CN102337298B

CN102337298B - 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用

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Publication number: CN102337298B
Application number: CN 201110240287
Authority: CN
Inventors: 黄开红; 陈茵婷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-08-19
Filing date: 2011-08-19
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2031-08-19
Also published as: CN102337298A

Abstract

本发明公开了一种输送siRNA的免疫纳米载体，所述免疫纳米载体的活性成分为单链抗体与siRNA输送载体的偶联产物，所述siRNA输送载体为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒。另外本发明还公开了该免疫纳米载体的制备方法。本发明免疫纳米载体将单链抗体与siRNA输送载体相偶联，既具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，而且是良好的靶向性输送特性，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

Description

一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的在生物界普遍存在的一种古老的生物学现象，是生物进化的产物。具体是指由双链RNA(double strand RNA，dsRNA)指导的，在特定酶参与下，以外源或内源mRNA为降解目标，在转录后水平上使特异性靶基因发生的沉默现象，即不表达。目前研究表明：RNAi广泛存在于从真菌到高等植物、从无脊椎动物到哺乳动物的大多数真核生物中，原核生物暂未发现。RNAi不仅参与了细胞正常的生长、发育、衰老和凋亡的调控，还可使外源基因导入时或病毒入侵后基因不被表达，从而成为生物体的一种有效的特异性自我防御机制。RNA干扰能特异而有效的阻断靶基因的表达外源性或内源性dsRNA，在细胞内导致与其序列同源的分子发生特异性降解，从而干扰相应基因的表达。dsRNA引起RNA干扰的过程为：核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的siRNA，大小约21-23bp。siRNA具有一些特征性结构：即siRNA的序列与所作用的靶mRNA序列具有同源性；siRNA两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。此外，每条单链的3′端均有2-3个突出的非配对的碱基，这种结构形式对siRNA进入蛋白复合体是必须的。siRNA是RNAi赖以发生的重要中间效应分子。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义链再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。携带反义链的的RISC与mRNA的互补序列特异性结合并切割mRNA。被切割后断裂的mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞内特定mRNA的降解反应。RNAi具有普遍、高效、特异、操作简单等突出优点，目前该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

胃癌的发生是一个多步骤多阶段的过程，其特征是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。还有凋亡相关基因的异常表达、部分自分泌生长因子和受体的过量表达也与细胞癌变有密切关系。研究发现，多个分子标志物与胃癌转移潜能相关，其中研究较为深入的包括CD44异构体6(CD44 variant isoform 6，CD44v6)。CD44由一个包含20个外显子的基因编码，其中10个外显子是组成型外显子，另外10个外显子可选择性拼接而被称为变异外显子(variant exon，v1-v10)。仅含有组成型外显子称为CD44标准体(CD44 standard form，CD44s)，而含有变异外显子则为CD44异构体(CD44 variant isoform，CD44v)。CD44s广泛存在于在正常组织和癌组织中，而CD44v主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生发展过程中。CD44v胞内区域与下游因子的选择性相互作用在协调细胞内信号通路起着重要作用，如Rho/Ras、酪氨酸激酶途径等，并与肿瘤细胞生长、迁移和侵袭作用密切相关。CD44v6是目前研究较为广泛的异构体，被认为是上皮起源恶性肿瘤，包括肝细胞癌，乳腺癌，结直肠癌和胃癌发生转移的分子标志物，尤其是胃癌发生转移相对特异的分子标志物，制备抗CD44v6单链抗体用于进展期胃癌的生物治疗，可以封闭性结合胃癌组织表达的CD44v6，阻断其与细胞外间质或基底膜的正常连接及其所促进的肿瘤细胞浸润转移，延缓肿瘤进展；破坏CD44v6蛋白在肿瘤细胞表面形成的糖蛋白伪装，有利于免疫系统对肿瘤细胞的识别和杀灭，抑制肿瘤的淋巴转移。采用RNAi技术可特异地抑制相关基因的表达，使这些基因呈现沉默或休眠状态.从而达到肿瘤治疗的目的。与传统的基因治疗的方法相比，RNAi能够实现同一基因家族的多个基因同时敲除，且抑制效果互不干扰，因为其特有的优势成为基因治疗的新策略。

siRNA给药载体的研究和开发一直是困扰各国科学家的关键问题。人们一直在研究合适的载体材料能有效地将siRNA药物分子输送到靶细胞和部位，并在一段合理时间维持其功效。目前所采用的载体体系大多是阳离子脂质体或水溶性的阳离子聚合物，将这些载体分子与siRNA溶液互混得到二者的复合物，从而实现传递siRNA的目的，这类方法的不足就是不容易放大规模并且重复性较差。另外，基于高分子的纳米颗粒已经广泛用于从小分子到生物活性DNA分子的传递的研究，取得了不菲成绩，其中很多成果已经用于临床或临床试验。

