CN108024961A - 使用靶向Hsp47和p21的RNAi分子的恶性肿瘤治疗组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过向所述哺乳动物施用治疗有效量的含RNAi分子的组合物从而在有需要的哺乳动物中预防或治疗恶性肿瘤的方法和组合物，所述RNAi分子能具有降低Hsp47表达的活性，或者是对Hsp47和P21有活性的RNAi分子的组合。

Description

使用靶向Hsp47和p21的RNAi分子的恶性肿瘤治疗组合物和 方法
技术领域
本发明涉及由基于核酸的分子构成的生物药物和治疗剂领域。更具体地，本发明涉及用于递送RNA干扰剂以预防、治疗或改善涉及恶性肿瘤的病症和疾病的影响的方法和组合物。
序列表
本申请包括2015年12月20日创建的、名为ND5123767WO_SL.txt、以电子方式作为ASCII文件提交的序列表，其大小为100,000字节，并且通过引用的方式整体并入本文。
背景技术
恶性肿瘤的生长与细胞外基质(ECM)有关。分子伴侣“热休克”蛋白Hsp47参与调节ECM基因转录网络。
Hsp47表达可以在乳腺癌和其他癌症中被激活。减少Hsp47可以减少乳腺癌细胞的生长，并限制肿瘤生长。
Hsp47的表达增加可能是乳腺癌患者生存结果差的因素。Hsp47表达可能促进癌症进展，部分是通过增加ECM蛋白而导致的。参见例如Cancer Res,2015,75(8)；1580-91。
Hsp47可以在胰腺癌中高度表达。Hsp-47可能是口腔癌检测有用的特异性标记物。
Hsp47或其同源基因序列公开为例如GenBank登录号ABO 10273(人)，X60676(小鼠)或M69246(大鼠，gp46)。
已经公开了用于抑制Hsp47的药剂用于抑制纤维化。参见例如US 8,173,170 B2和US 8,710,209 B2。然而，关于抑制Hsp47在恶性肿瘤发展、进展和生长中的影响的信息有限。
p21是由CDKN1A基因编码并属于CIP/KIP家族的细胞周期调节蛋白。该蛋白具有通过结合复合物抑制细胞周期蛋白CDK-复合物的作用从而在G1期和G2/M期抑制细胞周期进展的功能。具体来说，p21基因经肿瘤抑制基因之一p53激活。据报道，由于DNA损伤等激活p53时，p53激活p21，使得细胞周期在G1期和G2/M期停滞。
p21在多种人类癌症(包括前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌和鳞状细胞癌)中过表达，在许多情况下，p21上调与肿瘤分级、浸润性和侵袭性呈正相关。参见例如Chang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,Vol.97,No.8,pp.4291-96。也报道了，p21的上调与许多形式的癌症，包括脑、前列腺、卵巢、乳腺和食道细胞癌的致瘤性和预后差相关。参见例如Winters等,Breast Cancer Research,2003,Vol.5,No.6,pp.R242-R249。此外，该疾病可以是年龄相关疾病，包括动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、淀粉样变性和关节炎。参见例如Chang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,Vol.97,No.8,pp.4291-96。
迫切需要方法和组合物来开发恶性肿瘤患者的治疗方法，例如用于抑制Hsp47和p21表达的siRNA序列、化合物和结构。
人们需要用于预防或治疗恶性肿瘤的方法和组合物。持续需要用于预防、治疗或减少恶性肿瘤的靶向Hsp47、p21和其他结构的RNAi分子和组合物。
发明内容
本发明涉及通过用Hsp47的siRNA抑制剂、以及Hsp47抑制剂与p21的抑制剂的组合进行的治疗可以在体内减少恶性肿瘤大小的惊人发现。
本发明涉及包括基于核酸的治疗化合物的方法和组合物，其用于递送至各种器官以预防、治疗或改善恶性肿瘤的病症和疾病。在一些实施方案中，本发明提供了用于与恶性肿瘤相关各种靶的基因沉默的RNA干扰分子(RNAi分子)的组合物。
本发明可以提供用于递送治疗性分子的组合物及其使用方法。本发明的各种基于RNA和药物组合物可用于预防或治疗恶性肿瘤的方法。
本发明涉及抗恶性肿瘤的基于核酸的治疗化合物的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供可以沉默Hsp47、以及Hsp47和p21表达的RNAi分子、结构和组合物。本公开的结构和组合物可用于预防治疗或减少恶性肿瘤的大小。
在某些实施方案中，本发明提供了双链核酸分子，其是RNAi分子，例如用于遏制Hsp47的siRNAs或shRNAs。本发明的实施方案还可以提供用于遏制p21的RNAi分子。
在某些实施方案中，抑制性核酸分子可以是反义核酸分子、小干扰RNA(siRNA)或双链RNA(dsRNA)。
本发明的RNAi分子可对于基因沉默均具有活性，例如有基因沉默活性的dsRNA、siRNA、微小RNA或有基因沉默活性的shRNA、以及DNA导向RNA(ddRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)。
在另外一些实施方案中，本发明的方法可以减少恶性肿瘤中Hsp47和/或p21的转录或翻译。
在具体实施方案中，本发明包括在恶性肿瘤细胞中降低Hsp47表达或降低Hsp47和p21表达的方法，其中细胞可以是人细胞、肿瘤细胞、体内细胞或体外细胞。
本发明的实施方案还可以提供用于治疗有肿瘤的受试者的方法，其中肿瘤癌细胞显示异常的Hsp47表达水平。所述方法可以包括向所述受试者施用有效量的抑制性核酸分子，其中所述抑制性核酸分子降低Hsp47表达，或者其中RNAi分子的组合降低Hsp47和p21的表达，从而治疗肿瘤。在一些实施方案中，相对于治疗前或未经治疗的肿瘤的大小，本发明的方法可以减小肿瘤的大小。
在各种实施方案中，抑制性核酸分子可以在脂质体、聚合物、微球、纳米颗粒、基因治疗载体或裸DNA载体中递送。
在另外的方面，本发明的特征在于治疗有肿瘤的受试者(例如，人类患者)的方法，其中肿瘤癌细胞表达Hsp47。在某些实施方案中，所述方法可以包括向所述受试者施用有效量的抑制性核酸分子，其中抑制性核酸分子是抑制Hsp47多肽表达、或者抑制Hsp47多肽和p21多肽的表达的反义核酸分子或RNAi分子或它们的组合。
在特定实施方案中，肿瘤细胞过表达Hsp47。
在某些实施方案中，肿瘤可以是恶性肿瘤、或肺癌、或胰腺癌。
本发明的实施方案可以提供用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，所述组合物包含包封RNAi分子的纳米颗粒，其中RNAi分子靶向Hsp47。在一些实施方案中，本发明包括将活性药剂分配给受试者以治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用上述药物组合物。
在另外的实施方案中，本发明包括用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，该组合物包含包封RNAi分子的纳米颗粒，其中部分RNAi分子靶向Hsp47，部分RNAi分子靶向p21。
本发明进一步涉及在有需要的哺乳动物中预防、治疗或改善恶性肿瘤的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的包含对降低Hsp47表达具有活性的RNAi分子的组合物。
在另外的方面，本发明包括用于在有需要的哺乳动物中预防、治疗或改善恶性肿瘤的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的包含RNAi分子的组合物，其中部分RNAi分子对降低Hsp47的表达具有活性，部分RNAi分子对降低p21的表达具有活性。
在某些方面，本发明包括减少有需要的哺乳动物中癌干细胞的生长速率或增殖的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的包含RNAi分子的组合物，其中部分RNAi分子对降低Hsp47的表达具有活性，部分RNAi分子对降低p21的表达具有活性。
本发明的另外的实施方案可以提供用于分配活性药剂以治疗受试者的恶性肿瘤的组合物，其中所述组合物包含脂质体纳米颗粒。该组合物可用于将活性药剂分配到受试者的器官以治疗恶性肿瘤的方法中。
附图说明
图1显示了使用Hsp47作为单一靶进行以测试肿瘤生长抑制的胰腺癌模型的体内研究的结果。如图1所示，对于用含有Hsp47 siRNA(2M)的制剂治疗的组，肿瘤在研究过程中即使有生长也很缓慢。没有检查到体重减轻。相反，介质对照组的肿瘤在仅22天内即倍增。总之，观察到Hsp47 siRNA以0.75mpk的剂量完全抑制肿瘤生长，这表明，含有Hsp47 siRNA的制剂是有效的抗癌治疗剂。
图2显示了人类癌细胞系中Hsp47、胶原I和胶原IV的基因表达。
图3显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的未经处理的样品。
图4显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。
图5显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的50nM阴性siRNA的作用。
图6显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的100nM阴性siRNA的作用。
图7显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的10nM活性siRNA的作用。
图8：显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的50nM的活性siRNA的作用。
图9显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的100nM活性siRNA的作用。
图10显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的生长试验的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。X标记是阴性siRNA。三角标记代表以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图11显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的染料排除测定的结果。纵轴是死细胞的百分比。空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。X标记是阴性siRNA。实心圆标记代表未处理的样品。
图12显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的未处理样品。
图13显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。
图14显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的10nM活性siRNA的作用。
