위치시킬 수 있다. 상기 코딩 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 비활성으로 만들며 또한 피복 단백질 피복이 부족한 재조합 바이러스를 생산한다. 재조합 바이러스는 이후 본 발명의 단백질이 발현되는 S. frugiperda 세포 또는 Trichoplusia 유충을 감염시키는데 사용된다 (Smith, J. Virol. 46(1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).
추가의 조절 요소는 전사는 물론 해독 인헨서를 포함할 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 상술한 벡터는 선별 가능한 및/또는 계수 가능한 표지를 포함할 수 있다.
형질전환된 세포 및 예를 들어 식물조직 및 식물의 선별에 유용한 선별 가능한 표지 유전자는 당해 분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며 또한 예를 들어 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 내성을 부여하는 dhfr (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 내성을 부여하는 npt (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995), 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485)에 대한 선별을 기반으로 하는, 항대사물질 저항성을 포함한다. 추가의 선택가능 유전자, 즉 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용하게 해주는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 해주는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); 세포가 만노스를 이용하게 해주는 만노스-6-포스페이트 아이소메라아제 (WO 94/20627) 및 오르니틴 데카르복실라아제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communication in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) 에 대한 내성을 부여하는 ODC (오르니틴 데카르복실라아제), 또는 블라스티시딘 S 에 대한 내성을 부여하는 아스퍼길루서 테레우스 (Aspergillus terreus)로부터의 탈아미노효소 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338)가 기술되어 있다.
유용한 계수 가능한 표지는 또한 당해 분야의 기술자에게 알려져 있으며 또한 상업적으로 입수가능하다. 유리하게는, 상기 표지는 루시페라제 (Giacomin, Pl. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), 녹색 형광 단백질 (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) 또는 β-글루크로니다아제 (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907)를 인코딩하는 유전자이다. 이 실시태양은 기술된 벡터를 함유하는 세포, 조직 및 유기물의 간단하고 빠른 스크리닝에 특히 유용하다.
전술한 바와 같이, 기술된 핵산분자는 단독으로 또는 벡터의 일부로서 사용하여, 예를 들어 정제를 위해, 또한 유전자 치료 목적을 위해 세포 내에서 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 전술한 본 발명의 이중특이적 결합 분자 중의 어느 하나를 인코딩하는 DNA 서열(들)을 포함하는 핵산 분자 또는 벡터는 세포 내로 도입되고 차례로 관심 있는 폴리펩티드를 생산한다. 생체 내 또는 생체 외 기술에 의해 세포 내로 치료적 유전자를 도입하는 것을 기본으로 하는 유전자 치료는, 유전자 전달의 가장 중요한 적용중의 하나이다. 생체 내 또는 생체 외 유전자 치료를 위한 적절한 벡터, 방법, 또는 유전자-전달 시스템은 문헌에 기술되어 있으며 또한 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다; 예를 들면, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; or Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640을 참조한다. 기술된 핵산분자 및 벡터는 세포 내로 직접 도입하거나 또는 리포솜이나 바이러스성 벡터 (예, 아데노바이러스, 레트로바이러스)를 통해 도입하는 것으로 설계될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 병원균 세포주, 배아세포, 또는 난세포이거나 또는 그로부터 유도된 것이며, 가장 바람직하게 상기 세포는 줄기세포이다. 배아줄기세포의 예는 특히 Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428에 기술된 바와 같은 줄기세포일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환 또는 형질변환된 숙주를 제공한다. 상기 숙주는 전술한 본 발명의 벡터의 하나 이상 또는 전술한 본 발명의 핵산 분자의 하나 이상을 숙주 내로 도입하여 생산될 수 있다. 숙주 내에 상기 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 핵산 분자의 존재는 전술한 단일 쇄 항체 구조체를 인코딩하는 유전자의 발현을 매개할 수 있다.
숙주 내에 도입되는 본 발명의 전술한 핵산 분자 또는 벡터는 숙주의 게놈 내에 통합하거나 또는 염색체외에(extrachromosomally) 유지될 수 있다.
숙주는 원핵 또는 진핵세포일 수 있다.
용어 "원핵생물"는 본 발명의 단백질의 발현을 위한 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질변환될 수 있는 모든 박테리아를 포함하는 것을 의미한다. 원핵 숙주는 그람 음성은 물론 그람 양성 박테리아 예를 들어 E. coli , S. typhimurium , Serratia marcescens 및 Bacillus subtilis등을 포함할 수 있다. 용어 "진핵생물"는 효모, 고등 식물, 곤충 및 바람직하게는 포유동물 세포를 포함하는 것을 의미한다. 재조합 생산 절차에서 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 단백질은 당화되거나 또는 비-당화될 수 있다. 특히 바람직한 것은 본 발명의 폴리펩티드의 코딩 서열을 함유하는 바이러스 또는 플라스미드의 사용이며 또한 여기에 N-말단 FLAG-tag 및/또는 C-말단 His-tag가 유전학적으로 융합된다. 바람직하게는 상기 FLAG-tag의 길이는 약 4 내지 8개 아미노산, 가장 바람직하게 8개 아미노산이다. 전술한 폴리뉴클레오티드는 기술분야의 당업자들에게 통상적으로 공지된 기술의 어느 것을 사용하여 숙주를 형질전환 또는 형질변환하는데 사용할 수 있다. 더욱이 융합되고 작동적으로 연결된(operably linked) 유전자를 제조하고, 이들을 예를 들어, 포유동물 세포 및 세균에서 발현하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 (Sambrook, loc cit).
바람직하게는, 상기 숙주는 세균 또는 곤충, 진균, 식물 또는 동물 세포이다.
기술된 숙주는 포유동물 세포인 것이 특별히 고안된다.
특히 바람직한 숙주세포는 CHO 세포, COS세포, SP2/0 또는 NS/0같은 골수종 세포주를 포함한다. 첨부된 실시예에 설명된 바와 같이 특히 바람직한 것은 숙주로서 CHO 세포이다.
더욱 바람직하게는 상기 숙주 세포는 예를 들어, per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168)의 인간 세포 또는 인간 세포주이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 제조방법에 관한 것이며, 상기 방법은 이중특이적 결합 분자의 발현/발현의 허용에 적합한 조건하에서 본 발명의 세포 및/또는 숙주를 배양하고 상기 세포 또는 상기 배양물/배양 배지로부터의 이중특이적 결합 분자를 분리/회수하는 것을 포함한다.
형질전환된 숙주는 발효조에서 성장하고 최적 세포성장을 달성하기 위해 기술분야에 공지된 기술에 따라 배양한다. 이어서 본 발명의 폴리펩티드는 성장 배지, 세포 용해질, 또는 세포막 분획으로부터 분리될 수 있다. 예들 들어 본 발명의 미생물로 발현된 폴리펩티드의 분리 및 정제는 임의의 기존의 수단, 예를 들어 제조용 크로마토그래피법 분리(preparative chromatographic separations), 및 면역학적 분리, 예를 들어 첨부된 실시예에 기술된 바와 같이 또는 본 발명의 폴리펩티드의 태그에 대해 지시되는 단일클론 또는 다클론 항체의 사용을 수반하는 것일 수 있다.
