ES2319977T3 - Represor de la diferenciacion del musculo esqueletico, acido nucleico que lo codifica y su uso en diagnostico y terapia. - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo que se une específicamente in vitro a un epítopo de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº 3 para la detección de GRIM1 en células, caracterizado porque las células se seleccionan a partir de células del músculo esquelético y de preadipocitos.

Description

Represor de la diferenciación del músculo esquelético, ácido nucleico que lo codifica y su uso en diagnóstico y terapia.

Objeto de la presente invención es el uso de un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº:3, para la detección de un corepresor en células del músculo esquelético y preadipocitos.

La denominación GRIM1 elegida para el co-represor representa la abreviatura de la denominación anglófona "Global Repressor Involved in Myogenic Differentiation". Este nombre fue elegido porque el factor clonado juega un importante papel especialmente durante la diferenciación del músculo esquelético.

En los últimos años se encontraron un gran número de moléculas que parecen ser responsables de la inmediata regulación transcripcional. Junto a los factores ligantes de ADN (designados en sentido más estricto como factores de transcripción) hay moléculas reguladoras que, como co-activadores, facilitan la expresión génica o, como corepresores, provocan activamente un descanso tanscripcional. Los cofactores son de carácter promiscuo, pueden ser reclutados en diferentes combinaciones por diferentes partícipes ligantes de ADN. El cambio entre complejos co-activadores y complejos correpresores asociados es un importante paso regulador dentro de los procesos de la diferenciación
celular.

Tomando como ejemplo la diferenciación del músculo esquelético, se ha determinado en el transcurso de los años una cascada de factores de transcripción que son necesarios para la miogénesis. Junto a otros factores de transcripción las proteínas bHLH MyoD, myf5, MRF4 y miogenina provocan que en una célula precursora de mioblastos, proliferante, se lleve a cabo el programa genético que dé lugar a una célula funcional terminalmente diferenciada del músculo esquelético. En el transcurso de esta filogénesis, la célula pasa por un arresto del ciclo celular, se fusiona con otras células musculares determinadas para dar mioblastos multinucleares y expresa enzimas estructurales y metabólicas, específicas del músculo esquelético.

Los cofactores asociados que intervienen durante este proceso sólo fueron investigados a partir de los últimos años. La expresión positivamente regulada de genes miógenos específicos tiene lugar, por ejemplo, por una asociación funcional de MyoD con la proteína co-activadora p300. La myoD acetilada actúa transcripcionalmete de modo mucho más activo que la proteína no modificada.

Por otra parte, existen determinados co-represores que evitan activamente en células proliferantes una represión preestablecida de la expresión de genes específicos musculares. Así, se descubrió, por ejemplo, una asociación funcional entre MyoD y el co-represor N-CoR y colocó de este modo a los co-factores sólo adscritos hasta el momento a los receptores nucleares de hormonas en un nuevo campo de acción. Aparte de esto, se ha descrito que miembros de la familia de la desacetilasa de la histona (HDAC) están implicados en la diferenciación del músculo esquelético (modelo de cultivo celular C2C12) y en los primeros pasos de la diferenciación presentan una relocalización
subcelular.

La relación de los HDAC con una represión activa se considera como uno de los pilares fundamentales de la regulación transcripcional negativa, puesto que la reacción catalizada por los HDAC se transmite directamente a la cromatina y explica mecánicamente los efectos observados.

El documento WO 01/57190 A2 describe un gran número de ácidos nucleicos y polipéptidos que son codificados por estos ácidos nucleicos. Estos ácidos nucleicos se identificaron en un procedimiento de "sceening".

Los datos mostrados en esta solicitud describen GRIM1 como un nuevo represor transcripcional "bona fide" con un nuevo mecanismo de represión. GRIM1 no está asociado a una actividad HDAC y la represión propiciada por GRIM1 no se deja influenciar por inhibidores HDAC específicos. GRIM1 puede inhibir directamente la acetilación del N-terminal de la histona (una de las premisas para la activación transcripcional dirigida) a través de dominios ácidos en los N-terminal y C-terminal. Dominios de represión no caracterizados con detalle hasta el momento dentro de GRIM1 tienen igualmente un elevado potencial para reprimir la actividad de transcripción. En transfecciones transitorias, GRIM1 tiene el potencial para reprimir en función de la dosis tanto promotores mínimos complejos como también sintéticos. En base a estos datos, el nuevo factor clonado se designó como GRIM1 (Global Repressor Involved in Myogenic differentiation).

GRIM1 manifiesta una relocalización durante la diferenciación del músculo esquelético, no obstante en un instante claramente más tardío que el que se describió hasta el momento para los HDAC 4, 5 y 7 en relación con la transcripción específica de MEF2. Los presentes datos sugieren que el potencial de represión de GRIM1 se tiene que desconectar en instantes más tardíos de la diferenciación del músculo esquelético para que los miotubos se puedan diferenciar terminalmente. Además de esto, GRIM1 muestra igualmente durante la diferenciación de los preadipocitos una modificación subcelular de la localización.

Una función de GRIM1 es que, como represor, regula conjuntamente la diferenciación de las células del músculo esquelético. Los datos muestran que GRIM1 muestra un papel claramente diferente al de los factores partícipes hasta ahora descritos. La explicación del papel in vivo de GRIM1 tiene lugar a través de animales "noqueados" a través de GRIM1 y de ratones transgénicos. En los animales transgénicos se expresarán mutantes de GRIM1 bajo promotores específicos del músculo esquelético, los cuales ya no alcanzan el núcleo o no pueden ser transportados fuera del núcleo. El fenotipo de los ratones, que se origina por la localización atípica del GRIM1 creada, va a seguir contribuyendo al entendimiento de la función de GRIM1 dentro de los procesos de diferencia-
ción.

La aplicación de la presente invención se encuentra sobre todo en el sector de las enfermedades musculares degenerativas o en el control de la pérdida muscular en el hombre en vías de envejecimiento. La modificación terapéutica de la función del GRIM1 puede contrarrestar en este caso una pérdida muscular anticipada o intervenir activamente en los procesos constructivos de los músculos.

Por lo tanto, en la presente solicitud se describen polipéptidos que presentan una secuencia de al menos 20 aminoácidos sucesivos de la secuencia del hsGRIM1 (hs = homo sapiens) con la secuencia ID nº 3.

Los polipéptidos descritos muestran preferentemente una secuencia de al menos 40 aminoácidos sucesivos.

De modo más preferente, los polipéptidos muestran una secuencia de al menos 80 aminoácidos sucesivos y, de modo aún más preferente, una secuencia de al menos 120 aminoácidos sucesivos y, muy preferentemente, los polipéptidos descritos muestran una secuencia de al menos 200 aminoácidos sucesivos de la secuencia Seq. Id nº 3.

Aparte de esto, en la presente solicitud se describen polipéptidos que muestran una secuencia de al menos 20 aminoácidos sucesivos de la secuencia mmGRIM1 (mm = mus musculus) con la Seq.ID nº 4.

De modo más preferente, estos polipéptidos muestran una secuencia de al menos 40 aminoácidos sucesivos y, de modo aún más preferente, una secuencia de al menos 120 aminoácidos sucesivos y muy preferentemente una secuencia de al menos 200 aminoácidos sucesivos de la secuencia Seq.Id nº 4.

En la presente solicitud se describen igualmente anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo de un polipéptido conforme a la invención. Los anticuerpos descritos se pueden preparar según métodos estándar habituales. Los polipéptidos que codifican GRIM1 pueden servir bien sea para la inmunización de animales de laboratorio adecuados tales como, por ejemplo, conejos o cabras y, de esta manera se pueden preparar anticuerpos policlonales adecuados. Los anticuerpos pueden estar dirigidos contra epítopos, como epítopos de conformación, pero también contra los péptidos descritos.

Alternativamente a esto, anticuerpos monoclonales adecuados se pueden preparar según métodos bien conocidos desde la publicación de Köhler y Milstein en el año 1975 y que pertenecen al repertorio estándar de un biólogo molecular de tipo medio.

Este tipo de anticuerpos pueden encontrar aplicación en terapia. Pero para ello, por lo regular es necesario que se preparen anticuerpos humanizados, puesto que los anticuerpos con componentes procedentes de animales pueden provocar reacciones secundarias no deseadas. Cuando se secuencian las regiones ligantes de un anticuerpo adecuado, estas secuencias pueden ser incorporadas a una estructura de base de un anticuerpo humano, y un anticuerpo de este tipo se puede utilizar terapéuticamente.

Un campo de aplicación alternativo para este tipo de anticuerpos representa el diagnóstico. Para ello, pueden ser absolutamente suficientes simples anticuerpos policlonales, con los cuales se pueda determinar cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de polipéptidos GRIM1 en las células o compartimentos de células que interesen. Con este tipo de anticuerpos, el experto medio en la materia puede llevar a cabo los métodos diagnósticos adecua-
dos.

Los medicamentos que contienen un polipéptido aquí descrito, se pueden emplear para el tratamiento de perturbaciones en la diferenciación del músculo esquelético, así como para el tratamiento de perturbaciones en la diferenciación de los adipocitos.

Los medicamentos pueden contener un polipéptido con la secuencia de GRIM1 completa o con una parte adecuada de la secuencia. Los medicamentos se administran de forma adecuada a los pacientes a tratar. Para ello, son adecuadas las formulaciones farmacéuticas orales o preferentemente parenterales.

El mecanismo de acción de los medicamentos parte de una modulación de la función de GRIM1. Durante la diferenciación del músculo esquelético se transporta GRIM1 desde el núcleo al citoplasma. Los medicamentos pueden intervenir en este proceso de diferenciación porque o bien la importación se bloquea de forma preestablecida o porque se bloquea la exportación. Esto se puede conseguir incorporando las secciones adecuadas de los polipéptidos en las correspondientes formulaciones para que se pueda alcanzar el punto diana que interese.

En el marco de la presente invención se descubrió también que GRIM1 participa en otros procesos de diferenciación. GRIM1 muestra una relocalización subnuclear durante la diferenciación de los adipocitos. Una participación de GRIM en otros procesos de regulación diferentes resulta de los descubrimientos de la presente invención, especialmente de los datos experimentales, los cuales muestran que GRIM1 manifiesta una represión de los complejos más diferentes y de los promotores sintéticos, y que existe una expresión ubicuitaria de GRIM1.