图15显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的生长测定的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。上升曲线中的空心圆标记是阴性siRNA。平曲线中的空心圆标记表示以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图16显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的染料排除测定的结果。纵轴是死细胞的百分比。上升曲线中的空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。平曲线中的空心圆标记是阴性siRNA。实心圆标记代表未处理的样品。
图17显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的未处理样品。
图18显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。
图19显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的50nM阴性siRNA的作用。
图20显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的100nM阴性siRNA的作用。
图21显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的10nM的活性siRNA的作用。
图22显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的50nM的活性siRNA的作用。
图23显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的100nM活性siRNA的作用。
图24显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中生长测定的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。空心圆标记是阴性siRNA。三角标记代表以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图25显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中染料排除试验的结果。纵轴是死细胞的百分比。空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。X标记是阴性siRNA。实心圆标记代表未处理的样品。
图26显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的未处理样品。
图27显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。
图28显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的50nM阴性siRNA的作用。
图29显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的100nM阴性siRNA的作用。
图30显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的10nM的活性siRNA的作用。
图31显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的50nM的活性siRNA的作用。
图32显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的100nM的活性siRNA的作用。
图33显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的生长试验的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。空心圆标记是阴性siRNA。X标记代表以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图34显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的染料排除试验的结果。纵轴是死细胞的百分比。空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。X标记是阴性siRNA。空心方形标记代表未处理的样品。
图35显示了转染siRNA后第2天，以活性Hsp47 siRNA转染的结肠癌细胞SW480中的膜联蛋白V和PI的检测方法结果。
图36显示了转染siRNA后第2天，以活性Hsp47 siRNA转染的结肠癌细胞HCT116中的膜联蛋白V和PI的检测方法结果。
图37显示了用活性Hsp47 siRNA转染的SW480结肠癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白的表达检测方法的结果。
图38显示了用活性Hsp47 siRNA转染的HepG2肝癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白的表达检测方法的结果。
图39显示了用活性Hsp47 siRNA转染的A549肺癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白的表达检测方法的结果。
图40显示了以Hsp47 siRNA和p21 siRNA转染的结肠癌细胞SW480中半胱天冬酶-3/7活性检测方法的结果。这些数据显示，在结肠癌细胞中使用Hsp47 siRNA和p21 siRNA的组合提供了意想不到地有利的半胱天冬酶水平增加，并且，细胞具有惊人的增加的细胞凋亡。
发明详述
本发明提供了在受试者中利用降低Hsp47核酸分子或多肽表达的治疗组合物来治肿瘤形成的的方法。在某些实施方案中，本发明提供了在受试者中利用降低Hsp47核酸分子或多肽或p21核酸分子或多肽表达的治疗组合物来治肿瘤形成(neoplasia)的方法。
在另外的方面，本发明的实施方案可以提供用于降低癌症干细胞生长或增殖速率的方法和组合物。本发明涉及通过以Hsp47的siRNA抑制剂和以及Hsp47抑制剂与p21的抑制剂组合治疗可以在体内抑制癌干细胞的生长或增殖的令人惊奇的效果。
本发明的治疗组合物可以包括抑制性核酸分子，包括RNAi分子，如siRNAs、shRNA和反义RNA。
本发明包括用于抑制编码Hsp47的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸、表达其的载体，以及Hsp47的显性阴性变体。
通常，在将受试者诊断为具有肿瘤(例如肺癌或胰腺癌)之后，选择涉及Hsp47抑制、或Hsp47和p21抑制的治疗方法。
本文所用抑制Hsp47的药剂的实例包括抑制Hsp47产生和/或活性的药物，以及促进Hsp47降解和/或失活的药物。抑制Hsp47产生的药物的实例包括编码Hsp47的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、的DNA/RNA嵌合多核苷酸，或表达其的载体。
本文所用的抑制p21的药剂的实例包括抑制p21产生和/或活性的药物和促进p21降解和/或失活的药物。抑制p21产生的药物的实例包括编码p21的DNA的RNAi分子、核酶、反义核酸、DNA/RNA的嵌合多核苷酸、或表达其的载体。
RNAi分子
本领域普通技术人员会理解，所报告的序列可能随时间而变化，并且相应地将所述核酸分子中所需的任何变化纳入本文。
本发明的实施方案可以提供使用小核酸分子的Hsp47表达的基因沉默的组合物和方法。本发明的另外的实施方案可以提供使用小核酸分子的Hsp47表达和p21表达的基因沉默的组合物和方法。
本发明的RNAi分子可对基因沉默具有活性，例如有基因沉默活性的dsRNA、siRNA、微小RNA或有基因沉默活性的shRNA、以及DNA导向的RNA(ddRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)和重复相关siRNA(rasiRNA)。这样的分子能够介导RNA干扰。
本文公开的组合物和方法也可以用于治疗受试者中的各种恶性肿瘤。
本发明的核酸分子和方法可以合并或组合使用以下调编码Hsp47的基因的表达，以及同步下调编码Hsp47和p21的基因的表达。
本发明的组合物和方法可以包括下述核酸分子，其可调节或调控Hsp47蛋白和/或编码该蛋白的基因的表达，或可调节或调控与p21蛋白和/或编码该蛋白的基因组合的Hsp47蛋白和/或编码该蛋白的基因，以及编码与Hsp47相关的病症或失调(如恶性肿瘤)的维持和/或进展相关的蛋白和/或编码该蛋白的基因的表达。
参考Hsp47和p21的示例性序列描述本发明的组合物和方法。本领域普通技术人员将理解，本发明的各个方面和实施方案涉及任何相关的Hsp47或p21基因、序列或变体，例如同源基因和转录变体，以及与任何Hsp47或p21基因相关的多态性，包括单核苷酸多态性(SNP)。
本发明的RNAi分子可以靶向Hsp47或p21以及任何同源序列，例如使用互补序列或通过掺入非典型碱基对，例如错配和/或摆动碱基对，其可以提供额外的靶序列。
在鉴定错配的情况下，可以使用非典型碱基对，例如错配和/或摆动碱基来产生靶向多于一个基因序列的核酸分子。
例如，非典型碱基对，例如UU和CC碱基对可以用于产生能够靶向共享序列同源性的不同靶的靶向序列的核酸分子。因此，RNAi分子可以靶向同源基因之间保守的核苷酸序列，单个RNAi分子可用于抑制多于一种基因的表达。
在一些方面，本发明的组合物和方法包括对Hsp47mRNA的任何部分具有活性的RNAi分子。RNAi分子可以包括与编码Hsp47序列的任何mRNA互补的序列。
在另外的方面，本发明的组合物和方法包括对p21mRNA的任何部分具有活性的RNAi分子。RNAi分子可以包括与编码p21序列的任何mRNA互补的序列。
在一些实施方案中，本公开的RNAi分子可以具有抗Hsp47RNA的活性，其中RNAi分子包括与具有变体Hsp47编码序列的RNA互补的序列，例如本领域已知的与恶性肿瘤相关的突变Hsp47基因。
在另外的实施方案中，本发明的RNAi分子可以包括可介导Hsp47或p21基因表达沉默的核苷酸序列。
在本文中使用时，RNAi分子表示引起RNA干扰的任何分子，包括双链RNA，例如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ddRNA(DNA导向的RNA)、piRNA(Piwi相互作用的RNA)或rasiRNA(重复相关siRNA)及其修饰形式。这些RNAi分子可以是可商购的，或者可以基于已知的序列信息等设计和制备。反义核酸包括RNA，DNA，PNA或其复合物。在本文中使用时，DNA/RNA嵌合多核苷酸包括由抑制靶基因表达的DNA和RNA组成的双链多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的试剂含有siRNA作为治疗剂。siRNA分子可以具有约10-50个或更多个核苷酸的长度。siRNA分子可以具有约15-45个核苷酸的长度。siRNA分子可以具有约19-40个核苷酸的长度。siRNA分子可以具有19-23个核苷酸的长度。本发明的siRNA分子可以介导抗靶mRNA的RNAi。市售的设计工具和试剂盒，例如可从Ambion，Inc.(Austin，TX)，以及MIT(Cambridge,MA)的the Whitehead Institute of BiomedicalResearch可获得的那些允许设计和生产siRNA。
治疗恶性肿瘤的方法
本发明的实施方案可以提供可用于下调或抑制Hsp47和/或Hsp47蛋白表达，以及下调或抑制p21和/或p21蛋白表达的RNAi分子。