발현을 허용하는 숙주를 배양하기 위한 조건은 숙주 시스템 및 그러한 프로세스에서 사용되는 발현 시스템/벡터에 의존하는 것으로 기술분야에 알려져 있다. 재조합 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건을 달성하기 위해서 수정될 파라미터들은 기술분야에 알려져 있다. 따라서, 적합한 조건은 추가적인 발명의 제공 없이 기술분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일단 발현되면, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 기술 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982)를 참조한다. 약학적 용도에 대해서, 실질적으로 적어도 약 90 내지 95%의 동질성(homogeneity)의 순수한 폴리펩티드가 바람직하며, 98 내지 99% 또는 그 이상의 동질성이 가장 바람직하다. 일단 정제되면, 부분적으로 또는 원하는 동질성으로, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 이어서 치료적으로(체외를 포함) 또는 분석 절차를 개발하고 수행하는 데 사용될 수 있다. 또한, 배양으로부터 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 회수를 위한 방법의 예들은 첨부한 실시예에 상세히 설명된다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 이중특이적 결합 분자 또는 상기 기술된 공정으로 생성된 이중특이적 결합 분자, 본 발명의 핵산 분자, 본 발명의 벡터 또는 숙주를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은, 임의로, 또한 면역 작동 세포(effector cell)에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물을 포함할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 조성물은 약학적 조성물이고, 임의로 적합한 운반체 제형, 안정화제 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명의 관점에서, 면역 작동 세포(effector cell)에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 상기 "단백질성 화합물"은 예를 들어 T 세포에 대한 활성화 신호일 수 있다. 단백질성 화합물의 바람직한 형태는 이중특이적 항체 및 그 단편 또는 유도체, 예를 들어 이중특이적 scFv를 포함한다. 바람직하게는, 상기 T 세포에 대한 활성화 신호는 T 세포 수용체(TCR)를 통해, 더욱 바람직하게는 TCR의 CD3 분자를 통해 제공될 수 있다. 단백질성 화합물은, 여기에 한정되는 것은 아니지만, CD3에 대해 특이적인 scFv's, T 세포 수용체에 대해 특이적인 scFv's 또는 초항원(superantigen)을 포함할 수 있다. 초항원은 MHC-독립적인 방식으로 T 세포 수용체 가변 영역의 특정 아과(subfamily)에 직접 결합하고 따라서 1차 T 세포 활성화 신호를 매개한다. 단백질성 화합물은 또한 비-T 세포인 면역 작동 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있다. 비-T 세포인 면역 작동 세포의 예들로, 특히 B 세포 및 NK 세포를 포함한다.
본 발명에 따라, 용어 "약학적 조성물"은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 약학적 조성물은 비경구, 경피성, 관강내(intraluminal), 동맥내(intra arterial), 경막내(intrathecal) 투여 또는 조직 또는 종양 내에 직접 주사를 위한 조성물을 포함한다. 특히 상기 약학적 조성물은 주입 또는 주사를 통해 환자에게 투여될 것이 고안된다. 적절한 조성물의 투여는 상이한 방법으로, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 피내 투여에 의해 수행할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 운반체를 추가로 포함할 수 있다. 적절한 약학적 운반체의 예는 당 업계에 잘 알려져 있으며 또한 인산염 완충 염수 용액, 물, 유화액, 예를 들어 오일/물 유화액, 다양한 유형의 습윤제, 멸균액 등을 포함한다. 이러한 운반체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상의 방법으로 제형화 할 수 있다. 이들 약학적 조성물은 대상에게 적절한 용량으로 투여할 수 있다. 투여량 요법은 주치의 및 임상 요소에 의해 결정할 수 있다. 의약 기술에서 잘 알려진 바와 같이, 어떤 한 환자를 위한 투여량은 환자 크기, 신체 표면적, 나이, 투여할 특정 화합물, 성, 시간 및 투여경로, 일반적 건강, 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한 많은 요소에 따라 달라진다. 일반적으로, 약학적 조성물의 정규적인 투여로서의 요법은 하루에 1㎍ 내지 5g 단위의 범위 내여야 한다. 그렇지만 연속 주입에 대한 더 바람직한 투여량은 체중 킬로그램당 시간당 0.01㎍ 내지 2mg, 바람직하게는 0.01㎍ 내지 1mg, 더욱 바람직하게는 0.01㎍ 내지 100㎍, 훨씬 더 바람직하게는 0.01㎍ 내지 50㎍ 및 가장 바람직하게는 0.01㎍ 내지 10㎍ 단위의 범위일 수 있다. 특히 바람직한 투여량은 아래에 기술된다. 진행은 주기적인 평가에 의해 모니터 될 수 있다. 투여량은 변할 것이지만 DNA의 정맥내 투여의 바람직한 투여량은 대략 106 내지 1012개 카피의 DNA 분자이다. 본 발명의 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여할 수 있다. 투여는 일반적으로 비경구, 예를 들어 정맥내일 것이며; DNA는 또한 예를 들어 내부 또는 외부 표적 부위로 비올리스틱 전달(biolistic delivery)에 의해 또는 동맥 내의 어느 부위로 도관(catheter)에 의해 표적 부위에 직접적으로 투여할 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예를 들어 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예를 들어 에틸 올리에이트이다. 수성 운반체는 염수 및 완충 매체를 포함하여, 물, 알콜/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 부형제(vehicle)는 염화 나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화 나트륨, 유산을 가한 링거(lactated Ringer's) 또는 고정유(fixed oil)을 포함한다. 정맥내 부형제는 유체 및 영양 보충물, 전해질 보충물 (예를 들어 링거 덱스트로스 계통) 등을 포함한다. 보존제 및 다른 첨가제는 또한 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 불활성 기체 등일 수 있다. 그 외에, 본 발명의 약학적 조성물은 혈청 알부민 또는 면역 글로불린과 같은 단백질성 운반체, 바람직하게는 인간 기원인 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은, 단백질성 CD3 결합 분자 또는 핵산 분자 또는 이를 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터(본 발명에서 기술된 바와 같음) 이외에, 약학적 조성물의 의도한 용도에 따라 생물학적 활성제를 추가로 포함할 수 있는 것으로 고안된다. 이러한 약제는 당업계에 알려진, 위장계에 작용하는 약물, 세포증식 억제제로 작용하는 약물, 고요산혈증(hyperuricaemia)을 예방하는 약물, 면역반응을 억제하는 약물(예, 코르티코스테로이드), 순환계에 작용하는 약물, 및/또는 T-세포 공-자극성(co-stimulatory) 분자 또는 사이토카인(cytokine) 등의 약물일 수 있다.
본 발명의 조성물(들)의 투여를 위한 가능한 징후는 종양 질환, 암, 특히 상피 암/암종 예를 들어 유방암, 대장암, 전립선암, 머리 및 목 암, 비-멜라닌성 피부암, 요생식기관 암, 예를 들어 난소암, 자궁내막암, 자궁경부암 및 신장암, 폐암, 위암, 소장 암, 간암, 췌장암, 담낭암, 담관암, 식도암, 수액선 암, 및 갑상선 암이며, 또는 혈액암, 흑색종, 신경아교종, 육종, 예를 들어 골육종과 같은 기타 종양 질환이다. 본 발명의 조성물의 투여에 대한 추가적인 징후는 증식 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환, 또는 숙주대이식 질환이다.