Otro objetivo de la presente invención es un procedimiento para la identificación de sustancias que influyen sobre la función biológica de un polipéptido aquí descrito. Para ello, la sustancia a identificar se pone en contacto con el polipéptido en un sistema de ensayo. A través de este sistema de ensayo se pueden identificar aquellas sustancias que interaccionan con el polipéptido GRIM1 y que inhiben o fomentan la función biológica de GRIM1.

En los sistemas utilizados conforme a la invención se trata preferentemente de sistemas de diferenciación celular, que se sirven especialmente de células C2C12 miógenas o de células 10T_{^{1}/_{2}} MyoD-ER diferenciantes rápida e induciblemente. La detección de GRIM1 o, respectivamente, de la localización de GRIM1 se puede efectuar, por ejemplo, inmunohistológicamente. Métodos adecuados son entre otros el uso de anticuerpos acoplados a fluorescencia o a enzimas, en una etapa de tinción directa.

También se pueden preparar líneas celulares adecuadas que contengan una construcción genética correspondiente con un gen GRIM1. Después, las sustancias a examinar se pueden poner en contacto con las células y, a través los respectivos ensayos comparativos, se puede determinar entonces el efecto de la sustancia a examinar.

En otra forma de ejecución, se pueden introducir en animales de laboratorio construcciones genéticas adecuadas y los animales transgénicos se pueden utilizar para los procedimientos de ensayo.

En otra forma de ejecución de la invención, fragmentos de GRIM1 preparados de forma recombinante en sistemas de ensayo exentos de células se pueden incubar con las sustancias a examinar y por el empleo de una molécula informadora adecuada, se puede obtener el resultado del ensayo deseado.

El cADN que codifica hsGRIM1 (homo sapiens), el cual presenta una secuencia de al menos 1200 nucleótidos sucesivos de la Seq.ID nº 1, se describe aquí igualmente.

Se describe, además, el cADN que codifica mmGRIM (mus musculus) el cual presenta una secuencia de al menos 1200 nuclótidos sucesivos de la Seq.ID nº 2.

Los cADN descritos se pueden emplear en vectores de transfección que presenten uno de estos cADN. En este caso, se puede tratar preferentemente de un vector adenoviral.

Estos vectores de transcripción se utilizan para la preparación de células que fueron transfectadas con un vector de este tipo.

En los ejemplos descritos a continuación con más detalle, junto a los métodos estándar habituales utilizados se utilizaron preferentemente los siguientes métodos, de los que a continuación se explican con más detalle los sectores subrayados de los mismos:

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Método 1

Transfección transitoria y estable de células de cultivos celulares

Las células se cultivaron bajo condiciones estériles en cápsulas para cultivos celulares de 15 cm, en los medios recomendados por ATCC. Cada dos a tres días las células se subcultivaron en una relación de 1:5 hasta 1:20, y se mantuvieron en un máximo de 60% de confluencia. Se separa el medio usado, las células se lavan con tampón PBS y se tratan con solución de tripsina/EDTA (0,25% de tripsina, 0,04% de EDTA en tampón PBS) hasta el desprendimiento de la cápsula de cultivo. Las células se aíslan en medio reciente y se subcultivan en nuevas cápsulas de cultivo
celular.

Tampón PBS

NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na_{2}HPO_{4} 8 mM; KH_{2}PO_{4} 1,8 mM.

Medios utilizados:

DMEM (Gibco BRL), 100 IU de penicilina G/ml; 100 \mug/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, 10% de suero fetal de ternera. Como medio de diferenciación en el caso de células C2C12 y L6 se reemplazó el 10% de FCS por 2% de suero equino. Células 1oT½ MyoD-ER se cultivaron en suero exento de hormonas, como medio de diferenciación se suplementaron estradiol 1 \muM, 10 \mug/ml de insulina y 10 \mug/ml de transferrina.

Para determinar las propiedades transcripcionales de las proteínas hsGRIM1 en células eucariotas se cotransfectaron plásmidos de expresión pCMX-hsGRIM1 con plásmidos informadores de Luciferasa-(LUC). En un plásmido de expresión pCMX la expresión de la respectiva proteína hsGRIM1 se encuentra bajo el control del promotor del citomegalovirus. En los plásmidos informadores LUC utilizados, la expresión de la luciferasa se controla bien sea por el promotor de la timidinquinasa (TK), un promotor mínimo E1b (TATA-Box), o bien por los promotores complejos respectivamente indicados.

La transfección tiene lugar por el método del fosfato cálcico o con el método de los liposomas DOTAP (Roche Diagnostics, información del producto). En placas de 12 pocillos se siembran, si no se indica de otro modo, 10^{5} células/pocillo en 1 ml de medio de cultivo. En el método de CaPO_{4}, el plásmido de ADN a transfectar se coprecipita con fosfato de calcio, y el precipitado se reparte sobre las células capacitadas para la división. Para la preparación del precipitado de fosfato de calcio se prepara la tanda indicada más abajo, para valores dobles, en placas de 12
pocillos:

Plásmido informador

1 \mug

Plásmido de expresión hsGRIM1

10-400 ng

Soporte de ADN (pUC18)

hasta 8 \mug

Solución de CaCl_{2} (2,5 M)

20 \mul

H_{2}O dd

hasta 80 \mul

A esta tanda se añaden gota a gota bajo agitación (Vortex), lenta y constantemente 80 \mul de tampón 2xBES. El precipitado se incuba durante 10 min a TA y se reparte homogéneamente sobre las células (80 \mul por pocillo) y al cabo de 8 horas se separa por lavado con PBS. Las células se siguen incubando durante 18 a 24 h en medio de cultivo reciente.

Tampón BES (2 veces):

ácido N,N-bis-[2-hidroxietil]-2-aminoetanosulfónico 50 mM NaCl 280 mM; Na_{2}HPO_{4}\cdot 2H_{2}O 1,5 mM; pH 6,95.

La transfección estable de células de cultivos celulares se lleva a cabo con el sistema pcDNA6-His de la razón social Invitrogen. Las células se transfieren tal como se indicó anteriormente y la integración estable de los plásmidos utilizados se detecta mediante el antibiótico de selección blasticidina S. Se toman clones individuales, se expanden y se ensayan en cuanto a expresión estable mediante Western Blotting e inmunodetección.

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Método 2

Intercacciones proteína-proteína

Ensayos de interacción con levadura di-híbrida, THS de mamíferos, análisis pull-down, inmunoprecipitación de proteínas celulares seguida de inmunodetección o en combinación con partícipes de interacción marcados con ^{35}S-metionina, trasladados in vitro, sistema Phast-gel.

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Pulldown de glutatión-S-transferasa

Una proteína se expresa en E. coli como proteína de fusión GST, se inmoviliza en un material soporte ligante de GST y se incuba con el partícipe potencial de interacción, marcado por lo regular radiactivamente. En las subsiguientes etapas de lavado se lavan las proteínas no interactivas o débilmente interactivas del material soporte o, respectivamente, de la proteína de fusión GST ligada al material soporte. La cantidad de partícipe de interacción asociada se puede determinar por separación de las proteínas mediante SDS-PAGE y una subsiguiente autoradiografía. Para el control de la especificidad de la interacción entre el partícipe potencial de interacción y la proteína de fusión GST, se examina la interacción con sólo GST. Partes alícuotas de fragmentos de GST-GRIM1 o lisado bruto de E. Coli que contiene GST se mezclan con respectivamente 30 \mul de glutation-(GSH)-sefarosa y se incuban durante 1 h a 4ºC sobre un Bohemian Wheel. La GSH-sefarosa se "peletiza" por centrifugación (1' a 2000 rpm) y se lava dos veces en tampón Pulldown. El "pelet" se vuelve a suspender a continuación en 500 \mul de tampón Pulldown y se incuba con el partícipe potencial de interacción marcado con ^{35}S-metionina, trasladado in vitro, durante 1 h a 4ºC sobre el Bohemian Whell. Después de lavar por tres veces con tampón Pulldown el pelet de GSH-sefarosa se disuelve por ebullición en 30 \mul de tampón de muestra SDS, las proteínas se separan por SDS-PAGE y, después de secado el gel, se somete a una
autoradiografía.

Tampón Pulldown:

HEPES 20 mM (pH 7,7); KCl 150 mM; EDTA 0,1 mM; MgCl_{2} 25 mM; DTT 10 mM, 0,15% (v/v) de NP40.

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Inmunoprecipitación

Si dos proteínas interaccionan en solución, entonces el complejo estable de las dos proteínas se puede precipitar con un anticuerpo que esté dirigido contra sólo uno de los dos partícipes de interacción. El aislamiento del complejo proteína-anticuerpo de la solución se efectúa en este caso con ayuda de un material soporte ligante del anticuerpo (\gamma-bind G sefarosa, Pharmacia). Para examinar las interacciones entre GRIM1 y partícipes putativos de interacción se mezclan bien sea extractos celulares nativos o extractos celulares que contienen GRIM1 con proteínas-diana marcadas con ^{35}S-metionina, trasladados in vitro, en 500 \mul de tampón IP. Se añaden respectivamente 5 \mug de anti-GRIM1 o de anticuerpo no específico (IgG_{1} de conejo) junto con 30 \mul de \gamma-bind G sefarosa preequilibrada y el conjunto se incuba durante 60 min a 4ºC sobre un Bohemian Wheel. A continuación se "peletiza" la G-sefarosa durante 1' a 2000 rpm, se lava tres veces con respectivamente 300 \mul de tampón IP enfriado con hielo y, finalmente, el pelet se disuelve por ebullición en 30 \mul de tampón de muestra SDS. Las muestras se separan finalmente por SDS-PAGE y la interacción se detecta bien sea mediante Western-Blotting o, en el caso de las proteínas trasladadas in vitro en presencia de ^{35}S-metionina, a través de autoradiografía.

Tampón IP:

TrisHCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, EDTA 5 mM, 0,3% (v/v) NP40, Pefablock 0,5 mM

Tampón de lísis celular:

TrisHCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 170 mM, 0,1% NP40, NaF 50 mM, NaO_{3}V_{4} 2 mM, DTT 0,2 mM, Pefablock 0,1 mM, 1 \mug/ml de aprotinina, 10% de glicerol.