抗体对靶向抗原具有很高的特异性和亲和力，因此目前多选用特异抗体作为靶向性结合肿瘤细胞的小分子，并且在疾病诊断、预防和治疗等方面广泛应用。但传统方法制备的抗体由于分子量大和激发人体免疫反应，且难于通过血管内皮细胞间隙，临床应用受限。基因重组抗体可以制备单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)。scFv由重链可变区(variable domain of the heavy chain，VH)和轻链可变区(variable domain of the light chain，VL)通过柔性肽链连接起来。由于采用该技术获取的人源性scFv总体分子量小，易于通过血管内皮细胞间隙，且能保持对抗原的特异识别功能且不攻击人体的免疫系统。因而，采用scFv作为靶向性结合肿瘤细胞的小分子，在疾病诊断、预防和治疗等方面广泛应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供输送siRNA的免疫纳米载体，将单链抗体与siRNA输送载体相偶联，既具有粒径小、表面电位合适的理化性质，拥有良好siRNA复合能力、低细胞毒性和高转染率，而且是良好的靶向性输送特性。

一方面，本发明提供了一种输送siRNA的免疫纳米载体，所述免疫纳米载体的活性成分为单链抗体与siRNA输送载体的偶联产物，所述siRNA输送载体为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒。

优选地，所述单链抗体与聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒以等摩尔比构建偶联产物。

优选地，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。

其中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40-60kD之间，优选控制在50-60kD之间，最优为55KD；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40-50kD之间，更优地控制在42-48kD之间，最优为45KD。例如在本发明的实施例2中，即是选择2kD的单甲基醚聚乙二醇与25kD枝化聚乙烯亚胺以10∶1的摩尔比合成聚乙二醇-聚乙烯亚胺；而后再与55kD的超顺磁性氧化铁纳米粒子以偶联形成的siRNA输送载体，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55％。而且结合本发明实施例中的实验结果表明，采用上述分子量范围内或者本发明实施例中所用的成分，能够使siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。

另外，所述纳米颗粒的平均粒径为60-80nm，表面zeta电位为30-40mV。本发明实施例中纳米颗粒的平均粒径优选为67.3±2.0nm，表面zeta电位优选为34.38±1.66mV。

优选地，所述单链抗体为人源性CD44v6单链抗体，所述人源性CD44v6单链抗体基因具有如SEQ ID NO.1的核素序列，所述人源性CD44v6单链抗体具有如SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

另一方明，本发明还提供了一种真核细胞转染液，所述转染液包括siRNA和上述方案中揭示的免疫纳米载体，所述siRNA被吸附于免疫纳米载体形成复合物。

其中，其中，复合物的N/P比值计算公式为：

优选地，所述复合物的N/P比值控制在5-20之间。在合适的N/P比值情况下，纳米颗粒能够与siRNA完全结合形成稳定的负载siRNA分子的纳米颗粒。

从分子结构上分析，本发明提供免疫纳米载体的活性成分为单链抗体与siRNA输送载体的偶联产物，一方面，单链抗体单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)分子量小，使整个偶联产物总体分子量小，不影响免疫纳米载体的传输性能，易于通过血管内皮细胞间隙，而且由于scFv良好的靶向性，能够保持对抗原的特异识别功能且不攻击人体的免疫系统。另一方面，本发明中所用的siRNA输送载体含有由超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的纳米颗粒。其中，聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)是一种广泛采用的高分子纳米载体，是一种水溶性的高分子聚合物，具有一级、二级和三级胺，胺基基团所带的阳性电荷和核酸的磷酸基团带的阴性电荷中和，产生强大的核酸亲和力，形成稳定的PEI/核酸复合物。此外，PEI突出的优势在于结构灵活，易调整其分子量，可以通过引入侧链和特异靶向性基团来修饰多聚物骨架，进而调整和改善载体的性能，其体积比脂质体小，易于通过血管内皮间隙。然而，PEI和PEI/核酸复合物有较大的细胞毒性，而本发明的siRNA的输送载体中，通过聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修饰，构成PEG-g-PEI能够降低细胞毒性且保证PEI的基因转染效率。需要说明的是，本发明siRNA的输送载体用到的PEG是一种常用药用辅料，具有良好的水溶性，其分子量当控制在200-35,000Da之间。而超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)是一种高效的磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)造影剂，本发明的siRNA输送载体通过将SPION与PEG-g-PEI偶联形成PEG-g-PEI-SPION(PPS)，同时具备基因输送和MRI成像功能，通过MRI这一非侵入性成像技术能够及早地发现肿瘤并更准确地观察、分析治疗效果。本发明的siRNA的输送载体具有良好的生物相容性和可降解性，其在水溶液中自组装形成纳米颗粒，具有合适的理化性质，良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，同时拥有良好的siRNA复合能力，低细胞毒性和高转染率，作为载体能保护siRNA免于降解，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应，是一种安全、高效、优良的siRNA输送载体。

另一方面，本发明所解决的问题还在于提供了一种输送siRNA的免疫纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将末端带有羧基和马来酰亚胺的聚乙二醇水溶液与带有巯基单链抗体混合，4℃孵育过夜，巯基与马来酰亚胺偶联，形成单链抗体-末端带有羧基的聚乙二醇；

(2)复合溶液用PBS超滤洗涤，截留分子量为5kDa，去除未偶联的聚乙二醇；

(3)超滤后得到的单链抗体-末端带有羧基的聚乙二醇与siRNA输送载体以摩尔比混合，4℃孵育过夜，偶联形成输送siRNA的免疫纳米载体；

所述siRNA输送载体为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒；所述siRNA输送载体和单链抗体以等摩尔比构建偶联产物。