在一些实施方案中，本发明的RNAi分子可用于下调或抑制由可能与疾病或病症例如恶性肿瘤相关的Hsp47单倍型多态性产生的Hsp47和/或Hsp47蛋白的表达。
可以使用Hsp47蛋白或mRNA水平和/或p21蛋白或mRNA水平的监测来表征基因沉默，并确定本发明化合物和组合物的功效。
本公开的RNAi分子可以单独或与其它siRNA组合使用来调节一种或多种基因的表达。
本公开的RNAi分子可以单独或组合、或与其他已知药物联合使用来预防或治疗与Hsp47相关的疾病，或改善与Hsp47相关的病症或疾病，包括恶性肿瘤的症状。
本发明的RNAi分子可用于以序列特异性方式调节或抑制Hsp47或p21的表达。
本公开的RNAi分子可以包括一系列连续核苷酸与Hsp47mRNA或p21mRNA至少部分互补的引导链。
在某些方面，可以使用本发明的一种或多种RNAi分子通过RNA干扰来治疗恶性肿瘤。
可以在合适的基于细胞的模型以及离体或体内动物模型中表征恶性肿瘤的治疗。
可以通过测定受影响组织的细胞中Hsp47mRNA的水平或Hsp47蛋白的水平和/或通过测定受影响组织的细胞中p21mRNA的水平或p21蛋白的水平来表征恶性肿瘤的治疗。
可以通过对受影响的器官或组织的非侵入性医学扫描来表征恶性肿瘤的治疗。
本发明的实施方案可以包括用于有需要的受试者中预防、治疗或改善与Hsp47相关的疾病或病症症状的方法。
在某些实施方案中，Hsp47 siRNA和p21siRNA的组合可以提供意想不到的有利的癌细胞死亡增加。在另外的实施方案中，Hsp47 siRNA和p21siRNA的组合可以提供意想不到的有利的癌细胞增殖降低。
在一些实施方案中，用于预防，治疗或改善受试者恶性肿瘤症状的方法可包括向所述受试者施用本发明的RNAi分子以调节所述受试者或生物体中Hsp47基因和/或p21基因的表达。
在一些实施方案中，本发明涉及通过使细胞或生物以与本发明的RNAi分子接触来下调细胞或生物中Hsp47基因表达的方法。在某些实施方案中，本发明涉及通过使细胞或生物与本发明的两种或多种RNAi分子接触来下调Hsp47基因和p21基因在细胞或生物体的表达的方法。
抑制性核酸分子可以是能作为单链或双链核酸分子使用以降低基因表达的核苷酸寡聚物。在一种方法中，抑制性核酸分子是用于RNA干扰(RNAi)介导的基因表达敲低的双链RNA。在一个实施方案中，制备了双链RNA(dsRNA)分子，其包括8至25个(例如，8、10、12、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25)本发明的核苷酸寡聚物的连续核苷酸。dsRNA可以是具有双链的两条RNA的互补链，或具有自身双链的单RNA链(小发夹(sh)RNA)。
在一些实施方案中，dsRNA为约21或22个碱基对，但可以更短或更长，上至约29个核苷酸。双链RNA可以使用标准技术制备，例如化学合成或体外转录。例如，试剂盒可获自Ambion(Austin,Tex.)和Epicentre(Madison,Wis.)。
在哺乳动物细胞中表达dsRNA的方法描述于Brummelkamp等Science 296:550-553,2002；Paddison等Genes&Devel.16:948-958,2002；Paul等Nature Biotechnol.20:505-508,2002；Sui等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5515-5520,2002；Yu等Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:6047-6052,2002；Miyagishi等,Nature Biotechnol.20:497-500,2002；和Lee等,Nature Biotechnol.20:500-505 2002，其每个通过引用的方式并入本文。
“对应”Hsp47基因的抑制性核酸分子包括至少双链基因的片段，使得双链抑制性核酸分子的每条链能够结合靶Hsp47基因的互补链。抑制性核酸分子不需要与参考Hsp47序列完美对应。
在一个实施方案中，siRNA与靶核酸具有至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％的序列同一性。例如，具有1-2个碱基对错配的19个碱基对双链被认为在本发明的方法中是可用的。在其它实施方案中，抑制性核酸分子的核苷酸序列显有出1、2、3、4、5或更多个错配。
本发明提供的抑制性核酸分子不限于siRNA，其包括足以降低Hsp47或p21核酸分子或多肽表达的任何核酸分子。本文提供的DNA序列可用于例如降低编码蛋白表达的治疗性反义核酸分子的发现和开发。本发明还提供了催化RNA分子或核酶。这样的催化性RNA分子可以用于抑制体内靶核酸分子的表达。在反义RNA中纳入核酶序列赋予分子RNA切割活性，从而增加构建体的活性。靶RNA特异性核酶的设计和使用描述于Haseloff等,Nature334:585-591.1988和US2003/0003469Al中描述，其每个通过引用的方式并入本文。
在本发明的各种实施方案中，催化核酸分子以锤头或发夹基序形成。这种锤头基序的实例由Rossi等,Aids Research and Human Retroviruses,8:183,1992描述。发夹基序的实例由Hampel等,Biochemistry,28:4929,1989和Hampel等,Nucleic AcidsResearch,18:299,1990描述。本领域技术人员会认识到，酶核酸分子中需要与一个或多个靶基因RNA区互补的特异性底物结合位点，并且其具有向该分子赋予RNA切割活性的该底物结合位点内或周围的核苷酸序列。
对靶的遏制可通过与不使用抑制剂的细胞相比被遏制的细胞中相应蛋白的表达或活性来测定。蛋白的表达可以通过任何已知技术进行评估；其实例包括利用抗体的免疫沉淀方法、EIA、ELISA、IRA、IRMA、western印迹法、免疫组织化学方法、免疫细胞化学方法、流式细胞术方法、利用与编码该蛋白的核酸或所述核酸的转录产物(例如mRNA)或剪接产物或其独特的片段特异性杂交的核酸的各种杂交方法、、Northern印迹法、Southern印迹法和各种PCR方法。
可以以已知的方法，例如免疫沉淀法、western印迹法、积分法、下拉法或表面等离子体共振(SPR)法，通过分析蛋白的已知活性(包括与蛋白例如Raf-1(特别是磷酸化的Raf-1)或EGFR(特别是磷酸化的EGFR)的结合)，来评估该蛋白的活性。
一方面，本发明的特征在于编码任何上述方面的抑制性核酸分子的载体。在一个具体实施方案中，载体是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体。在另一个实施方案中，载体含有适于在哺乳动物细胞中表达的启动子。
配制在本发明的组合物中活性RNA干扰诱导成分的量可以是不引起超过施用益处的不良反应的量。这样的量可以通过使用培养的细胞的体外测试或模型动物或哺乳动物例如小鼠、大鼠、狗或猪等中的测试来确定，并且这些测试方法是本领域技术人员已知的。
配制的活性成分的量可以根据给药剂或组合物的施用方式而变化。例如，当组合物的多个单位用于一次施用时，要配制在组合物的一个单位中的活性成分的量可以通过把一次施用所需的活性成分的量除以所述多个单位来确定。
本发明还涉及制备用于抑制Hsp47或p21的药剂或组合物的方法，以及抑制Hsp47或抑制Hsp47和p21的组合物减少或缩小恶性肿瘤的用途。
RNA干扰
RNA干扰(RNAi)是指由短干扰RNA(siRNA)介导的动物中的序列特异性转录后基因沉默。参见例如Zamore等,Cell,2000,Vol.101,pp.25-3；Fire等,Nature,1998,Vol.391,pp.806811；Sharp,Genes&Development,1999,Vol.13,pp.139-141。
细胞中的RNAi应答可以由双链RNA(dsRNA)触发，尽管尚未完全了解该机制。细胞中的某些dsRNA可以经历Dicer酶，核糖核酸酶III酶的作用。参见例如Zamore等,Cell,2000,Vol.101,pp.25-33；Hammond等,Nature,2000,Vol.404,pp.293-296。Dicer酶可以将dsRNA加工成dsRNA的较短片段，其为siRNA。
通常，siRNA的长度可以为约21至约23个核苷酸，并且包括长度为约19个核苷酸的碱基对双链区。
RNAi包括称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的核酸内切酶复合物。siRNA具有进入RISC复合物并介导具有与siRNA双链的反义链互补序列的单链RNA靶切割的反义或引导链。siRNA的另一条链是乘客链。靶RNA的切割发生在与siRNA双链反义链互补的区域的中部。参见例如Elbashir等,Genes&Development,2001,Vol.15,pp.188-200。
在本文中使用时，术语“有义链”是指与siRNA分子相应反义链的至少一部分部分或完全互补的siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的有义链可以包括与靶核酸序列具有同源性的核酸序列。
本文所用的术语“反义链”是指与靶核酸序列的至少一部分部分或完全互补的siRNA分子的核苷酸序列。siRNA分子的反义链可以包括与siRNA分子的相应有义链的至少一部分互补的核酸序列。
通过以序列特异性方式介导RNA干扰，RNAi分子可以下调或敲低基因表达。参见例如Zamore等,Cell,2000,Vol.101,pp.25-33；Elbashir等,Nature,2001,Vol.411,pp.494-498；Kreutzer等，WO2000/044895；Zernicka-Goetz等，WO2001/36646；Fire等，WO 1999/032619；Plaetinck等，WO2000/01846；Mello等，WO2001/029058。
在本文中使用时，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“减少”意为基因的表达或编码一种或多种蛋白的mRNA分子的水平，或一种或多种所编码蛋白的活性降低到低于不存在本发明的RNAi分子或siRNA的情况所观察到的。例如，表达水平，mRNA水平，或所编码蛋白活性水平可以从不存在本发明的RNAi分子或siRNA的情况所观察到的降低至少1％、或至少10％、或至少20％、或至少50％或至少90％、或更多。
RNAi分子也可用于敲低病毒基因表达，并由此影响病毒复制。
RNAi分子可以由单独的多核苷酸链：有义链或乘客链(passenger strand)、以及反义链或引导链制成。引导和乘客链至少部分互补。引导链和乘客链可以形成具有约15至约49个碱基对的双链区域。
在一些实施方案中，siRNA的双链区可以具有17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个碱基对。
在某些实施方案中，RNAi分子可以在RISC复合物中是有活性的，其具有对RISC有活性的双链区域长度。
在另外的实施方案中，RNAi分子可以作为Dicer底物有活性，转化为可在RISC复合物中有活性的RNAi分子。
在一些方面，RNAi分子可以在长分子的相对端具有互补的引导和乘客序列部分，使得该分子可以与互补序列部分形成双链区域，并且该链通过核苷酸或非核苷酸接头连接在双链区域的一端。例如，发夹排布、或茎和环排布。与链的连接相互作用可以是共价键或非共价相互作用。