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Método 3

Detección de la localización intracelular Inmunofluorescencia indirecta, fraccionamiento celular seguido de inmunodetección Inmunofluorescencia indirecta (IIF)

Se siembran células con la densidad celular deseada sobre portaobjetos tratados en autoclave y se fijan al soporte con 5% de paraformaldehído durante 10'. Membranas celulares se hacen permeables a los anticuerpos por medio de 10' de incubación en 0,2% de TritonX100. Antes de la incubación, las células se bloquean con los anticuerpos primarios durante 1 h a la TA en 0,2% de gelatina (en PBS). Anticuerpos anti-hsGRIM1 se diluyen 1:500 en solución de gelatina al 0,2% y se incuban durante 1 h a TA. Después de lavar tres veces con PBS durante 5' en cada caso se añade el correspondiente anticuerpo secundario acoplado a fluorocromo, 1:2000 en 0,2% de solución de gelatina y se incuba en la oscuridad durante 30' a TA. Después de las etapas de lavado se contra-tiñe el núcleo sobre DAPI (1 \mug/ml de PBS, Roche Diagnostics) y finalmente las células se lavan 2 veces en 0,1% de TritonX100, para minimizar la autofluorescencia. Los portaobjetos se conservan en Flouromount M (Southem Biotechnology Associates) y se analizan con un microscopio de fluorescencia.

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Fraccionamiento celular

A través de la lisis hipotónica de la membrana celular se pueden aislar núcleos intactos y lisarlos por separado. Las células se recolectan en PBS enfriado con hielo, se "peletizan" y se expanden en tampón de lisis hipotónico (LB). Por adición de NP40 hasta 0,1% se hace permeable la membrana celular y por suave agitación e incubación sobre hielo durante 15' se liberan los componentes citoplasmáticos. Los núcleos intactos se peletizan por centrifugación a 14.000 rpm durante 15', se separa cuantitativamente la fracción de CP y se determina la concentración de proteína. Los núcleos se lisan por incubación durante 15' y tratamiento en Vortex en tampón de lisis nuclear (KLB). El resto se peletiza y se separa el preparado nuclear soluble. La calidad del preparado se examina mediante Western Blotting e inmunodetección con marcadores específicos de núcleos (por ejemplo TIF2) y citoplasmáticos (por ejemplo
RasGAP).

LB:

HEPES 10 mM (pH 7,9), MgCl_{2} 1,5 mM; KCl 10 mM; DTT 0,5 mM, Pefablock 0,5 mM

KLB:

HEPES 20 mM (pH 7,9), NaCl 420 mM, MgCl_{2} 1,5 mM; EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, Pefablock 0,5 mM, 10% de glicerol

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Método 4

Detección de actividades enzimáticas Ensayo-HDAC, ensayo INHAT, ensayos con luciferasa Ensayo-HDAC

Las reacciones de desacetilación de histona llevadas a cabo se realizaron en el marco de un "kit" obtenido de Upstate Biotechnology (histona H3 marcada con ^{3}H en el N-terminal, como sustrato). Como sustratos alternativos se utilizaron histonas marcadas con p300 ^{14}C-acetilo o histonas maracadas in vivo (gentilmente puestas a disposición por Dr. Martin Göttlicher, Kernforschungszentrum Karlsruhe).

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Ensayos INHAT

Los ensayos INHAT se llevaron a cabo tal como se describe por Eckner et al. y por Seo et al. (Eckner et al., 1996, Genes and development 10 (19), págs. 2478-2490, Seo et al., 2001, Cell 104 (1), págs. 119-130). Las histonas o mezclas de histonas se incuban previamente con los respectivos péptidos en un total de 50 \mul de tampón HAT, después se mezclan con dominios p300-Hat expresados bacterialmente y 0,5\muCi ^{14}C-acetil-coenzima-A y se incuban durante 2 h a 30ºC y 1000 rpm. Las reacciones se detienen por adición de tampón SDS-Laemmli, las proteínas se separan en SDS-PAGE desnaturalizado y los geles se incuban durante 1 h en Amplify (NEN). Las acetilaciones se comprueban en autoradiografías.

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Ensayos con luciferasa

Células transfectadas transitoriamente se lavan una vez con PBS y se lisan por adición de 50 \mul de tampón informador de lisis (Promega) y por congelación a -80ºC se siguen abriendo.

Los lisados celulares se traspasan a recipientes de reacción Eppendorf y los residuos celulares se "peletizan" durante 2' a 14000 rpm. Para determinar la actividad de la luciferasa se pipetean en cada caso 10 \mul de los lisados en placas para microtitulación de 96 pocillos. El ensayo de la luciferasa tuvo lugar en un EG&G Bethold Microluminomat. A los 10 \mul de lisados celulares se inyectan 40 \mul de tampón de ensayo de la luciferasa y la quimioluminiscencia resultante se determinó en una integral de tiempo de 10''. Los valores medidos de la actividad de la luciferasa se equipararon con la cantidad de proteína existente en el lisado celular. Para ello, se dispusieron en cada caso 3 \mul de los lisados en placas para microtitulación de 96 pocillos con 100 \mul de reactivo de ensayo Bradford (BioRad) diluido con H_{2}O a 1:5, y se determinó la absorción de la solución a 595 nm. Actividades relativas de la luciferasa se obtienen de la relación entre la actividad de la luciferasa y la absorción protéica.

Tampón de ensayo con luciferasa:

Tricine 200 mM; (MgCO_{3})\cdot4Mg(OH)_{2} 1,07 mM; MgSO_{4} 0,1 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0); DTT 33 mM; ATP 0,5 M; acetil-coencima A 270 mM; luciferina de luciérnaga 470 mM.

La invención se explica con más detalle por los siguientes ejemplos:

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Ejemplo 1

La proteína humana GRIM1 clonada comprende 2250 pares de bases y codifica 749 aminoácidos. La secuencia de GRIM1 humano, clonada y obtenida por secuenciación se depositó primeramente en 1999 bajo el número de acceso AL050019 (proteína DKFZp564c186) en el marco de un proyecto de secuenciación EST randomizado del DKFZ en Heidelberg, como cADN desconocido. Una secuencia más elaborada se depositó en marzo de 2001 (Wiemann et al., 2001). Hasta el momento, aún no ha tenido lugar una descripción de la función de la proteína DKFZp564c186. El cADN conforme a la invención se representa en la Figura 1. La secuencie tiene la Seq.ID
nº 1.

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Ejemplo 2

A partir de bancos de datos de ratones EST se pudo calcular, por análisis comparativo con la secuencia aa del hsGRIM1 procedente de EST independientes, la longitud completa de una proteína con un total de 750 aminoácidos, la cual presenta un total del 60% de restos idénticos y, en más del 85%, homólogos a la conocida secuencia de hsGRIM1. Análisis de cADN de ratón y de bancos genómicos de ratón (Celera) han confirmado la secuencia aa de mmGRIM1, calculada y esperada. El cADN ficticio pudo ser confirmado por análisis RT-PCR. La longitud total de cADN de mmGRIM1 aún no se ha descrito ni depositado. La secuencia con la Seq. ID nº 2 se representa en la Figura 2.

La Seq.ID nº 2 se obtuvo por "screening" de mmEST-dbs con la secuencia aa de hsGRIM1. Los datos obtenidos se compararon con mm-cADN-dbs y dbs-genómico de ratón, y se estableció el cADN virtual mmGRIM1. La secuencia se confirmó a través de RT-PCR y secuenciación genómica, así como a través de una comparación directa de la secuencia con el banco de datos genómicos de ratón de Celera Inc.

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Ejemplo 3

Una representación homóloga entre hs y mmGRIM1 sobre cADN y a nivel protéico se muestra en la Figura 3. En la Figura 3 se muestra una representación homóloga de las secuencias de aminoácidos de mmGRIM1 y hsGRIM1, incluidos los motivos de secuencia conservados.

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La secuencia de aminoácidos de mmGRIM1 (ratón) es Seq. ID nº 4 y la secuencia de aminoácidos de hsGRIM1 (humano) es Seq. ID nº 3.

Todos los motivos funcionales y potencialmente interesantes de la secuencia descritos detalladamente a continuación se conservan de forma secuencialmente idéntica dentro de la proteína de ratón y de la proteína humana (señal de localización nuclear NLS, señal de exportación nuclear NES, los denominados "CoRNR-box" pueden interaccionar con los co-represores con sus factores de transcripción asociados). Otros motivos son los dominios parecidos a HMG-box dentro de los C- y N-terminales de GRIM1 de ambas especies, los cuales eventualmente pueden conseguir establecer contacto con ADN y/o histonas. Además de esto, dentro de la secuencia primaria hsGRIM1 aa están contenidos un total de 5 motivos denominados LXXLL o motivos emparentados, una estructura alfa-helicoidal, que fue descrita como responsable solitaria del contacto de co-factores con sus factores de transcripción asociados. Dentro de la secuencia primara mmGRIM1 sólo se conservan 2 de estos motivos frente a la secuencia humana. Hasta ahora faltan datos funcionales respecto a estos motivos. En base a cálculos, hsGRIM1 es principalmente de estructura alfa-helicoidal (programa PHD-Predict de la Universidad Columbia) y no-globular (GLOBE del PredictProtein-Servers de la Universidad Columbia). GRIM1 se localiza nuclearmente en células proliferativas, dentro de sistemas de diferenciación celular (por ejemplo en células C2C12, L6, 10T1/2 y 3T3-L1) GRIM1 se relocaliza fuera del núcleo en el citoplasma.

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Ejemplo 4

En base al cADN, en el marco de la presente invención se trabajó solamente con hsGRIM1. Se parte sin embargo de que en el caso de emplear cADN de ratón se obtienen resultados correspondientes. A través de mutagénesis puntuales específicas en cuanto a deleción y secuencia se prepararon diferentes construcciones para la caracterización funcional detallada del GRIM1 humano, que se han recopilado en las siguientes Tablas.

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TABLA 1 Mutantes puntuales de hsGRIM1 utilizados

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TABLA 2 Mutantes de deleción de hsGRIM1 utilizados

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2

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Muchos de los mutantes utilizados portan Tags específicos tales como los dominios de unión Gal4-ADN del factor de transcripción GAL4 de la levadura [Gal4-DBD], proteína de fluorescencia verde [GFP], la proteína transactiva 16 [VP16] del Herpes Simplex Virus, las secuencias de señales específicas de anticuerpos FLAG-tag [FLAG], Xpress-tag [XPRESS], c-myc-tag [MYC], epítopo His-tag [His] ligante de níquel, epítopos [MBP] ligantes de maltosa, partes ligantes de glutation de la transferasa de glutation-S [GST]. El uso de proteínas así modificadas se caracteriza por el uso del nombre del epítopo en la construcción de GRIM1 empleada. Por medio de estos ensayos se investigó la función de las regiones individuales de los polipéptidos conformes a la invención.

