CN101787075A - 具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体 - Google Patents

具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一段具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体，属于生物技术领域。该氨基酸顺序进化上保守，具有特异性结合组蛋白去乙酰化酶1特性，所述氨基酸序列构建的表达载体pcDNA3-FATS转染细胞后，特异性诱导细胞周期抑制性蛋白p21的表达水平上升；抑制结合组蛋白去乙酰化酶1与p21的结合，从而增加p21蛋白的乙酰化修饰，抑制p21蛋白的降解。本发明证实目前进入临床实验的抑制组蛋白去乙酰化酶的小分子化合物的抗癌作用，为新一代更特异的抗HDAC1化学药物的研发提供了天然模拟靶点。

Description

具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体。
背景技术
细胞周期负调控蛋白p21主要通过抑制细胞周期素依赖性激酶的活性调控细胞周期，在转录水平上受p53抑癌基因的调节，缺乏p21将导致DNA损伤后细胞周期G2/M节点功能严重破坏，提高p21的蛋白质表达水平则导致细胞周期阻滞在G1期。目前进入临床II期试验的一类抗癌药物(组蛋白去乙酰化酶抑制剂)如SAHA(suberoylanilide hydroxamicacid，N-羟基-N′-苯基辛二酰胺；伏立诺他)及一系列TSA(曲古菌素A，Trichostatin A)的衍生物等，共同的作用机理都是诱导癌细胞内p21蛋白质表达水平增加。
人源序列位于人类10号染色体10q26.2区的一段基因序列，恰好位于一个普通型染色体脆性位点FAR10F内，我们将其命名为FATS(Fragile-site Associated Tumor Suppressor)。该基因序列在抗肿瘤药物研发中的应用日益引起关注。
发明内容
本发明是为进一步研究FTAS抑癌分子机理，以及为FATS在抗肿瘤药物研发中的应用，而提供一段FATS蛋白序列中进化上保守，具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体。
一段氨基酸序列，该氨基酸序列具有特异性结合组蛋白去乙酰化酶1的特性，所述氨基酸序列如图1a、图1b所示。
所述的一段氨基酸序列，该氨基酸序列还包含一段进化上极端保守序列：GFS/ASITITARRVGPPA，并在人、小鼠、大鼠、牛、狗中高度同源。
所述的一段氨基酸序列，该氨基酸序列在细胞内的表达，增加p21蛋白的乙酰化修饰，从而抑制p21蛋白的降解。
一段氨基酸序列表达载体的制备方法，其是将mini-FATS双链核酸序列以平末端正向连接到pcDNA3载体中CMV启动子下游，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养，挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列；mini-FATS双链核酸序列通过PCR扩增得到，引物序列为5′-CTGGCATCACAGAACACAAGAATGA-3′和5′-CTACTCACCAGCCCTGTAACTCCAG-3′，得到表达载体pcDNA3-FATS。
一段氨基酸序列的表达载体，将编码该氨基酸序列的pcDNA3-FATS表达载体转染细胞后，特异性诱导细胞周期抑制性蛋白p21的表达水平上升。
本发明的有益效果是：本发明证实目前进入临床实验的一类抗癌药物，即抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的小分子化合物的抗癌作用靶点，并证实一个新的内源性蛋白FATS的抑癌机理与目前所用的HDAC抑制性药物的抗癌机理类似，从而为研发新一代更特异的抗HDAC1化学药物提供了天然模拟靶点。
附图说明
图1a是具有结合组蛋白去乙酰化酶1的特性的鼠源氨基酸序列；
图1b是具有结合组蛋白去乙酰化酶1的特性的人源氨基酸序列；
图2a是pcDNA3-FATS表达载体构件示意图；
图2b是GST-mini-FATS融合表达载体构建示意图；
图3是免疫印迹分析结果；
图4a、图4b是用cylcoheximide(CHX)抑制蛋白质合成后，用免疫印迹分析p21蛋白质表达水平的变化；
图5是GST融合蛋白结合HDAC1实验结果；
图6是GST-mini-FATS缺失突变蛋白结合实验的结果示意图；
图7是免疫沉淀和免疫印迹检测p21蛋白乙酰化的实验结果；
图8是HDAC1结合p21蛋白的实验结果；
图9是免疫沉淀和免疫印迹检测FATS抑制HDAC1结合p21蛋白的实验结果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
一.实验材料来源：
小鼠NIH3T3和人Hela细胞购自美国American Type CultureCollection(ATCC)。表达载体pcDNA3购自Invitrogen公司。Cycloheximide(CHX)购自Sigma公司。针对p21和p27的抗体购自BDPharmigen。针对Actin和Flag的抗体购自Sigma公司。针对乙酰化赖氨酸(Ac-K)的抗体购自Upstate公司。
二.实施方法
1.pcDNA3-FATS表达载体构建
参照图2a，融合表达载体pcDNA3-FATS其结构为环状，其是将mini-FATS双链核酸序列包括终止密码(stop)以平末端正向连接到pcDNA3载体中CMV启动子下游，载体带氨苄青霉素抗性基因(Amp)和新霉素抗性基因(neo)，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养，挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列。
将mini-FATS双链核酸序列以平末端正向连接到pcDNA3载体中CMV启动子下游，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养，挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列；mini-FATS双链核酸序列通过PCR扩增得到，引物序列为5′-CTGGCATCACAGAACACAAGAATGA-3′和5′-CTACTCACCAGCCCTGTAACTCCAG-3′，得到表达载体pcDNA3-FATS；用PCR仪GeneAmp 9700上进行PCR反应，反应体系为94℃预变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次。用琼脂糖凝胶电泳分析结果。
2.GST-mini-FATS融合表达载体构建和融合蛋白纯化
参照图2b，融合表达载体GST-mini-FATS其结构为环状，mini-FATS双链核酸序列源自pcDNA3-FATS，以平末端正向连接到pGex-6p1(购自Amersham Biosciences公司)载体中，其表达受启动子Ptac调控，可以用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导转录活性，带氨苄青霉素抗性基因(Amp)。所述氨基酸序列的表达载体，其特征在于：mini-FATS双链核酸序列源自pcDNA3-FATS，以平末端正向连接到pGex-6p1载体中，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养，挑取转化菌扩增培养提取质粒GST-mini-FATS，酶切测序验证插入序列，得环状结构的GST-mini-FATS融合表达载体。GST-FATS的突变体通过位点特异性突变试剂盒(Stratagene公司)得到。