전술한 바와 같은 본 발명의 조성물은 또한, 선택적으로, 증식 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환 또는 숙주대이식 질환을 검출하기 위한 수단 및 방법을 추가로 포함하는 진단용 조성물일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자는 또한 액체 상에서 또는 고체상 운반체에 부착되어 사용될 수 있는 면역측정법(immunoassay)에서 사용하기에 적합하다. 예를 들어 진단용 목적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 사용할 수 있는 면역측정법의 예는 직접 또는 간접 형태의 경쟁적 및 비-경쟁적 면역측정법이다. 그러한 면역측정법의 예는 효소연관면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay) (ELISA), 효소 면역측정법(enzyme immunoassay) (EIA), 방사선면역측정법(radioimmunoassay) (RIA), 샌드위치(면역계량 분석(immunometric assay)) 및 점적(dot blot) 분석법 및 웨스턴 블롯 분석법이 있다. 예를 들어 진단적 분석에서, 이중특이적 결합 분자를 검출하기 위해 사용할 수 있는 추가적인 분석법은 FACS에 기초한 분석법, 세포독성 분석법(Cr51, 형광 방출) 또는 염료 방출 분석법이다.
본 발명의 이중특이적 특정 결합 분자는 많은 상이한 운반체에 결합될 수 있고, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 세포를 분리하는 데 사용될 수 있다. 잘 알려진 운반체의 예로는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로오스, 천연 및 변형 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스, 및 자철광(magnetite)을 포함한다. 운반체의 속성은 가용성 또는 불용성, 예를 들면, 본 발명의 목적을 위해 비드(beads)일 수 있다.
상기 진단용 조성물은 선택적으로 완충액(들), 저장 용액 및/또는 의학적 또는 과학적 목적의 행위에 요구되는 나머지(remaining) 시약 또는 재료를 포함하는 하나 이상의 용기에 실릴 수 있다. 또한, 본 발명의 진단용 조성물의 일부는 바이얼(vial) 또는 병(bottle)에 개별로, 또는 용기의 조합 또는 다중용기 단위로 포장될 수 있다.
기술분야의 당업자에 알려진 많은 상이한 표지 및 표지하는 방법이 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 표지의 유형의 예로는, 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드 금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물, 및 생발광(bioluminescent) 화합물을 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 실시형태에서, 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 이중특이적 결합 분자 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 결합 분자, 본 발명의 벡터 또는 숙주의 사용이 고안된다. 상기 약학적 조성물은 본 발명에서 증식 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환 또는 숙주대이식 질환의 예방, 치료 또는 완화에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 이중특이적 결합 분자 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 결합 분자, 본 발명의 벡터 또는 숙주의 유효량을 예방, 치료 또는 완화가 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 증식 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환 또는 숙주대이식 질환의 예방, 치료 또는 완화를 위한 방법에 관한 것이다. 상기 대상은 바람직하게는 인간이다.
치료 방법은 면역 작동 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물의 유효량의 투여를 더 포함하는 것이 추가로 고안된다. 바람직하게는, 상기 단백질성 화합물은 본 발명의 이중특이적 결합 분자 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 결합 분자, 본 발명의 핵산분자, 벡터 또는 숙주와 동시에 또는 비-동시에 투여된다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 결합 분자 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 결합 분자, 본 발명의 핵산분자, 벡터 또는 숙주를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트는 본 발명의 약학적 조성물의 제조에 특히 유용하고, 특히, 주사 또는 주입에 유용한 용기로 이루어질 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 키트는, 또한 선택적으로 완충액(들), 저장 용액 및/또는 의학적 또는 과학적 목적의 행위에 요구되는 나머지 시약 또는 재료를 포함한다. 또한, 본 발명의 키트의 일부는 바이얼(vial) 또는 병(bottle)에 개별로, 또는 용기의 조합 또는 다중용기 단위에 포장될 수 있다. 본 발명의 키트는 특히 본 발명의 방법을 수행하기 위해 유리하게 사용될 수 있고, 예를 들면, 연구 도구 또는 의료 도구들과 같은 여기에 언급된 다양한 응용에 사용될 수 있다. 상기 키트의 제조는 바람직하게는 기술분야의 당업자에게 알려진 표준 절차를 따른다.
이들 및 다른 실시태양들이 본 발명의 상세한 설명 및 실시예에 기재되고 포함된다. 본 발명에 따라 사용될 항체, 방법, 용도 및 화합물 중의 임의의 하나에 관한 추가의 문헌은, 예를 들면 전자 장치들을 사용하여 공공 도서관 및 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 인터넷에서 이용가능한 공공 데이터베이스 "Medline"이, 예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html에서 이용가능하다. 추가의 데이터베이스 및 주소, 예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/ 이 기술분야의 당업자에 알려져 있고, 또한 예를 들면, http://www.lycos.com 또는 http://www.google.com를 사용하여 얻을 수 있다.
도 1.
A) 인간화된 항-CD3 항체 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열식별번호 : 9-12); B) 이중특이적 항-CD19x인간화된 항-CD3 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열식별번호 :19, 20); C) 이중특이적 항-EpCAM (5-10) x 인간화된 항-CD3 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열(서열식별번호 : 35, 36); D) 이중특이적 항-EpCAM (3-1) x 인간화된 항-CD3 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (서열식별번호 :33, 34),
도 2.
CD3 및 CD19 또는 EpCAM에 대한 상이한 구조체의 결합 친화성의 FACS 분석.
CD3 결합의 FACS분석을 CD3 양성의 쥬르카트(Jurkat) 세포로 수행하였다. A) 이중특이적 항-CD19x 인간화된 항-CD3 항체 구조체(서열식별번호: 20). CD19에 대한 결합은 CD19 양성의 Nalm6 세포로 도시되었다; B) 이중특이적 항-EpCAM (3-1)x 인간화된 항-CD3 항체 구조체(서열식별번호:34). EpCAM에 대한 결합은 EpCAM 양성의 KatoIII 세포로 도시되었다; C) 이중특이적 항-EpCAM (5-10)x 인간화된 항-CD3 항체 구조체(서열식별번호: 36). EpCAM에 대한 결합은 EpCAM 양성인 KatoIII 세포로 도시되었다. 오른쪽으로의 이동은 결합을 나타낸다.
도 3:
Zn-킬레이팅 프랙토겔(Fractogel®)컬럼으로부터 단백질 분획을 함유한 이중특이적 항-CD19x 인간화된 항-CD3 항체의 용출 패턴.
50-530 ml 정체 시간으로부터 280 nm에서 높은 흡수는 컬럼 흐름 경로에 있는 비-결합된 단백질에 기인하였다. 617.44 ml에서의 피크에 있는 화살모양은 사용되거나 또는 추가로 정제된 단백질 분획을 함유하는 인간화된 이중특이적 구조체를 나타낸다.
도 4:
세파덱스(Sephadex) S200 ® 겔 여과 컬럼으로부터 단백질 용출 패턴.
항-CD19x인간화된 항-CD3에 대한 이중특이적 항체를 함유하는 82.42 ml에서의 단백질 피크는 ca. 52 kD의 분자량에 대응한다. 분획은 40-120 ml 정체 시간으로 수집하였다.
도 5:
A) 이중특이적 항-CD19x 인간화된 항-CD3 항체 단백질 분획의 SDS-PAGE 분석.레인 M: 분자량 표지, 레인 1: 세포 배양 상청액; 레인 2: IMAC 용출액(eluate); 레인 3: 겔 여과 응집 피크; 레인 4: 정제된 이중특이적 항체 항- CD19x 인간화된 항-CD3;
B) 정제된 이중특이적 항-CD19x인간화된 항-CD3 항체의 웨스턴 블롯 분석. 레인 M: 분자량 표지, 레인 1: 세포 배양 상청액; 레인 2: IMAC 용출액; 레인 3: 겔 여과 응집 피크; 레인 4: 겔 여과로부터 얻어진 정제된 이중특이적 항체 항- CD19x 인간화된 항-CD3.