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Ejemplo 5

Análisis de bancos de datos han puesto de manifiesto que proteínas homólogas a hsGRIM1 se pueden encontrar en numerosas especies. En Shizosaccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, Rattus spec., Bos bovis, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, así como también en Arabidopsis thaliana se puede encontrar secuencias homólogas. Un aspecto resumido se obtiene de los bancos de datos UNIGENE (National Center for Biotechnological Information, NCBI) y del PredictProtein-Servers de la Universidad de Columbia) y se representan en la siguiente Tabla 3:

TABLA 3 Representación de las proteínas UNIGÉNICAS máximamente homólogas de ratón, rata, arabidopsis, nemátodos, mosca de la fruta y levadura de panadero

Se indican números de Swissprot Accession, números de UNIGENE-Accession, región examinada y máxima homología (ratón Q9WV70 no es el clon en su longitud total, compárese para ello el descrito con el clon de ratón descrito bajo Seq.ID nº4).

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ORGANISMOS MODELO SELECCIONADOS EN UNA REPRESENTACIÓN DE SIMILITUDES PROTÉICAS.

Organismo, proteína, identidad porcentual y longitud de la región comparada.

H. sapiens: sp:

Q9Y3T9 - YU20 PROTEÍNA HIPOTÉTICA HUMANA 84,9 KDA

\quad

DKFZP564Cl86 100% sobre 753 aminoácidos (conforme a la invención)

M. musculus: sp:

Q9WV70 - YU20 PROTEÍNA HIPOTÉTICA DE RATON

\quad

73% sobre 267 aminoácidos

R. norvegicus: sp:

- [segmento 1 de 2] CADENA ALFA I (I) DE COLÁGENO, 29% sobre 328 aminoácidos

A. thaliana: sp:

Q9ZPV5 - YU20 UNA PROTEÍNA HIPOTÉTICA DE RATA

\quad

T3OD6,27 IN CROMOSOMA II 27% sobre 722 aminoácidos

C. elegans sp:

O 17580 - YTB2 _ PROTEÍNA HIPOTÉTICA DE CAEEL 82 O KDA

\quad

CO7E3: 2 IN CROMOSOMA II 27% sobre 656 aminoácidos

D. melanogaster: sp:

Q9VIF0 - YU20 PROTEÍNA HIPOTÉTICA DROME CG9246

\quad

37% sobre 681 aminoácidos

S. cerevisiae: sp:

P39744 - Y026 _ YEAST HYPOTHETICAL 81,6 KDA PROTEIN IN DEDI-RETI INTERGENIC REGION 29% sobre 674 aminoácidos

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En la Figura 4 se representa una comparación de los aminoácidos y la determinación de una secuencia de consenso.

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Ejemplo 6

Organización genómica

La característica de las secuencias genómicas de mmGRIM1 y hsGRIM1 se confrontan en la siguiente Tabla 4. La secuencia genómica de las dos especies, incluidos los detallados límites de exon-intron se indican en las Figuras 5
y 6.

TABLA 4 Confrontación comparativa de la organización genómica de mm (ratón) y hsGRIM1 (humano)

3

En la Figura 5 se representa la secuencia genómica de hsGRIM1 (NCBI Human Genome Server, Chromosome 1 map view, build 27, diciembre 2001). Los exones tienen el fondo sombreado y el lugar putativo poly-A está subrayado. La secuencia corresponde a Seq.ID nº 5.

En la Figura 6 se representa la secuencia genómica de mmGRIM1 inclusive las secuencias 5,5 kb flanqueantes (obtenido a través del NCBI público del genoma-db de ratón y del genoma-db de ratón Celera). Los exones tienen el fondo sombreado y las secuencias intrónicas se representan con fondo más claro. Tansposiciones exon/intron se representan más marcadas. El lugar putativo poly-A y el inicio de transcripción putativo están subrayados. Fragmentos secuenciales no ensamblados totalmente se representan con "N". La secuencia genómica del ratón tiene la Seq.ID nº 6.

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Ejemplo 7

Expresión de la proteína GRIM1 recombinante

Para la expresión de la proteína GRIM1 recombinante se ensayaron muchas estrategias y sistemas de expresión diferentes, sin embargo sólo transcurrió con éxito la expresión de fragmentos protéicos cortos ya sea en el contexto His_{6x} o el contexto GST. Los siguientes listados resumen brevemente los resultados y los métodos empleados.

a) Sistemas de expresión y breve descripción de las características de la expresión de hsGRIM1 en longitud total

Sistemas bacterianos: todos los sistemas utilizados emplean cepas de seguridad de Escherichia coli obtenidas a partir de Stratagene.

BL21(DE3)lysGOLD His-fusionado: expresión en el sistema pRSET o en un vector pRSET modificado con "Tag" singular de hexahistidina, purificación a través de una matriz de afinidad de níquel (TALON, Clontech). Co-expresión con GrpESL y chaperonas hspHJK.

BL21(DE3)lysGOLD GST-fusionado: expresión en pGEX4 o Sistema 6 de Pharmacia, purificación a través de columnas de afinidad GSH. Expresión inducible a través de IPTG, co-expresión con GroESL y chaperonas hspHJK.

BL21(DE3)lysGOLD NusA-fusionado: aumento de la solubilidad de la proteína diana a través de la parte NusA, purificación por GPC (Tratagene, Novagen).

BL21(DE3)lysGOLD MBP-fusionado: expresión periplasmática por lo cual toxicidad reducida (sistema pMAL Stratagene, New England Biolabs)

BL21(DE3)lysRIL: codón optimizado cepa BL21 (stratagene). Expresión protéica fusionada tanto con hexahistidina como también con GST.

ABLE C: cepa de seguridad, que regula disminuyendo en un factor 4 el número de copias de plásmidos endógenos (Stratagene). Expresión protéica fusionada tanto con hexahistidina como también con GST.

ABLE K: cepa de seguridad, que regula disminuyendo en un factor 4 el número de copias de plásmidos endógenos (Stratagene). Expresión protéica fusionada tanto con hexahistidina como también con GST.

Sistemas vegetales

Musgo Physcomitrella patens: integración estable de un plásmido de expresión incorporado en CaMV para GST-hsGRIM1 (pRT99/35S-GST-hsGRIM1) a través de recombinación no homóloga. Triple selección por dos antibióticos de selección diferentes y varias siembras (en cooperación con Prof. Ralf Haski, Institut für Pflanzenbiotechnologie de la Universidad Freiburg).

Sistemas celulares

Expresión de la proteína de fusión GST en un cultivo celular de células eucariotas bajo control de un promotor CMV constructivamente activo.

b) Expresión de fragmentos peptídicos de hsGRIM1

Fragmentos protéicos cortos de hsGRIM1 se obtuvieron tanto como proteínas de fusión de hexahistidina y también de GST sólo en BL21(DE3)lysGOLD sin co-expresión de chaperonas. La siguiente Tabla recopila los resultados obtenidos de la expresión, los fragmentos no incluidos en la lista no pudieron ser expresados (compárese para ello la Tabla de las construcciones hsGRIM1 utilizadas):

TABLA 5 Fragmentos de hsGRIM1 expresados en bacterias

4

Ejemplo 8

Generación y descripción de los anticuerpos \alpha-GRIM1 utilizados

Para la preparación de anticuerpos específicos de hsGRIM1 se expresaron en E. coli dos fragmentos protéicos de hsGRIM1 fusionados con hexahistidina, se purificaron y se emplearon para la inmunización de conejos. Como epítopos de los anticuerpos sirvieron los aminoácidos 3-147 y 609-749 de hsGRIM1.

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TABLA 6 Péptido His_{6x}-hsGRIM1 (aa 3-147) N-terminal que se empleó para la inmunización de conejos, péptido "E" (Seq.ID nº 7). A partir de ello resultaron los anticuerpos 2719 y 2720

5

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TABLA 7 Péptido His_{6x}-hsGRIM1 (aa 609-749) C-terminal que se empleó para la inmunización de conejos, péptido "I" (Seq.ID nº 8). A partir de ello resultaron los anticuerpos 2910 y 2911

6

Estas regiones corresponden a los dominios putativos INHAT de hsGRIM1 y se caracterizan particularmente por (cluster poliE/poliD) ácidos. Las correspondientes regiones de la secuencia del cADN de hsGRIM1 se generaron por digestión de restricción con puntos de corte EcoRi- (aa147) y X veces (aa609), y los productos se clonaron en el vector pRSET-B (Invitrogen) (aa 609-749) o pRSET-N^{*}/H basado en el pRSET-B, con la diferencia de que se separaron varios "tags" y que la proteína sólo se expresa con tag de hexahistidina (aa 3-147). Los fragmentos protéicos de hsGRIM1 (aa 3-147 "E", aa 609-749 "I") fusionados con hexahistidina se sobreexpresaron en E. coli BL21(DE3)lysGOLD y tras la apertura de las bacterias se purificaron por cromatografía de afinidad TALON. Después del aislamiento y purificación a partir de E. coli los dos polipéptidos presentaban una pureza estimada en 80-90%. La inmunización de conejos se llevó a cabo con los polipéptidos y el antisuero obtenido fue purificado. Los anticuerpos monoespecíficos purificados contra aa 3-147 (2719, 2720) y contra aa 609-749 (2910 y 2911) se caracterizaron funcionalmente.

Los anticuerpos obtenidos en este caso se emplearon en diferentes procedimientos de ensayos inmunológicos e hicieron posible la detección de la expresión de GRIM1. Los dos anticuerpos dirigidos contra el N-terminal muestran la localización de GRIM1 exclusivamente nuclear en compartimentos subnucleares, los cuales se denominan genéricamente como "speckles". El número y tamaño de los speckles nucleares varía de una línea celular a otra, sólo es común la exclusiva localización nuclear de GRIM1 en células proliferativas. Los dos anticuerpos dirigidos contra el C-terminal reconocen exclusivamente GRIM1 nuclear en células proliferativas, pero no en speckles, sino que en una localización pan-nuclear en todo el nucleoplasma.

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Ejemplo 9

Expresión del mARN y proteína de GRIM1 Expresión cADN/mARN de hsGRIM1 y mmGRIM1

La expresión de cADN de hsGRIM1 es ubicuitario según el informe del banco de datos Unigene (UniGene Cluster Hs. 134200, proteína de Homo sapiens DKFZP564C 186/DKFZP564C 186 con el cADN de biblioteca 2334BT0407 utilizada). Expresión comprobada en:

cerviz, páncreas, amnios_normal, hueso, médula ósea, cerebro, seno, cerviz, colon, colon_est, colon_ ins, denis drash, oído, tumor_epidérmico, esófago, ojo, tracto genito-urinario, células germinales, cabeza_cuello, corazón, riñón, tumor_renal, hígado, pulmón, pulmón_normal, tumor_pulmonar, linfa, músculo, nervio_normal, ovarios, páncreas, placenta, mezcla, mezclado, cerebro mezclado, pulmón, testículos, colon mezclado, riñón, estómago, pulmón y bazo mezclados, próstata, tumor_prostático, glándula salivar, piel, intestino delgado, estómago, testículos, línea celular testicular, timo mezclado, tonsila, útero, tumor_uterino, embrión completo.