将GST-mini-FATS质粒转化感受态大肠杆菌BL21，在37℃培养转化后BL21菌，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导GST(glutathioneS-transferase，谷胱甘肽转移酶)蛋白和GST-FATS蛋白表达。超声破碎菌体，15000g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1h，结合于GST-beads的蛋白可用含有新鲜配制的20mM还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，或直接用于蛋白结合实验。HDAC1蛋白用体外转录和体外翻译系统(Promega公司)产生，并用S35-甲硫氨酸标记。与GST融合蛋白结合的复合物用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，在暗室曝光显影。GST-mini-FATS融合表达蛋白能结合组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)蛋白，但GST蛋白本身并不与HDAC1发生相互作用，证实FATS该氨基酸序列具有结合组蛋白去乙酰化酶1的特性，参照图5。用GST-mini-FATS融合表达蛋白的缺失突变体进行体外蛋白结合试验进一步证实：mini-FATS蛋白67-175这一段氨基酸序列，该氨基酸序列具有特异性结合组蛋白去乙酰化酶1的特性，见图6。所述氨基酸序列如图1a。其人源序列见图1b。该氨基酸序列还包含一段进化上极端保守序列：GFS/ASITITARRVGPPA，并在人、小鼠、大鼠、牛、狗中高度同源。我们还证实：HDAC1直接与p21蛋白质发生相互作用，参照图8。
3.细胞转染
应用EndoFree Plasmid Maxi(Qiagen公司)试剂盒提取纯化质粒，用200μl低渗液将2μg重组质粒与4μl脂质体Lipofactamine2000混合，静置15分钟，加入细胞培养液中，5％CO2温箱孵育。
4.免疫印迹(Western Blot，WB)
收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30min后取上清；取少量裂解液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到纤维素酯膜上，与针对p21、p27或Actin的特异性抗体4℃孵育过夜，再与相应的第二抗体室温孵育1小时，经PBST溶液洗膜，进行ECL化学发光反应，在暗室曝光显影，参照图3，所述的氨基酸序列的表达载体，将编码该氨基酸序列的pcDNA3-FATS表达载体转染细胞后，特异性诱导细胞周期抑制性蛋白p21的表达水平上升，而对p27的蛋白表达水平没有影响。进一步证实：用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞后，FATS基因的表达能明显增加p21蛋白质的稳定性，见图4。
5.免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)
收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min，12,000g离心30min后取上清；取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50μl proteinA/G-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，在4℃以3,000g速度离心5min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印迹实验，将蛋白转移到膜上，与适量抗体在4℃孵育过夜，将第二抗体结合，进行ECL化学发光反应，在暗室曝光显影。将FATS(1-363)(即mini-FATS)转染细胞后，用针对乙酰化赖氨酸(Ac-K)的抗体进行免疫沉淀，随后用p21特异性抗体进行免疫印迹实验，所述的氨基酸序列的表达载体，该氨基酸序列在细胞内的表达，增加p21蛋白的乙酰化修饰，从而抑制p21蛋白的降解，参照图7。将与Flag融合表达的HDAC1表达载体和mini-FATS表达载体共转染细胞，进行免疫沉淀和免疫印迹实验，进一步证实FATS蛋白表达抑制HADC1与p21蛋白质的相互作用，见图9。
SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学附属肿瘤医院
<120>具有结合组蛋白去乙酰化酶1特性的氨基酸序列及其表达载体
<130>鼠.人
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>116
<212>PRT
<213>2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<220>
<221>鼠源序列
<222>(1)..(116)
<223>
<400>1
Thr Pro Ser Asp Asp Gln Gly Leu Glu Thr Glu Pro Leu Ser Thr Gly
1               5                   10                  15
Asp Asn Leu Gly Lys Gly Ser His Ser Gly Phe Ser Ser Ile Thr Ile
            20                  25                  30
Thr Ala Arg Arg Val Gly Pro Pro Ala Ser Ser Leu Val Trp Asp Thr
        35                  40                  45
Phe Arg Asp Pro Leu Cys Pro Lys Cys Lys Ala Lys Asp Ala Leu Phe
    50                  55                  60
Gln Glu Pro Pro Val Leu Ala Gly Asp Ala His Leu Cys Gln His Asn
65                  70                  75                  80
Arg Pro Phe Thr Cys Thr Glu Ser Pro Ser Asn Gly Ser Val Glu Gly
                85                  90                  95
Met Lys Val Phe Gln Ala His Ser Arg Leu Ser Ala Arg Gln Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Val Thr His
        115
<221>人源序列
<222>(1)..(116)
<223>
<400>1
Ala Pro Ser Asp Glu Arg Gly Pro Glu Ala Glu Leu Pro Pro Lys Glu
1                5                   10                  15
Glu Arg Pro Cys Gly Gly Pro Arg Arg Gly Phe Ala Ser Ile Thr Ile
            20                  25                  30
Thr Ala Arg Arg Val Gly Pro Pro Ala Arg Ala Leu Val Trp Gly Thr
        35                  40                  45
Ala Gly Asp Ser Leu Cys Pro Lys Cys Arg Ala Glu Asp Thr Leu Phe
    50                  55                  60
Gln Ala Pro Pro Ala Leu Ala Asn Gly Ala His Pro Gly Arg His Gln
65                  70                  75                  80
Arg Ser Phe Ala Cys Thr Glu Phe Ser Arg Asn Ser Ser Val Val Arg
                85                  90                  95
Leu Lys Val Pro Glu Ala His Thr Gly Leu Cys Glu Arg Arg Lys Tyr
            100                 105                 110
Trp Val Thr His
        115

