CN112359060B - 含有靶向突变型kras融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白质复合物及其构建方法和应用 - Google Patents

含有靶向突变型kras融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白质复合物及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物dCas‑HDAC1/gRNAKRAS，首先催化死亡Cas9作为DNA结合装置，然后与转录抑制因子组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)融合，同时本申请设计了一个由三个crRNA组成的小组，覆盖了KRAS启动子的1500bp范围，并鉴定了crRNA1、crRNA2和crRNA3有效地沉默了KRAS，KRAS的抑制可显著抑制细胞生长，抑制软琼脂中的菌落形成，并可诱导KRAS突变的癌细胞死亡。

Description

含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白 质复合物及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体、融合蛋白及其蛋白质复合物及构建方法和应用。
背景技术
KRAS基因(又称p21和GTP酶Kras)是Ras基因家族成员之一，Ras基因家族与人类恶性肿瘤相关的基因有三种，即H-Ras、K-Ras和N-Ras，在不同的器官中表达不同。KRAS基因位于12号染色体上，编码21KD的Ras蛋白(也称p21蛋白)，高表达于胸腺、大肠和骨骼肌中，在调控细胞增殖和血管生成过程中发挥着重要的作用。Ras蛋白位于细胞膜内侧，属于GDP/GTP结合蛋白，具有内在的GTP酶活性，通过与GTP/GDP两种分子结合互相转化传导细胞间信息，就像体内的一个“开关”：细胞正常状态下，Ras蛋白与GDP结合无活性；当外界刺激因子(如生长因子EGF)把信号传导到膜内的Ras蛋白后，促进了Ras和GDP的解离，同时Ras与GTP结合而激活，从而打开下游Raf-MAPK-ERK和PI3K-AKT等其它信号通路，Ras激活后构象发生变化发挥其内在的GTP酶活性，将GTP水解为GDP，之后Ras又与GDP结合而失去活性，下游信号通路被阻断。正是由于Ras蛋白的这种内在GTP酶活性从而调节了细胞的生长、分化和凋亡等。
KRAS基因点突变后可激活其表达产物Ras蛋白，使其构型发生改变，与GDP结合能力和内在GTP酶活性下降，和GTP结合后无需外界信号刺激便可自身活化，失去了正常与GDP/GTP结合后有序的调节，活化状态的Ras持续的激活下游信号通路，造成细胞不可控制的增殖，恶性逃避凋亡，促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移的发生，原癌基因变成了有致癌活性的癌基因。
研究表明突变的KRAS基因是人类很多种癌症的驱动基因，与肿瘤的分期和预后有着密不可分的关系。例如，近95％的胰腺癌、45％的结肠癌和30％的肺腺癌患者都存在着KRAS的突变。西班牙一项大肠癌患者的研究表明，在无肺癌转移的患者中主癌灶KRAS基因突变率大约是35％，合并肺癌转移后Kra基因的突变率增长至57％；美国一项大肠癌肝转移的临床研究也表明Kras基因突变是一个独立预测预后不良的指标。类似的结论也出现在胰腺癌中，在低级别胰腺癌中突变率为74％，而发展到浸润癌状态时突变率将超过90％。这种KRAS突变在大肠癌、肺癌、胰腺癌以及其它癌症中的普遍存在使得它成为一个很好的抗肿瘤药物靶点，但是目前以它为靶点所研发的药物都未能取得预期效果，未能进入临床实验阶段。EGFR的抑制剂已经开发到第四代了，KRAS还没看到有希望的靶向药。更为遗憾的是，虽然目前临床上应用治疗肺癌和肠癌的针对EGFR分子靶向药物吉非替尼取得了很好的治疗效果，但是对存在KRAS基因突变的患者确无效，此外，KRAS突变导致对临床使用的靶向治疗(如西妥昔单抗和帕尼妥单抗)产生耐药性。这就意味着，存在着KRAS突变的近95％胰腺癌、45％结肠癌和30％肺腺癌的患者，几乎没有靶向药可用，生存期比较短。因此目前亟待开发针对突变KRAS的分子靶向药物或新技术来应对目前难以解决的由KRAS突变而引起的临床问题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明的目的之一是提供含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体。
本发明的目的之二是提供含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体的构建方法。
本发明的目的之三是提供了含有靶向突变型KRAS融合基因的融合基因蛋白。
本发明的目的之四是提供了含有靶向突变型KRAS融合基因的融合基因蛋白的构建方法。
本发明的目的之五是提供了含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物。
本发明的目的之六是提供了含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物的构建方法。
本发明的目的之七是提供了含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物在抑制含有突变KRAS基因的癌细胞抑制药物上的应用。
本发明提供的技术方案为：
含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体，所述重组载体包含融合基因dCas9-HDAC1；
其中，所述融合基因dCas9-HDAC1含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。
含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤一、以表达Flag-tagged HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.3所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pcDNA3.1-dCas9质粒上以得到所述重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1；
步骤二、以表达重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pFastBac HT质粒上以得到所述重组载体pFastBac dCas9 HDAC1。
含有靶向突变型KRAS融合基因的融合基因蛋白，所述融合基因蛋白含有由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
含有靶向突变型KRAS融合基因的融合基因蛋白的构建方法，使用所述的含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体，包括如下过程：
将重组载体pFastBac dCas9 HDAC1转化至DH10Bac细菌中，得到重组bacmid DNA后侵染昆虫细胞，侵染后收获细胞液纯化后得到所述融合基因蛋白；
其中，所述融合基因蛋白含有由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物，包括所述的融合基因蛋白和crRNA:tracrRNA二聚体；
其中，所述crRNA:tracrRNA二聚体通过含有SEQ ID NO.8所示的碱基序列组成的RNA片段、SEQ ID NO.9所示的碱基序列组成的RNA片段或者SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成的RNA片段分别与tracrRNA互补制备得到。
含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物的构建方法，包括如下步骤：
步骤1、构建重组载体pFastBac dCas9 HDAC1；
其中，所述重组载体pFastBac dCas9 HDAC1含有融合基因dCas9-HDAC1，其含有SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段；
步骤2、根据重组载体pFastBac dCas9 HDAC1制备得到融合基因蛋白dCas9-HDAC1；
其中，所述dCas9-HDAC1融合蛋白含有由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
步骤3、分别通过含有SEQ ID NO.8所示的碱基序列组成的DNA片段、SEQ ID NO.9所示的碱基序列组成的DNA片段或者SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成的DNA片段制备3种crRNA:tracrRNA二聚体；
步骤4、将所述融合基因蛋白dCas9-HDAC1和所述crRNA:tracrRNA二聚体分别组装成所述核苷酸蛋白质复合物。
优选的是，在所述步骤1中，构建重组载体pFastBac dCas9 HDAC过程包括如下步骤：
步骤1.1、以表达Flag-tagged HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.3所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pcDNA3.1-dCas9质粒上以得到所述重组载体pcDNA-dCas9-HDAC1；
步骤1.2、以表达重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pFastBac HT质粒上以得到所述重组载体pFastBac dCas9 HDAC1；以及
优选的是，在所述步骤2中，根据重组载体pFastBac dCas9 HDAC1制备得到dCas9-HDAC1融合基因蛋白过程包括如下步骤：
将所述重组载体pFastBac dCas9 HDAC1转化至DH10Bac细菌中，得到重组bacmidDNA后侵染昆虫细胞，侵染后收获细胞液纯化后得到所述融合基因蛋白dCas9-HDAC1；
其中，所述融合基因蛋白含有由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
优选的是，在所述步骤4中，组装成所述核苷酸蛋白质复合物过程包括：
将所述融合基因蛋白dCas9-HDAC1和所述crRNA:tracrRNA二聚体加入Opti-MEM培养基中室温孵育后，将贴壁细胞用胰酶处理，用不含抗生素的完全培养基重悬，在孔板中加入室温孵育后的混合物和含有细胞的培养液，在37℃孵箱中继续培育后得到所述核苷酸蛋白质复合物。
使用所述的含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物在抑制含有突变KRAS基因的癌细胞增殖药物的应用。
本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：
1、本发明应用dCas9-HDAC1融合蛋白在不破坏DNA序列或DSBs形成的前提下，通过表观基因组编辑抑制K-Ras突变体蛋白的表达，通过针对癌细胞的靶向抑制开发毒性较小的应用方法具有显著的益处；
2、本发明由于不引入外源DNA，在宿主基因组中没有插入突变，dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在靶细胞中的传递比其他形式的传递有许多优点，并且由于内源蛋白酶的降解，它具有较低的靶外效应和较低的免疫原性；
3、本发明通过对含有KRAS突变的结肠癌细胞HCT-116和肺癌细胞NCI-H358和的抑制含有突变KRAS基因的癌细胞生长的试验验证和诱导癌细胞凋亡的试验验证，证明了dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在由KRAS突变驱动的癌细胞抑制方面具有巨大的潜力和应用效果。
附图说明
图1为本发明所述的含有靶向突变型KRAS融合基因的蛋白质复合物的制备流程示意图。
图2为KRAS启动子区crRNA的位置以及覆盖的范围示意图。
图3a为dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在Western Blot试验中验证对结肠癌KRAS表达的沉默效率结果示意图。
图3b为dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在Western Blot试验中验证对肺癌KRAS表达的沉默效率结果示意图。
图4a为dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在WST-1实验中对含有KRAS突变的结肠癌细胞抑制作用的结果示意图。
图4b为dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在WST-1实验中对含有KRAS突变的肺癌细胞抑制作用的结果示意图。
图5a为dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在软琼脂克隆实验中对含有KRAS突变的结肠癌细胞抑制作用的结果示意图。
图5b为dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物在软琼脂克隆实验中对含有KRAS突变的肺癌细胞抑制作用的结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