도 6
이중특이적 항-CD19x 인간화된 항-CD3 항체의 세포독성 분석 (서열식별번호: 20).
E:T 비율 1:10으로, 표적 세포로서 NALM-6 세포를 사용하고, 작동 세포로서 CD4 양성 CB15 T-세포를 사용하였다.
본 발명은 다음의 생물학적 실시예를 참조하여 기술할 것이며, 이들 실시예는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석해서는 안된다.
실시예
1.
CD3
항원에 대해 특이적인 인간화된 항체의 생성
CD3 특이적 항체 OKT3의 CDRs의 위치를 Kabat, EA, 등 Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th edition. 3 vols. Bethesda, MD: National Institutes of Health. National Center for Biotechnology Information, 1991;2597. NIH publication no. 91-3242를 참조하여 결정하였다.
이식된 CDRs을 수용하도록 선택된 인간의 골격 영역은 각각 중쇄 및 경쇄에 대해 KOL 및 REI였다. 이러한 단백질의 구조는 결정학적으로 해석되어있다.(REI: Palm(1975) Hoppe Seylers Z Physiol Chem 356, 167-191,KOL: Schmidt (1983) Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364, 713-747.)
Adair 1994 Hum. Antibod. Hybridomas, 5:41-48에 따라 다수의 추가적인 마우스 잔기가 인간 가변 영역 골격으로 도입되었다. 변화되어 왔던 이러한 잔기는 원래의 항원 특이성을 보유하는데 중요하다. 추가의 돌연변이는 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3에 도입되었다. 인간화된 OKT 및 본 발명의 개선된 인간화된 CD3의 CDR 서열은 표 2에 나타낸다. 개선된 인간화된 CD3 결합 분자의 서열은 도 1A; 서열식별번호 9-12에 나타낸다.
실시예
2.
인간화된 항-
CD3
부위를 갖는
이중특이적
단일 쇄 항체의 구성
실시예
2.1
인간화된 항-
CD3
부위로
이중특이적
단일 쇄 항-
CD19x
항-
CD3
항체의 구성
결과로 인간화된 항체를 가져오는 scFv를 인코딩하는 DNA를 유전자 합성에 의해 얻고, 추가로 CD19-특이적 scFv와 유전적 융합을 행하여 이중특이적 단일 쇄 항체를 얻었다(도 1B, 서열식별번호 : 19, 20). 이중특이적 단일 쇄 항체를 제한효소 EcoRI 및 SalI를 이용하여 포유류 발현 벡터 pEF-DHFR로 서브클로닝하였다.
실시예
2.2
인간화된 항-
CD3
부위를 갖는
이중특이적
단일 쇄 항-
EpCAMx
항-
CD3
항체의 구성
실시예 1.1에서 기술한 이중특이적 구조체에 더하여 상이한 종양 특이성을 가진 두 추가적인 이중특이적 단일 쇄 항체를 구성하였다.
이중특이적 항-CD19x인간화된 항-CD3의 CD19 특이성은 두 선택된 EpCAM 항체 5-10 및 3-1로 대체되었다. 따라서, 두 EpCAM-특이적인 이중특이적 단일 쇄 항체 구조체 항-EpCAM(5-10)x인간화된 항-CD3 (서열식별번호: 35, 36) 및 항-EpCAM (3-1)x인간화된 항-CD3 (서열식별번호: 33, 34)를 얻었다.
실시예
3.
인간화된 항-
CD3
부위를 갖는
이중특이적
단일 쇄 항체의 발현
항-CD19x인간화된 항-CD3 및 항-EpCAMx인간화된 항-CD3 구조체(서열식별번호 19, 20, 33, 34, 35, 36)는 Mack, M. et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 7021-7025에 기재된 바와 같이 DHFR 결핍 중국 햄스터 난소(CHO) 세포로 안정한 형질변환에 의해 발현되었다. 발현 벡터의 형질변환은 세포의 인산 칼슘 처리 후 수행되었다(Sambrook 등, 1989).
실시예
4.
인간화된 항-
CD3
부위를 갖는 단일 쇄
이중특이적
항체의 결합 활성의
FACS
분석
결합 능력에 관한 기능성을 테스트하기 위해서 FACS 분석을 수행하였다.
실시예
4. 1
항-
CD19x
인간화된 항-
CD3
이중특이적
항체의 흐름 세포측정 결합 분석
CD19 양성 Nalm 6 세포(인간 B 세포 전구체 백혈병) 및 CD3 양성 쥬르카트 세포 (인간 T 세포 백혈병)를 사용하였다. 200,000 Nalm 6 세포 및 200,000 쥬르카트 세포를 항-CD19x인간화된 항-CD3 특이적 폴리펩티드로 형질변환된 CHO 세포의 50㎕의 순수한 세포 배양 상청액과 함께 아이스 상에서 30분간 배양했다. 세포는 PBS에서 두 번 세척하였다. 이어서 구조체의 결합을 마우스 Penta His 항체(2% FCS가 들어있는 50㎕ PBS에서 1:20으로 희석됨; Qiagen), 뒤이은 세척 및, 2% FCS가 들어있는 50㎕ PBS로 1:100으로 희석된, 피코에리트린이 접합된 Fc 감마 특이적 항체(Dianova)로 그 C-말단의 히스티딘 태그를 통해 검출하였다(도 2A, 두꺼운 선). 음성 대조군으로 세포 배양 상청액 대신 새로운 세포 배양 배지를 사용하였다(도 2, 얇은 선).
세포는 FACS-Calibur (Becton Dickinson, Heidelberg)상에서 흐름 세포측정으로 분석하였다. 형광 강도의 FACS 염색 및 측정은 Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 이중특이적 결합 분자의 결합 활성은 선행 기술에 기재된 바와 같은 인간화된 OKT3 부위와 함께 대응하는 대조군 이중특이적 항체의 결합 활성과 비교하였다.
도 2에 도시하는 바와 같이, 항-CD19 x인간화된 OKT3 및 항-CD19x인간화된 항-CD3(개선된 인간화된 OKT3) 양자는 CD19 및 CD3에 잘 결합하였다.
실시예
4. 2
항-
EpCAMx
인간화된 항-
CD3
이중특이적
항체의 흐름 세포측정 결합 분석
EpCAM 특이적인 이중특이적 항체의 결합 능력을 테스트하기 위해서 실시예 4.1에 기재한 바와 같은 분석을 다음과 같이 변형하여 반복하였다: Nalm 6 세포 대신 EpCAM 양성 Kato III 세포를 사용하였고(위암 세포주 ; ATCC HTB-103) EpCAM 이중특이적 항체로 형질변환된 CHO 세포의 상청액을 적용하였다. EpCAM 결합 분석의 결과는 도 2B 및 도 2C에 나타낸다. 선행 기술에 기재된 바와 같은 인간화된 OKT3과 대응하는 이중특이적 항체를 대조군으로 사용하였다.
도 2B 및 도 2C에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 인간화된 항-CD3 (서열식별번호 34, 36)을 포함하는 이중특이적 구조체는 인간화된 OKT3과 구조체보다 훨씬 우수한 결합을 보인다.
실시예
5.