本公开的RNAi分子可以包括将核酸的有义区连接到核酸的反义区的核苷酸，非核苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸接头。核苷酸接头可以是长度≥2个核苷酸的接头，例如长度为约3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。核苷酸接头可以是核酸适体。本文所用的“适体”或“核酸适体”是指特异性结合靶分子的核酸分子，其中核酸分子所具有的序列包含目标分子在其天然环境中识别的序列。或者，适体可以是结合靶分子的核酸分子，其中靶分子不天然地结合核酸。例如，适体可用于结合蛋白的配体结合结构域，从而防止天然存在的配体与蛋白的相互作用。参见例如，Gold等,Annu Rev Biochem,1995,Vol.64,pp.763-797；Brody等,J.Biotechnol.,2000,Vol.74,pp.5-13；Hermann等,Science,2000,Vol.287,pp.820-825。
非核苷酸接头的实例包括脱碱基核苷酸，聚醚，聚胺，聚酰胺，肽，碳水化合物，脂质，多烃或其它聚合物化合物，例如聚乙二醇，例如具有2至100个乙二醇单元的那些。一些实例在Seela等,Nucleic Acids Research,1987,Vol.15,pp.3113-3129；Cload等,J.Am.Chem.Soc,1991,Vol.113,pp.6324-6326；Jaeschke等,Tetrahedron Lett.,1993,Vol.34,pp.301；Arnold等,WO 1989/002439；Usman等,WO 1995/006731；Dudycz等,WO1995/011910和Ferentz等,J.Am.Chem.Soc,1991,Vol.113,pp.4000-4002中描述。
RNAi分子可以具有来自双链区域的一个或多个突出端。非碱基配对的单链区域的突出端长度可以为1至8个核苷酸，或更长。突出端可以是3'末端突出端，其中链的3'末端具有1至8个核苷酸的单链区域。突出端可以是5'端突出端，其中链的5'末端具有1至8个核苷酸的单链区域。
RNAi分子的突出端可以具有相同的长度，或者可以是不同的长度。
RNAi分子可以具有一个或多个平末端，其中双链区域以无突出端结束，并且该链与双链区域的末端配对。
本公开的RNAi分子可以具有一个或多个平末端，或可以具有一个或多个突出端，或者可以具有平末端和突出端的组合。
RNAi分子的链的5'末端可以是平末端，或者可以是突出端。RNAi分子的链的3'末端可以是平末端，或者可以是突出端。
RNAi分子链的5'末端可以是平末端，而3'末端是突出端。RNAi分子的链的3'末端可以是平末端，而5'末端是突出端。
在一些实施方案中，RNAi分子的两端是平末端。
在另外的实施方案中，RNAi分子的两端具有突出端。
在5'和3'端的突出端可以具有不同的长度。
在某些实施方案中，RNAi分子可以具有平末端，其中反义链的5'末端和有义链的3'末端不具有任何突出核苷酸。
在进一步的实施方案中，RNAi分子可以具有平末端，其中反义链的3'末端和有义链的5'末端不具有任何突出核苷酸。
RNAi分子在双链区域的碱基配对中可能具有错配。
RNAi分子的突出端中的任何核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
一个或多个脱氧核糖核苷酸可以在5'端，其中RNAi分子的另一条链的3'端可以不具有突出端，或者可以不具有脱氧核糖核苷酸突出端。
一个或多个脱氧核糖核苷酸可以在3'端，其中RNAi分子的另一条链的5'端可以不具有突出端，或可以不具有脱氧核糖核苷酸突出端。
在一些实施方案中，RNAi分子的一个或多个或所有突出核苷酸可以是2'-脱氧核糖核苷酸。
Dicer酶底物RNAi分子
在一些方面，RNAi分子可以具有适合作为Dicer酶底物的长度，其可被加工以产生RISC活性RNAi分子。参见例如Rossi等，US2005/0244858。
Dicer酶底物dsRNA可以具有足够使其由Dicer酶加工以产生活性RNAi分子的的长度，并且还可以包括以下一个或多个性质：(i)Dicer酶底物dsRNA可以是不对称的，例如，在反义链上具有3'突出端，和(ii)Dicer酶底物dsRNA可以在有义链上具有修饰的3'端，以引导Dicer酶结合并将dsRNA加工成活性RNAi分子的方向。
P21的RNAi分子
靶向p21mRNA的本发明RNAi分子的实例示于表1中。
表1：针对p21的RNAi分子序列
表1备注：大写A、G、C和U分别是指ribo-A、ribo-G、ribo-C、和ribo-U。小写字母a、g、c、t分别代表2'-脱氧-A、2'-脱氧-G、2'-脱氧-C和胸苷。mU为2'-甲氧基-U。
靶向p21mRNA的本发明的RNAi分子的实例示于表2中。
表2：p21RNAi分子序列
表2备注：大写A、G、C和U分别是指ribo-A、ribo-G、ribo-C、和ribo-U。小写字母a、u、g、c、t分别代表2'-脱氧-A、2'-脱氧-U、2'-脱氧-G、2'-脱氧-C和脱氧胸苷。(dT＝T＝t)。下划线是指2'-OMe取代的，例如U。N是A、C、G、U、U、a、c、g、u、t或修饰的、倒置的或化学修饰的核苷酸。
在本文中使用时，RNAi分子表示引起RNA干扰的任何分子，包括双链RNA，例如siRNA(小干扰RNA)、miRNA(微小RNA)、shRNA(短发夹RNA)、ddRNA(DNA引导的RNA)、piRNA(Piwi相互作用的RNA)或rasiRNA(重复相关siRNA)及其修饰形式。这些RNAi分子可以是可商购的，或者可以基于已知的序列信息等设计和制备。反义核酸包括RNA，DNA，PNA或其复合物。在本文中使用时，DNA/RNA嵌合多核苷酸包括由抑制靶基因表达的DNA和RNA组成的双链多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的药剂含有siRNA作为治疗剂。siRNA分子可以具有约10-50个或更多个核苷酸的长度。siRNA分子可以具有约15-45个核苷酸的长度。siRNA分子可以具有约19-40个核苷酸的长度。siRNA分子可以具有19-23个核苷酸的长度。本发明的siRNA分子可以介导抗靶mRNA的RNAi。市售的设计工具和试剂盒，例如Ambion，Inc.(Austin，TX)和MIT(Cambridge,MA)的the Whitehead Institute of BiomedicalResearch获得的那些允许设计和生产siRNA。
p21存在于包括人在内的各种动物中。人CDKN1A(p21)的序列信息在：NM_000389.4、NM_078467.2、NM 001291549.1、NM_001220778.1、NM_001220777.1(NP_001207707.1、NP_001278478.1、NP_001207706.1、NP_510867.1、NP_000380.1)中找到。
实例靶p21mRNA的核酸序列公开在长度为2175个核苷酸的GenBank登录号NM_000389.4(CDKN1A)中。
靶向Hsp47的RNAi分子
在一些实施方案中，本发明可以提供用于调节热休克蛋白47(Hsp47)的表达的RNAi分子和组合物的系列，所述热休克蛋白47(Hsp47)是用于细胞内转运和成熟的胶原特异性分子伴侣。
Hsp47的siRNA的一些实例在US 8,710,209中给出，其全部内容通过引用的方式并入本文用于所有目的。
Hsp47或其同源基因序列公开为例如GenBank登录号ABO010273(人)，X60676(小鼠)或M69246(大鼠，gp46)。
已经公开了用于抑制Hsp47的药剂用于抑制纤维化。参见例如US 8,173,170 B2，其全部内容通过引用的方式并入本文用于所有目的。然而，关于抑制Hsp47在恶性肿瘤发展，进展和生长中的作用的信息有限。
在一些实施方案中，本发明的siRNA分子的每条链可以是长度为15至60个核苷酸，或长度为15至40个核苷酸，或长度为19至25个核苷酸。
在某些实施方案中，本发明提供用于治疗恶性肿瘤的含有RNAi分子的药物组合物，所述RNAi分子是靶向Hsp47的RNAi分子。
本公开的靶向Hsp47mRNA的RNAi分子的实例显示在表3中。
表3：Hsp47RNAi分子序列
表3备注：大写A、G、C和U分别是指ribo-A、ribo-G、ribo-C和核糖核苷酸-U。小写d代表“脱氧”。
本文公开的靶向Hsp47mRNA的RNAi分子另外实例如表4所示
表4：Hsp47RNAi分子序列和对照
表4备注：命名：rX表示核糖核苷酸，mX表示2'-O-甲基核糖核苷酸，25rX表示具有2'-5'连接的核糖核苷酸，C3表示1,3-丙二醇间隔物，idAB表示倒置1,2-二脱氧-D-核糖，P表示3'末端的磷酸基。
RNAi分子的使用方法
本发明的核酸分子和RNAi分子可以通过直接施用分子或以与运载体或稀释剂组合的分子递送至细胞或组织。
本发明的核酸分子和RNAi分子可以通过直接施用该分子以及运载体或稀释剂或任何其它递送载体来递送或施用于细胞、组织、器官或受试者，所述运载体或稀释剂或任何其它递送载体作用帮助，促进或辅助进入细胞，例如是病毒序列、病毒材料或脂质或脂质体制剂。
本发明的核酸分子和RNAi分子可与阳离子脂质络合，包装在脂质体内，或以其它方式递送至靶细胞或组织。核酸或核酸复合物可以通过直接皮肤施用，透皮施用或注射在体外或体内局部施用于相关组织。
递送系统可以包括例如水性和非水性凝胶、乳膏、乳液、微乳液、脂质体、软膏、水性和非水性溶液、洗剂、气溶胶、烃基质和粉末，并且可以含有赋形剂如增溶剂和渗透促进剂。
本发明的抑制性核酸分子或组合物可以在药学可接受的稀释剂，运载体或赋形剂中以单位剂量形式施用。可以使用常规药学实践来提供合适的制剂或组合物，以向患有由过度细胞增殖引起的疾病的患者施用化合物。施用可能在患者症状出现之前开始。可以使用任何合适的施用途径，例如，可以是肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、肿瘤内、肌肉内、颅内、眶内、眼内、脑室内、肝内、囊内、鞘内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂、栓剂或口服施用。例如，治疗制剂可以是液体溶液或悬液的形式；对于口服施用，制剂可以是片剂或胶囊剂的形式；而对于鼻内制剂，以粉末，滴鼻剂或气溶胶的形式。
本公开的组合物和方法可以包括以允许表达核酸分子的方式包含编码本发明至少一种RNAi分子的核酸序列的表达载体。
本发明的核酸分子和RNAi分子可以从插入DNA或RNA载体的转录单位表达。重组载体可以是DNA质粒或病毒载体。可以使用提供核酸分子的瞬时表达的病毒载体。
例如，载体可以包含编码双链RNAi分子两条链的序列，或者是自身互补并由此形成RNAi分子的单个核酸分子。表达载体可以包括编码两个或更多个核酸分子的核酸序列。
核酸分子可以在细胞内从真核启动子表达。本领域技术人员意识到任何核酸可以在真核细胞中从适当的DNA/RNA载体表达。
在一些方面，病毒构建体可用于将表达构建体引入细胞，用于由表达构建体编码的dsRNA构建体的转录。
可以通过静脉内、肌内或腹膜内注射或口服或通过吸入或本领域已知的其它方法向动物施用脂质制剂。
用于施用寡核苷酸的药学上可接受的制剂是已知的并且可以使用。
在上述方法的一个实施方案中，抑制性核酸分子以约5至500mg/m2/天，例如5、25、50、100、125、150、175、200、225、250、275或300mg/m2/天的剂量施用。
在一些实施方案中，本发明的抑制性核酸分子以约1至100mg/kg，例如，1、5、10、20、25、50、75或100mg/kg的剂量全身施用。
在另外的实施方案中，剂量可以为约25至500mg/m2/天。
