CN109777798A

CN109777798A - 一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用

Info

Publication number: CN109777798A
Application number: CN201711115396.4A
Authority: CN
Inventors: 赵正琦; 高千千; 韩序; 侯勇; 王飞; 李波; 李燕珊; 昃白尘
Original assignee: Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Current assignee: Shenzhen BGI Life Science Research Institute
Priority date: 2017-11-13
Filing date: 2017-11-13
Publication date: 2019-05-21

Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用。本发明首先保护一种sgRNA，命名为G12S‑sgRNA，其靶序列长度为15‑25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20‑34位核苷酸。本发明还保护一种用于治疗癌症的药物，其活性成分为所述sgRNA。本发明还保护所述sgRNA在制备药物中的应用；所述药物为治疗癌症的药物。本发明提供的G12S‑sgRNA适用于对携带G12S突变型KRAS基因的恶性肿瘤的精准靶向治疗，具有很强的应用前景和临床应用价值。

Description

一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR associated)基因编辑系统是第三代基因编辑技术。对比前两代基因编辑技术ZFN和TALEN，CRISPR有更高的切割效率，更易用的系统基因以及高自由度的靶位点选择空间，其应用更加广泛和大众化。

CRISPR/Cas9主要有三部分组成，用于靶向识别的5’端含有20nt左右引导序列的crRNA(CRISPR-derived RNA)与其3’部分互补配对的tracrRNA(trans-activating RNA)以及Cas9核酸酶。crRNA和tracrRNA主要通过核酸互补配对起到DNA的靶向识别功能，而cas9则作为解旋酶和核酸酶辅助识别、完成DNA定点切割。其中，Cas9的Ruvc和HNH元件分别对非互补链和互补链进行剪切，在特定位置造成DNA双链断裂。随着技术的发展，在不影响系统效率的情况下，本领域技术人员将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA，即sgRNA。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用。

本发明首先保护一种sgRNA，命名为G12S-sgRNA，其靶序列长度为15-25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20-34位核苷酸。所述靶序列为序列2中的第n1-n2位核苷酸；n1为10以上的自然数，n2为44以下的自然数。所述靶序列为序列2中的第16-35位核苷酸。G12S-sgRNA具体如序列表的序列3所示。

本发明还保护编码所述sgRNA的DNA分子。

本发明还保护具有所述DNA分子的重组载体。所述重组载体中还具有编码Cas蛋白的基因。所述Cas蛋白具体可为Cas9蛋白。所述重组载体的制备方法具体可为：分别合成KRAS-G12S-gRMA-F和KRAS-G12S-gRMA-R，然后退火，将退火得到的具有粘末端的双链DNA分子与具有粘末端的载体骨架连接，得到重组质粒-tsG12S。具有粘末端的载体骨架是用限制性内切酶BsmBI酶切LentiCRISPR V2载体得到的。

本发明还保护一种药物，其活性成分为以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体。所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。所述癌症由特定癌细胞引起，所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。所述癌症为肺癌。所述癌症为肺腺癌。所述癌细胞为肺癌细胞。所述癌细胞为肺腺癌细胞。

本发明还保护以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。所述癌症由特定癌细胞引起；所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。所述癌症为肺癌。所述癌症为肺腺癌。所述癌细胞为肺癌细胞。所述癌细胞为肺腺癌细胞。

本发明还保护一种用于对G12S突变型KRAS基因进行基因编辑的产品，其活性成分为以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体。

本发明还保护以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体在制备产品中的应用；所述产品的功能为对G12S突变型KRAS基因进行基因编辑。

本发明还保护用于特异沉默G12S突变型KRAS基因的物质在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。所述“特异沉默G12S突变型KRAS基因”指的是沉默“G12S突变型KRAS基因”且不沉默“野生型KRAS基因”。所述用于特异沉默G12S突变型KRAS基因的物质具体可为以上任一所述的sgRNA、编码所述sgRNA的DNA分子或具有所述DNA分子的重组载体。所述癌症由特定癌细胞引起；所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。所述癌症为肺癌。所述癌症为肺腺癌。所述癌细胞为肺癌细胞。所述癌细胞为肺腺癌细胞。

以上任一所述G12S突变型KRAS基因如序列表的序列2所示。

以上任一所述野生型KRAS基因如序列表的序列1所示。

本发明基于CRISPR技术开发一种针对KRAS-G12位点点突变的sgRNA，实现了高特异性和高效的G12S突变型KRAS基因的靶向，可以高效特异地杀伤携带G12S突变型KRAS基因的肿瘤细胞，对野生型KRAS基因没有编辑作用，因此仅抑制携带KRAS突变基因的细胞的增殖，对携带野生型KRAS基因的正常细胞没有影响。

在世界范围内，KRAS基因突变在肿瘤患者中的携带率非常高，如KRAS基因突变在肺癌中的发生率为15-25％，其中G12S突变率为5％。而在非小细胞肺癌中，KRAS基因突变的发生率更是超过1/4。在结直肠癌中，36-40％的肿瘤患者携带KRAS基因突变，其中G12S突变率占4.9-5.7％。目前尚无有效的临床用KRAS靶向的小分子药物。本发明提供的G12S-sgRNA适用于对携带G12S突变型KRAS基因的恶性肿瘤的精准靶向治疗，具有很强的应用前景和临床应用价值。