개선된 인간화된 항-
CD3
부위를 갖는
이중특이적
구조체의 정제
이중특이적 단일 쇄 구조체를 정제하기 위해서 항-CD19x인간화된 항-CD3로 안정하게 형질변환된 CHO 세포를, 수확하기 전 7일간 HiClone®CHO 변형된 DMEM 배지(HiQ)와 함께 회전 병(roller bottle)에서 배양하였다. 세포는 원심분리에 의해 제거되었고, 발현된 단백질을 포함하는 상청액은 -20℃에서 보관되었다.
Akta FPLC System® (Pharmacia) 및 Unicorn Software가 크로마토그래피를 위해 사용되었다. 모든 화학물질은 연구 등급이었고 Sigma(Deisenhofen, Germany) 또는 Merck (Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다.
인간화된 이중특이적 단일 쇄 구조체 단백질을 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 및 겔 여과를 포함하는 2 단계 정제 과정으로 분리하였다.
제작자의 프로토콜에 따라 ZnCl2가 적재된 Fractogel®컬럼(Pharmacia)을 사용하여, IMAC(고정된 금속 친화성 크로마토그래피)가 수행되었다. 컬럼은 완충액 A2(20 mM 인산나트륨 pH 7.5, 0.4 M NaCl)로 평형화되었고, 세포 배양 상청액(500ml)은 3ml/분의 유속으로 컬럼(10ml)에 적용되었다. 컬럼은 완충액 A2 로 세척되어 결합되지 않은 샘플을 제거하였다. 결합된 단백질은 완충액 B2 (20 mM 인산나트륨 pH 7.5, 0.4M NaCl, 0.5 M 이미다졸)의 2 단계 그래디언트를 사용하여 용출하였다. 단계 1: 10 컬럼 부피 내의 20% 완충액 B2; 단계 2: 10 컬럼 부피 내의 100% 완충액 B2. 100% 단계로부터 용출된 단백질 분획은 추가의 정제를 위해 모여졌다(도 3).
겔여과 크로마토그래피가 PBS (Gibco)로 평형화된 세파덱스(Sephadex) S200 HiPrep 컬럼®(Pharmacia)에서 수행되었다. 용출된 단백질 샘플은(유속 1ml/분)은 검출을 위해 SDS-Page 및 웨스턴 블롯을 행하였다. 컬럼은 이전에 분자량 결정을 위해 보정되었다 (분자량 표지 키트, Sigma MW GF-200).(도 4)
정제된 구조체의 단백질 농도는 단백질 분석 염료(Micro BCA, Pierce) 및 IgG (Biorad)를 표준 단백질로 사용하여 측정되었다. 단백질의 수율은 표2에 나타낸다. 모든 구조체는 세포 배양 상청액으로부터 정제할 수 있다. 정제된 단백질의 비교되는 수율을 항-CD19x인간화된 항-CD3 (16 ㎍/ml) 및 항-CD19x인간화된 OKT3 (13,6 ㎍/ml)에 대해 얻었다. 정제된 제품은 PBS 내의 겔여과에 의해 측정된 바와 같은 음성 조건하에서 52 kDa의 분자량을 가졌다.
정제된 이중특이적 단백질의 SDS-PAGE를 미리 성형된 4-12% Bis Tris 겔 (Invitrogen)에서 수행하였다. 샘플 준비 및 적용은 제작자의 프로토콜을 따랐다. 분자량은 MultiMark 단백질 표준® (Invitrogen)으로 측정되었다. 겔은 52 kDa에서 밴드를 나타내는 콜로이드의 쿠마시 (Invitrogen 프로토콜)로 염색되었다. 분리된 단백질의 순도는 >95% 이었다.
제작자의 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯을 Optician BA-S83 막® 및 Invitrogen Blot Module®로 수행하였다. 사용된 항체는 Penta His (Quiagen) 및 염소-항-마우스-알칼리성 포스파타아제(AP)(Sigma)이었고, 염색 용액은 BCIP/NBT(Sigma)이었다. 쿠마시 염색된 SDS-겔에 있는 정제된 이중특이적 단백질(도 5A)에 대응하여 인간화된 이중특이적 단백질은 52kD 밴드(도 5B)를 나타내는 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다.
실시예
6.
인간화된 항-
CD3
부위를 갖는
이중특이적
항체의
생활성
(
Bioactivity
)
구성된 이중특이적 항체의 높은 세포독성 활성을 확인하기 위하여 다음의 분석을 수행하였다.
실시예
6. 1
항-
CD19x
인간화된 항-
CD3
이중특이적
항체(서열식별번호: 20)
표적 NALM-6 세포(1.5x107)를 10μM의 칼세인(calcein) AM(Molecular Probes)으로 세포 배양 배지에서 37℃에서 30분간 표지하였다. 세포 배양 배지에서 두 번 세척 후, 세포를 세고 CD4-양성 CB15 T-세포와 혼합하였다. 결과의 작동 표적 세포 혼합물은 단위 ml당 2 x 105 Nalm6 세포 및 2 x 106 CB15 세포를(1:10의 E:T 비율) 포함한다. 항체는 RPMI/10% FCS에서 필요한 농도로 희석되었다. 이 용액 50㎕를 세포 현탁액에 첨가하고 2 시간 동안 37℃/ 5% CO2에서 배양하였다. 세포 독성 반응 후, 배양 배지에서 방출된 염료를 형광 판독기에서 정량하고, 세포 독성 화합물이 없는(음성 대조군) 대조군 반응으로부터의 형광 신호 및 양성 대조군으로서 완전히 용해된 세포에 대해(1% 사포닌에서 10분간) 형광 신호가 측정된 반응으로부터의 형광 신호와 비교하였다. 이러한 판독에 기초하여, 특이적인 세포독성을 다음의 식에 의해 계산하였다: [형광(샘플)-형광(대조군)] : [형광(완전 용해)-형광(대조군)] ×100.
S자꼴 만곡의 용량 반응 커브(sigmoidal dose response curves)는 Prism Software(GraphPad Software 사, 샌디에고, 미국)에 의해 측정된 바와 같이, 전형적으로 R2 값 >0.97이었다. 분석 프로그램에 의해 측정된 EC50 값을 생활성의 비교를 위해 사용하였다. 인간화된 CD3 부위를 갖는 CD3 및 CD19에 대한 이중특이적 항체의 세포독성은 도 6에 나타낸다. 선행기술에 기재된 바와 같은 인간화된 OKT3을 갖는, 대응하는 이중특이적 항체를 대조군으로 사용하였다.
이중특이적 형태에서 이중특이적 인간화된 개선된 CD3 (인간화된 항-CD3) (서열식별번호 20)은 Adair에 기재된 인간화된 OKT3(EC50 값 195 pg/ml)과 비교했을 때 명백하게 증가된 세포독성 활성(EC50값 50 pg/ml)을 가진다.