如图1、图2所示，本发明构建了dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物系统，本发明将dCas9和HDAC1的cDNA连接于pFastBack HT真核表达载体上，成功构建了dCas9-HDAC1融合基因蛋白，同时设计了3种CRISPR RNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3)，范围覆盖了KRAS启动区的1500bp的碱基序列，在体外体系中将3种crRNA1与tracrRNA互补形成了3种不同的二聚体crRNA:tracrRNA1、crRNA:tracrRNA2、crRNA:tracrRNA3，作用类似于CRISPR/Cas9系统中的gRNA，利用转染技术，将dCas9-HDAC1融合基因蛋白和3种不同的二聚体crRNA:tracrRNA构建dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物(RNP)。
如图1所示，具体解决方案如下：
步骤S110、以表达Flag-tagged HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.3所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pcDNA3.1-dCas9质粒上以得到重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1；
步骤S120、以表达重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pFastBac HT质粒上以得到所述重组载体pFastBac dCas9 HDAC1；
步骤130、将重组载体pFastBac dCas9 HDAC1转化至DH10Bac细菌中，得到重组bacmid DNA后侵染昆虫细胞，侵染后收获细胞液纯化后得到如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的融合基因蛋白dCas9-HDAC1；
步骤210、分别通过含有SEQ ID NO.8所示的碱基序列组成的RNA片段、SEQ IDNO.9所示的碱基序列组成的RNA片段或者SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成的RNA片段制备3种二聚体crRNA:tracrRNA1、crRNA:tracrRNA2、crRNA:tracrRNA3；
步骤310、将融合基因蛋白dCas9-HDAC1分别与二聚体crRNA:tracrRNA1、crRNA:tracrRNA2、crRNA:tracrRNA3加入Opti-MEM培养基中室温孵育后，将贴壁细胞用胰酶处理，用不含抗生素的完全培养基重悬，在孔板中加入室温孵育后的混合物和含有细胞的培养液，在37℃孵箱中继续培育后得到dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物(ribonucleoprotein，RNP)。
本发明中的“重组载体”是指已连接了基因的表达载体，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。
实施例
主要实验材料和仪器
1、质粒和细胞
pcDNA3.1-dCas9购自美国Addgene公司(MA,USA,#47106)；pFastBack HT购自Lifetechnologies公司(CA,USA,#10359-016)；HCT116细胞株购自
Figure BDA0002771894490000071
CCL247TM；NCI-H358购自
Figure BDA0002771894490000072
CRL-5807TM；
2、试剂、酶与药品
限制性内切酶xbaI购自美国NEB公司(MA，USA，#R0145T)；限制性内切酶AflII购自美国NEB公司(MA，USA，#R0520S)；限制性内切酶SalI购自美国NEB公司(MA，USA，#R0138S)；NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit购自NEB公司(MA，USA，Cat#E5520S)；Ampicillin(氨苄青霉素)购自Millipore公司(MA，USA，#171254)；限制性内切酶XhoI购自美国NEB公司(MA，USA，#R0146S)；T4 DNA Ligase购自NEB公司(Cat#M0202)；NEB 5-alpha感受态细菌购自美国NEB公司(MA,USA,#C2988J)；质粒小量提取试剂盒购自Qiagen公司(Cat#27106)；DH10Bac感受态细菌购自Life technologies公司(CA，USA，#10359-016)；kanamycin购自IBI scientific公司(USA，#IB02120)；gentamicin购自Milliporem公司(MA，USA，#G1397)；tetracycline购自Millipore公司(MA，USA，#87128-25G)；X-gal购自Promega公司(WI，USA，#V3941)；IPTG购自Corning公司(#46-102-RF)；Tryptone购自Sigma-Aldrich公司(#T9410)；Bacteriological agar购于Sigma-Aldrich公司(#A5306)；Yeastextract购自Sigma-Aldrich公司(#Y1626)；NaCl购自VWR公司(#97061-270)；PureLinkTMHiPure Plasmid Maxiprep Kit购自ThermoFisher公司(Cat#K210007)；crRNA1、crRNA2、crRNA3和tracRNA(Cat#1072533)购自Integrated DNA Technologies公司；BCA试剂盒购自Bio-rad公司(CA，USA，#500-0113，#500-0114，#500-0115)；RIPA细胞裂解液购自AlfaAesar公司(#J63306-AP)；-Tween20购自(Bio-rad，#1706531)；ras单克隆抗体购自Cellsignaling technology公司(Cell signaling technology，Cat#3965)；HRP标记羊抗兔IgG购自Biorad公司(Cat#170-6515)；β-actin蛋白购自Thermo fisher公司(#A3854)；WST-1试剂购于Roche公司(USA，#11644807001)；
Figure BDA0002771894490000081
Gel Extraction试剂盒购于Qiagen公司(USA#28704)。
实验方法：
1、重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1的构建
(1)目的基因HDAC1引物设计
目的基因HDAC1引物序列如下：
上游端引物：
5'-GAAGAGGAAGGTGGGCTCTAGAGCGCAGACGCAGGGC-3'(SEQ ID NO.4)；
下游端引物：
5'-GGCTGATCAGCGGTTTAAACTTAAGTCAGGCCAACTTGACCTCC TCC-3'(SEQ ID NO.5)；
(2)PCR扩增目的基因HDAC1
以表达Flag-tagged HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物序列通过PCR扩增得到SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的DNA片段，即为目的基因HDAC1；
PCR反应条件为：98℃，30s；98℃，10sec；50℃，30sec；72℃，1.5min，25个循环；72℃，2min；
SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的DNA片段为：
atggcgcagacgcagggcacccggaggaaagtctgttactactacgacggggatgttggaaattactattatggacaaggccacccaatgaagcctcaccgaatccgcatgactcataatttgctgctcaactatggtctctaccgaaaaatggaaatctatcgccctcacaaagccaatgctgaggagatgaccaagtaccacagcgatgactacattaaattcttgcgctccatccgtccagataacatgtcggagtacagcaagcagatgcagagattcaacgttggtgaggactgtccagtattcgatggcctgtttgagttctgtcagttgtctactggtggttctgtggcaagtgctgtgaaacttaataagcagcagacggacatcgctgtgaattgggctgggggcctgcaccatgcaaagaagtccgaggcatctggcttctgttacgtcaatgatatcgtcttggccatcctggaactgctaaagtatcaccagagggtgctgtacattgacattgatattcaccatggtgacggcgtggaagaggccttctacaccacggaccgggtcatgactgtgtcctttcataagtatggagagtacttcccaggaactggggacctacgggatatcggggctggcaaaggcaagtattatgctgttaactacccgctccgagacgggattgatgacgagtcctatgaggccattttcaagccggtcatgtccaaagtaatggagatgttccagcctagtgcggtggtcttacagtgtggctcagactccctatctggggatcggttaggttgcttcaatctaactatcaaaggacacgccaagtgtgtggaatttgtcaagagctttaacctgcctatgctgatgctgggaggcggtggttacaccattcgtaacgttgcccggtgctggacatatgagacagctgtggccctggatacggagatccctaatgagcttccatacaatgactactttgaatactttggaccagatttcaagctccacatcagtccttccaatatgactaaccagaacacgaatgagtacctggagaagatcaaacagcgactgtttgagaaccttagaatgctgccgcacgcacctggggtccaaatgcaggcgattcctgaggacgccatccctgaggagagtggcgatgaggacgaagacgaccctgacaagcgcatctcgatctgctcctctgacaaacgaattgcctgtgaggaagagttctccgattctgaagaggagggagaggggggccgcaagaactcttccaacttcaaaaaagccaagagagtcaaaacagaggatgaaaaagagaaagacccagaggagaagaaagaagtcaccgaagaggagaaaaccaaggaggagaagccagaagccaaaggggtcaaggaggaggtcaagttggcctga(SEQ ID NO.3)
(3)PCR产物的电泳及回收
在目的基因HDAC1引物两端分别引入xbaI和AflII的酶切位点，1％琼脂糖凝胶回收目的基因条带(1500bp)。
上述PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后将切下的目的胶块，利用
Figure BDA0002771894490000101
Gel Extraction试剂盒回收PCR产物。具体步骤如下：向胶块中加入三倍体积QG缓冲液，50℃放置10min使胶块溶解，加入等体积异丙醇，将混合液加入试剂盒中的吸附柱，13000rpm离心1min使以上溶液通过吸附柱,弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入750μl漂洗液PE，13000rpm离心1min，弃去收集管中的液体。将吸附柱放入新的1.5ml EP管，向其中加入50μl无菌水溶解PCR产物，13000rpm离心1min收集PCR产物；测定PCR产物浓度，-20℃保存备用。
(4)重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1的连接
将质粒载体pcDNA3.1-dCas9和回收目的基因条带用xbaI和AflII双酶切，酶切反应在37℃孵育60min，1％琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒酶切片段和目的基因酶切片段；
将质粒酶切片段和目的基因酶切片段连接，连接反应使用NEB uilder HiFi DNAAssembly Master Mix，取5ul连接产物与50ul NEB 5-alpha感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置冰上放置5min，加入预热至室温的950ul SOC培养基，37℃恒温摇床培养1h，吸取200ul的菌液，均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上，在37℃培养箱倒置培养过夜；