附图说明

图1为实施例2的步骤二中T7E1酶切的结果。

图2为实施例2的步骤三中T7E1酶切的结果。

图3为实施例2的步骤三中测序的结果。

图4为实施例2的步骤四的结果。

图5为实施例2的步骤五的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的DNA序列均为5’→3’方向。

LentiCRISPR V2载体：Addgene,产品编号#52961。

293T细胞(人胚胎肾细胞)，携带野生型KRAS基因：中国科学院细胞库，货号SCSP-502。A549细胞(人肺腺癌细胞)，携带G12S突变型KRAS基因：COBIOER，货号CBP60084，品牌)。H2228细胞(人非小细胞肺癌细胞)，携带野生型KRAS基因：COBIOER，货号CBP60073。野生型KRAS基因如序列表的序列1所示。G12S突变型KRAS基因如序列表的序列2所示。

实施例1、sgRNA的设计

经过大量序列比对、设计、效果验证和比较，从设计的sgRNA中选择一条靶向G12S突变型KRAS基因的效果最好的sgRNA，命名为G12S-sgRNA。设置针对野生型KRAS基因相应位点的sgRNA，命名为WT-sgRNA。

G12S-sgRNA的靶点为：cttgtggtagttggagctAg；

G12S-sgRNA的全长序列为：cuugugguaguuggagcuAgguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc。

WT-sgRNA的靶点为：cttgtggtagttggagctGg；

WT-sgRNA的全长序列为：cuugugguaguuggagcuGgguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc。

G12S-sgRNA的全长序列即序列表的序列3。

实施例2、sgRNA的性能验证

一、重组质粒的构建

各条单链DNA分子的序列如下：

KRAS-wt-gRNA-F：5’-CACCGcttgtggtagttggagctGg-3’；

KRAS-wt-gRNA-R：5’-AAACcCagctccaactaccacaagC-3’。

KRAS-G12S-gRMA-F：5’-CACCGcttgtggtagttggagctAg-3’；

KRAS-G12S-gRMA-R：5’-AAACcTagctccaactaccacaagC-3’。

1、用限制性内切酶BsmBI酶切LentiCRISPR V2载体，回收具有粘末端的载体骨架。

2、分别合成KRAS-wt-gRNA-F和KRAS-wt-gRNA-R，然后退火，将退火得到的具有粘末端的双链DNA分子与步骤1得到的具有粘末端的载体骨架连接，得到重组质粒-tswt。重组质粒-tswt表达得到WT-sgRNA。

3、分别合成KRAS-G12S-gRMA-F和KRAS-G12S-gRMA-R，然后退火，将退火得到的具有粘末端的双链DNA分子与步骤1得到的具有粘末端的载体骨架连接，得到重组质粒-tsG12S。重组质粒-tsG12S表达得到G12S-sgRNA。

二、sgRNA的特异性

试验载体分别为：重组质粒-tswt或重组质粒-tsG12S或LentiCRISPR V2载体。

每10⁵个细胞转染0.5μg试验载体。

1、在细胞培养板中培养293T细胞至细胞融合度达80％左右，吸弃上清。

2、试验载体与50μlOpti-MEM混匀，得到体系A；脂质体与50μlOpti-MEM混匀，静置5min，得到体系B；将体系A和体系B混匀后室温静置20min，得到体系C。

3、取完成步骤1的细胞培养板，每孔加入100μl步骤2得到的体系C和400μlOpti-MEM，培养4-6小时。

4、完成步骤3后，吸弃上清，加入新的Opti-MEM，培养48小时。

5、完成步骤4后，收集细胞，用PBS缓冲液洗涤，然后提取基因组DNA。

6、T7E1酶切

(1)以步骤5提取的基因组DNA为模板，采用genomic-KRAS-F1和genomic-KRAS-R1组成的引物对进行PCR扩增(靶序列为554bp)，回收PCR扩增产物。

genomic-KRAS-F1：atgcatttttcttaagcgtcgatgg；

genomic-KRAS-R1：ccctgacatactcccaaggaaag。

(2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，进行变性退火反应。

反应体系：200ngPCR扩增产物、10×NEBuffer 2，用无DNase/RNase水补足至19μl。反应条件：95℃5分钟；95–85℃，每秒降低2℃；85–25℃，每秒降低0.1℃；4℃保存。

(3)完成步骤(2)后，取整个体系，加入1μl T7Endonuclease I(只要发生sgRNA的剪切，就可以酶切)，37℃反应15min，进行1％琼脂糖电泳检测。

结果见图1。图1中，1对应LentiCRISPR V2载体，2对应重组质粒-tswt，3对应重组质粒-tsG12S。293T细胞携带野生型KRAS基因，WT-sgRNA可以对293T细胞中的野生型KRAS基因发生剪切，但G12S-sgRNA不对293T细胞中的野生型KRAS基因发生剪切。结果表明，G12S-sgRNA不对野生型KRAS基因发生非特异性剪切。