따라서, 이러한 결과는 본 발명의 CD3에 결합하는 개선된 인간화된 항체의 주요한 장점을 입증한다. 이중특이적 형태에서 개선된 인간화된 CD3의 세포독성 활성에서의 약 4배 증가에 기인하여 본 발명의 분자는 치료적 적용에 매우 유용하다. 더 강한 세포독성 활성에 기초하여 종래 기술의 분자에 비해 단백질의 더 적은 양을 치료에 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 이중특이적 분자는 인간화에 기인하여 높은 세포독성 활성과 낮은 면역원성을 동시에 보이기 때문에, 이들은 환자를 치료할 때 선행 기술의 항체에 비해 중요한 장점을 제공한다. 그러므로, 본 발명의 이중특이적 분자는 의학 분야에서 명백한 개선을 제공한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Micromet AG
<120> Less immunogenic binding molecules
<130> H3150 PCT
<160> 36
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 318
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: OKT3 light chain"
<400> 1
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gtgcaagttc aagcgtaagc tacatgaatt ggtatcagca gacaccaggg 120
aaagccccta agagatggat ctatgacaca tccaaattgg cttctggggt cccatcaagg 180
ttcagtggca gtggatctgg gacagattac actttcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240
gatattgcaa cttactactg tcaacagtgg agtagtaacc cttttacttt tggccagggg 300
accaagctgc agatcacc 318
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: OKT3 VL"
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 CDRL1"
<400> 3
agagcaagtt caagcgtaag ctacatgaat 30
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 CDRL1"
<400> 4
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn
1 5 10
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 CDRL2"
<400> 5
gacacatcca aagtggcttc t 21
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 CDRL2"
<400> 6
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 CDRL3"
<400> 7
caacagtgga gtagtaaccc tctcact 27
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 CDRL3"
<400> 8
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 318
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 VL"
<400> 9
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gagcaagttc aagcgtaagc tacatgaatt ggtatcagca gacaccaggg 120
aaagccccta agagatggat ctatgacaca tccaaagtgg cttctggggt cccatcaagg 180
ttcagtggca gtggatctgg gacagattac actttcacca tcagcagtct gcaacctgaa 240
gatattgcaa cttactactg tcaacagtgg agtagtaacc ctctcacttt tggccagggg 300
accaagctgc agatcacc 318
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 VL"
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105
<210> 11
<211> 357
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 VH"
<400> 11
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtaagt cttctggata caccttcact aggtatacga tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggatac ataaatccta gccgtggtta tactaattat 180
aatcagaagg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cacggccttt 240
ctgcaaatgg acagcctgag acccgaggac acgggtgtgt atttctgtgc gagatattat 300
gatgatcatt actgccttga ctactggggc cagggcaccc cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 VH"
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 729
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 VH-VL"
<400> 13
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtaagt cttctggata caccttcact aggtatacga tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggatac ataaatccta gccgtggtta tactaattat 180
aatcagaagg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca actccaagaa cacggccttt 240
ctgcaaatgg acagcctgag acccgaggac acgggtgtgt atttctgtgc gagatattat 300
gatgatcatt actgccttga ctattggggc cagggcaccc cggtcaccgt ctcctcagtc 360
gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagtgga cgacatccag 420
atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca tctgtaggag acagagtcac catcacttgc 480
agagcaagtt caagcgtaag ctacatgaat tggtatcagc agacaccagg gaaagcccct 540
aagagatgga tctatgacac atccaaagtg gcttctgggg tcccatcaag gttcagtggc 600
agtggatctg ggacagatta cactttcacc atcagcagtc tgcaacctga agatattgca 660
acttactact gtcaacagtg gagtagtaac cctctcactt ttggccaggg gaccaagctg 720
cagatcacc 729
<210> 14
<211> 243
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: hum. CD3 VH-VL"
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
195 200 205
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Gln Ile Thr
<210> 15
<211> 372
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: CD19 VH"
<400> 15
caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180
aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccag cacagcctac 240
atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag 300
actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cc 372
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: CD19 VH"
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<221> source
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<400> 17
gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180
gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaa 333
<210> 18
<211> 111
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: CD19 VL"
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 1494
<212> DNA
<213> artificial sequence
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<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: anti-CD19xhum. anti-CD3"
<400> 19
gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180
gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 360
tccggtggtg gtggttctca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct 420
gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag ctactggatg 480
aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat ttggcctgga 540
gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac tgcagacgaa 600
tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc tgcggtctat 660
ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat ggactactgg 720
ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggaggtggtg gctcccaggt gcagctggtg 780
cagtctgggg gaggcgtggt ccagcctggg aggtccctga gactctcctg taagtcttct 840
ggatacacct tcactaggta tacgatgcac tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg 900
gagtggattg gatacataaa tcctagccgt ggttatacta attataatca gaaggtgaag 960
gaccgattca ccatctccag agacaactcc aagaacacgg cctttctgca aatggacagc 1020
ctgagacccg aggacacggg tgtgtatttc tgtgcgagat attatgatga tcattactgc 1080
cttgactatt ggggccaggg caccccggtc accgtctcct cagtcgaagg tggaagtgga 1140
ggttctggtg gaagtggagg ttcaggtgga gtggacgaca tccagatgac ccagtctcca 1200
tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga gtcaccatca cttgcagagc aagttcaagc 1260
gtaagctaca tgaattggta tcagcagaca ccagggaaag cccctaagag atggatctat 1320
gacacatcca aagtggcttc tggggtccca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 1380
gattacactt tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagata ttgcaactta ctactgtcaa 1440
cagtggagta gtaaccctct cacttttggc caggggacca agctgcagat cacc 1494
<210> 20
<211> 498
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
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<400> 20
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
130 135 140
Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
245 250 255
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
260 265 270
Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr
275 280 285
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
290 295 300
Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys
305 310 315 320
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu
325 330 335
Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala
340 345 350
Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Pro Val Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly
370 375 380
Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
385 390 395 400
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
405 410 415
Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly
420 425 430
Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly
435 440 445
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe
450 455 460
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
465 470 475 480
Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln
485 490 495
Ile Thr
<210> 21
<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 5-10 VH"
<400> 21
gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtaa ggcctgggac ttcagtgaag 60
atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggtaaagcag 120
aggcctggac atggacttga gtggattgga gatattttcc ctggaagtgg taatatccac 180
tacaatgaga agttcaaggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcttc gagcacagcc 240
tatatgcagc tcagtagcct gacatttgag gactctgctg tctatttctg tgcaagactg 300