La muestra de expresión de hsGRIM1 se representó por medio de Northern Blot-Analyse (CLONTECH hsMTN I y hsMTN II, Sonda: tanto longitud total de cADN de hGRIM1, respectivamente los fragmentos N- y C-terminales). El tamaño de transcripción de hsGRIM1 es aproximadamente 3.3 kb (en conformidad con la longitud total de mARN depositada bajo el Acc # AL 050019):

corazón (1), cerebro (2), placenta (3), pulmón (4), hígado (5), músculo esquelético (6), riñón (7), glándula suprarrenal (8), bazo (9), timo (10), próstata (11), testículos (12), ovarios (13), intestino delgado (14), intestino grueso (15), linfocitos periféricos (16).

La expresión de mmGRIM1 en diferentes tejidos de ratón adulto (4-6 semanas) se determinó a través de RT-PCR. Los siguientes tejidos y órganos se clasificaron como mmGRIM1 positivos:

tórax, tórax de mamíferos, placenta, testículos, ovarios, grasa, piel, hueso, cartílago, bazo, pulmón, glándula andronérgica, riñón, hígado, intestino delgado, estómago, hipófisis, timo, lengua, músculo esquelético, corazón, ojos, médula espinal, cerebelo, médula, hipotálamo, corteza cerebral, cerebro completo.

La expresión de mARN de mmGRIM1 en el desarrollo embrionario se determinó por RT-PCR con mARN embrionario completo. En todos los instantes se detecta una clara señal de mmGRIM1, durante el desarrollo no se observa una fuerte modificación de la expresión del mARN de mmGRIM1.

En la Tabla 8 se representa un análisis de la expresión de EST del banco de datos UNIGENE seleccionado en homología con la proteína mm/hsGRIM1. Se indican los números de acceso de los clones IMAGE o de las secuencias parcialmente desconocidas, así como del tipo de tejido del que fueron aislados los ADN. GRIM1 parece ser que también a nivel protéico se expresa ubicuitariamente. En total se encontraron 308 EST, de los cuales a continuación se presentan listados los que manifiestan una clara relación con el tejido:

TABLA 8

7

8

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Ejemplo 10

Expresión proteica

Puesto que diferentes experimentos no se pueden llevar a cabo, sin más, en el ser humano, se llevaron a cabo ensayos en cultivos celulares y animales, los cuales sin embargo presentan también argumentos contundentes para la situación en el ser humano.

a)

La expresión de la proteína mmGRIM1 en células y tejidos primarios se indica a continuación (todas las células indicadas están clasificadas como GRIM1-positivas en Western-Blot (86kD), en el caso de células se examinó la expresión también en IIF). Las señales se obtuvieron con los dos anticuerpos (epítopo N- y C-terminal):

Fibroblastos embrionales de ratón

Tejido cardíaco humano (pacientes de DCM y corazón normal)

Células de músculo liso de ratón (diferenciadas, no diferenciadas y proliferantes)

Órganos de ratón: testículos, ovarios, bazo, timo y en menor cantidad también en próstata y estómago (representados en la siguiente Figura), cerebro, pulmón, hígado.

b)

La expresión de la proteína mmGRIM1 se pudo determinar por inmunohistoquímica in vitro en cortes sagitales de embriones de ratón E10.5. La mmGRIM1 se expresa en estructuras epiteliales, en el dermomiotomo de las extremidades posteriores, en las regiones interepiteliales del tubo neural y en otras colonias celulares, aún no determinadas más de cerca. Sólo en el dermomiotomo se puede detectar una expresión concentrada, en los demás áreas sólo se pueden detectar células mmGRIM1 positivas aisladas. En análisis de mARN y EST se detectó una expresión ubicuitaria de GRIM1. En análisis inmunohistoquímicos in situ en embriones E10.5 de ratón se pudo poner de manifiesto que mmGRIM1 se expresa ciertamente en cada tipo de tejido, pero no en cada célula, sino más bien en colonias celulares especializadas. mmGRIM1 no se expresa en cada tipo de célula, sino que de forma distribuida por todo el organismo en tipos especializados de células.

c)

La expresión de mGRIM1 (m = rata) en el cerebro de rata se determinó in situ por inmunohistoquímica en cortes sagitales a través del cerebro de una rata Sprague Dawley (Rattus norvegicus ssp).

mGRIM1 se expresa en células Purkinje del cerebelo (nuclear y también citoplásmicamente; fuerte inmunoreactividad en 1-2 estructuras sub-nucleares), en células bipolares de la capa mitral del lóbulo olfatorio (nuclear y también citoplasmáticamente; fuerte inmunoreactividad en 1-2 estructuras sub-nucleares); fuerte inmunoreactividad en todas las células del plexo coroide (nuclear y en parte también citoplasmáticamente; fuerte inmunoreactividad en mayormente 2 estructuras sub-nucleares), en células de toda la región del córtex no determinadas con más detalle (nuclear y en parte también citoplasmáticamente; fuerte inmunoreactividad en 1-2 estructuras sub-nucleares), rnGRIM1 no se expresa en cualquier tipo de células, sino distribuido en todo el área craneal en células especializadas.

d)

Expresión de la proteína GRIM1 en células de cultivos celulares. Todas las líneas presentadas están clasificadas como GRIM1-positivas en análisis Western-Blot (tamaño abarcado por las especies de aproximadamente 86 kD) y por inmunofluorescencia indirecta (IIF). Los dos análisis se llevaron a cabo con todos los anticuerpos \alpha-GRIM1 disponibles. En estado proliferativo se puede detectar GRIM1 en cada línea celular en las denominadas estructuras "speckle" (tal como se describe también en la bibliografía para muchos co-represores):

Ratón:

Fibroblastos NIH3T3, preadipocitos NIH3T3-L1, adipocitos NIH3T3-L1, células C1C12 del músculo esquelético no diferenciadas, células C1C12 del músculo esquelético diferenciadas, células neuronales N2a, células P19 de teratocarcininoma, fibroblastos 10T½, células neuronales gliales Monc-1.

Ser humano:

Células HL1 del músculo cardíaco, 293 células renales embrionarias, células LnCaP de carcinoma de próstata, células PC3 de carcinoma de próstata.

Mono:

Líneas de células renales COS-7 y CV1.

Rata:

Células L6 del músculo esquelético

Hamster:

Células renales fetales BHK

e)

GRIM1 de Drosófila melanogaster

La expresión de una proteína parecida a hsGRIM1 se estudió por Western Blot, en cuanto a hibridaciones in situ, en Drosófila melanogaster y en la mosca de la lana (whole-fly).

Ni en el conjunto de lisado de larvas ni en el conjunto de extractos celulares de cabezas de mosca se detectó por Western Blot una señal específica con los anticuerpos específicos anti-hsGRIM1 (dilución de 36 a 210 kD). Igualmente, hibridaciones in situ en distintos estados larvarios tampoco pudieron detectar ninguna señal específica de dmGRIM1 (dm = drosófila melanogaster) con los anticuerpos de GRIM1 existentes.

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Ejemplo 11

Partícipe de interacción de hGRIM1

En los estudios de interacción proteína-proteína llevados a cabo hasta el momento se examinaron con los siguientes métodos los siguientes partícipes potenciales de interacción de mm/hsGRIM1 en relación a una interacción directa o indirecta:

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Los factores subrayados mostraban una interacción con hs/mmGRIM1 y se describen de forma especial al final de la exposición (ma = mesocricetus aureus, células BHK).

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Receptores nucleares de hormonas

hsAR (PD, utflP, tflP, y THS, tT), hsER\alpha (utflP, tflP), hsER\beta, mGR (tT, tflP), hsMR (tT), hsPR (tT), PPAR\gamma (tT), hsRAR\alpha (tflP), mTR\alpha (tT), hsTR\beta-2 (tT), mmERR1 (tflP, tT), mmGCNF (PD, ivIP, tflP, tT), hsRevErbA (tT), mmRVR (tT, tflP), mmSF1 (tT).

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Factores de transcripción

Myogenin (ivlP, tT), MEF2A (ivlP), MEF2B (ivlP), MEF2C (ivlP, tT), eHand (ivlP), dHand (ivlP), E47 (ivlP), E12 (ivlP), GATA4 (ivlP), MyoD (ivlP, tT), SEV (ivlP, tT), MRF4 (ivlP, tT), Myf5 (ivlP), Sp1 (tT), CBF (tT).

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Co-represores transcripcionales

N-CoR (ivlP, tflP, utflP, PD), Sin3A (ivlP, tflP, utflP), Sin3B (tflP, utflP), SuN-CoR (ivlP, tT), SMRT (ivlP, tflP, utflP), HDAC1 (tflP, utflP), HDAC2 (tflP, utflP), RIP140 (ivlP).

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Co-activadores transcripcionales

p300 (tT), FHL2 (ivlP, PD), FHL3 (PD), TIF2 (ivlP), RIP140 (ivlP)

Otros factores: histonas H3, H4, H2A, H2B (PD).

Sólo pudo mostrarse hasta el momento una fuerte interacción directa entre hsGRIM1/mmGRIM1 con el receptor andrógeno (hsAR) (detectado por tflP en ambas direcciones, utflP en ambas direcciones, THS, PD y tT). La interacción con el receptor andrógeno es independiente de los ligandos y no se deja influir por la presencia de antagonistas (casodex, hidroxi-flutamida, acetato de ciproterona). GRIM1 interacciona tanto con el AR "normal" con 17 glutaminas, como también con isoformas de AR, que están asociadas a la enfermedad de Kennedy y que contienen inserciones (17, 44 y 77 Q) ricas en poliglutamina, igualmente independiente de los ligandos. Los análisis PD se llevaron a cabo con los fragmentos GST-I/E/H/M de GRIM1, interaccionando todos los fragmentos ensayados, hasta el GRIM1-"E" (aa 3-147) con el AR, en el orden de sucesión M\geqH>>I. La relevancia fisiológica de la interacción AR-GRIM1 se describe con más detalle en un capítulo aparte.