挑取4个单独菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床过夜培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行验证，得到重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1。
2、重组载体pFastBac dCas9 HDAC1的构建
(1)目的基因dcas9-HDAC1引物设计
目的基因dcas9-HDAC1引物序列如下：
上游端引物：
5′-CAAGTCGACGACTACAAAGACCATGACGGTG-3′(SEQ ID NO.6)；
下游端引物：
5′-GAACTCGAGTCAGGCCAACTTGACCTCCTCC-3′(SEQ ID NO.7)；
(2)PCR扩增目的基因dcas9-HDAC1
以表达pcDNA-dCas9-HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物序列通过PCR扩增得到SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA片段，即为目的基因dcas9-HDAC1；
PCR反应条件为：98℃，30s；98℃，10sec；62℃，30s；72℃，11min，25个循环；72℃，2min；
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的DNA片段为：
atggataagaaatactcaataggcttagctatcggcacaaatagcgtcggatgggcggtgatcactgatgaatataaggttccgtctaaaaagttcaaggttctgggaaatacagaccgccacagtatcaaaaaaaatcttataggggctcttttatttgacagtggagagacagcggaagcgactcgtctcaaacggacagctcgtagaaggtatacacgtcggaagaatcgtatttgttatctacaggagattttttcaaatgagatggcgaaagtagatgatagtttctttcatcgacttgaagagtcttttttggtggaagaagacaagaagcatgaacgtcatcctatttttggaaatatagtagatgaagttgcttatcatgagaaatatccaactatctatcatctgcgaaaaaaattggtagattctactgataaagcggatttgcgcttaatctatttggccttagcgcatatgattaagtttcgtggtcattttttgattgagggagatttaaatcctgataatagtgatgtggacaaactatttatccagttggtacaaacctacaatcaattatttgaagaaaaccctattaacgcaagtggagtagatgctaaagcgattctttctgcacgattgagtaaatcaagacgattagaaaatctcattgctcagctccccggtgagaagaaaaatggcttatttgggaatctcattgctttgtcattgggtttgacccctaattttaaatcaaattttgatttggcagaagatgctaaattacagctttcaaaagatacttacgatgatgatttagataatttattggcgcaaattggagatcaatatgctgatttgtttttggcagctaagaatttatcagatgctattttactttcagatatcctaagagtaaatactgaaataactaaggctcccctatcagcttcaatgattaaacgctacgatgaacatcatcaagacttgactcttttaaaagctttagttcgacaacaacttccagaaaagtataaagaaatcttttttgatcaatcaaaaaacggatatgcaggttatattgatgggggagctagccaagaagaattttataaatttatcaaaccaattttagaaaaaatggatggtactgaggaattattggtgaaactaaatcgtgaagatttgctgcgcaagcaacggacctttgacaacggctctattccccatcaaattcacttgggtgagctgcatgctattttgagaagacaagaagacttttatccatttttaaaagacaatcgtgagaagattgaaaaaatcttgacttttcgaattccttattatgttggtccattggcgcgtggcaatagtcgttttgcatggatgactcggaagtctgaagaaacaattaccccatggaattttgaagaagttgtcgataaaggtgcttcagctcaatcatttattgaacgcatgacaaactttgataaaaatcttccaaatgaaaaagtactaccaaaacatagtttgctttatgagtattttacggtttataacgaattgacaaaggtcaaatatgttactgaaggaatgcgaaaaccagcatttctttcaggtgaacagaagaaagccattgttgatttactcttcaaaacaaatcgaaaagtaaccgttaagcaattaaaagaagattatttcaaaaaaatagaatgttttgatagtgttgaaatttcaggagttgaagatagatttaatgcttcattaggtacctaccatgatttgctaaaaattattaaagataaagattttttggataatgaagaaaatgaagatatcttagaggatattgttttaacattgaccttatttgaagatagggagatgattgaggaaagacttaaaacatatgctcacctctttgatgataaggtgatgaaacagcttaaacgtcgccgttatactggttggggacgtttgtctcgaaaattgattaatggtattagggataagcaatctggcaaaacaatattagattttttgaaatcagatggttttgccaatcgcaattttatgcagctgatccatgatgatagtttgacatttaaagaagacattcaaaaagcacaagtgtctggacaaggcgatagtttacatgaacatattgcaaatttagctggtagccctgctattaaaaaaggtattttacagactgtaaaagttgttgatgaattggtcaaagtaatggggcggcataagccagaaaatatcgttattgaaatggcacgtgaaaatcagacaactcaaaagggccagaaaaattcgcgagagcgtatgaaacgaatcgaagaaggtatcaaagaattaggaagtcagattcttaaagagcatcctgttgaaaatactcaattgcaaaatgaaaagctctatctctattatctccaaaatggaagagacatgtatgtggaccaagaattagatattaatcgtttaagtgattatgatgtcgatgccattgttccacaaagtttccttaaagacgattcaatagacaataaggtcttaacgcgttctgataaaaatcgtggtaaatcggataacgttccaagtgaagaagtagtcaaaaagatgaaaaactattggagacaacttctaaacgccaagttaatcactcaacgtaagtttgataatttaacgaaagctgaacgtggaggtttgagtgaacttgataaagctggttttatcaaacgccaattggttgaaactcgccaaatcactaagcatgtggcacaaattttggatagtcgcatgaatactaaatacgatgaaaatgataaacttattcgagaggttaaagtgattaccttaaaatctaaattagtttctgacttccgaaaagatttccaattctataaagtacgtgagattaacaattaccatcatgcccatgatgcgtatctaaatgccgtcgttggaactgctttgattaagaaatatccaaaacttgaatcggagtttgtctatggtgattataaagtttatgatgttcgtaaaatgattgctaagtctgagcaagaaataggcaaagcaaccgcaaaatatttcttttactctaatatcatgaacttcttcaaaacagaaattacacttgcaaatggagagattcgcaaacgccctctaatcgaaactaatggggaaactggagaaattgtctgggataaagggcgagattttgccacagtgcgcaaagtattgtccatgccccaagtcaatattgtcaagaaaacagaagtacagacaggcggattctccaaggagtcaattttaccaaaaagaaattcggacaagcttattgctcgtaaaaaagactgggatccaaaaaaatatggtggttttgatagtccaacggtagcttattcagtcctagtggttgctaaggtggaaaaagggaaatcgaagaagttaaaatccgttaaagagttactagggatcacaattatggaaagaagttcctttgaaaaaaatccgattgactttttagaagctaaaggatataaggaagttaaaaaagacttaatcattaaactacctaaatatagtctttttgagttagaaaacggtcgtaaacggatgctggctagtgccggagaattacaaaaaggaaatgagctggctctgccaagcaaatatgtgaattttttatatttagctagtcattatgaaaagttgaagggtagtccagaagataacgaacaaaaacaattgtttgtggagcagcataagcattatttagatgagattattgagcaaatcagtgaattttctaagcgtgttattttagcagatgccaatttagataaagttcttagtgcatataacaaacatagagacaaaccaatacgtgaacaagcagaaaatattattcatttatttacgttgacgaatcttggagctcccgctgcttttaaatattttgatacaacaattgatcgtaaacgatatacgtctacaaaagaagttttagatgccactcttatccatcaatccatcactggtctttatgaaacacgcattgatttgagtcagctaggaggtatggcgcagacgcagggcacccggaggaaagtctgttactactacgacggggatgttggaaattactattatggacaaggccacccaatgaagcctcaccgaatccgcatgactcataatttgctgctcaactatggtctctaccgaaaaatggaaatctatcgccctcacaaagccaatgctgaggagatgaccaagtaccacagcgatgactacattaaattcttgcgctccatccgtccagataacatgtcggagtacagcaagcagatgcagagattcaacgttggtgaggactgtccagtattcgatggcctgtttgagttctgtcagttgtctactggtggttctgtggcaagtgctgtgaaacttaataagcagcagacggacatcgctgtgaattgggctgggggcctgcaccatgcaaagaagtccgaggcatctggcttctgttacgtcaatgatatcgtcttggccatcctggaactgctaaagtatcaccagagggtgctgtacattgacattgatattcaccatggtgacggcgtggaagaggccttctacaccacggaccgggtcatgactgtgtcctttcataagtatggagagtacttcccaggaactggggacctacgggatatcggggctggcaaaggcaagtattatgctgttaactacccgctccgagacgggattgatgacgagtcctatgaggccattttcaagccggtcatgtccaaagtaatggagatgttccagcctagtgcggtggtcttacagtgtggctcagactccctatctggggatcggttaggttgcttcaatctaactatcaaaggacacgccaagtgtgtggaatttgtcaagagctttaacctgcctatgctgatgctgggaggcggtggttacaccattcgtaacgttgcccggtgctggacatatgagacagctgtggccctggatacggagatccctaatgagcttccatacaatgactactttgaatactttggaccagatttcaagctccacatcagtccttccaatatgactaaccagaacacgaatgagtacctggagaagatcaaacagcgactgtttgagaaccttagaatgctgccgcacgcacctggggtccaaatgcaggcgattcctgaggacgccatccctgaggagagtggcgatgaggacgaagacgaccctgacaagcgcatctcgatctgctcctctgacaaacgaattgcctgtgaggaagagttctccgattctgaagaggagggagaggggggccgcaagaactcttccaacttcaaaaaagccaagagagtcaaaacagaggatgaaaaagagaaagacccagaggagaagaaagaagtcaccgaagaggagaaaaccaaggaggagaagccagaagccaaaggggtcaaggaggaggtcaagttggcctga(SEQ ID NO.1)