在本发明是具体实施方式中，以人源性CD44v6单链抗体为例，详细揭示本发明的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)MAL-PEG-COOH的水溶液与带有巯基的scFv_CD44v6混合，4℃孵育过夜，巯基与马来酰亚胺偶联，形成scFv_CD44v6-PEG-COOH；

(2)复合溶液用PBS超滤洗涤3-5次，截留分子量为5kDa，去除未偶联的MAL-PEG-COOH；

(3)超滤后得到的scFv_CD44v6-PEG-COOH与siRNA输送载体以摩尔比混合，4℃孵育过夜，偶联形成输送siRNA的免疫纳米载体。

其中，所述siRNA输送载体为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxide nanoparticles，PEG-g-PEI-SPION，简称PPS)；所述siRNA输送载体和人源性CD44v6单链抗体以等摩尔比构建偶联产物。

其中，所述人源性CD44v6单链抗体通过以下步骤获取：

(1)通过T7Select噬菌体展示库筛选获取CD44v6单链抗体基因，将此基因片段进行PCR扩增；

(2)将扩增产物与原核表达质粒pET-30b(+)进行Sal I和Not I双酶切、连接，构建重组质粒；

(3)将重组质粒转化至表达宿主，构建CD44v6单链抗体原核表达载体，表达纯化人源性CD44v6单链抗体。

在本发明的具体实施例中将具有胃癌靶向性的scFv_CD44v6与PPS偶联，构建胃癌靶向性输送siRNA的免疫纳米微粒s-PPS。通过凝胶阻滞试验证明，在N/P≥10时，s-PPS和PPS均完全复合siRNA。通过细胞毒性试验证明，s-PPS组细胞存活率和PPS组相似，无统计学差别，说明scFv_CD44v6并没有增加细胞毒性作用，而且靶向组和非靶向组细胞均具有极高的存活率。另外，siRNA转染率试验表明，在N/P＝5，10，15和20时，s-PPS和PPS的转染率均超过95％，与lipofectamine相仿，说明本发明的免疫纳米微粒s-PPS和其中用到的siRNA输送载体PPS均具有siRNA转化能力。同时，通过测定了3组细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)，Lipofectamine组MFI最高，明显高于s-PPS组和PPS组，说明lipofectamine向细胞内转染的siRNA数量最多。该结果与lipofectamine转染siCD44v6沉默CD44v6的效果较PPS组明显相符合。而且s-PPS较PPS转染更多siRNA进入细胞内。根据N/P比值计算公式，N/P比值越高，承载相同量siRNA所需的纳米载体量越多。而细胞所能胞吞纳米载体的数量是有限的，在纳米载体数量达到细胞胞吞的饱和量的情况下，N/P比值越高，进入细胞内的siRNA数量则越少。相应的，PPS组随着N/P比值的增加，MFI逐渐下降。然而，配体与受体结合加强细胞对纳米微粒的内吞作用。s-PPS上偶联的scFv_CD44v6与胃癌细胞表面CD44v6抗原结合，介导内吞作用，从而增加s-PPS/siRNA复合物的细胞摄取，体外展现了s-PPS向胃癌细胞的肿瘤靶向性输送siRNA。所以在同一N/P比值下，s-PPS组MFI高于PPS组。而随着N/P比值增加，非靶向组MFI下降，与靶向组的差别则变得明显。s-PPS和PPS与siNC-Cy3按N/P＝15复合转染SGC-7901细胞后，荧光显微镜下可见红色荧光出现在细胞胞浆，表明两组siRNA聚合物均已进入细胞内，且s-PPS组荧光强度较PPS组强，这与流式细胞仪检测MFI结果相符。由于scFv_CD44v6带有His·Tag标签蛋白，转染后以FITC标记小鼠抗6×His tag单克隆抗体进行细胞免疫荧光试验，可见s-PPS组出现绿色荧光，而PPS组则无绿色荧光出现，说明scFv_CD44v6与PPS能够成功偶联。

另外，本发明还公开本发明的免疫纳米载体和真核细胞靶向转染液在制备癌症基因治疗药物中的应用，尤其是在制备胃癌基因治疗药物中的应用。本发明通过细胞毒性实验证明本发明的免疫纳米载体具有良好的生物相容性，同时具有很好的稳定性、靶向性和方便制备等特点，在siRNA输送和基于RNA干扰的疾病治疗中具有良好的应用前景。

附图说明

图1A是本发明实施例1中重组质粒PCR产物电泳图一，图中M：100bp DNA Marker；1、2：2个重组质粒的Ligation PCR产物。

图1B是本发明实施例1中重组质粒PCR产物电泳图二，M：100bp DNA Marker；1-10：10个单克隆菌落的菌液PCR产物，图中可见1-3、5、8-10号单克隆PCR产物大小亦约为1100bp，为合适的克隆菌落。

图2重链区域氨基酸序列分析图。

图3是SDS-PAGE和Western Blotting鉴定scFv_CD44v6表达实验结果图。其中，A是实施例1中SDS-PAGE鉴定试验中蛋白电泳后考马斯亮蓝染色图样。B是实施例1中针对scFv_CD44v6表达做的Western blot检测结果图。其中，Marker：预染蛋白marker；1：无IPTG诱导的细菌总蛋白；2：IPTG诱导的细菌总蛋白；3：IPTG诱导的细菌可溶蛋白；4：IPTG诱导的细菌包涵体蛋白；5：纯化复性后的scFv_CD44v6。