三、sgRNA编辑效率检测

试验细胞为：A549细胞或H2228细胞。

1、在细胞培养板中培养293T细胞至细胞融合度达50％-70％，吸弃上清。

2、重组质粒-tsG12S与500μlOpti-MEM混匀，得到体系A；PEI与500μlOpti-MEM混匀，静置5min，得到体系B；将体系A和体系B混匀后室温静置20min，得到体系C。

3、取完成步骤1的细胞培养板，每孔加入1000μl步骤2得到的体系C，培养4-6小时。

4、完成步骤3后，吸弃上清，加入新的Opti-MEM，培养48小时(实际应用中，48-72均可)。

5、4℃、20000g离心90min，收集上清液，即为病毒液。

6、用RPMI-1640培养基培养试验细胞，然后加入步骤5得到的病毒液进行感染(MOI＝20)并培养2天，然后吸弃上清，加入含3ng/μl嘌呤霉素的RPMI-1640培养基培养2天。

7、完成步骤6后，收集细胞，提取基因组DNA，按照步骤步骤二的6进行检测。

结果见图2。A549细胞携带G12S突变型KRAS基因。H2228细胞携带野生型KRAS基因。G12S-sgRNA可以对A549细胞中的G12S突变型KRAS基因发生剪切，但不对H2228细胞中的野生型KRAS基因发生剪切。

8、取试验细胞，采用采用genomic-KRAS-F1和genomic-KRAS-R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并进行测序，结果见图3。

四、sgRNA编辑对细胞增殖的影响

试验质粒为：重组质粒-tsG12S或LentiCRISPR V2载体。

1、制备病毒液

(1)在细胞培养板中培养293T细胞至细胞融合度达50％-70％。

(2)将试验质粒与500μl Opti-MEM混匀，得到体系A；将PEI与500μlOpti-MEM混匀，静置5min，得到体系B；将体系A和体系B混匀后室温静置20min，得到体系C。

(3)取完成步骤(1)的细胞培养板，每孔加入1000μl步骤(2)得到的体系C，培养4-6小时。

(4)完成步骤(3)后，吸弃上清，加入新的完全DMEM培养基，培养48-72小时。

(5)完成步骤(4)后，4℃、20000g离心90min，收集上清液，得到浓缩后的病毒液。

试验质粒为重组质粒-tsG12S，得到的病毒液命名为G12S-sgRNA病毒液。

试验质粒为LentiCRISPR V2载体，得到的病毒液命名为V2病毒液。

2、分组处理

用RPMI-1640培养基培养A549细胞，然后加入步骤1得到的病毒液(设置用等体积培养基代替病毒液的空白对照)进行感染(MOI＝20)，然后分别于第0天、第3天、第8天、第11天和第14天检测细胞数量。

结果见图4。结果表明，G12S-sgRNA具有抑制A549细胞增殖的作用效果。

五、sgRNA编辑对细胞增殖的影响

1、制备病毒液

同步骤四的1。

2、分组处理

在6孔板中，每孔铺200个A549细胞(采用RPMI-1640培养基培养)，然后加入步骤1得到的病毒液(设置用等体积培养基代替病毒液的空白对照)进行感染(MOI＝20)，培养至第14天，用结晶紫染色并观察克隆形成情况。

结果见图5。结果表明，G12S-sgRNA具有抑制A549细胞增殖的作用效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种基于CRISPR技术治疗KRAS突变恶性肿瘤的sgRNA及其应用

<130> GNCYX171851

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 567

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 2

<211> 567

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctagtggcg taggcaagag tgccttgacg 60

atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120

aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180

caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240

gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300

aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360

ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420

tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag ggtgttgatg atgccttcta tacattagtt 480

cgagaaattc gaaaacataa agaaaagatg agcaaagatg gtaaaaagaa gaaaaagaag 540

tcaaagacaa agtgtgtaat tatgtaa 567

<210> 3

<211> 96

<212> RNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

cuugugguag uuggagcuag guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96

Claims

1.一种sgRNA，其靶序列长度为15-25bp，所述靶序列中具有序列2中的第20-34位核苷酸。

2.编码权利要求1所述sgRNA的DNA分子。

3.具有权利要求2所述DNA分子的重组载体。

4.一种药物，其活性成分为权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。

5.权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。

6.如权利要求4所述的药物或如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌症由特定癌细胞引起，所述特定癌细胞携带G12S突变型KRAS基因；所述癌细胞携带G12S突变型KRAS基因。

7.如权利要求4所述的药物或如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述癌症为肺癌；所述癌细胞为肺癌细胞。

8.一种用于对G12S突变型KRAS基因进行基因编辑的产品，其活性成分为权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体。

9.权利要求1所述sgRNA、权利要求2所述DNA分子或权利要求3所述重组载体在制备产品中的应用；所述产品的功能为对G12S突变型KRAS基因进行基因编辑。

10.用于特异沉默G12S突变型KRAS基因的物质在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗癌症和/或抑制癌细胞增殖。