(3)PCR产物的电泳及回收
在目的基因dcas9-HDAC1引物两端分别引入SalI和XhoI的酶切位点，1％琼脂糖凝胶回收目的基因条带(11000bp)。
上述PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后将切下的目的胶块，用
Figure BDA0002771894490000131
Gel Extraction试剂盒回收PCR产物。具体步骤如下：向胶块中加入三倍体积QG缓冲液，50℃放置10min使胶块溶解，加入等体积异丙醇，将混合液加入试剂盒中的吸附柱，13000rpm离心1min使以上溶液通过吸附柱，弃去收集管中的液体。向吸附柱中加入750μl漂洗液PE，13000rpm离心1min，弃去收集管中的液体，将吸附柱放入新的1.5ml EP管，向其中加入50μl无菌水溶解PCR产物，13000rpm离心1min收集PCR产物；测定PCR产物浓度，-20℃保存备用。
(4)重组载体pFastBac dCas9 HDAC1的连接
将质粒载体pFastBac HT和回收目的基因条带用SalI和XhoI双酶切，酶切反应在37℃孵育60min，1％琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒酶切片段和目的基因酶切片段；
将质粒酶切片段与目的基因酶切片段连接，连接反应使用T4 DNA Ligase，取5ul连接产物与50ul NEB 5-alpha感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激30s，立即置冰上放置5min，加入预热至室温的950ul SOC培养基，37℃恒温摇床培养1h，吸取200ul的菌液，均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上，在37℃培养箱倒置培养过夜；
挑取4个单独菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床过夜培养，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，进行验证，得到重组载体pFastBac dCas9 HDAC1。
3、融合基因蛋白dcas9-HDAC1的构建
将重组载体pFastBac dcas9 HDAC1转化至DH10Bac细菌中，得到重组bacmid DNA，使用蓝白斑筛选含有重组杆粒的克隆；
取5ul连接产物与100ul DH10Bac感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激45s，立即置冰上放置2min，加入室温的900ul SOC培养基，37℃恒温摇床培养4h，吸取稀释10倍的的菌液200ul，均匀涂布于含50μg/mL kanamycin，7μg/mL gentamicin，10μg/mLtetracycline，200μg/mL X-gal,and 1mM IPTG的LB平板上，在37℃培养箱倒置培养48h。Bacmid如果没有发生重组的话，在X-gal和IPTG的存在下，会形成蓝色的菌落。相反，会形成白色的菌落。挑选6个白色单独菌落接种于含5ml，50μg/mL kanamycin，7μg/mLgentamicin，10μg/mL tetracycline抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床过夜培养，用PureLinkTM HiPure Plasmid Maxiprep Kit提取Bacmid；
将5×105个sf9昆虫细胞接种到细胞培养皿中，27℃培养1h待细胞贴壁。准备两个1.5mL的离心管，各加入100μL Grace培养基，其中一个加入1μg Bacmid-dcas9 HDAC1质粒，另外一个加入6μL转染试剂CellfectinⅡReagent，将两者轻柔混匀后静置30min，加入800μL Grace培养基轻柔混匀后缓慢滴入接种了sf9的细胞培养皿中，放置于27℃培养。5h后更换培养基为SIM SF培养基，继续27℃培养72h。72h后将培养基室温500×g离心5min后上清液即为dcas9 HDAC1重组杆状病毒P1；
将200μL P1病毒加到接种了4×106个sf9细胞的细胞培养瓶中，置于27℃培养72h后，将培养基室温500×g离心5min后获取的上清液为dcas9HDAC1重组杆状病毒P2；
将300μL杆状病毒P2加到接种了1×107个sf9细胞的细胞培养瓶中，置于27℃培养72h，将培养基室温500×g离心5min后获得的上清液为dcas9HDAC1重组杆状病毒P3；
将1×107个sf9细胞接种到含10mL昆虫SIM SF培养基的细胞培养瓶中，27℃培养1h待细胞贴壁，然后加入dcas9HDAC1重组杆状病毒P3 600μL，27℃培养72h，观察到明显的细胞病变，收集细胞，每个培养瓶的细胞沉淀加入1mL非变性细胞裂解液；
(1)离心收集细胞，加入适量的裂解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，pH＝8.0)，裂解细胞，我们的方法是反复冻融或者冰浴超声，然后，4℃15 000×g离心15min获取上清；
(2)用的是GE的纯化系统纯化的，选用Ni亲和层析；
(3)离心后的上清首先上Ni柱，流速为1ml/min，缓冲液为(1)中裂解缓冲液；
(4)洗脱采用的是线性洗脱，将B泵(缓冲液为裂解液50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，pH＝8.0加入500mM咪唑)，洗脱条件为B泵0％-100％是35ml，平衡后就调节B泵，做一个线性洗脱，分管收集后跑电泳。
(5)收集目的蛋白，用Sephadex G-50分子筛层析进行除盐，上样后，用50mM的磷酸缓冲液洗脱，收集的蛋白峰组分积进行超滤浓缩，得到由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的融合基因蛋白dcas9-HDAC1；
由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的融合基因蛋白dcas9-HDAC1为：
MetAspLysLysTyrSerIleGlyLeuAlaIleGlyThrAsnSerValGlyTrpAlaValIleThrAspGluTyrLysValProSerLysLysPheLysValLeuGlyAsnThrAspArgHisSerIleLysLysAsnLeuIleGlyAlaLeuLeuPheAspSerGlyGluThrAlaGluAlaThrArgLeuLysArgThrAlaArgArgArgTyrThrArgArgLysAsnArgIleCysTyrLeuGlnGluIlePheSerAsnGluMetAlaLysValAspAspSerPhePheHisArgLeuGluGluSerPheLeuValGluGluAspLysLysHisGluArgHisProIlePheGlyAsnIleValAspGluValAlaTyrHisGluLysTyrProThrIleTyrHisLeuArgLysLysLeuValAspSerThrAspLysAlaAspLeuArgLeuIleTyrLeuAlaLeuAlaHisMetIleLysPheArgGlyHisPheLeuIleGluGlyAspLeuAsnProAspAsnSerAspValAspLysLeuPheIleGlnLeuValGlnThrTyrAsnGlnLeuPheGluGluAsnProIleAsnAlaSerGlyValAspAlaLysAlaIleLeuSerAlaArgLeuSerLysSerArgArgLeuGluAsnLeuIleAlaGlnLeuProGlyGluLysLysAsnGlyLeuPheGlyAsnLeuIleAlaLeuSerLeuGlyLeuThrProAsnPheLysSerAsnPheAspLeuAlaGluAspAlaLysLeuGlnLeuSerLysAspThrTyrAspAspAspLeuAspAsnLeuLeuAlaGlnIleGlyAspGlnTyrAlaAspLeuPheLeuAlaAlaLysAsnLeuSerAspAlaIleLeuLeuSerAspIleLeuArgValAsnThrGluIleThrLysAlaProLeuSerAlaSerMetIleLysArgTyrAspGluHisHisGlnAspLeuThrLeuLeuLysAlaLeuValArgGlnGlnLeuProGluLysTyrLysGluIlePhePheAspGlnSerLysAsnGlyTyrAlaGlyTyrIleAspGlyGlyAlaSerGlnGluGluPheTyrLysPheIleLysProIleLeuGluLysMetAspGlyThrGluGluLeuLeuValLysLeuAsnArgGluAspLeuLeuArgLysGlnArgThrPheAspAsnGlySerIleProHisGlnIleHisLeuGlyGluLeuHisAlaIleLeuArgArgGlnGluAspPheTyrProPheLeuLysAspAsnArgGluLysIleGluLysIleLeuThrPheArgIleProTyrTyrValGlyProLeuAlaArgGlyAsnSerArgPheAlaTrpMetThrArgLysSerGluGluThrIleThrProTrpAsnPheGluGluValValAspLysGlyAlaSerAlaGlnSerPheIleGluArgMetThrAsnPheAspLysAsnLeuProAsnGluLysValLeuProLysHisSerLeuLeuTyrGluTyrPheThrValTyrAsnGluLeuThrLysValLysTyrValThrGluGlyMetArgLysProAlaPheLeuSerGlyGluGlnLysLysAlaIleValAspLeuLeuPheLysThrAsnArgLysValThrValLysGlnLeuLysGluAspTyrPheLysLysIleGluCysPheAspSerValGluIleSerGlyValGluAspArgPheAsnAlaSerLeuGlyThrTyrHisAspLeuLeuLysIleIleLysAspLysAspPheLeuAspAsnGluGluAsnGluAspIleLeuGluAspIleValLeuThrLeuThrLeuPheGluAspArgGluMetIleGluGluArgLeuLysThrTyrAlaHisLeuPheAspAspLysValMetLysGlnLeuLysArgArgArgTyrThrGlyTrpGlyArgLeuSerArgLysLeuIleAsnGlyIleArgAspLysGlnSerGlyLysThrIleLeuAspPheLeuLysSerAspGlyPheAlaAsnArgAsnPheMetGlnLeuIleHisAspAspSerLeuThrPheLysGluAspIleGlnLysAlaGlnValSerGlyGlnGlyAspSerLeuHisGluHisIleAlaAsnLeuAlaGlySerProAlaIleLysLysGlyIleLeuGlnThrValLysValValAspGluLeuValLysValMetGlyArgHisLysProGluAsnIleValIleGluMetAlaArgGluAsnGlnThrThrGlnLysGlyGlnLysAsnSerArgGluArgMetLysArgIleGluGluGlyIleLysGluLeuGlySerGlnIleLeuLysGluHisProValGluAsnThrGlnLeuGlnAsnGluLysLeuTyrLeuTyrTyrLeuGlnAsnGlyArgAspMetTyrValAspGlnGluLeuAspIleAsnArgLeuSerAspTyrAspValAspAlaIleValProGlnSerPheLeuLysAspAspSerIleAspAsnLysValLeuThrArgSerAspLysAsnArgGlyLysSerAspAsnValProSerGluGluValValLysLysMetLysAsnTyrTrpArgGlnLeuLeuAsnAlaLysLeuIleThrGlnArgLysPheAspAsnLeuThrLysAlaGluArgGlyGlyLeuSerGluLeuAspLysAlaGlyPheIleLysArgGlnLeuValGluThrArgGlnIleThrLysHisValAlaGlnIleLeuAspSerArgMetAsnThrLysTyrAspGluAsnAspLysLeuIleArgGluValLysValIleThrLeuLysSerLysLeuValSerAspPheArgLysAspPheGlnPheTyrLysValArgGluIleAsnAsnTyrHisHisAlaHisAspAlaTyrLeuAsnAlaValValGlyThrAlaLeuIleLysLysTyrProLysLeuGluSerGluPheValTyrGlyAspTyrLysValTyrAspValArgLysMetIleAlaLysSerGluGlnGluIleGlyLysAlaThrAlaLysTyrPhePheTyrSerAsnIleMetAsnPhePheLysThrGluIleThrLeuAlaAsnGlyGluIleArgLysArgProLeuIleGluThrAsnGlyGluThrGlyGluIleValTrpAspLysGlyArgAspPheAlaThrValArgLysValLeuSerMetProGlnValAsnIleValLysLysThrGluValGlnThrGlyGlyPheSerLysGluSerIleLeuProLysArgAsnSerAspLysLeuIleAlaArgLysLysAspTrpAspProLysLysTyrGlyGlyPheAspSerProThrValAlaTyrSerValLeuValValAlaLysValGluLysGlyLysSerLysLysLeuLysSerValLysGluLeuLeuGlyIleThrIleMetGluArgSerSerPheGluLysAsnProIleAspPheLeuGluAlaLysGlyTyrLysGluValLysLysAspLeuIleIleLysLeuProLysTyrSerLeuPheGluLeuGluAsnGlyArgLysArgMetLeuAlaSerAlaGlyGluLeuGlnLysGlyAsnGluLeuAlaLeuProSerLysTyrValAsnPheLeuTyrLeuAlaSerHisTyrGluLysLeuLysGlySerProGluAspAsnGluGlnLysGlnLeuPheValGluGlnHisLysHisTyrLeuAspGluIleIleGluGlnIleSerGluPheSerLysArgValIleLeuAlaAspAlaAsnLeuAspLysValLeuSerAlaTyrAsnLysHisArgAspLysProIleArgGluGlnAlaGluAsnIleIleHisLeuPheThrLeuThrAsnLeuGlyAlaProAlaAlaPheLysTyrPheAspThrThrIleAspArgLysArgTyrThrSerThrLysGluValLeuAspAlaThrLeuIleHisGlnSerIleThrGlyLeuTyrGluThrArgIleAspLeuSerGlnLeuGlyGlyMetAlaGlnThrGlnGlyThrArgArgLysValCysTyrTyrTyrAspGlyAspValGlyAsnTyrTyrTyrGlyGlnGlyHisProMetLysProHisArgIleArgMetThrHisAsnLeuLeuLeuAsnTyrGlyLeuTyrArgLysMetGluIleTyrArgProHisLysAlaAsnAlaGluGluMetThrLysTyrHisSerAspAspTyrIleLysPheLeuArgSerIleArgProAspAsnMetSerGluTyrSerLysGlnMetGlnArgPheAsnValGlyGluAspCysProValPheAspGlyLeuPheGluPheCysGlnLeuSerThrGlyGlySerValAlaSerAlaValLysLeuAsnLysGlnGlnThrAspIleAlaValAsnTrpAlaGlyGlyLeuHisHisAlaLysLysSerGluAlaSerGlyPheCysTyrValAsnAspIleValLeuAlaIleLeuGluLeuLeuLysTyrHisGlnArgValLeuTyrIleAspIleAspIleHisHisGlyAspGlyValGluGluAlaPheTyrThrThrAspArgValMetThrValSerPheHisLysTyrGlyGluTyrPheProGlyThrGlyAspLeuArgAspIleGlyAlaGlyLysGlyLysTyrTyrAlaValAsnTyrProLeuArgAspGlyIleAspAspGluSerTyrGluAlaIlePheLysProValMetSerLysValMetGluMetPheGlnProSerAlaValValLeuGlnCysGlySerAspSerLeuSerGlyAspArgLeuGlyCysPheAsnLeuThrIleLysGlyHisAlaLysCysValGluPheValLysSerPheAsnLeuProMetLeuMetLeuGlyGlyGlyGlyTyrThrIleArgAsnValAlaArgCysTrpThrTyrGluThrAlaValAlaLeuAspThrGluIleProAsnGluLeuProTyrAsnAspTyrPheGluTyrPheGlyProAspPheLysLeuHisIleSerProSerAsnMetThrAsnGlnAsnThrAsnGluTyrLeuGluLysIleLysGlnArgLeuPheGluAsnLeuArgMetLeuProHisAlaProGlyValGlnMetGlnAlaIleProGluAspAlaIleProGluGluSerGlyAspGluAspGluAspAspProAspLysArgIleSerIleCysSerSerAspLysArgIleAlaCysGluGluGluPheSerAspSerGluGluGluGlyGluGlyGlyArgLysAsnSerSerAsnPheLysLysAlaLysArgValLysThrGluAspGluLysGluLysAspProGluGluLysLysGluValThrGluGluGluLysThrLysGluGluLysProGluAlaLysGlyValLysGluGluValLysLeuAla(SEQ ID NO.2)
4、二聚体crRNA:tracrRNA1、crRNA:tracrRNA2、crRNA:tracrRNA3的构建
(1)3种crRNA的引物设计
crRNA1的序列：
5′-UCUUCAGACGGGCGUACGAGGUUUUAGAGCUAUGCU-3′(SEQ ID NO.8)；
crRNA2的序列：
5′-CAGGGACUUCGCUUAUACCCGUUUUAGAGCUAUGCU-3′(SEQ ID NO.9)；
crRNA3的序列：
5′-AUCAUCACGACAACCUUAUGGUUUUAGAGCUAUGCU-3′(SEQ ID NO.10)；
(2)二聚体crRNA1:tracrRNA、crRNA2:tracrRNA、crRNA3:tracrRNA、在体外合成过程：
将crRNA1，crRNA2，crRNA3及tracrRNA分别溶解于Duplex缓冲液中制成储备液，终浓度为100μM；
将三种crRNA与tracrRNA分别等浓度混合于Duplex缓冲液中，终浓度为1μM；
将三种crRNA与tracrRNA混合溶液在95摄氏度加热5min，冷却至室温后使用。
5、dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物(RNP)的构建
步骤1、分别将二聚体crRNA:tracrRNA1(1μM，24μL)、crRNA:tracrRNA2(1μM，24μL)、crRNA:tracrRNA3(1μM，24μL)与融合基因蛋白dcas9-HDAC1(24pmol)加入到Opti-MEM培养基，稀释到800μL得到制备的RNP；
步骤2、室温孵育5min；
步骤3、将贴壁细胞用胰酶消化处理，400000细胞用不含抗生素的完全培养基重悬，6孔板中加入800μL步骤1中制备好的RNP以及1.6mL含有细胞的培养液(640,000细胞/每孔)，RNP终浓度为10nM；
步骤4、在37℃孵箱中继续培育得到最终的dCas-HDAC1/gRNAKRAS核苷酸蛋白质复合物(RNP)。
6、Western Blot试验验证KRAS的沉默效率
取生长状态良好的癌细胞，加入RNP复合物(10nmol)，继续培养48h。收集细胞，加入RIPA细胞裂解液，用枪头轻轻吹打，冰上静置30min。13000rpm,4℃离心10min，取上清于-80℃保存备用。用BCA试剂盒检测提取液中总蛋白浓度。
将相当于100μg蛋白的细胞裂解液与4×蛋白上样缓冲液混匀均匀，加入上样孔中进行恒压电泳。电泳条件：浓缩胶80V，30min；分离胶120V，60min。用Trans-Blot Turbo系统进行转印。转印后的膜用PBST(含0.1％吐温20的PBS溶液)洗涤，用PBST配置的5％(w/v)脱脂奶粉溶液在摇床上振荡封闭0.5h，TBS洗涤三次，与稀释后(1:1000)的ras单克隆抗体(Cell signaling technology,Cat#3965)孵育过夜，PBST洗涤三次。再与稀释后(1:1000)的二抗(HRP标记羊抗兔IgG，Biorad Cat#170-6515)孵育，室温振摇1h，PBST洗涤三次。内参选用β-actin蛋白，同等条件下分别孵育一抗与二抗。随后ECL化学发光检测，分析结果。
如图3a～3b所示，将RNP复合物分别转入到HCT-116(结肠癌，G13D KRAS点突变)和后，Western Blot结果表明二聚体crRNA:tracrRNA1、crRNA:tracrRNA2与dCas9-HDAC1联合可使得KRAS表达降低，效果最为显著，在NCI-H358(肺癌，G12C KRAS点突变)中同样有效。
7、抑制含有突变KRAS基因的癌细胞生长的试验验证
96孔细胞板中培养细胞，5000个细胞/100uL/每孔。每个处理组设置3个复孔，每孔加入10微升WST-1溶液；用无细胞的细胞培养液和WST-1溶液作为空白对照。在细胞培养箱中培养1个小时，然后450nm检测吸光度值，细胞活力值通过百分比表示。
本发明利用WST-1实验和软琼脂克隆形成实验对含有KRAS突变的结肠癌细胞HCT-116和肺癌细胞NCI-H358检测了RNP复合物沉默KRAS表达的同时，对细胞增殖的影响。
如图4、图5所示，实验结果表明，RNP复合物显著的抑制了这2株细胞的增殖，并且KRAS的沉默也可以显著的抑制这两株细胞的增殖。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林医药学院
<120> 含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白质复合物及其构建方法和应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5550
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，融合基因dCas9-HDAC1
<400> 1
atggataaga aatactcaat aggcttagct atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg 60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc 120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa 180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt 240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga 300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga 360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa 420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat 480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat 540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct 600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga 660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat 720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa 780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg 840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt 900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca 960