Interacciones débiles se detectaron entre hsGRIM1 y los Orphan-receptores nucleares Germ Cell Nuclear Factor (mmGCNF) y el receptor de estrógeno Related Receptor1 (mmERR1) (sólo IvlP, tflP y PD), así como una débil interacción con el receptor \alpha de estrógeno (hsER \alpha; la interacción sólo fue detectada en tflP y mostró ser independiente de ligandos, tanto en presencia de agonistas (estradiol), de antagonistas (raloxifen, tamoxifen, ICI) como también en ausencia de un ligando). En general, la relevancia fisiológica, co-localización in vivo o interacción in vivo no está nada clara. En transfecciones transitorias no se pudo poner de manifiesto una relación directa entre GRIM1 y mmGCNF, mmERR1 o hsER\alpha.

En análisis GST-Pulldown, GRIM1 muestra una fuerte interacción con las histonas Core H4, H2B, H2A y H3. Proteínas de fusión GST-GRIM1 expresadas recombinantemente (GST-aa 3-147 y GST-aa 609-749) muestran una clara interacción con todas las cuatro histonas Core, lo que sigue apoyando la actividad INHAT observada de los dominios de GRIM1 N- y C-terminales.

Los potenciales partícipes de interacción de mm/hsGRIM1 se pueden identificar por métodos convencionales. Estos métodos comprenden Two Hybrid-Screen de levadura con diversos bancos de cADN y métodos directos protein-bioquímicos tales como Co-IP de GRIM1 y proteínas asociadas, separación por electroforesis en gel de 2 dimensiones, análisis espectrométricos de masas y secuenciación Mikrospray de las proteínas potencialmente integrantes de diferentes líneas de cultivos celulares (C2C12 diferenciada, C2C12 no diferenciada, 3T3L1 diferenciada, 3T3L1 no diferenciada, BHK etc.).

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Ejemplo 12

Función fisiológica de GRIM1: análisis del potencial de represión de hsGRIM1 en transfecciones transitorias

Todos los datos descritos se obtuvieron con el clon de shGRIM1. GRIM1 es un potente represor transcripcional si se utiliza como proteína de fusión Gal4-DBD en transfecciones transitorias. Gal-GRIM1 reprime la expresión de genes informadores tanto de complejos controlados por Gal4-RE como de construcciones informadoras sintéticas mínimas. Por ejemplo, el potencial de represión de GRIM1 es claramente más fuerte en comparación con el co-represor Gal-SuN-CoR. En estos experimentos, los correspondientes co-represores se expresan transitoriamente en células como proteínas de fusión heterológicas Ga14-DBD. La capacidad de regresión sobre diferentes construcciones sintéticas de informadores-promotores en comparación con las mismas cantidades transferidas del tipo salvaje de Gal4-DBD se determina a través de la expresión de genes informadores con luciferasa.

TABLA 9 Gal-GRIM1 es un represor más fuerte que Gal-SuN-CoR

Se transfectaron células 293 con el informador G5E1bTATA-LUC y las cantidades indicadas de co-represores. El mismo efecto se puede observar cuando se ensayan promotores complejos (Gal4_{3x}-tk-LUC).

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Gal-GRIM1 es un represor igualmente fuerte que un gran número de co-represores descritos tales como, por ejemplo, Gal-HDAC1-10, Gal-CBF1, Gal-Alien y reprime tan sólo de forma insignificantemente más débil que Gal-N-CoR-RD o Gal-SMRT-RD. El potencial de represión de Gal-GRIM1 se examinó en combinación con los complejos de construcciones informador/promotor Gal4_{3x}-tk-LUC y Gal-MMTV-LUC y en combinación con las construcciones informador/promotor-mínimo Gal_{5x}-E1b-TATA-box y Gal_{3x}-\betaglobin-TATA-LUC. Además de esto, se examinó la capacidad de represión de Gal-GRIM1 frente a un dominio autónomo de transactivación VP-16 unido a ADN mediante LexA-DBD a través de un informador LexA_{8x}Gal_{5x}-LUC (puesto a disposición por Dr. S. Khochbhin). Los datos obtenidos de Gal-GRIM1 se ensayaron experimentalmente en las siguientes líneas celulares: A7r5, C2C12, CV1, BHK, 293, N2a, COS-7. En la siguiente Figura se muestran resultados representativos de células BHK y C2C12.

TABLA 10 Gal-GRIM1 es un represor transcripcional

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La represión de Gal-GRIM1 no se perjudica por adición de los inhibidores específicos de la desacetilasa de histona (HDAC) Tricostatin A (TSA, 300nM) y de butirato de sodio (Na-But, 5 mM), lo que sugiere fundamentalmente otros mecanismos de represión que los descritos para otros co-represores. Casos comparables se describieron para otros represores, sin embargo no se describe ninguna explicación metódica. Además, los factores descritos no muestran participación alguna en la diferenciación del músculo esquelético o en adipogénesis. En la siguiente Figura se representan a modo de ejemplo datos de la independencia de los HDAC en transfecciones transitorias, para células BHK. La actividad transcripcional de Gal-GRIM1 no se ve influenciada por TSA en ninguna línea celular ya ensayada.

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TABLA 11 La capacidad de represión de Gal-GRIM1 no se perjudica por adición del inhibidores de HDAC Tricostatin A (TSA)

Transfecciones transitorias se llevaron a cabo en células BHK con un plásmido informador Gal4-tk-LUC.

12

Para la determinación de los dominios de GRIM1 participantes en la represión se construyeron un total de 11 mutantes de deleción de GRIM1 y todos fueron ensayados en el contexto de Gal4-DBD en cuanto a su potencial de represión en todos los sistemas informadores descritos. Todos los dominios de GRIM1 utilizados muestran represión transcripcional en la región de 2x (Gal-E y Gal-I) hasta 15-20x (longitud total de Gal-Gram1). Todos los mutantes de deleción ensayados se mostraban insensibles frente a los inhibidores de HDAC.

En resumen, se pudo poner de manifiesto que GRIM1 posee al menos 5 dominios de represión independientes, encontrándose los 3 dominios de represión principales en la región hidrófuga del núcleo de la proteína (mutQ, mutR, mutP). Sin embargo, cada mutante de deleción analizado en el contexto Gal4-DBR muestra una capacidad de represión situada significativamente sobre el plano general.

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TABLA 12 Listado de recopilación de todos los mutantes de deleción de hsGRIM1 utilizados, los cuales como fusión Gal4-DBD fueron examinados en transfecciones transitorias en relación a su potencial de represión

13

Los subdominios "E" e "I" de GRIM1 descritos dentro de la sección "actividad INHAT" muestran en los ensayos transcripcionales como fusiones Gal4-DBD el menor efecto represivo, pero participan en la inhibición de la acetilación de histona por p300. No hay más informaciones relativas a los dominios Q, P y R, no se pudo confirmar una participación directa en el reclutamiento de co-represores adicionales a través de los estudios de interacción anteriormente expuestos. Momentáneamente no existen más que especulaciones sobre el mecanismo de represión aplicado por GRIM1, no obstante, se puede excluir una participación de los HDAC, y parece ser que se utilizan al menos dos mecanismos diferentes (E e I en contraposición con Q, R y P).

TABLA 13 Determinación de los dominios de represión de GRIM1 por análisis de deleción

Mutantes de deleción se examinaron en transfecciones transitorias en cuanto a su potencial de represión. El dominio de represión central del GRIM1 se encuentra en la región comprendida entre aa 246-609 (representado en blanco). El RD central, a través de otros estudios de deleción, se puede seguir dividiendo en un total de tres dominios independientes (representados en color oscuro).

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Los resultados obtenidos con el sistema LexA_{8x}Gal_{5x} confirman estos resultados, pero muestran otra represión relativa de los fragmentos aislados examinados (no se muestran datos).

GRIM1 en toda su longitud está en condiciones de reprimir promotores mínimos complejos tanto de origen natural como los sintéticos. En transfecciones transitorias se ensayaron los siguientes sistemas: GRIM1 y los promotores complejos (p21 (-4542)LUC, SKA-LUC, Calponin-LUC, Myogenin-LUC, Promotor-LUC próximo a Myogenin, Timidin-quinasa-LUC, Probasin-LUC, MMTV-LUC uvm.).

TABLA 14 GRIM1 reprime diferentes promotores naturales en células BHK

GRIM1 reprime en función de la dosis el promotor ApoA1, el promotor Calponin (-3000), el promotor SKA, así como el promotor Myogenin y su elemento próximo (myogenin 133-LUC).

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TABLA 15 GRIM1 reprime diferentes promotores naturales en células C2C12

GRIM1 reprime en función de la dosis el promotor Calponin (-3000), el promotor SKA el promotor p21 (-4542), así como el promotor Myogenin.

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Co-transfecciones de GRIM1 y E1b-TATA-Box que contienen promotores mínimos con puntos de unión TF sintéticos (puntos de unión AR, Gal4 y SEF) o con los promotores complejos MMTV conducen a una represión de la actividad transcripcional basal (todas las transcripciones mostradas se llevaron a cabo en células BHK).

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TABLA 16 GRIM1 reprime promotores mínimos y complejos

En transfecciones transitorias de células BHK se utilizaron 500 ng de construcción informadora. G5E1bTATA-LUC es un adenovirus que contiene una construcción mínima de E1b TATA-Box con 5 puntos de unión Gal4, ARE2x(tk)TATA-LUC es una construcción mínima con 2 copias de un punto de unión AR delante de una timidinquinasa TATA-Box, E-Box(tk)TATA-LUC contiene un punto de unión para el factor de transcripción bHlH SEF en el mismo contexto y MMTV describe el promotor complejo del virus Moloney del tumor de ratón.

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La represión de GRIM 1 en el caso de promotores mínimos sin puntos de unión TF sintéticos no se puede representar con más exactitud por los bajos valores basales de las construcciones utilizadas.

El potencial de represión de GRIM1 sobre construcciones informadoras del promotor de luciferasa, las cuales fueron integradas de forma estable en el genoma de la respectiva línea celular (HRL+N con RARE_{3x}-LUC, NIH3T3 con cyca-LUC, 293 con NF\kappaB-RE_{4x}-LUC) se recopila en la siguiente Figura. La transfección de las células con GRIM1 no muestra en estado inducido y en estado basal influencia alguna sobre la transcripción del gen infor-
mador.

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TABLA 17 GRIM1 no reprime ningún gen informador de luciferasa integrado de forma estable

A. células HRL+N con promotor inducible con ácido retínico integrado de forma estable. B. células NIH3T3 con promotor CycA-LUC integrado de forma estable. C. Células 293 con promotor NFkB inducible con TPA.