本领域已知的用于制备制剂的方法可以在例如“Remington:The Science andPractice of Pharmacy"Ed.A.R.Gennaro,Lippincourt Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,2000”中找到。
用于肠胃外施用的制剂可以例如含有赋形剂，无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇，植物来源的油或氢化萘。生物相容，可生物降解的丙交酯聚合物，丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。用于抑制性核酸分子的其它可能有用的胃肠外递送系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如，聚氧乙烯-9-月桂基醚，甘胆酸和脱氧胆酸盐的水性溶液，或者可以是以滴鼻剂或凝胶形式施用的油性溶液。
制剂可以以治疗有效量(例如，预防、消除或减少病理状况的量)施用于人类患者以提供对肿瘤疾病或病症的治疗。本发明的核苷酸寡聚物的优选剂量可以取决于诸如病症的类型和程度，特定患者的总体健康状况，化合物赋形剂的制剂及其施用途径等变量。
本发明的药物组合物可有效治疗Hsp47相关疾病。疾病的实例包括由于异常细胞增殖引起的疾病和呈现Hsp47过表达的疾病。
用于减少恶性肿瘤的所有上述方法可以是体外法或体内法。剂量可以通过使用本领域已知的使用培养细胞等的体外试验来测定。有效量可以是将肿瘤大小减少至少10％、至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、上至100％肿瘤大小的量。有效量可以是与对照相比将癌细胞增殖减少至少10％，至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或上至100％的量。
由于异常细胞增殖引起的疾病的实例包括恶性肿瘤、增生、瘢痕疙瘩、库欣综合征、原发性醛固酮增多症、红斑、真性红细胞增多症、白斑病、增生性瘢痕、扁平癣和扁桃体病。
由Hsp47过表达引起的疾病的实例包括恶性肿瘤。
癌症的例子包括肉瘤如纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、淋巴管肉瘤、滑膜肉瘤、软骨肉瘤和骨肉瘤、癌如脑肿瘤、头颈癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、十二指肠癌、阑尾癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、肛门癌、肾癌、输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、皮肤癌、白血病和恶性淋巴瘤。
癌症包括上皮性恶性肿瘤和非上皮性恶性肿瘤。癌症可以存在于身体的任何位置，例如脑、头和颈部、胸部、四肢、肺、心脏、胸腺、食道、胃、小肠(十二指肠、空肠、回肠)、大肠(结肠、盲肠、阑尾、直肠)、肝、胰腺、胆囊、肾、尿导管、膀胱、前列腺、睾丸、子宫、卵巢、皮肤、横纹肌、平滑肌、滑膜、软骨、骨、甲状腺、肾上腺、腹膜、肠系膜、骨髓、血液、血管系统、淋巴系统如淋巴结、淋巴液等。
在另一个实施方案中，癌症包括显示激素或生长因子非依赖性增殖的癌细胞。在另外的实施方案中，癌症包括呈现Hsp47过表达的癌细胞。
纳米颗粒
本发明的实施方案可以提供脂质体纳米颗粒组合物。本发明的可离子化分子可用于形成脂质体组合物，其可以具有脂质样分子的双层。
纳米颗粒组合物可以具有脂质体结构、双层结构、胶束、层状结构或其混合物中的一种或多种本发明的可离子化分子。
在一些实施方案中，组合物可以包括一种或多种液体载体组分。适用于递送本发明的活性药剂的液体载体可以是药学上可接受的液体载体。液体载体可以包括有机溶剂，或水和有机溶剂的组合。
本发明的实施方案可以提供具有10至1000nm尺寸的脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质体纳米颗粒可以具有10至150nm的尺寸。
在某些实施方案中，本发明的脂质体纳米颗粒可以包封RNAi分子并且在暴露于人血清1小时后保留至少80％的包封的RNAi分子。
药物组合物
本发明进一步考虑了通过向受试者施用本发明的组合物来将活性药剂分配到受试者器官以治疗恶性肿瘤的方法。可以治疗的器官包括肺、肝、胰腺、结肠、心脏、骨骼、皮肤、肠和关节。
在一些实施方案中，本发明提供了通过向受试者施用本发明的组合物来治疗肺恶性肿瘤疾病的方法。
在另外的方面，本发明提供一系列药物制剂。
本文的药物制剂可以包括活性药剂，以及本发明的药物载体或脂质，以及药学上可接受的载体或稀释剂。通常，本说明书的活性药剂包括siRNA，恶性肿瘤的活性药剂以及任何小分子药物。
药物载体可以将组合物靶向达到星状细胞。药物载体可以在其内部包括药物，或者附着于含药物质的外部，或者与药物混合，只要药物载体中包含维甲酸衍生物和/或维生素A类似物，以及至少部分地暴露在制剂的外部。组合物或制剂可以用合适的材料覆盖，例如肠溶衣或随时间分解的物质，或者可以纳入合适的药物释放系统中。
本发明的药物制剂可以含有以下每项中的一种或多种：表面活性药剂、稀释剂、赋形剂、防腐剂、稳定剂、染料和悬浮剂。
一些药物制剂的药物载体，稀释剂和组分以及配制和施用本发明化合物和组合物的方法描述于Remington的Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Penn.(1990)。
防腐剂的实例包括苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸的酯。
表面活性剂的实例包括醇、酯、硫酸化脂族醇。
赋形剂的实例包括蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、轻质无水硅酸盐、铝酸镁、偏硅酸铝酸镁、合成硅酸铝，碳酸钙、碳酸钠、碳酸氢钙和羧甲基纤维素钙。
悬浮剂的实例包括椰子油，橄榄油，芝麻油，花生油，大豆，乙酸邻苯二甲酸纤维素，乙酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯共聚物和邻苯二甲酸酯。用于递送一种或多种用于基因沉默活性分子的本发明的治疗性制剂可以施用于有需要的哺乳动物。可以将治疗有效量的可包封在脂质体中的制剂和活性药剂施用于哺乳动物以预防或治疗恶性肿瘤。
施用途径可以是局部的或全身的。
本发明的治疗有效的制剂可以通过各种途径施用，包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下和口服。
施用途径可包括例如肠胃外输送、包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射、以及鞘内、直接脑室内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
制剂也可以以持续或控释剂型形式施用，包括储存注射，渗透泵等，以在预定速率延长和/或定时的，脉冲给药。
本发明的组合物可以通过包括口服和肠胃外途径的各种途径施用，其实例包括但不限于口服、静脉内、肌内、皮下、局部、肺内、气道内、气管内、支气管内、鼻内、直肠、动脉内、脑内、脑室内、髓内、淋巴结内、淋巴管内、脑内、鞘内、脑室内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内和子宫内途径，并且其可以配制成适合于每种途径的药剂。可以从任何已知的剂型和方法适当地选择这样的剂型和配制方法。参见例如Hyojun Yakuzaigaku,StandardPharmaceutics,Yoshiteru Watanabe等编,Nankodo,2003。
适合于口服施用的剂型的实例包括但不限于粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、液体剂、悬液剂、乳剂、凝胶剂和糖浆剂，适用于胃肠外施用的剂型的实例包括注射剂例如可注射溶液、可注射悬浮液、可注射乳液和即用型注射液。用于肠胃外施用的制剂可以是例如水性或非水性等渗无菌溶液或悬液的形式。
用于肠胃外施用的药物制剂，例如通过快速注射或连续输注的，包括水溶性形式的活性制剂水溶液。可以制备活性化合物的悬液作为合适的油性注射悬液。含水注射悬液可含有增加悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬液还可含有合适的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。
用于注射的制剂可以以单位剂量形式存在，例如在加入防腐剂的安瓿或多剂量容器中。制剂可以采取在油性或水性载体中的悬液，溶液或乳液的形式，并且可以含有配方剂，例如悬浮、稳定和/或分散剂。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用之前用合适的载体例如无菌无热原的水构建。
除了前述的制剂之外，制剂也可以配制成贮库制品。这种长效制剂可以通过肌内注射施用。因此，例如，该制剂可以用合适的聚合物或疏水性材料配制，例如作为可接受的油中的乳液或离子交换树脂，或作为微溶衍生物，例如作为微溶盐。
本发明的组合物和制剂也可以配制用于局部递送，并且可以使用任何合适的施用局部递送载体的方法施用于受试者的皮肤。例如，制剂可以手动施用，使用施用器，或涉及两者的方法。在施用后，可以例如通过摩擦使制剂进入到受试者的皮肤中。施用可以进行每天多次或基于每天一次。例如，制剂可以每天一次，每天两次或每天多次施用于受试者的皮肤，或者可以每两天一次，每三天一次，或约每周一次，每两周一次，或每数周一次施用。
本文所述的制剂或药物组合物可以通过任何合适的方式施用于受试者。施用方法的实例包括，其中(a)通过注射，皮下，腹膜内，静脉内，肌肉内，皮内，眶内，囊内，脑内，胸骨内等施用，包括输注泵递送；(b)局部施用，例如通过肾脏或心脏区域直接注射，例如通过贮库植入；以及被本领域技术人员认为是适当的使活性化合物与活组织接触的方式。
鉴于患者的状况，个体医生可以选择药物组合物的适合的配方、施用途径和剂量。参见，例如，Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，12thEd.,Sec.1。通常，施用患者的组合物的剂量范围可以是患者体重的约0.5至约1000mg/kg。如患者所需要的，剂量可以是在一天或多天的过程中给予的两种或更多的单次或系列。在至少一些条件下的化合物人剂量已确立的情况下，剂量将与已确立的剂量大约相同或为已确立的剂量的约0.1％至约500％，更优选约25％至约250％。在新发现的药物组合物的情况下，没有确立人的剂量时，合适的人剂量可以从ED50或ID50值，或从体外或体内研究得出的其他合适的值推断出来，通过动物的毒性研究和功效研究证明可行。
用于预防或治疗恶性肿瘤的方法
本发明还涉及用于控制恶性肿瘤的活性或生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物。这里所指的有效量是在治疗恶性肿瘤的方法中，减轻其症状，延迟或停止其进展的量，优选为防止恶性肿瘤的发生或复发或治愈其的量。还优选不引起超过施用益处的不良反应的量。这样的量可以通过使用培养的细胞的体外测试或通过在模型动物或哺乳动物如小鼠，大鼠，狗或猪中的测试来适当地确定，并且这样的测试方法是本领域技术人员公知的。此外，载体中活性药剂的剂量和本发明方法中使用的活性药剂的剂量本领域技术人员已知，或者可以通过上述试验适当确定。
施用的频率取决于所使用的组合物的性质和受试者的上述条件，并且可以是每天多次(即每天2、3、4、5或更多次)，每天一次，每数天(即每2、3、4、5、6或7天等)，每周数次(例如每周2次、3次、4次等)，每隔一周或每隔数周(即每2、3、4周等)。