图4是scFv_CD44v6抗原结合特异性鉴定试验结果图一。其中，A图中CD44v6mAb作为一抗与蛋白膜孵育；B图中scFv_CD44v6作为一抗与蛋白膜孵育；C图中CD44v6 mAb、CD44 mAb和scFv_CD44v6分别作为一抗与蛋白膜孵育。各图中，M：生物素标记蛋白ladder；1：SGC-7901总蛋白；2：重组人可溶性CD44std。

图5是凝胶阻滞电泳图。其中，图A PEG-g-PEI-SPION/siRNA复合物；图B scFv_CD44v6-PEG-g-PEI-SPION/siRNA复合物。各泳道为1：裸siRNA；2-6：N/P 比值＝2.5，5，10，15和20。

图6是细胞存活率实验结果图。

图7A是转染率测定结果图。

图7B是MFI测定试验结果图。

图8是s-PPS/siRNA复合物细胞内分布图。

图9是MRI成像图。

图10是肿瘤组织苏木精-伊红染色和普鲁士蓝染色图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。

本发明的以下实施方式中，将具有胃癌靶向性的scFv_CD44v6与siRNA输送载体PEG-g-PEI-SPION(PEG-g-PEI-SPION(polyethylene glycol-grafted polyethylenimine and superparamagnetic iron oxide nanoparticles，PEG-g-PEI-SPION，简称PPS)偶联，构建胃癌靶向性输送siRNA的免疫纳米微粒scFv_CD44v6-PEG-g-PEI-SPION(以下简称s-PPS)。并以PPS向胃癌细胞输送靶向CD44v6基因的siRNA(siCD44v6)为例，研究s-PPS的siRNA复合能力、细胞毒性、转染效率、平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)以及细胞内分布等生物学特性。并观察其在裸鼠体内胃癌靶向性、MRI成像能力，并且揭示了其在制备基因治疗药物尤其是癌症治疗药物中的应用。

下列实施例中，采用的生物材料及其来源为：

1、细胞株

人胃腺癌细胞株SGC-7901购买自上海生物化学与细胞研究所。人胃正常上皮细胞株GES-1购买于北京肿瘤研究所。人恶性黑色素瘤细胞株A375由上海肿瘤研究所惠赠。

2、裸鼠

雌性裸鼠，4周龄，体重约14-16g，购于中山大学实验动物中心，SPF级培养。

3、主要试剂

实施例1、scFv_CD44v6的表达纯化

按照如下步骤实现scFv_CD44v6的表达纯化

(1)通过T7Select噬菌体展示库筛选获取CD44v6单链抗体基因，将此基因片段进行PCR扩增。

CD44v6单链抗体基因通过T7Select噬菌体展示库筛选获取，在克隆区域的上、下游分别含有T7Select引物序列。其中，人源性CD44v6单链抗体基因具有如SEQ ID NO.1的核素序列，人源性CD44v6单链抗体具有如SEQ ID NO.2的氨基酸序列。

其中，克隆区域的上、下游分别含有T7Select引物序列为：

T7Select Up primer：5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′<SEQ ID NO.3>

T7Select Down primer：5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′<SEQ ID NO.4>

(2)将扩增产物与原核表达质粒pET-30b(+)进行Sal I和Not I双酶切、连接，构建重组质粒。

scFv_CD44v6基因两端具有Sal I(5′-G^*TCGAC-3′)和Not I(5′-GC^*GGCCGC-3′)双内切酶位点，将基因扩产物进行酶切后，用T4多聚核苷酸激酶进行末端去磷酸化，而后纯化回收目的DNA片段；

将质粒pET-30b(+)进行类似Sal I和Not I双酶切和末端去磷酸化处理，而后采用T4DNA连接酶将scFv_CD44v6基因与pET-30b(+)质粒重组连接；

而后采用如下引物对重组质粒进行PCR鉴定，检测电泳图如图1A所示：

T7promoter primer：5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′<SEQ ID NO.5>

T7terminator primer：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′<SEQ ID NO.6>

再将重组质粒转化至克隆宿主菌大肠杆菌DH5α中，通过上述T7 promoter primer和T7 terminator primer，进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图1B所示；

CD44v6单链抗体基因与pET-30b(+)质粒经Sal I和Not I双酶切、连接后，首先通过ligation PCR初步鉴定重组质粒连接成功。如图1A所示，重组质粒的Ligation PCR产物大小约为1100bp，符合预计。重组质粒转化DH5α，挑取多个单克隆菌落，其菌液PCR产物大小亦约为1100bp(图1B)。选取阳性克隆进行测序。测序结果证实scFv_CD44v6基因大小为756bp，其中1-390bp，391-435bp以及436-756bp分别编码scFv_CD44v6重链区域、(Gly₄Ser)₃linker区域和轻链区域。然而由于在重链序列末端出现终止子，翻译中断，所以scFv_CD44v6仅含有重链区域，其氨基酸序列分析如图2所示。