18

Además, en transfecciones transitorias se examinaron efectos directos de GRIM1 sobre diversos factores de transcripción (compárese también con Ejemplo 11). Junto al AR se analizaron experimentalmente, en especial mmGCNF, mmERR1 y mmRVR, como proteínas con longitud total con las correspondientes construcciones informadoras, en cuanto a una interacción funcional con GRIM1. En ninguna de las transfecciones se pudo observar un efecto significativo.

Se examinaron interacciones de GRIM1 con otros factores de transcripción o co-factores en el contexto basado en Gal4-DBD, co-transfectándose el respectivo factor fusionado con Gal4-DBD en cantidad constante al ir aumentando la cantidad de GRIM1 tipo salvaje. Los factores examinados dentro de este sistema son: Gal4-p300, Gal4-DBD, Gal-Sp1-4, Gal4-CBF). Tampoco aquí pudo observarse un efecto significativo en ninguna de las transfecciones.

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Ejemplo 13

Mecanismo de represión de GRIM1 a) Actividad de HDAC

El mecanismo de represión más extendido hasta el momento a través del reclutamiento de desacetilasas de histona (HDAC) no parece estar implicado en el caso de GRIM1. No se perjudica el potencial de represión de Gal4-DBD-GRIM1 en transfecciones transitorias a través del empleo de inhibidores específicos de HDAC en una concentración de hasta 5 veces mayor que el K_{D} (concentración final de tricostatin A 300 nM, de butirato de sodio 5 mM). GRIM1 purificado de manera inmune a la afinidad y lavado de forma muy astringente no presenta ninguna actividad HDAC endógena. Tampoco los complejos asociados que mediante suaves condiciones de lavado fueron co-precipitados con GRIM1 de forma inmune mostraron ningún tipo de actividad HDAC. Además de esto, a través de estudios Co-IP se excluyó una participación directa en complejos HDAC/N-CoR/SMRT.

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TABLA 18 GRIM1 no posee ninguna actividad HDAC endógena o asociada

La radioactividad liberada sobre el fondo de 850 cpm se evalúa como actividad de HDAC. Las muestras se lavaron o bien 3 veces fisiológicamente (SC) o con cantidad creciente de NaCl (300 y 400 mM). Se parte de que con 400 mM de sal no co-precipitaron ningunas proteínas asociadas (confirmado por Western-Blot y tinciones-S de Ponceau). La Figura recoge 5 ensayos HDAC llevados a cabo independientemente. El nombre Arco utilizado se refiere a la proteína GRIM1.

19

b) Actividad INHAT

Otra posibilidad para la represión transcripcional consiste en el enmascaramiento directo de los N-terminales de la histona, de modo que se impide una acetilación y, con ello, un esponjamiento de la cromatina de la región afectada. A través de análisis de bancos de datos se encontró que el N-terminal (aa 25-135) y el C-terminal absoluto (aa 638-749) de hsGRIM1 disponen de dominios ácidos, que presentan una homología con un dominio INHAT descrito de la proteína Set. INHAT es un acrónimo de dominios proteicos/proteínas, que están en condiciones de ligar lisina e impedir, por ello, una acetilación de la histona.

En análisis GST-Pulldown se pudo demostrar que los fragmentos N- y C-terminales de hsGRIM1 se pueden asociar directamente in vitro con histonas. Además, en ensayos de acetilación in vitro se pudo demostrar que GRIM1 aa 3-147 y aa 609-749 expresados recombinantemente bloquean eficientemente la acetilación de las cuatro histonas Core (H3, H2A, H2B y H4) por p300. Por ello, se pudo poner de manifiesto que un posible mecanismo de la represión mediada por GRIM1 se podría garantizar por enmascaramiento de la histona.

La inhibición de la acetilación de histonas individuales por GRIM1 tiene lugar con diferente eficacia. Hasta ahora, sólo se pudo confirmar unívocamente el bloqueo de la acetilación de H2A y H2B.

c) Otros mecanismos de represión \bullet Metilación de la lisina de histonas

La metilación de lisinas específicas en los N-terminales libres de la histona (H3K9, H3K4) son responsables de una compactación de la estructura de cromatina, inhibiendo una acetilación de las lisinas reguladoras importantes e inhibiendo, por ello, un esponjamiento de la cromatina. Además, las lisinas metiladas representan un punto de unión muy afín para la proteína HP1 (proteína heterocromática 1). Por consiguiente, HP1 puede reclutar ADM-metilasas, MeCPs y también HDACs y llevar a una formación dirigida de hetercromatina transitoria o constructiva y reprimir, por consiguiente, los procesos transcripcionales. Las HMTasas hasta ahora descritas son, por ejemplo, Suv39h1, Suv39h2 y PRMT1.

Análisis homológicos muestran que en la secuencia de GRIM1 no existe ningún dominio SET conservado, que son responsables de la actividad de metiltransferasa de la histona (HMTasa). Por ello se supone que GRIM1 no posee ninguna actividad endógena de HMTasa.

\bullet Reclutamiento de complejos reorganizantes de cromatina

Otra posibilidad de la represión dirigida sería el reclutamiento preestablecido de complejos reorganizantes de cromatina (por ejemplo BRG, SWI/SNF, CHRAC, ARC, RSC, etc.). A través de la reorganización activa de la cromatina se pueden envolver en cromatina compacta regiones del promotor de los genes a reprimir, de tal modo que el inicio de la transcripción se dificulta claramente.

No se puede excluir que GRIM1 establece una interacción funcional con uno de los componentes de un complejo de remodelación.

\bullet Bloqueo de la formación de PIC/inhibición de la reacción de iniciación/inhibición de la elongación

Otra forma de represión es la inhibición o impedimento de la formación del complejo de preiniciación (PIC) al inicio de la transcripción. Una iniciación plena de éxito sólo puede tener lugar cuando la parte ligante del TATA-Box de TFIID puede reclutar el holocomplejo de la polimerasa en el punto del inicio de la transcripción y cuando todos los factores basales de transcripción participantes están disponibles en suficiente cantidad. Otro requisito previo para el éxito de una transcripción es que el C-terminal del RNAPII tiene que ser fosforilizado para que se pueda abandonar el punto de iniciación.

En un experimento habitual para el experto en la materia se puede poner en claro si GRIM1 interacciona directamente con uno de los factores de transcripción basales o factores de elongación, bloqueando por ello una transcripción eficiente (sistema bi-híbrido de levadura, análisis Pulldown). Mediante análisis homológicos no se puede encontrar un dominio de fosfatasa dentro de la estructura de GRIM1, no se tiene todavía la demostración experimental de que GRIM1 podría desfosforilizar el RNAPII.

\bullet Valoración de co-activadores por unión a GRIM1

El potencial de GRIM1 de inactivar co-activadores basales o generales por ligamiento y reprimir así el proceso de iniciación o de elongación, se examina ahora a través de la búsqueda de potenciales partícipes de interacción de hsGRIM1.

Dentro de la proteína GRIM1, en transfecciones transitorias se detectaron al menos un total de 5 dominios de represión independientes (RDs). Los fragmentos E e I de GRIM1 muestran en transcripciones transitorias el potencial de represión más bajo, pero su función en la represión por GRIM1 fue confirmada en los análisis INHAT.

No obstante, los mutantes de deleción P, Q, R y también S muestran una función represora mucho más potente en transfecciones basadas en Gal, lo cual aparte de los hechos conocidos, sugiere aún otros mecanismos. Por experimentos habituales se puede calcular el aporte a la represión que ofrecen las demás regiones de GRIM1. En este caso, se deberían identificar proteínas interaccionantes, partícipes de GRIM1, para descubrir si existe una asociación con componentes no-HDAC de complejos co-represores transcripcionales.

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Ejemplo 14

Análisis de motivos funcionales en hsGRIM1

Motivos funcionales dentro de la estructura de hsGRIM1 se encontraron mediante análisis homológicos de bancos de datos. Una recopilación de los motivos encontrados, su localización dentro de la proteína global y la estrategia experimental utilizada se representa en la siguiente Tabla.

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TABLA 18 Recopilación de los motivos funcionales en hsGRIM1

LxxLL: motivo de interacción a través del cual interaccionan los co-activadores con los NHR. NES: señal de exportación nuclear. NLS: señal de localización nuclear. CoRNR-Box: motivo de interacción a través del cual interaccionan los co-represores con los NHRs. HMG-Box: contacto de proteínas HMG con ADN e histonas.

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Detección del NES dentro de hsGRIM1

Para el análisis directo del motivo se inactivaron las cuatro lisinas relevantes por medio de mutagénesis puntual dirigida, de modo que se destruyó la estructura \alpha-helicoidal del NES. Las mutaciones inactivantes se representan en la siguiente Figura. Una inactivación dirigida sólo de las dos lisinas situadas en 3' resultó no ser suficiente para destruir la funcionalidad del NES.

TABLA 20 Mutagénesis dirigida para la inactivación de las cuatro lisinas participantes en la NES

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Para determinar la funcionalidad de la señal de exportación se fusionaron fragmentos protéicos de HsGRIM1 con GFP (Green Fluorescent Protein) (representados en la siguiente Figura) y se expresaron en células mediante transfección transitoria. La localización de los respectivos fragmentos de determinó por radioscopía de fluorescencia.

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TABLA 21 Proteínas de fusión GFP utilizadas para determinar la funcionalidad de la señal de exportación nuclear (NES)

\DeltaNES designa las mutaciones puntuales descritas.

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Sólo GFP mostraba una localización pan-celular, la longitud total de GFP-hsGRIM1 estaba localizada exclusivamente de forma nuclear por la dominancia de NLS igual que el mutante de deleción de la NES y el fragmento al que fue deleccionada una región flanqueante de NES (hsGRIM1 \Deltaaa246-334). Si el fragmento de hsGRIM1 que contiene el NES se fusionaba con GFP (hsGRIM1 aa246-334), la proteína resultante mostraba exclusivamente una localización citoplasmática. Si el fragmento de aa 246-334 mutado puntualmente se acoplaba a GFP, se reestablecía la localización pan-celular, de manera que se pudo confirmar la funcionalidad del motivo.

Detección del NLS dentro de hsGRIM1

Para el análisis del motivo, junto a los mutantes de deleción expuestos más abajo, se inactivaron el conjunto de los siete radicales básicos relevantes mediante mutagénesis puntual dirigida. Una inactivación sólo de los 3 radicales básicos situados en 3' resultó no ser suficiente para inactivar el NSL.