在一些实施方案中，本发明还涉及通过利用上述载体将药物递送至恶性肿瘤细胞的方法。该方法包括将具有待输送物质的载体施用或添加到活体或培养基上，例如含有肺中细胞外基质产生细胞的培养基上的步骤。可以根据任何已知方法或本发明中所述的方法适当地实现这些步骤。此外，上述方法包括体外进行的模式和其中靶向体内肺恶性肿瘤细胞的模式。
本发明的治疗有效的制剂可以通过全身递送来施用，其可以提供活性药剂的广泛的生物分布。
本发明的实施方案可以提供治疗制剂，其包括本发明的治疗分子和药学上可接受的载体。
本发明的制剂的有效剂量可以每天1至12次或每周一次施用。施用的持续时间可以是1、2、3、4、5、6或7天，或者可以是1、2、3、4、5、6、8、10或12周。
实施例
实施例1：进行体内研究测试用HSP47作为单一靶的肿瘤生长抑制。选择由PANC-1衍生的胰腺癌模型，这是因为其富集胶原蛋白，如表5所示。
表5：测试用HSP47作为单一靶的肿瘤生长抑制的体内研究
研究方法：
将PANC-1细胞皮下接种到雌性无胸腺裸鼠的右侧腹部。
使用下式测量和计算肿瘤大小：肿瘤体积＝长度×宽度2/2。当已建立的肿瘤达到约200mm3时，将小鼠随机并分配以试验物品注射。
含有HSP47-siRNA(2M)的制剂以0.75mg/kg静脉内注射到动物中，q1w并总共4次剂量。
每周两次监测动物体重和肿瘤体积。
结果和结论：PANC-1模型中肿瘤生长缓慢，介质组的倍增时间为22天。没有检查到体重减轻。基于化合物81并含有HSP47-siRNA(2M)的制剂观察到以0.75mpk的剂量完全抑制肿瘤生长。总的来说，抑制Hsp47抑制肿瘤生长，表明该制剂是有效的抗癌治疗剂。
结果与结论：图1显示了使用Hsp47作为单一靶进行以测试肿瘤生长抑制的胰腺癌模型的体内研究的结果。如图1所示，对于用含有Hsp47siRNA(2M)的制剂治疗的组，肿瘤在研究过程中即使有生长也很缓慢。没有检查到体重减轻。相反，介质对照组的肿瘤在仅22天内即倍增。总之，观察到Hsp47 siRNA以0.75mpk的剂量完全抑制肿瘤生长，显示含有Hsp47siRNA的制剂是有效的抗癌治疗剂。
实施例2：人癌细胞系A549，MCF7，MDA-MB-231，HCT116，M7609，COLO230HSR，SW480，PANC-1，SW1990，MIA-PaCa-2，HepG2，HT1080和HaLa中Hsp47，胶原I和胶原IV的基因表达如图2所示。表达在SW480和HepG2中显著。
实施例3：使用靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法的结果示于图3-11。
图3显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的未处理样品。图4显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。图5显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的50nM阴性siRNA的作用。图6显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的100nM阴性siRNA的作用。图7显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的10nM活性siRNA的作用。图8：显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的50nM的活性siRNA的作用。图9显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的100nM活性siRNA的作用。
图4和7、5和8以及6和9的比较显示靶向Hsp47的活性siRNA抑制SW480结肠癌细胞。
图10显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的生长试验的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。X标记是阴性siRNA。三角标记代表以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图11显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制SW480结肠癌细胞增殖的方法中的染料排除测定的结果。纵轴是死细胞的百分比。空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。X标记是阴性siRNA。实心圆标记代表未处理的样品。
实施例4：用靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法的结果示于图12-16。
图12显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的未处理样品。图13显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。图14显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的10nM活性siRNA的作用。图12，13和14的比较显示靶向Hsp47的活性siRNA抑制HCT116结肠癌细胞。
图15显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的生长测定的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。上升曲线中的空心圆标记是阴性siRNA。平曲线中的空心圆标记表示以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图16显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HCT116结肠癌细胞增殖的方法中的染料排除测定的结果。纵轴是死细胞的百分比。上升曲线中的空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。平曲线中的空心圆标记是阴性siRNA。实心圆标记代表未处理的样品。
实施例5：用靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法的结果示于图17-25。
图17显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的未处理样品。图18显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。图19显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的50nM阴性siRNA的作用。图20显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的100nM阴性siRNA的作用。图21显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的10nM的活性siRNA的作用。图22显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的50nM的活性siRNA的作用。图23显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中的100nM活性siRNA的作用。
图18和21，19和22以及22和23的比较显示靶向Hsp47的活性siRNA抑制A549肺癌细胞。
图24显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中生长测定的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。空心圆标记是阴性siRNA。三角标记代表以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图25显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法中染料排除试验的结果。纵轴是死细胞的百分比。空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。X标记是阴性siRNA。实心圆标记代表未处理的样品。
实施例6：用靶向Hsp47的siRNA抑制A549肺癌细胞增殖的方法的结果示于图26-34。
图26显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的未处理样品。图27显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的10nM阴性siRNA的作用。图28显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的50nM阴性siRNA的作用。图29显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的100nM阴性siRNA的作用。图30显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的10nM的活性siRNA的作用。图31显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的50nM的活性siRNA的作用。图32显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的100nM的活性siRNA的作用。
图27和30，28和31以及29和32的比较显示靶向Hsp47的活性siRNA抑制HepG2肝癌细胞。
图33显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的生长试验的结果。纵轴是细胞数x104。实心圆是未处理的样品。空心圆标记是阴性siRNA。X标记代表以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。
图34显示了以靶向Hsp47的siRNA抑制HepG2肝癌细胞增殖的方法中的染料排除试验的结果。纵轴是死细胞的百分比。空心圆是以靶向Hsp47的活性siRNA处理的样品。X标记是阴性siRNA。空心方形标记代表未处理的样品。
实施例7：以Hsp47 siRNA转染的结肠癌细胞中膜联蛋白V和PI检测的方法的结果示于图35和36。
图35显示了转染siRNA后第2天，以活性Hsp47 siRNA转染的结肠癌细胞SW480中的膜联蛋白V和PI的检测方法结果。
图36显示了转染siRNA后第2天，以活性Hsp47 siRNA转染的结肠癌细胞HCT116中的膜联蛋白V和PI的检测方法结果。
实施例8：以Hsp47 siRNA转染的癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白表达检测的方法的结果示于图37-39。
图37显示了用活性Hsp47 siRNA转染的SW480结肠癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白的表达检测方法的结果。图38显示了用活性Hsp47 siRNA转染的HepG2肝癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白的表达检测方法的结果。图39显示了用活性Hsp47 siRNA转染的A549肺癌细胞中半胱天冬酶原-3和Hsp47蛋白的表达检测方法的结果。