根据菌落PCR鉴定结果，选择合适的菌株进行质粒抽提，获取重组质粒。

采用BL21(DE3)plysS作为scFv_CD44v6表达宿主，实现CD44v6单链抗体的表达，而后通过通过SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白scFv_CD44v6表达的部位、分子量大小以及是否含有His·Tag标签蛋白。

重组质粒转化表达宿主菌BL21(DE3)plysS后，在IPTG诱导作用下表达外源基因蛋白scFv_CD44v6。IPTG诱导后将细菌裂解提取总蛋白、可溶蛋白、包涵体蛋白以及纯化的scFv_CD44v6进行SDS-PAGE试验，初步鉴定scFv_CD44v6在细菌的表达部位及其分子量大小。如图3所示，A图中，IPTG诱导后的细菌总蛋白、包涵体蛋白较无IPTG诱导的细菌总蛋白增加了一条大小约20kDa条带，且这一条带与Ni柱纯化、复性后蛋白的大小一致，证实scFv_CD44v6表达部位在包涵体，其分子量大小为20kDa。B图中，Western blot试验为进一步证实SDS-PAGE试验结果并证明scFv_CD44v6带有His·Tag标签蛋白。

另外，对scFv_CD44v6的抗原特异性进行鉴定，一方面，通过Western blot分析证实scFv_CD44v6与小鼠抗人CD44v6单克隆抗体所结合的抗原一致，选取在前期研究中已证实表达CD44v6的人胃腺癌细胞SGC-7901，提取细胞总蛋白进行Western blot试验。另一方面，并以重组人可溶性CD44std蛋白作为对照，证实scFv_CD44v6结合的抗原是CD44v6而不是CD44std。将SGC-7901细胞总蛋白与重组人可溶性CD44std蛋白上样，分别以CD44v6mAb、CD44std mAb、scFv_CD44v6为一抗进行Western blot试验。如图4A和4B所示，当上样蛋白为SGC-7901总蛋白，分别以scFv_CD44v6和CD44v6mAb作为一抗与蛋白膜孵育，两者所出现的条带大小相一致。当上样蛋白为重组人可溶性CD44std，以scFv_CD44v6和CD44v6mAb作为一抗与蛋白膜孵育，两者均没有出现条带(图4C)。而CD44mAb能同时检测到SGC-7901总蛋白中的CD44std以及重组人可溶性CD44std，两者出现的条带大小相一致。从而证实SGC-7901同时表达CD44v6和CD44std，而scFv_CD44v6仅与CD44v6结合，并且所出现条带大小与CD44v6mAb相同。

实施例2、PPS纳米颗粒的制备

1、聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺(mPEG-g-PEI)的合成。

称取4.0g单甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)于干燥两口瓶中60℃真空干燥8h，冷却后Ar保护下加入30mL已干燥的四氢呋喃(THF)，充分溶解。称取N，N’-羧基二咪唑(CDI)3.2g置于另一干燥两口瓶中，Ar保护下将溶有mPEG-OH的THF溶液缓慢滴加到两口瓶中，室温下继续搅拌反应12h。加入200μL水使过量的CDI失活，反应进行0.5h，用大量无水乙醚沉淀2次，过滤后干燥得白色粉末状固体。

再称取支化聚乙烯亚胺(hy-PEI，25kD)1.1g和上述白色粉末0.8g共溶于20mL CHCl₃，室温下继续搅拌反应24h。而后通过再生纤维透析除去CHCl₃，部分溶质在常压下挥发，将浓缩后的溶液用大量无水乙醚沉淀3次，收集沉淀物干燥得白色粉末状固体，产率为80％。对产物进行核磁共振分析(H-NMR)，其结果为：¹H-NMR in CDCl₃：2.5-2.9ppm(m，-CH₂CH₂NH-)，3.4ppm(s，CH₃-OCH₂CH₂-)，3.65ppm(s，-OCH₂CH₂-)，4.2ppm(t，-OCH₂CH₂-O(C＝O))。与理论值相符，从而表明PFG成功接枝于PEI分子链中。

2、PPS的制备。

将300mg mPEG-g-PEI溶解于3ml氯仿中，而后使15mg超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION，55kD)均匀分散于该溶液中，室温下继续搅拌过夜。而后加入大量正己烷沉淀，离心收集沉淀物，用正己烷洗涤2次，而后进行真空干燥除去有机溶剂。将上述得到的产物通过超声波均匀溶解于双蒸水，并通过200nm超滤膜除去大的凝聚颗粒。

需要说明的是，实施例1仅仅是本发明中制备PPS的一种实现方式，其中采用的单甲基醚聚乙二醇(mPEG-OH，2kD)和二支化聚乙烯业胺(hy-PEI，25kD)均购自Sigma公司，而超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPION，55kD)由中山大学化学与工程学院合成提供，PPS也是根据实施例1中方案委托中山大学化学与工程学院合成，通过对胶粒理化性质的测试，超顺磁性氧化铁纳米粒子占胶粒质量的55％。当然，在本发明的其他实施例中，对于PPS的制备也会根据需要，对其用料和方法上做出调整，以实现解决本发明的技术问题为准。为此，本发明的技术方案中，超顺磁性氧化铁纳米粒子控制在40-60kD之间，优选控制在50-60kD之间，最优为55KD；聚乙二醇-聚乙烯亚胺控制在40-60kD之间，优选控制在40-50kD之间，更优控制在42-48kD之间，最优为45KD。而PPS纳米颗粒的平均粒径则应控制在60-80nm之间，表面zeta电位为30-40mV。采用上述分子量范围内或者本发明实施例中所用的成分，能够使siRNA载体与待输送的siRNA有效结合，提高siRNA的输送效率，对RNA干扰效果有积极的影响。