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga 1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca 1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta 1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc 1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat 1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt 1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt 1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa 1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa 1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt 1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt 1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc 1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt 1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt 1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt 1860
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct 1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga 1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta 2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat 2100
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta 2160
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact 2220
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt 2280
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt 2340
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct 2400
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga 2460
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatgcc 2520
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct 2580
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa 2640
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta 2700
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa 2760
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat 2820
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct 2880
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat 2940
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa 3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa 3060
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct 3120
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc 3180
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt 3240
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta 3300
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt 3360
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct 3420
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt 3480
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac 3540
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa 3600
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta 3660
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt 3720
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag 3780
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt 3840
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa 3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct 3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa 4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt 4080
gatttgagtc agctaggagg tatggcgcag acgcagggca cccggaggaa agtctgttac 4140
tactacgacg gggatgttgg aaattactat tatggacaag gccacccaat gaagcctcac 4200
cgaatccgca tgactcataa tttgctgctc aactatggtc tctaccgaaa aatggaaatc 4260
tatcgccctc acaaagccaa tgctgaggag atgaccaagt accacagcga tgactacatt 4320
aaattcttgc gctccatccg tccagataac atgtcggagt acagcaagca gatgcagaga 4380
ttcaacgttg gtgaggactg tccagtattc gatggcctgt ttgagttctg tcagttgtct 4440
actggtggtt ctgtggcaag tgctgtgaaa cttaataagc agcagacgga catcgctgtg 4500
aattgggctg ggggcctgca ccatgcaaag aagtccgagg catctggctt ctgttacgtc 4560
aatgatatcg tcttggccat cctggaactg ctaaagtatc accagagggt gctgtacatt 4620
gacattgata ttcaccatgg tgacggcgtg gaagaggcct tctacaccac ggaccgggtc 4680
atgactgtgt cctttcataa gtatggagag tacttcccag gaactgggga cctacgggat 4740
atcggggctg gcaaaggcaa gtattatgct gttaactacc cgctccgaga cgggattgat 4800
gacgagtcct atgaggccat tttcaagccg gtcatgtcca aagtaatgga gatgttccag 4860
cctagtgcgg tggtcttaca gtgtggctca gactccctat ctggggatcg gttaggttgc 4920
ttcaatctaa ctatcaaagg acacgccaag tgtgtggaat ttgtcaagag ctttaacctg 4980
cctatgctga tgctgggagg cggtggttac accattcgta acgttgcccg gtgctggaca 5040
tatgagacag ctgtggccct ggatacggag atccctaatg agcttccata caatgactac 5100
tttgaatact ttggaccaga tttcaagctc cacatcagtc cttccaatat gactaaccag 5160
aacacgaatg agtacctgga gaagatcaaa cagcgactgt ttgagaacct tagaatgctg 5220
ccgcacgcac ctggggtcca aatgcaggcg attcctgagg acgccatccc tgaggagagt 5280
ggcgatgagg acgaagacga ccctgacaag cgcatctcga tctgctcctc tgacaaacga 5340
attgcctgtg aggaagagtt ctccgattct gaagaggagg gagagggggg ccgcaagaac 5400
tcttccaact tcaaaaaagc caagagagtc aaaacagagg atgaaaaaga gaaagaccca 5460
gaggagaaga aagaagtcac cgaagaggag aaaaccaagg aggagaagcc agaagccaaa 5520
ggggtcaagg aggaggtcaa gttggcctga 5550
<210> 2
<211> 1849
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，融合基因蛋白dCas9-HDAC1的氨基酸序列
<400> 2
Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val
1 5 10 15
Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe
20 25 30
Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile
35 40 45
Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu
50 55 60
Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser
85 90 95
Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys
100 105 110
His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr
115 120 125
His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp
130 135 140
Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His
145 150 155 160
Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro
165 170 175
Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr
180 185 190
Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala
195 200 205
Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn
210 215 220
Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn
225 230 235 240
Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe
245 250 255
Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp
260 265 270
Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp
275 280 285
Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp
290 295 300
Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser
305 310 315 320
Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys
325 330 335
Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe
340 345 350
Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser
355 360 365
Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp
370 375 380
Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg
385 390 395 400
Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu
405 410 415
Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe
420 425 430
Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile
435 440 445
Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp
450 455 460
Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu
465 470 475 480
Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr
485 490 495
Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser
500 505 510
Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys
515 520 525
Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln
530 535 540
Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr
545 550 555 560
Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp
565 570 575
Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly
580 585 590
Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr
610 615 620
Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala
625 630 635 640
His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr
645 650 655
Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp
660 665 670
Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe
675 680 685
Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe
690 695 700
Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu
705 710 715 720
His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly
725 730 735
Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly
740 745 750
Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln
755 760 765
Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile
770 775 780
Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro
785 790 795 800
Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu
805 810 815
Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg
820 825 830
Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys
835 840 845
Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg
850 855 860
Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys
865 870 875 880
Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys
885 890 895
Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp
900 905 910
Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr
915 920 925
Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp
930 935 940
Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser
945 950 955 960
Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg
965 970 975
Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val
980 985 990
Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe
995 1000 1005
Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser
1025 1030 1035 1040
Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu
1045 1050 1055
Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile
1060 1065 1070
Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser
1075 1080 1085
Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1090 1095 1100
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile
1105 1110 1115 1120
Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser
1125 1130 1135
Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly
1140 1145 1150
Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile
1155 1160 1165
Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala
1170 1175 1180
Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys
1185 1190 1195 1200
Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser
1205 1210 1215
Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr
1220 1225 1230
Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser
1235 1240 1245
Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val
1265 1270 1275 1280
Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys
1285 1290 1295
His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu
1300 1305 1310
Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp
1315 1320 1325
Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1330 1335 1340
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile
1345 1350 1355 1360
Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Met Ala Gln Thr Gln Gly Thr Arg Arg
1365 1370 1375
Lys Val Cys Tyr Tyr Tyr Asp Gly Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly
1380 1385 1390
Gln Gly His Pro Met Lys Pro His Arg Ile Arg Met Thr His Asn Leu
1395 1400 1405
Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr Arg Lys Met Glu Ile Tyr Arg Pro His
1410 1415 1420
Lys Ala Asn Ala Glu Glu Met Thr Lys Tyr His Ser Asp Asp Tyr Ile
1425 1430 1435 1440
Lys Phe Leu Arg Ser Ile Arg Pro Asp Asn Met Ser Glu Tyr Ser Lys
1445 1450 1455
Gln Met Gln Arg Phe Asn Val Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly
1460 1465 1470
Leu Phe Glu Phe Cys Gln Leu Ser Thr Gly Gly Ser Val Ala Ser Ala
1475 1480 1485
Val Lys Leu Asn Lys Gln Gln Thr Asp Ile Ala Val Asn Trp Ala Gly
1490 1495 1500
Gly Leu His His Ala Lys Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Val
1505 1510 1515 1520
Asn Asp Ile Val Leu Ala Ile Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg
1525 1530 1535
Val Leu Tyr Ile Asp Ile Asp Ile His His Gly Asp Gly Val Glu Glu
1540 1545 1550
Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr
1555 1560 1565
Gly Glu Tyr Phe Pro Gly Thr Gly Asp Leu Arg Asp Ile Gly Ala Gly
1570 1575 1580
Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Tyr Pro Leu Arg Asp Gly Ile Asp
1585 1590 1595 1600
Asp Glu Ser Tyr Glu Ala Ile Phe Lys Pro Val Met Ser Lys Val Met
1605 1610 1615
Glu Met Phe Gln Pro Ser Ala Val Val Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ser
1620 1625 1630
Leu Ser Gly Asp Arg Leu Gly Cys Phe Asn Leu Thr Ile Lys Gly His
1635 1640 1645
Ala Lys Cys Val Glu Phe Val Lys Ser Phe Asn Leu Pro Met Leu Met