aggaactggg acgagcctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc 360
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 5-10 VH"
<400> 22
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
1 5 10 15
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
20 25 30
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 339
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 5-10 VL"
<400> 23
gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaa 339
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 5-10 VL"
<400> 24
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 25
<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 3-1 VH"
<400> 25
gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggtga aacctggggc ctcagtgaag 60
atatcctgca aggcttctgg atacgccttc actaactact ggctaggttg ggtaaagcag 120
aggcctggac atggacttga gtggattgga gatcttttcc ctggaagtgg taatactcac 180
tacaatgaga ggttcagggg caaagccaca ctgactgcag acaaatcctc gagcacagcc 240
tttatgcagc tcagtagcct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgcaagattg 300
aggaactggg acgaggctat ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc 360
<210> 26
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 3-1 VH"
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
20 25 30
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Asp Leu Phe Pro Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Arg
50 55 60
Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Phe Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 3-1 VL"
<400> 27
gagctcgtca tgacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60
attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaacct 120
gggaaaacta ataagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc ttgagatcaa a 321
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 3-1 VL"
<400> 28
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 372
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 4-7 VH"
<400> 29
gaggtgcagc tgctcgagca gtctggagct gagctggcga ggcctggggc ttcagtgaag 60
ctgtcctgca aggcttctgg ctacaccttc acaaactatg gtttaagctg ggtgaagcag 120
aggcctggac aggtccttga gtggattgga gaggtttatc ctagaattgg taatgcttac 180
tacaatgaga agttcaaggg caaggccaca ctgactgcag acaaatcctc cagcacagcg 240
tccatggagc tccgcagcct gacctctgag gactctgcgg tctatttctg tgcaagacgg 300
ggatcctacg atactaacta cgactggtac ttcgatgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct cc 372
<210> 30
<211> 124
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 4-7 VH"
<400> 30
Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn
20 25 30
Tyr Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Val Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Val Tyr Pro Arg Ile Gly Asn Ala Tyr Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Ser Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Thr Asn Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 4-7 VL"
<400> 31
gagctcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagcttgag atcaaa 336
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: 4-7 VL"
<400> 32
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 1470
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: anti-EpCAM (3-1)xhum. anti-CD3"
<400> 33
gagctcgtca tgacccagtc tccatcttat cttgctgcat ctcctggaga aaccattact 60
attaattgca gggcaagtaa gagcattagc aaatatttag cctggtatca agagaaacct 120
gggaaaacta ataagcttct tatctactct ggatccactt tgcaatctgg aattccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagtag cctggagcct 240
gaagattttg caatgtatta ctgtcaacag cataatgaat atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc ttgagatcaa aggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt 360
ggttctgagg tgcagctgct cgagcagtct ggagctgagc tggtgaaacc tggggcctca 420
gtgaagatat cctgcaaggc ttctggatac gccttcacta actactggct aggttgggta 480
aagcagaggc ctggacatgg acttgagtgg attggagatc ttttccctgg aagtggtaat 540
actcactaca atgagaggtt caggggcaaa gccacactga ctgcagacaa atcctcgagc 600
acagccttta tgcagctcag tagcctgaca tctgaggact ctgctgtcta tttctgtgca 660
agattgagga actgggacga ggctatggac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 720
tcctccggag gtggtggatc ccaggtgcag ctggtgcagt ctgggggagg cgtggtccag 780
cctgggaggt ccctgagact ctcctgtaag tcttctggat acaccttcac taggtatacg 840
atgcactggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt ggattggata cataaatcct 900
agccgtggtt atactaatta taatcagaag gtgaaggacc gattcaccat ctccagagac 960
aactccaaga acacggcctt tctgcaaatg gacagcctga gacccgagga cacgggtgtg 1020
tatttctgtg cgagatatta tgatgatcat tactgccttg actattgggg ccagggcacc 1080
ccggtcaccg tctcctcagt cgaaggtgga agtggaggtt ctggtggaag tggaggttca 1140
ggtggagtgg acgacatcca gatgacccag tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga 1200
gacagagtca ccatcacttg cagagcaagt tcaagcgtaa gctacatgaa ttggtatcag 1260
cagacaccag ggaaagcccc taagagatgg atctatgaca catccaaagt ggcttctggg 1320
gtcccatcaa ggttcagtgg cagtggatct gggacagatt acactttcac catcagcagt 1380
ctgcaacctg aagatattgc aacttactac tgtcaacagt ggagtagtaa ccctctcact 1440
tttggccagg ggaccaagct gcagatcacc 1470
<210> 34
<211> 490
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of artificial sequence: anti-EpCAM (3-1)xhum. anti-CD3"
<400> 34
Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu
115 120 125
Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val
145 150 155 160
Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Leu Phe Pro
165 170 175
Gly Ser Gly Asn Thr His Tyr Asn Glu Arg Phe Arg Gly Lys Ala Thr
180 185 190
Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe Met Gln Leu Ser Ser
195 200 205
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Leu Arg Asn
210 215 220
Trp Asp Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly
245 250 255
Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ser Ser
260 265 270
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr
290 295 300
Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
305 310 315 320
Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu
325 330 335
Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys
340 345 350
Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Val Glu
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp
370 375 380
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
385 390 395 400
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
405 410 415
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
420 425 430
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
435 440 445
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
450 455 460
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
465 470 475 480
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
485 490
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<221> source
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gagctcgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60
atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagcctcct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctt gagatcaaag gtggtggtgg ttctggcggc 360
ggcggctccg gtggtggtgg ttctgaggtg cagctgctcg agcagtctgg agctgagctg 420
gtaaggcctg ggacttcagt gaagatatcc tgcaaggctt ctggatacgc cttcactaac 480
tactggctag gttgggtaaa gcagaggcct ggacatggac ttgagtggat tggagatatt 540
ttccctggaa gtggtaatat ccactacaat gagaagttca agggcaaagc cacactgact 600
gcagacaaat cttcgagcac agcctatatg cagctcagta gcctgacatt tgaggactct 660
gctgtctatt tctgtgcaag actgaggaac tgggacgagc ctatggacta ctggggccaa 720
gggaccacgg tcaccgtctc ctccggaggt ggtggctccc aggtgcagct ggtgcagtct 780
gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc ctgagactct cctgtaagtc ttctggatac 840
accttcacta ggtatacgat gcactgggtc cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg 900
attggataca taaatcctag ccgtggttat actaattata atcagaaggt gaaggaccga 960
ttcaccatct ccagagacaa ctccaagaac acggcctttc tgcaaatgga cagcctgaga 1020
cccgaggaca cgggtgtgta tttctgtgcg agatattatg atgatcatta ctgccttgac 1080
tattggggcc agggcacccc ggtcaccgtc tcctcagtcg aaggtggaag tggaggttct 1140
ggtggaagtg gaggttcagg tggagtggac gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 1200
ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca gagcaagttc aagcgtaagc 1260
tacatgaatt ggtatcagca gacaccaggg aaagccccta agagatggat ctatgacaca 1320
tccaaagtgg cttctggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagattac 1380
actttcacca tcagcagtct gcaacctgaa gatattgcaa cttactactg tcaacagtgg 1440
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1 5 10 15