实施例3、PPS/siRNA和s-PPS/siRNA复合物的制备及其理化性质的测定

1、PPS/siRNA复合物的制备及其理化性质的测定

(1)PPS溶于灭菌去离子水，按照不同的N/P比值，将一定量的siRNA溶液与PPS溶液在去离子水或PBS中轻轻混匀，室温下静置孵育10-15分钟，即得到不同N/P值的PPS/siRNA复合物。

其中，PPS/siRNA N/P比值计算公式

(2)粒径和电位的测定

按N/P比值5，10，15，20形成PPS/siRNA复合物，各复合物所含siRNA量设定为10μg，用去离子水稀释至500μl，用Zeta-Plus粒度分析仪测定复合物的粒径和电位。每个样本测定5次，所得数值表示为均数±标准差。

测定结果表明，PPS的平均粒径是67.3±2.0nm，表面zeta电位为34.38±1.66mV。当其与siRNA复合形成PPS/siRNA复合物后，粒径和电位随N/P比值的增加而变化，详见表1。N/P＝5和10时，复合物粒径分别为98.5±2.2nm和93.8±0.6nm，随着N/P比值增加粒径缩小，当N/P＝20时复合物粒径为88.4±2.6nm。此外，复合物的zeta电位随着N/P比值增加而增大，N/P＝5和10时，zeta电位分别为4.18±0.18mV和15.10±0.64mV，而N/P＝20时，zeta电位增加至18.22±1.20mV。

表1不同N/P比值下PPS/siRNA复合物的粒径和电位

数据以均数±标准差表示。

(3)s-PPS的构建

scFv_CD44v6与PPS按1∶1摩尔比偶联，过程简述如下：

①末端带有羧基和马来酰亚胺(maleimide，MAL)的PEG(MAL-PEG-COOH)水溶液与带有巯基scFv_CD44v6，4℃孵育过夜。

②巯基与马来酰亚胺偶联，形成scFv_CD44v6-PEG-COOH。

③复合溶液用PBS超滤洗涤3次，截留分子量为5kDa，去除未偶联的MAL，-PEG-COOH。

④超滤后的scFv_CD44v6-PEG-COOH与PPS溶液4℃孵育过夜。

⑤羧基与氨基偶联，形成s-PPS。

(4)s-PPS/siRNA复合物的制备

以s-PPS和siRNA为原料，参见PPS/siRNA复合物的制备方法制备s-PPS/siRNA复合物。

3、凝胶阻滞电泳

凝胶阻滞电泳用于评估s-PPS复合siRNA的能力。按照不同的N/P比值(1-10)，合成s-PPS/siRNA复合物，各复合物所含siRNA量设定为10pmol。将复合物分别与6×DNA上样缓冲液、胶体金溶液混匀后上样，在1％的琼脂糖凝胶上恒压100V电泳15分钟。并以PPS/siRNA复合物作为参照，在UV凝胶成像仪上观察条带并照相。

带负电荷的siRNA在电场中从负极向正极泳动。当带正电荷s-PPS按不同的N/P比值复合siRNA后，部分或全部中和siRNA所带的负电荷，从而使siRNA在电场中无法泳动。如图5A和5B所示，PPS/siRNA(图5A)和s-PPS/siRNA(图5B)在N/P＝5时形成复合物，siRNA条带亮度较裸siRNA明显减弱。当N/P＝10和20时，siRNA条带消失，表明s-PPS和PPS均完全复合siRNA并将siRNA所带的负电荷完全中和，故无siRNA泳出。

实施例4、细胞培养及细胞毒性试验

1、细胞培养

人胃腺癌细胞株SGC-7901、人胃正常上皮细胞株GES-1、人恶性黑色素瘤细胞株A375在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基，恒温37℃，5％CO₂培养箱中培养。

2、细胞毒性试验

为评估s-PPS/siRNA复合物对SGC-7901的细胞毒性，按N/P比值2.5，5，10，15，20形成s-PPS/siRNA复合物，并以PPS/siRNA复合物作为对照，对SGC-7901细胞进行MTT细胞毒性试验。每组设3个复孔，该实验独立重复3次，所得数值表示为均数±标准差。

(1)SGC-7901细胞接种在96孔板，5×10³/孔，贴壁生长24小时。

(2)去除旧培养基，加入N/P比值为1.25，5，10，20的s-PPS/siRNA复合物及新鲜培养基共200μl，各复合物所含siRNA量设定为100nM。空白组仅含DMEM培养基，对照组含细胞和DMEM培养基。

(3)37℃，5％CO₂培养箱中培养48小时后，每孔加入20μl MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4小时。