Claims (5)

1.一段氨基酸序列，该氨基酸序列具有特异性结合组蛋白去乙酰化酶1的特性，所述氨基酸序列如图1a、图1b所示。
2.根据权利要求1所述的一段氨基酸序列，其特征在于：该氨基酸序列还包含一段进化上极端保守序列：GFS/ASITITARRVGPPA，并在人、小鼠、大鼠、牛、狗中高度同源。
3.根据权利要求1所述的一段氨基酸序列，其特征在于：该氨基酸序列在细胞内的表达，增加p21蛋白的乙酰化修饰，从而抑制p21蛋白的降解。
4.如权利要求1所述一段氨基酸序列表达载体的制备方法，其特征在于：将mini-FATS双链核酸序列以平末端正向连接到pcDNA3载体中CMV启动子下游，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺平板过夜培养，挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列；mini-FATS双链核酸序列通过PCR扩增得到，引物序列为5′-CTGGCATCACAGAACACAAGAATGA-3′和5′-CTACTCACCAGCCCTGTAACTCCAG-3′，得到表达载体pcDNA3-FATS。
5.根据权利要求4所述一段氨基酸序列的表达载体，其特征在于：将编码该氨基酸序列的pcDNA3-FATS表达载体转染细胞后，特异性诱导细胞周期抑制性蛋白p21的表达水平上升。
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