实施例9：以Hsp47 siRNA和p21siRNA转染的结肠癌细胞(SW480)中半胱天冬酶-3/7活性检测方法的结果示于图40。这些数据显示，在结肠癌细胞中使用Hsp47 siRNA和p21siRNA的组合提供了意想不到的，有利的，半胱天冬酶水平增加，以及细胞具有惊人的增加的细胞凋亡。
实施例10：在A549细胞系中进行体外转染以确定siRNA敲低效力。使用含有靶向Hsp47的RNAi分子的本发明制剂，观察到Hsp47mRNA的剂量依赖性敲低。
用于体外敲低的方案：转染前一天，用含有10％FBS的100μlDMEM(HyClone Cat.#SH30243.01)将细胞以2×103个细胞/孔置于96孔板中，并培养于含空气中5％CO 2的潮湿气氛的37℃培养箱中。在转染前，将培养基更换至90μl含有2％FBS的Opti-MEM I ReducedSerum Medium(Life Technologies Cat.#31985-070)。将Lipofectamine RNAiMax(LifeTechnologies Cat.#13778-100)0.2μl与4.8μl的Opti-MEM I在室温下混合5分钟。将1μl的siRNA与4μl的Opti-MEM I混合，并与LF2000溶液组合，然后无涡旋轻轻混合。在室温下等待5分钟。在室温下孵育混合物10分钟，以形成RNA-RNAiMax复合物。将10μl的RNA-RNAiMax复合物加入到孔中，用手轻轻摇动板。将细胞在含空气中5％CO2的潮湿气氛的37℃培养箱中孵育2小时。将培养基更换为含有2％FBS的新鲜-MEM I Reduced Serum Medium(LifeTechnologies Cat。#31985-070)。转染24小时后，用冰冷的PBS清洗细胞一次。用50μlCell-to-Ct裂解缓冲液(Life Technologies Cat.#4391851C)在室温下将细胞裂解5-30分钟。加入5μl终止液，室温孵育2分钟。立即用TAQMAN RT-qPCR测量mRNA水平。或者，样品可以在-80℃下冷冻，并在随后测定。
实施例11：Hsp47 siRNA的肿瘤抑制功效。以相对低的0.75mg/kg靶向Hsp47 siRNA剂量使用胰腺癌异种移植模型。组合的siRNAs在第28天表现出显著和意想不到的有利的肿瘤抑制功效。
在本实验中，从ATCC获得A549和PANC-1细胞系。将细胞悬液与冰解冻的BD基质胶以1:1的比例充分混合以注射。将每只小鼠，无胸腺裸鼠雌性小鼠，6至8周，Charles River，使用25G针和注射器在右侧腹部用0.1ml 2×106(A549)或2.5×106(PANC-1)细胞接种物皮下接种(每只小鼠1份接种物)。麻醉小鼠进行接种。在建立的肿瘤达到约250-350mm3(A549)或150-250mm3(PANC-1)的当天，动物通过尾静脉进行快速注射。在施用后的不同时间点，通过过量CO2来处死动物并肿瘤解剖。肿瘤首先进行湿重称重，然后分为三部分，用于测量Hsp47敲低，siRNA的生物分布和生物标志物分析。将样品在液氮中快速冷冻并储存在-80℃直到准备好进行生物分析处理。
实施例12：包封在脂质体制剂中的siRNA在原位A549肺癌小鼠模型上的功效评估。
实验动物：研究中共使用了60只雄性NCr nu/nu小鼠，5-6周龄。实验动物在Anticancer公司饲养和培育。在实验期间，它们保持在HEPA过滤的环境中。笼子，食物和窝被高压灭菌。动物饮食从Harlan Teklad(Madison，WI)获得。
脂质体制剂制备：制备制剂并在4℃下储存。在注射到小鼠前10分钟将其温热至室温。
A549人肺癌原位模型(SOI)：在SOI的当天，从携带A549肿瘤异种移植物的动物的皮下部位收获储备肿瘤，并置于RPMI-1640培养基中。去除坏死组织，将活组织切成1.5-2mm3片。动物用异氟烷吸入麻醉，手术区用碘和酒精灭菌。大约1.5cm长的横切口使用一对手术剪刀在小鼠的左胸壁上制成。在第三肋和第四肋之间制成肋间切口并暴露左肺。将一个A549肿瘤片用8-0手术缝合线(尼龙)移植到肺表面。胸壁用6-0手术缝合线(丝)封闭。使用有25G X 1 1/2针的3cc注射器通过胸腔内穿刺再次充气肺，以排出胸腔中剩余的空气。胸壁用6-0手术丝线缝合封闭。在HEPA过滤的层流罩下，用7×放大倍数显微镜(Olympus)进行所有上述操作方法。
肿瘤植入三天后，将荷瘤小鼠随机分组，每组10只。肿瘤植入后三天开始每组小鼠的治疗。
终点：实验小鼠在治疗开始后四十二天处死。切除原发性肿瘤并在电子天平上称重以用于随后的分析。
通过比较每个处理组和介质对照组之间在尸检时测量的最终原发肿瘤重量来评估制剂对人肺癌A549的抗肿瘤功效。测量每组中的平均肿瘤重量。
化合物毒性的评估：在整个实验期间，处理组和对照组的小鼠的平均体重保持在正常范围内。通过大量观察小鼠也未检测出毒性的其它症状。
结论：通过比较在实验终点获得的最终肿瘤重量，可以得出结论，与对照组相比，在处理组中用含有Hsp47 siRNA的制剂在2mg/kg治疗显著且令人惊讶地降低人肺癌A549肿瘤生长和肿瘤体积。没有观察到毒性。
实施例13：靶向Hsp47的小干扰RNA(siRNA)对裸鼠A549细胞生长和绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的影响。构建3对Hsp47 siRNA质粒和非沉默质粒，并分别通过LIPOFECTAMINE 2000转染A549细胞。通过ELISA和实时RT-PCR选择最有效的Hsp47 siRNA质粒对。将用选择的Hsp47 siRNA质粒转染的A549细胞，用非沉默质粒转染的A549细胞，和未转染的A549细胞分别接种到裸鼠中。将鸡胚随机分为4组，CAM采用不同溶液处理48h：培养基DMEM为阴性对照组，未转染的A549细胞培养上清为阳性对照组，Hsp47 siRNA A549细胞培养上清作为Hsp47 siRNA组，非沉默siRNA A549细胞培养上清作为非沉默siRNA组。在第12天收获CAM用于显微镜测定。
与对照组相比，Hsp47 siRNA质粒诱导A549细胞Hsp47分泌减少，伴随Hsp47mRNA的降低。与非沉默siRNA组比较，Hsp47 siRNA组小鼠异种移植瘤平均肿瘤体积减少；异种移植物生长到50mm3的时间延迟。异种移植物中的Hsp47含量降低。在CAM测定中，阴性组Hsp47含量为零，与非沉默siRNA组或阳性组相比，Hsp47 siRNA组降低20-70％；Hsp47 siRNA组或非沉默siRNA组或阳性组的CAM血管分支点比阴性组增加；Hsp47 siRNA组的CAM总血管长度与阴性组相比增加，而在非沉默siRNA组或阳性组中增加。与阴性对照组相比，在Hsp47 siRNA组中加入Hsp47的细胞培养上清液时微血管增殖增加，在非沉默siRNA组或阳性组中观察到显著增殖的血管。
实施例14：细胞培养。将人非小细胞肺癌细胞系A549在补充有10％FBS(FBS，Invitrogen)的F-12K培养基(ATCC)中，有5％CO2的潮湿气氛下37℃培养。根据制造商的说明书(Sigma-Aldrich)，用相应的慢病毒转导颗粒转导A549TR细胞来产生稳定表达对照或Hsp47siRNA的细胞。在2.5μg/mL嘌呤霉素(Invivogen)中选择抗性克隆12天，使用克隆柱分离，随后在含嘌呤霉素的培养基中扩增并保持。
实施例15：Hsp47靶向siRNA导致体内肿瘤体积的大幅减退。
使用脂质制剂在纳米颗粒中的包封并递送siRNA到scid小鼠中人A549肺癌细胞的异种移植物。测试异种移植物以鉴定相比正常细胞KRAS突变的存在或异常水平的表达。当肿瘤建立(>100mm3)时，每2天用Hsp47靶向siRNA或对照(非特异性)siRNA治疗小鼠2周。当对照组必须安乐死时，实验停止。
结果：用Hsp47靶向siRNA进行的治疗可以防止肿瘤扩张，并导致剧烈的肿瘤体积减少。
通过TUNEL染色将回收的肿瘤切片并观察。Hsp47靶向siRNA治疗的肿瘤显示出显著更高的细胞凋亡水平。从肿瘤中提取RNA，进行实时PCR以检查Hsp47的特异性敲低。
结果：使用Hsp47靶向siRNA的治疗显著降低体内Hsp47的表达。
实施例16：发现靶向p21的本发明的siRNA在体外对于基因沉默是有效。发现p21siRNA用于基因敲低的剂量依赖性活性显示出低于约3皮摩尔(pM)的IC 50并低至1pM的IC 50。
在A549细胞系中进行体外转染以确定siRNA敲低效力。如表6所示，用表1的siRNA观察对于p21mRNA的剂量依赖性敲低。
表6：A549细胞系中p21mRNA的剂量依赖性敲低
如表6所示，表1的p21siRNA的活性在0.3-10pM的范围内，其适用于许多用途，包括作为体内使用的药剂。
实施例17：具有位于siRNA的反义链的种区域中的脱氧核苷酸的本发明p21siRNA结构意外地并有利地提供增加的基因敲低活性。
在A549细胞系中进行体外转染，以确定基于结构1735'(SEQ ID NOs：57和71)的p21siRNA的敲低功效。基于结构1735'的p21siRNA观察到p21mRNA的剂量依赖性敲低，如表7所示。
表7：基于结构1735'的p21siRNA在A549细胞系中的p21mRNA的剂量依赖性敲低
如表7所示，与双链区域没有脱氧核苷酸的p21siRNA相比，基于在反义链的种区域中具有三个脱氧核苷酸的结构1735'的p21siRNA的活性相比惊人地和意外地增加了高达300倍。
这些数据显示与双链区域没有脱氧核苷酸的p21siRNA相比，具有反义链的种区域中有脱氧核苷酸的结构的p21siRNA惊人地提供了增加的基因敲低活性。
表7中显示的反义链的种区域中有三个脱氧核苷酸的p21siRNA的活性范围为0.001到0.1pM，其特别适用于许多用途，包括作为体内使用的药剂。
本文描述的实施方案不是限制性的，并且本领域技术人员可以容易地理解，可以不进行过度实验而测试本文所述修饰的特定组合以鉴定具有改进的RNAi活性的核酸分子。
出于所有目的，本文特别提及的所有出版物、专利和文献通过引用整体并入本文。
应当理解，本发明不限于所述特定方法、方案、材料和试剂，因为它们可能变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不背离本说明书的范围和宗旨的情况下，可以对本文所公开的描述进行各种替换和修改，并且这些实施方案在本说明书和所附权利要求的范围内。
必须指出，本文和所附权利要求中所使用的单数形式包括复数指称，上下文另有明确说明除外。同样地，术语“一个”(或“一种”)、“一个或更多个(一种或更多种)”和“至少一个/种”在本文可以互换使用。另外要注意，术语“包括”、“包含”、“含有”、“含”和“具有”可以互换使用，并且应该被广义、无限制地解释。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的记载仅仅意在作为对单独提到落入该范围的每个单独的值的速记法，每个单独的值均被并入说明书中，如同它们被单独记载于本文中一样。对于马库什组，本领域技术人员将认识到，该描述包括个体成员以及马库什组成员的亚组。
即使没有进一步的阐述，本领域技术人员亦可基于上述描述最大程度地利用本发明。因此，所附的具体实施方案应被解释为仅是说明性的，而不是以任何方式限制本公开的其余部分。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合而联用。本说明书中公开的每个特征可以由服务于相同、等同或相似目的的替代特征来代替。

Claims (77)