(4)去除培养基和MTT溶液，每孔加入DMSO溶液150μl，室温下摇床混匀10分钟。

(5)以空白组调零，酶标仪检测492nm吸光度值。

细胞存活率(％)＝(A_实验组/A_对照组)×100％。

SGC-7901细胞分别与不同N/P比值的PPS/siRNA和s-PPS/siRNA复合物孵育48小时后，细胞存活率如图6所示。随着N/P比值增加，细胞存活率逐渐下降。N/P＝10时，PPS和s-PPS细胞存活率分别为77.61％±1.24％和75.00％±1.61％。当N/P＝20时，两组细胞存活率分别为68.01％±2.93％和66.32％±3.08％。

实施例5、转染率测定实验

按N/P比值5，10，15，20形成s-PPS/siNC-Cy3复合物，并以PPS/siNC-Cy3和lipofectamine/siNC-Cy3复合物作为对照，转染SGC-7901细胞。通过流式细胞仪检测各组转染率和平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。具体按照如下步骤测定转染率：

(1)转染前24小时，SGC-7901细胞以2×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

(2)按不同的N/P比值3，5和10分别制备PPS/siNC-Cy3复合物。100pmol荧光标记的siNC-Cy3和一定量的PPS水溶液先后加入400ulPBS溶液中，轻轻吹打混匀，室温下孵育10-15分钟。

(3)弃去6孔板中旧DMEM培养基，每孔加入1.6ml新鲜的DMEM完全培养基。然后将上述400μl混合物逐滴加入孔板中，轻轻摇匀。

(4)同时以lipofectamine作为对照，lipofectamine/siNC-Cy3复合物的形成参照Lipofectammine 2000说明书进行。

(5)37℃，5％CO₂培养箱中培养4小时后，去除旧DMEM培养基，每孔加入2ml新鲜的DMEM完全培养基，继续培养。

(6)12小时后去除旧培养基，PBS轻轻洗细胞一遍后，用0.25％的胰酶把细胞从6孔板上消化下来，1,000转离心5分钟，去上清。

(7)PBS重悬细胞，1,000转离心5分钟，去上清。

(8)用0.5ml PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

以上均为避光操作。

检测不同N/P比值下s-PPS的转染率，并以PPS和lipofectamine作为对照。如图7A所示，N/P＝5，10，15和20时，s-PPS和PPS的转染率均超过95％，与lipofectamine相仿。此外，随着N/P比值增加，s-PPS和PPS的转染率并没有明显增加，且两组在同一N/P比值下无统计学差别。

MFI反映了细胞内化的siRNA复合物数量的多少。虽然转染率在3组之间没有明显差别，但是MFI在3组之间有统计学差别。如图7B所示，lipofectamine的MFI最高，为133.23±4.69，明显高于s-PPS和PPS。而在同一N/P比值下，s-PPS的MFI则高于PPS。N/P＝15和20时，s-PPS的MFI为78.74±3.53和73.57±4.46，PPS的MFI为60.00±2.30和46.91±3.83，两组之间有统计学差别，说明s-PPS较PPPS转染更多siRNA进入细胞内。

实施例6、荧光成像和和细胞免疫荧光试验

(1)s-PPS/siNC-Cy3和PPS/siNC-Cy3按N/P＝15复合、转染SGC-7901细胞4小时后，去除旧培养基，PBS轻轻洗细胞一遍后，加入2ml PBS，并在荧光显微镜下观察细胞荧光图像，了解复合物在细胞内分布情况。上述为避光操作。

(2)转染结束后进行细胞免疫荧光试验。由于scFv_CD44v6带有His·Tag标签蛋白，以FITC标记小鼠抗6×His tag单克隆抗体进行细胞免疫荧光试验，可证实scFv_CD44v6与PPS偶联成功。结合转染后荧光图像，观察siNC-Cy3、s-PPS在细胞内分布情况。

①去除PBS，每孔加入200μl 4％多聚甲醛，室温下固定10min。

②PBS轻轻洗细胞2次。

③每孔加入200μl 0.2％Triton X-100/PBS，室温下透化10min。

④PBS轻轻洗细胞2次。

⑤每孔加入200μl 1％BSA/PBS，室温下低速摇床封闭30min。

⑥去除封闭液，分别孵育FITC标记小鼠抗6×His tag单克隆抗体(10μg/ml)，室温下低速摇床孵育30min。

⑦去除抗体，加入PBS轻轻洗细胞2次。

⑧染核。Hoechest 33342工作液染核5min。

⑨PBS轻轻洗细胞2次。加入少量PBS，置于荧光显微镜下观察、拍照。

按N/P＝15转染SGC-7901细胞4小时后，荧光显微镜下观察s-PPS/siNC-Cy3和PPS/siNC-Cy3复合物细胞内分布情况。如图8所示，两组细胞胞浆均有红色荧光出现，表明siNC-Cy3复合物已进入细胞内。而且s-PPS组荧光强度较PPS组强，这与流式细胞仪检测MFI结果相符。

细胞经4％多聚甲醛固定、孵育FITC标记小鼠抗6×His tag单克隆抗体后，如图8免疫荧光染色图所示，s-PPS组出现绿色荧光，而PPS组则无绿色荧光出现。说明scFv_CD44v6与PPS成功偶联，并且s-PPS已被细胞内化。当绿色荧光(s-PPS)、红色荧光(siNC-Cy3)和蓝色荧光(核染色)3图重叠，如白色箭头所示，部分s-PPS/siNC-Cy3在细胞内尚未解离；如红色箭头所示，部分s-PPS/siNC-Cy3在细胞内已解离。