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Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
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Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly
130 135 140
Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn
145 150 155 160
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys
180 185 190
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225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln
245 250 255
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260 265 270
Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His
275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
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Claims (31)
- 이중특이적(bispecific) 결합 분자에 있어서, 상기 분자는 적어도 두 도메인을 포함하거나 두 도메인으로 구성되고,(a) 여기서 상기 두 도메인의 적어도 하나는 특이적으로 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하고, 여기서 상기 도메인은 항체 유래 경쇄(light chain)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 서열은(i) 서열식별번호 2의 아미노산 서열;(ii) 서열식별번호 1에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열;(iii) 엄격한 조건 하에서 (ii)에서 정의된 바와 같은 핵산 서열의 상보성 가닥(complementary strand)과 하이브리드하는(hybridizing) 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및(iv) (ii) 및 (iii) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로 디제너레이트된(degenerated) 핵산 서열로 인코드된 아미노산 서열이며,단, (i) 내지 (iv)에 따른 아미노산 서열은 Kabat 시스템에 따른 L24, L54 및 L96의 위치에서 경쇄의 CDR 영역에 있는 아미노산 치환체를 포함하고; 또한(b) 여기서 제2 도메인은 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소 및/또는 적어도 하나의 추가적인 작동 도메인(effector domain)이거나 또는 이들을 함유 하는 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1에 있어서, 상기 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하는 도메인이 위치 L24에 세린, 위치 L54에 발린 및 위치 L96에 류신을 갖는 것을 특징으로 하는 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 경쇄의 CDR 영역이 서열식별번호:4, 6 또는 8의 아미노산 서열 또는 서열식별번호:3, 5 또는 7의 핵산 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 구성되는 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 CD3 복합체에 결합/상호작용하는 상기 도메인은 scFv인 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 CD3 복합체와 결합/상호작용하는 상기 도메인은 서열식별번호:10의 아미노산 서열을 포함 또 는 이 서열로 구성되거나, 또는 서열식별번호:9의 핵산 서열에 의해 인코드되는 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 CD3 복합체와 결합/상호작용하는 상기 도메인은 서열식별번호:14로 나타낸 아미노산 서열 또는 서열식별번호:13의 핵산 서열에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 포함 또는 구성된 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 하나 이상의 세포 표면 분자(들)에 대해 특이적인 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소인, 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 7에 있어서, 상기 하나 이상의 세포 표면 분자(들)는 종양-특이적 분자(들)인 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서, 상기 제2 도메인은 추가적인 scFv인 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 7 내지 청구항 9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제2 도메인은 EpCAM, CCR5, CD19, HER-2, HER-3, HER-4, EGFR, PSMA, CEA, MUC-1(점액소), MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, bhCG, Lewis-Y, CD20, CD33, CD30, 강글리오시드 GD3, 9-O-아세틸-GD3, GM2, 글로보(Globo) H, 푸코실(fucosyl) GM1, 폴리 SA, GD2, 카르보안하이드라아제(Carboanhydrase) IX(MN/CA IX), CD44v6, 음파 고슴도치(Sonic Hedgehog)(Shh), Wue-1, 혈장 세포 항원, (막-결합)IgE, 흑색종 콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸(MCSP), CCR8, TNF-알파 전구체, STEAP, 메소텔린(mesothelin), A33 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), Ly-6 데스모글레인(desmoglein) 4, E-카드헤린 네오에피토프(cadherin neoepitope), 태아 아세틸콜린 수용체, CD25, CA19-9 표지, CA-125 표지 및 뮐러관 억제 물질(MIS) 수용체 타입 II, sTn(시알화(sialylated) Tn 항원; TAG-72), FAP(피브로블라스트 활성화 항원), 엔도시아린(endosialin), EGFRvIII, L6, SAS, CD63, TF-항원, 코라(Cora) 항원, CD7, CD22, Igα, Igβ, gp100, MT-MMPs, F19-항원 및 CO-29로 구성된 그룹으로부터 선택되는 항원과 특이적으로 결합/상호작용하는 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 10에 있어서, 상기 제2 도메인이 다음 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성되는 이중특이적 결합 분자.(a) 서열식별번호:16 또는 18에 대응하는 아미노산 서열;(b) 서열식별번호:15 또는 17에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열;(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
- 청구항 11에 있어서, 상기 분자가 다음 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성되는 이중특이적 결합 분자.(a) 서열식별번호:20에 대응하는 아미노산 서열 ;(b) 서열식별번호:21에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열 ;(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
- 청구항 10에 있어서, 상기 제2 도메인이 다음 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성되는 이중특이적 결합 분자.(a) 서열식별번호:22, 24, 26, 28, 30, 32에 대응하는 아미노산 서열 ;(b) 서열식별번호:21, 23, 25, 27, 29, 31에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열 ;(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
- 청구항 13에 있어서, 상기 분자가 다음 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이 서열로 구성되는 이중특이적 결합 분자.(a) 서열식별번호:34 또는 36에 대응하는 아미노산 서열 ;(b) 서열식별번호:33 또는 35에 대응하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미 노산 서열 ;(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 핵산 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열; 및(d) (b) 및 (c) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 핵산 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열.
- 청구항 7, 청구항 8, 청구항 9, 청구항 10, 청구항 11 또는 청구항 13 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항원-상호작용-장소가 인간화되는 이중특이적 결합 분자.
- 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열.
- 청구항 16에 있어서, 상기 핵산 분자는 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.(a) 서열식별번호:20, 34, 36의 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 성숙한 형태를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 ;(b) 서열식별번호:19, 33, 35의 그룹으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하거나 이 서열로 구성되는 뉴클레오티드 서열 ;(c) 엄격한 하이브리드형성 조건 하에서 (b)에 정의된 뉴클레오티드 서열의 상보성 가닥과 하이브리드하는 뉴클레오티드 서열; 및(d) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열의 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결손 및/또는 부가에 의해, (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 단백질로부터 유래된 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;(e) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열과 적어도 60% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;(f) (a) 내지 (e) 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열에 대한 유전 코드의 결과로서 디제너레이트되는 뉴클레오티드 서열.
- 청구항 16 또는 청구항 17에 의한 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 청구항 18에 있어서, 상기 벡터는 추가로 청구항 16 또는 청구항 17에 의한 상기 핵산 서열에 작동적으로(operably) 연결된 조절서열인 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 청구항 18 또는 청구항 19에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인 벡터.
- 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 하나의 항에 의한 벡터로 형질전환(transformed) 또는 형질변환된(transfected) 숙주.
- 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 의한 이중특이적 결합 분자의 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 이중특이적 결합 분자의 발현을 허용하고 배양물로부터 생산된 이중특이적 결합 분자를 회수하는 조건 하에서 청구항 21의 숙주를 배양하는 것을 포함하는 제조 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 의한 이중특이적 결합 분자 또는 청구항 22의 방법에 의해 제조된 이중특이적 결합 분자, 청구항 16 또는 청구 항 17의 핵산 분자, 청구항 18 내지 20 중 어느 하나의 항에 의한 벡터 또는 청구항 21의 숙주 및, 임의로 면역 작동 세포(immune effector cell)에 대한 활성 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물(proteinaceous compound)을 포함하는 조성물.
- 청구항 23에 있어서, 상기 조성물은 운반체, 안정화제 및/또는 부형제의 적합한 제형을 추가로 포함하는 약학적 조성물인 조성물.
- 청구항 23에 있어서, 상기 조성물은 증식 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환 또는 숙주대이식 질환을 검출하기 위한 수단 및 방법을 추가로 포함하는 진단용 조성물인 조성물.
- 증식 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환 또는 숙주대이식 질환의 예방, 치료 또는 완화를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 의한 이중특이적 결합 분자 또는 청구항 22 의 방법에 의해 제조된 이중특이적 결합 분자, 청구항 16 또는 청구항 17의 핵산 분자, 청구항 18 내지 20 중 어느 하나의 항에 의한 벡터 또는 청구항 21의 숙주의 용도.
- 예방, 치료 또는 완화가 필요한 대상에서 증식 질환, 종양성 질환, 염증성 질환, 면역학적 장애, 자가면역 질환, 감염 질환, 바이러스 질환, 알레르기성 반응, 기생성 반응, 이식대숙주 질환 또는 숙주대이식 질환의 예방, 치료 또는 완화를 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 의한 이중특이적 결합 분자 또는 청구항 22의 방법에 의해 제조된 이중특이적 결합 분자, 청구항 16 또는 청구항 17의 핵산 분자, 청구항 18 내지 20 중 어느 하나의 항에 의한 벡터 또는 청구항 21의 숙주의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 대상은 인간인 방법.
- 청구항 27 또는 청구항 28에 있어서, 면역 작동 세포에 대한 활성화 신호를 제공할 수 있는 단백질성 화합물의 투여를 추가로 포함하는 방법.
- 청구항 29에 있어서, 상기 단백질성 화합물은 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 의한 이중특이적 결합 분자 또는 청구항 22의 방법에 의해 제조된 이중특이적 결합 분자, 청구항 16 또는 청구항 17의 핵산 분자, 청구항 18 내지 20 중 어느 하나의 항에 의한 벡터 또는 청구항 21의 숙주와 동시에 또는 비-동시에 투여되는 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 하나의 항에 의한 이중특이적 결합 분자 또는 청구항 22의 방법에 의해 제조된 이중특이적 결합 분자, 청구항 16 또는 청구항 17의 핵산 분자, 청구항 18 내지 20 중 어느 하나의 항에 의한 벡터 또는 청구항 21의 숙주를 포함하는 키트.
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