1650 1655 1660
Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Ile Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr
1665 1670 1675 1680
Tyr Glu Thr Ala Val Ala Leu Asp Thr Glu Ile Pro Asn Glu Leu Pro
1685 1690 1695
Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr Phe Gly Pro Asp Phe Lys Leu His Ile
1700 1705 1710
Ser Pro Ser Asn Met Thr Asn Gln Asn Thr Asn Glu Tyr Leu Glu Lys
1715 1720 1725
Ile Lys Gln Arg Leu Phe Glu Asn Leu Arg Met Leu Pro His Ala Pro
1730 1735 1740
Gly Val Gln Met Gln Ala Ile Pro Glu Asp Ala Ile Pro Glu Glu Ser
1745 1750 1755 1760
Gly Asp Glu Asp Glu Asp Asp Pro Asp Lys Arg Ile Ser Ile Cys Ser
1765 1770 1775
Ser Asp Lys Arg Ile Ala Cys Glu Glu Glu Phe Ser Asp Ser Glu Glu
1780 1785 1790
Glu Gly Glu Gly Gly Arg Lys Asn Ser Ser Asn Phe Lys Lys Ala Lys
1795 1800 1805
Arg Val Lys Thr Glu Asp Glu Lys Glu Lys Asp Pro Glu Glu Lys Lys
1810 1815 1820
Glu Val Thr Glu Glu Glu Lys Thr Lys Glu Glu Lys Pro Glu Ala Lys
1825 1830 1835 1840
Gly Val Lys Glu Glu Val Lys Leu Ala
1845
<210> 3
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，融合基因HDAC1
<400> 3
atggcgcaga cgcagggcac ccggaggaaa gtctgttact actacgacgg ggatgttgga 60
aattactatt atggacaagg ccacccaatg aagcctcacc gaatccgcat gactcataat 120
ttgctgctca actatggtct ctaccgaaaa atggaaatct atcgccctca caaagccaat 180
gctgaggaga tgaccaagta ccacagcgat gactacatta aattcttgcg ctccatccgt 240
ccagataaca tgtcggagta cagcaagcag atgcagagat tcaacgttgg tgaggactgt 300
ccagtattcg atggcctgtt tgagttctgt cagttgtcta ctggtggttc tgtggcaagt 360
gctgtgaaac ttaataagca gcagacggac atcgctgtga attgggctgg gggcctgcac 420
catgcaaaga agtccgaggc atctggcttc tgttacgtca atgatatcgt cttggccatc 480
ctggaactgc taaagtatca ccagagggtg ctgtacattg acattgatat tcaccatggt 540
gacggcgtgg aagaggcctt ctacaccacg gaccgggtca tgactgtgtc ctttcataag 600
tatggagagt acttcccagg aactggggac ctacgggata tcggggctgg caaaggcaag 660
tattatgctg ttaactaccc gctccgagac gggattgatg acgagtccta tgaggccatt 720
ttcaagccgg tcatgtccaa agtaatggag atgttccagc ctagtgcggt ggtcttacag 780
tgtggctcag actccctatc tggggatcgg ttaggttgct tcaatctaac tatcaaagga 840
cacgccaagt gtgtggaatt tgtcaagagc tttaacctgc ctatgctgat gctgggaggc 900
ggtggttaca ccattcgtaa cgttgcccgg tgctggacat atgagacagc tgtggccctg 960
gatacggaga tccctaatga gcttccatac aatgactact ttgaatactt tggaccagat 1020
ttcaagctcc acatcagtcc ttccaatatg actaaccaga acacgaatga gtacctggag 1080
aagatcaaac agcgactgtt tgagaacctt agaatgctgc cgcacgcacc tggggtccaa 1140
atgcaggcga ttcctgagga cgccatccct gaggagagtg gcgatgagga cgaagacgac 1200
cctgacaagc gcatctcgat ctgctcctct gacaaacgaa ttgcctgtga ggaagagttc 1260
tccgattctg aagaggaggg agaggggggc cgcaagaact cttccaactt caaaaaagcc 1320
aagagagtca aaacagagga tgaaaaagag aaagacccag aggagaagaa agaagtcacc 1380
gaagaggaga aaaccaagga ggagaagcca gaagccaaag gggtcaagga ggaggtcaag 1440
ttggcctga 1449
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，以用作融合基因HDAC1编码序列的上游引物
<400> 4
gaagaggaag gtgggctcta gagcgcagac gcagggc 37
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，以用作融合基因HDAC1编码序列的下游引物
<400> 5
ggctgatcag cggtttaaac ttaagtcagg ccaacttgac ctcctcc 47
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，以用作融合基因dCas9-HDAC1编码序列的上游引物
<400> 6
caagtcgacg actacaaaga ccatgacggt g 31
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，以用作融合基因dCas9-HDAC1编码序列的下游引物
<400> 7
gaactcgagt caggccaact tgacctcctc c 31
<210> 8
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，crRNA1序列
<400> 8
ucuucagacg ggcguacgag guuuuagagc uaugcu 36
<210> 9
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，crRNA2序列
<400> 9
cagggacuuc gcuuauaccc guuuuagagc uaugcu 36
<210> 10
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成，crRNA3序列
<400> 10
aucaucacga caaccuuaug guuuuagagc uaugcu 36

Claims (8)

1.含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含融合基因dCas9-HDAC1；
其中，所述融合基因dCas9-HDAC1是由SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段。
2.含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、以表达Flag-tagged HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.3所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pcDNA3.1-dCas9质粒上以得到所述重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1；
步骤二、以表达重组质粒pcDNA-dCas9-HDAC1的质粒为模板，利用SEQ ID NO.6和SEQID NO.7所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQ ID NO.1所示的碱基序列组成的DNA片段，并将其构建到pFastBac-HT质粒上以得到所述重组载体pFastBac dCas9-HDAC1。
3.靶向突变型KRAS融合基因的融合基因蛋白，其特征在于，所述融合基因蛋白是由SEQID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.靶向突变型KRAS融合基因的融合基因蛋白的构建方法，使用如权利要求2所述的含有靶向突变型KRAS融合基因的重组载体制备得到，其特征在于，包括如下过程：
将权利要求2所述重组载体pFastBac dCas9-HDAC1转化至DH10Bac细菌中，得到重组bacmid DNA后侵染昆虫细胞，侵染后收获细胞液纯化后得到所述融合基因蛋白；
其中，所述融合基因蛋白是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
5.含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物，其特征在于，包括如权利要求3所述的融合基因蛋白和crRNA:tracrRNA二聚体；
其中，所述crRNA:tracrRNA二聚体通过由SEQ ID NO.8所示的碱基序列组成的RNA片段、SEQ ID NO.9所示的碱基序列组成的RNA片段或者SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成的RNA片段分别与tracrRNA互补制备得到。
6.含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、利用权利要求2所述方法构建重组载体pFastBac dCas9-HDAC1；
其中，所述重组载体pFastBac dCas9-HDAC1含有融合基因dCas9-HDAC1，其为由SEQ IDNO.1所示的碱基序列组成的DNA片段；
步骤2、根据重组载体pFastBac dCas9-HDAC1制备得到融合基因蛋白dCas9-HDAC1；
其中，所述dCas9-HDAC1融合蛋白是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
步骤3、分别通过由SEQ ID NO.8所示的碱基序列组成的DNA片段、SEQ ID NO.9所示的碱基序列组成的DNA片段或者SEQ ID NO.10所示的碱基序列组成的DNA片段制备3种crRNA:tracrRNA二聚体；
步骤4、将所述融合基因蛋白dCas9-HDAC1分别和所述crRNA:tracrRNA二聚体组装成所述核苷酸蛋白质复合物。
7.如权利要求6所述的含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物的构建方法，其特征在于，在所述步骤2中，根据重组载体pFastBac dCas9 HDAC1制备得到dCas9-HDAC1融合基因蛋白过程包括如下步骤：
将所述重组载体pFastBac dCas9-HDAC1转化至DH10Bac细菌中，得到重组bacmid DNA后侵染昆虫细胞，侵染后收获细胞液纯化后得到所述融合基因蛋白dCas9-HDAC1；
其中，所述融合基因蛋白是由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
8.如权利要求6或7所述的含有靶向突变型KRAS融合基因的核苷酸蛋白质复合物的构建方法，其特征在于，在所述步骤4中，组装成所述核苷酸蛋白质复合物过程包括：
将所述融合基因蛋白dCas9-HDAC1和所述crRNA:tracrRNA二聚体加入Opti-MEM培养基中室温孵育后，将贴壁细胞用胰酶处理，用不含抗生素的完全培养基重悬，在孔板中加入室温孵育后的混合物和含有细胞的培养液，在37℃孵箱中继续培育后得到所述核苷酸蛋白质复合物。
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