实施例7、体内胃癌靶向性试验

(1)裸鼠皮下移植瘤形成。

取SGC-7901和A375细胞，分别以2.0×10⁶和3.0×10⁶密度接种在同一裸鼠右侧和左侧大腿背侧皮下，共12只。约7-10天形成大小约200-400mm³SGC-7901皮下移植瘤(靶向肿瘤)和A375皮下移植瘤(非靶向肿瘤)。

(2)MRI成像。

荷瘤小鼠随机分为s-PPS和PPS两组。按铁∶裸鼠体重＝3.36μg∶1g于裸鼠尾静脉注射s-PPS和PPS。注射前行MRI扫描。注射后于0h，3h，6h和12h再次行MRI扫描。观察两组注射前后SGC-7901皮下移植瘤(靶向肿瘤)和A375皮下移植瘤(非靶向肿瘤)T₂加权信号的改变。

(3)组织病理学分析。

MRI扫描结束后，颈椎脱臼处死小鼠，取出皮下移植瘤，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片。切片进行苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，简称HE)染色和普鲁士蓝染色。

建立裸鼠皮下移植瘤动物模型，观察s-PPS能否在体内结合特异性肿瘤。选择SGC-7901(CD44v6阳性)为靶向肿瘤(右侧)，A375(CD44v6阴性)为非靶向肿瘤(左侧)，尾静脉注射s-PPS，对照组则注射PPS。由于SPION是一种MRI造影剂，当SPION与组织结合后可使T₂信号减低。如图9如绿色箭头所示，s-PPS组的靶向肿瘤T₂信号减低，而非靶向肿瘤T₂信号无明显变化。而PPS组靶向和非靶向肿瘤的T₂信号均无明显变化。证实s-PPS可在体内靶向性结合特异性肿瘤。

MRI扫描结束后，裸鼠皮下移植瘤石蜡包埋、切片。如图10箭头所示，普鲁士蓝染色后，蓝色颗粒仅出现在s-PPS组的靶向肿瘤，而非靶向肿瘤以及PPS组的靶向和非靶向肿瘤均无蓝色颗粒出现。进一步证实s-PPS体内胃癌靶向性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种输送siRNA的免疫纳米载体，其中，所述免疫纳米载体的活性成分为单链抗体与siRNA输送载体的偶联产物，所述siRNA输送载体为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒；其中，所述单链抗体为人源性CD44v6单链抗体，该人源性CD44v6单链抗体基因的序列为SEQ ID NO.1；其中，所述超顺磁性氧化铁纳米粒子的分子量控制在40-60kD之间，聚乙二醇-聚乙烯亚胺的分子量控制在40-60kD之间；所述纳米颗粒的平均粒径为60-80nm，表面zeta电位为30-40mV。

2.根据权利要求1所述的免疫纳米载体，其中，所述单链抗体与聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒以等摩尔比构建偶联产物。

3.根据权利要求1所述的siRNA输送载体，其中，所述聚乙二醇-聚乙烯亚胺为单甲基醚聚乙二醇接枝支化聚乙烯亚胺形成的水溶性共聚物，所述水溶性共聚物通过配体交换包裹超顺磁性氧化铁纳米粒子。

4.根据权利要求1所述的免疫纳米载体，其中，所述人源性CD44v6单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

5.一种输送siRNA的免疫纳米载体的制备方法，其包括如下步骤：

（1）将末端带有羧基和马来酰亚胺的聚乙二醇水溶液与带有巯基的单链抗体混合，4℃孵育过夜，巯基与马来酰亚胺偶联，形成单链抗体-末端带有羧基的聚乙二醇；其中，所述单链抗体为人源性CD44v6单链抗体，该人源性CD44v6单链抗体基因的序列为SEQ ID NO.1；

（2）复合溶液用PBS超滤洗涤，截留分子量为5kDa，去除未偶联的聚乙二醇；

（3）超滤后得到的单链抗体-末端带有羧基的聚乙二醇与siRNA输送载体以摩尔比混合，4℃孵育过夜，偶联形成输送siRNA的免疫纳米载体；

所述siRNA输送载体为超顺磁性氧化铁纳米粒子与聚乙二醇-聚乙烯亚胺偶联形成的聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁纳米颗粒；所述siRNA输送载体和单链抗体以等摩尔比构建偶联产物；其中，所述超顺磁性氧化铁纳米粒子的分子量控制在40-60kD之间，聚乙二醇-聚乙烯亚胺的分子量控制在40-60kD之间；所述纳米颗粒的平均粒径为60-80nm，表面zeta电位为30-40mV。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，所述人源性CD44v6单链抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

7.一种真核细胞靶向转染液，其中，所述转染液包括siRNA和如权利要求1-4中任意一项所述的免疫纳米载体，所述siRNA被吸附于免疫纳米载体形成复合物。

8.如权利要求1-4中任意一项所述的免疫纳米载体在制备癌症基因治疗药物中的应用。

9.如权利要求7所述的真核细胞靶向转染液在制备癌症基因治疗药物中的应用。