1.用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，所述组合物包含包封RNAi分子的纳米颗粒，其中RNAi分子靶向Hsp47。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述组合物在暴露于人血清1小时后保留包封的RNAi分子活性的至少80％。
3.权利要求1的药物组合物，其中用于治疗恶性肿瘤的RNAi分子是siRNA或shRNA。
4.权利要求1的药物组合物，其中每个RNAi分子包含双链区域，其中所述双链区域包含对应于Hsp47 mRNA靶序列的核苷酸序列。
5.将活性药剂分配给受试者以治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1的药物组合物。
6.治疗恶性肿瘤的药物组合物，所述组合物包含包封RNAi分子的纳米颗粒，其中部分RNAi分子靶向Hsp47，以及，部分RNAi分子靶向p21。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述组合物在暴露于人血清1小时后保留包封的RNAi分子活性至少80％。
8.权利要求6的药物组合物，其中用于治疗恶性肿瘤的RNAi分子是siRNA或shRNA。
9.权利要求6的药物组合物，其中对于具有降低Hsp47表达的活性的部分RNAi分子而言，每个RNAi分子包含双链区域，其中所述双链区域包含对应于Hsp47 mRNA靶序列的核苷酸序列。
10.权利要求6的药物组合物，其中对于具有降低p21表达的活性的部分RNAi分子而言，每个RNAi分子包含双链区域，其中所述双链区域包含对应于p21 mRNA的靶序列的核苷酸序列。
11.将活性药剂分配给受试者以治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求6的药物组合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述恶性肿瘤位于肺、结肠或胰腺、肝脏、心脏、骨骼、皮肤或肠内。
13.根据权利要求11的方法，其中所述施用是在至多12周的期间每天至少一次0.01至2mg/kg RNAi分子的剂量。
14.根据权利要求11的方法，其中所述施用提供Hsp47 RNAi分子的1至1000ug*min/mL的平均AUC(0-最后)和0.1至50ug/mL的平均Cmax。
15.用于在有需要的哺乳动物中预防、治疗或改善恶性肿瘤的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的包含具有降低Hsp47表达的活性的RNAi分子的组合物。
16.根据权利要求15的方法，其中所述哺乳动物是人，所述Hsp47是人Hsp47。
17.根据权利要求15的方法，其中所述恶性肿瘤过表达Hsp47。
18.根据权利要求15的方法，其中所述RNAi分子减少哺乳动物中Hsp47的表达。
19.根据权利要求15的方法，其中所述施用将所述哺乳动物中Hsp47的表达减少至少5％至少5天。
20.根据权利要求15的方法，其中所述施用将所述哺乳动物中所述恶性肿瘤的体积减少至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
21.根据权利要求15的方法，其中所述方法降低所述恶性肿瘤的一种或多种症状、或延迟或终止所述恶性肿瘤的进展。
22.根据权利要求15的方法，其中所述施用降低所述受试者中恶性肿瘤细胞生长。
23.根据权利要求15的方法，其中所述施用降低所述受试者中所述恶性肿瘤细胞生长至少2％、或至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％。
24.根据权利要求15的方法，其中所述肿瘤细胞过表达野生型Hsp47 RNA或蛋白。
25.根据权利要求15的方法，其中所述肿瘤是选自肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌和结肠直肠癌的肉瘤。
26.权利要求15的方法，其中所述恶性肿瘤是选自肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌、结肠直肠癌、乳腺癌和纤维肉瘤的肉瘤。
27.根据权利要求15的方法，其中所述恶性肿瘤位于选自肺、肝、胰腺、结肠、肾、心脏、骨骼、皮肤、肠内和关节、及其任意组合的解剖区域。
28.根据权利要求15的方法，其中所述施用每天进行1至12次。
29.根据权利要求15的方法，其中所述施用进行1、2、3、4、5、6或7天的持续时间。
30.根据权利要求15的方法，其中所述施用进行1、2、3、4、5、6、8、10或12周的持续时间。
31.根据权利要求15的方法，其中所述施用是在至多12周的期间每天至少一次0.01至2mg/kg RNAi分子的剂量。
32.根据权利要求15的方法，其中所述施用提供Hsp47 RNAi分子的1至1000ug*min/mL的平均AUC(0-最后)和0.1至50ug/mL的平均Cmax。
33.根据权利要求15的方法，其中所述施用是静脉内注射、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、口服、局部、输注或吸入。
34.用于在有需要的哺乳动物中预防，治疗或改善恶性肿瘤的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的包含RNAi分子的组合物，其中部分RNAi分子具有降低Hsp47的表达的活性，部分RNAi分子具有降低p21的表达的活性。
35.根据权利要求34的方法，其中所述哺乳动物是人，所述Hsp47是人Hsp47。
36.根据权利要求34的方法，其中所述恶性肿瘤过表达Hsp47。
37.根据权利要求34的方法，其中所述RNAi分子减少所述哺乳动物中Hsp47和p21的表达。
38.根据权利要求34的方法，其中所述施用将所述哺乳动物中Hsp47和p21的表达减少至少5％至少5天。
39.根据权利要求34的方法，其中所述施用将所述哺乳动物中所述恶性肿瘤的体积减少至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
40.根据权利要求34的方法，其中所述方法降低所述恶性肿瘤的一种或多种症状，或延缓或终止所述恶性肿瘤的进展。
41.根据权利要求34的方法，其中所述施用降低所述受试者中恶性肿瘤细胞生长。
42.根据权利要求34的方法，其中所述施用降低所述受试者中所述恶性肿瘤细胞生长至少2％、或至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％。
43.根据权利要求34的方法，其中所述肿瘤细胞过表达野生型Hsp47 RNA或蛋白。
44.根据权利要求34的方法，其中所述肿瘤是选自肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌和结肠直肠癌的肉瘤。
45.根据权利要求34的方法，其中所述恶性肿瘤是选自肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌、结肠直肠癌、乳腺癌和纤维肉瘤的肉瘤。
46.根据权利要求34的方法，其中所述恶性肿瘤位于选自肺、肝、胰腺、结肠、肾、心脏、骨骼、皮肤、肠内和关节、及其任意组合的解剖区域。
47.根据权利要求34的方法，其中所述施用每天进行1至12次。
48.根据权利要求34的方法，其中所述施用进行1、2、3、4、5、6或7天的持续时间。
49.根据权利要求34的方法，其中所述施用进行1、2、3、4、5、6、8、10或12周的持续时间。
50.根据权利要求34的方法，其中所述施用是在至多12周的期间每天至少一次0.01至2mg/kg RNAi分子的剂量。
51.根据权利要求34的方法，其中所述施用提供Hsp47 RNAi分子的1至1000ug*min/mL的平均AUC(0-最后)和0.1至50ug/mL的平均Cmax。
52.根据权利要求34的方法，其中所述施用是静脉内注射、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、口服、局部、输注或吸入。
53.在有需要的哺乳动物中降低癌干细胞的生长速度或增殖的方法，所述方法包括向哺乳动物施用治疗有效量的包含RNAi分子的组合物，其中部分RNAi分子具有降低Hsp47的表达的活性，以及，部分RNAi分子具有降低p21的表达的活性。
54.根据权利要求53的方法，其中所述哺乳动物是人，所述Hsp47是人Hsp47。
55.根据权利要求53的方法，其中所述RNAi分子减少所述哺乳动物中Hsp47和p21的表达。
56.根据权利要求53的方法，其中所述施用将所述哺乳动物中Hsp47和p21的表达减少至少5％至少5天。
57.根据权利要求53的方法，其中所述施用将所述哺乳动物中所述恶性肿瘤的体积减少至少5％、或至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
58.根据权利要求53的方法，其中所述施用减少所述受试者中癌干细胞生长至少2％、或至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％。
59.根据权利要求53的方法，其中所述癌细胞过表达野生型Hsp47 RNA或蛋白。
60.根据权利要求53的方法，其中所述癌细胞是选自肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌和结肠直肠癌的肉瘤。
61.根据权利要求53的方法，其中所述癌细胞是选自肺腺癌、粘液性腺瘤、胰腺导管癌、结肠直肠癌、乳腺癌和纤维肉瘤的肉瘤。
62.根据权利要求53的方法，其中所述癌细胞位于选自肺、肝、胰腺、结肠、肾、心脏、骨髓、皮肤、肠内、眼、及其任意组合的解剖区域。
63.根据权利要求53的方法，其中所述施用每天进行1至12次。
64.根据权利要求53的方法，其中所述施用进行1、2、3、4、5、6或7天的持续时间。
65.根据权利要求53的方法，其中所述施用进行1、2、3、4、5、6、8、10或12周的持续时间。
66.根据权利要求53的方法，其中所述施用是在至多12周的期间每天至少一次0.01至2mg/kg RNAi分子的剂量。
67.根据权利要求53的方法，其中所述施用提供Hsp47 RNAi分子的1至1000ug*min/mL的平均AUC(0-最后)和0.1至50ug/mL的平均Cmax。
68.根据权利要求53的方法，其中所述施用是静脉内注射、皮内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、口服、局部、输注或吸入。
69.用于治疗受试者恶性肿瘤的组合物，其中所述组合物包含包封靶向Hsp47的RNAi分子的脂质体纳米颗粒。
70.根据权利要求69的组合物，其中所述恶性肿瘤位于肺、结肠或胰腺中。
71.根据权利要求69的组合物，其中所述恶性肿瘤位于肝脏、心脏、骨骼、皮肤或肠内。
72.根据权利要求69的组合物，其中所述组合物包含10到1000nm尺寸的脂质体纳米颗粒。
73.根据权利要求69的组合物，其中所述组合物包含10到150nm尺寸的脂质体纳米颗粒。
74.根据权利要求69的组合物，其中部分RNAi分子靶向Hsp47，部分RNAi分子靶向p21。
75.根据权利要求74的组合物，其中所述脂质体纳米颗粒在暴露于人血清1小时后保留至少80％的所述包封的RNAi分子。
76.将活性药剂分配给受试者器官以治疗恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求69的组合物。
77.根据权利要求76的方法，其中所述恶性肿瘤位于肺、结肠、肾脏、胰腺、肝脏、骨髓、皮肤、眼或肠内。
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