TABLA 22 Mutagénesis dirigida para la inactivación de los siete radicales básicos participantes en la NSL

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Para determinar la funcionalidad de la señal de importación se fusionaron fragmentos protéicos de hsGRIM1 con GFP (representados en la siguiente Figura) y se expresaron en células mediante transfección transitoria. La localización de los respectivos fragmentos de determinó por radioscopía de fluorescencia.

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TABLA 23 Proteínas de fusión GFP utilizadas para determinar la funcionalidad de la señal de localización nuclear (NLS)

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Sólo GFP mostraba una localización pan-celular, la longitud total de GFP-hsGRIM1 estaba localizada exclusivamente de forma nuclear. Si se deleccionaban los últimos 140 aminoácidos (hsGRIM1 aa1-609), la proteína de fusión GFP mostraba una localización tanto citoplasmática como también débilmente nuclear, la correspondiente parte contraria fusionada a GFP (GFP-hsGRIM1 aa609-749) mostraba exclusivamente una localización nuclear. La longitud total de hsGRIM1 con la mutación puntual realizada siete veces dentro del NLS presentaba el mismo motivo de distribución que el mutante de deleción de hsGRIM1 aa1-609 y confirmaba la funcionalidad del NSL. Si el fragmento de aa609-749 mutado puntualmente se acoplaba a GFP, la proteína de fusión-celular se localizaba igualmente de manera citoplasmática.

Detección de los CoRNR-Box dentro de hsGRIM1

Para el análisis de los CoRNR-Box se reemplazaron el conjunto de las tres isoleucinas altamente conservadas y necesarias en el Core hidrófugo de la hélice, por alanina o respectivamente una serina: 1436A, 1437S, 1444A. Una caracterización funcional más extensa de las mutaciones puntuales establecidas sólo ha dado como resultado que el potencial de represión de hsGRIM1 no se perjudica y que la interacción con el AR por destrucción de la Core-Box no se perjudica.

Relocalización intracelular de mmGRIM1 en modelos de diferenciación basados en cultivos celulares

GRIM1 muestra una modificación de su localización subcelular dentro de procesos de diferenciación específicos. En sistemas de cultivos celulares, durante la diferenciación del músculo esquelético de células C2C12 de ratón, GRIM1 es transportado desde el núcleo al citoplasma circundante. El marco temporal de la translocación de GRIM1 observada se sitúa en el intervalo de la expresión del factor miogénico de transcripción bHLH miogenina (Myf4) y de la proteína estructural del músculo esquelético Myosin-Heavy-chain (MHC), es decir en un instante de la diferenciación muscular más avanzado que el de los factores descritos hasta ahora tales como HDAC4, HDAC5 y HDAC7. En el intervalo de 6-8 días, las células C2C12 se diferencian en condiciones bajas de suero, de mioblastos proliferantes a miotubos multinucleares fusionados. En este caso, las células inician un arresto-G_{o}, el CDK-inhibidor p21 se regula al alza y una cascada ordenada de factores de transcripción miogénicos tales como Myf5, MyoD y miogenina dan lugar a la premisa transcripcional de la miogénesis. Al cabo de aproximadamente 6 a 8 días, GRIM1 en células C2C12 en diferenciación del músculo esquelético abandona los núcleos de los miotubos fusionados, mientras que, por el contrario, GRIM1 en mioblastos mononucleares permanece siempre localizado en el núcleo. La expresión de la proteína estructural del músculo MHC tiene lugar en el instante en el que se pueden observar los primeros núcleos libres de GRIM1, y fue utilizada en los IIF como marcador temporal para la relocalización de GRIM1.

Los datos determinados para C2C12 valen también para otros sistemas celulares de diferenciación del músculo esquelético. El mismo efecto se pudo constatar también en células L6 del músculo esquelético de rata. Las células tienen otra cinética de diferenciación y se fusionan sólo al cabo de 10-12 días en medio de diferenciación (DM). GRIM1 se relocaliza también en células L6, los núcleos libres de GRIM1 se pueden detectar en DM sólo a partir del día 16. En otro sistema de diferenciación se transfectaron de forma estable fibroblastos 10T1/2 de ratón con un "caset" de expresión de MyoD, inducible con estrógenos (células puestas gentilmente a disposición por Dr. D. Bergstrom). Tras la adición de 1 \muM de estradiol se garantiza la diferenciación del músculo esquelético a través de la expresión de MyoD. Al cabo de casi 3-4 días en DM ya se pueden detectar muchas células en forma de miotubos
multinucleares.

Durante la diferenciación del músculo esquelético la proteína GRIM1 no se degrada ni se destruye, sino que se encuentra también en toda su amplitud en el citoplasma. En análisis Western Blot con extractos de células C2C12 completas que fueron diferenciadas a miotubos durante 8 días en DM (el 8º día, después de la adición de DM \geq 60% de todas las células presentes eran miotubos), se puede detectar que la inmunoreactividad de GRIM1 permanece inalterada. Los resultados se pueden confirmar también en gran medida por fraccionamientos de células. Aparte de esto, los análisis RT-PCR han confirmado que la cantidad de mmGRIM1-mRNA no ha variado durante la diferenciación de C2C12.

Como un control más se examinó si GRAM1 también sufría una relocalización subcelular durante la diferenciación del músculo liso. Para este fin se obtuvieron, ex vivo, células de músculo liso de ratón y se diferenciaron mediante adición de factor de crecimiento. Adicionalmente, en un medio de diferenciación se siguieron diferenciando células in vitro a células de músculo liso. Los resultados muestran que GRIM1 durante la diferenciación del músculo liso no abandona el núcleo. Además de esto, se utilizó un cultivo celular con sistema de diferenciación de músculo liso (células Monc1) para obtener in vitro datos sobre una eventual relocalización de GRIM1. Tal como ya se mostró también para las células ex vivo, no se pudo observar durante los tiempos de diferenciación examinados ninguna relocalización de GRIM1 en células de músculos lisos.

Otro modelo de diferenciación in vitro, que se utilizó para análisis de relocalización de GRIM1, es la diferenciación de preadipocitos 3T3-L1 a adipocitos maduros. En un total de tres protocolos de diferenciación llevados a cabo, GRIM1 mostraba dos veces una re-localización detectable desde el núcleo al citoplasma, en un caso, no se pudo detectar variación alguna de la localización de la inmunoreactividad de GRIM1. Ensayos Western Blot han puesto de manifiesto que en ninguno de los tres protocolos se pudo detectar una disminución de la inmunoreactividad de GRIM1 en extractos celulares completos.

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Ejemplo 15

Regulación de la función de GRIM1

No se dispone aún de resultados experimentales completos para la regulación de la función de GRIM1 y para las vías de señales que pudieran participar en la relocalización subcelular. Hasta ahora no se pudo identificar unívocamente ninguna vía de señales que module la actividad transcripcional de GRIM1. Tampoco existen pruebas experimentales de la participación de una cascada de señales que intervenga en el proceso de relocalización de GRIM1. A continuación se resumen brevemente los datos existentes sobre este tema.

Actividad transcripcional

\bullet En inmediata proximidad de NES dentro de la secuencia de GRIM1 se encuentra un punto de fosforilación de PKS de consenso (serina 308). La actividad transcripcional de Gal-GRIM1 se examinó en transfecciones transitorias en diferentes líneas celulares. Ni un tratamiento de las células con el inhibidor de PKC específico Gö6850 (Parke-Davis, antes Gödecke AG) ni una estimulación con el agente TPA activante de PKC dio lugar a una variación de la actividad transcripcional.

\bullet La única evidencia experimental de una modificación de GRIM1 es la detección de una acetilación directa de GRIM1 (aa3-147, así como la longitud completa de GRIM1) por el dominio HAT de p300.

\bullet Una co-transfección de la longitud completa de p300 y Gal-GRIM1 no muestra variación alguna del modelo de represión, la adición de tricostatina A (TSA) refuerza la transcripción general, pero la represión relativa por Gal-GRIM1 permanece invariable.

\bullet Una co-transfección con Gal-GRIM1 en combinación con una versión constitutivamente activa de la Rho-GTPasa (RhoAV14) no muestra igualmente variación alguna de la actividad.

Relocalización

\bullet La exportación nuclear de GFP-GRIM1 o, respectivamente, del mutante GFP-GRIM1 aa234-336 no se influye por tratamiento de las células con la toxina bacteriana leptomicina B (LMB. 20 nm 6 h antes de la recogida de las células y análisis por IIF). LMB es un inhibidor específico del factor de exportación exportin 1/Crm1, de modo que a partir del experimento se puede deducir que tiene que existir un mecanismo de transporte independiente de exportin.

\bullet Las proteínas 14-3-3 son responsables de que durante la diferenciación muscular los HDACs 4, 5 y 7 se alejan activamente del núcleo y se retienen en el citoplasma. Mediante estudios Co-IP se pudo excluir una interacción entre GRIM1 y las proteínas 14-3-3 (miembros familiares zeta, beta, tau).

\bullet El tratamiento de células C2C12 diferenciadas del músculo esquelético con diversos inhibidores de las vías de transducción de señales centrales, no tienen efecto alguno sobre la relocalización o el número de "speckles" nucleares de GRIM1 dentro de la diferenciación examinada desde el día 0 a día 6 después de la adición del medio de diferenciación. Inhibidores ensayados: inhibidores pan-HDAC TSA y butirato de sodio, inhibidores de protein-quinasas Gö6850 (inhibidor de PKC específico, 1 \muM), LY294002 (inhibidor de PI3quinasa específico, 10 \muM), Ro31-8220 (inhibidor de PKC de banda ancha, 0,5 \muM), PD98059 (inhibidor de MEK1, 10 \muM), fasudil (Inhibidor de Rock-quinasa, 10 \muM), SB203580 (inhibidor de p38\alpha/\beta). La sobreacetilación y el bloqueo de las cascadas de señales centrales tuvo visibles consecuencias morfológicas, en parte drásticas, para las células, pero la relocalización o el número de speckles de GRIM1 detectables no se vio influenciada.

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Ejemplo 16

Interacción de hsGRIM1 y el receptor andrógeno (AR) y consecuencias funcionales resultantes de ello

En un ensayo de interacción en levadura-dihidruro se pudo detectar una interacción de GRIM1 con el receptor de hormonas nucleares, receptor de andrógenos (AR). El dominio de interacción de GRIM1 en el ensayo basado en la levadura se encuentra en el C-terminal entre aa 606 hasta 749. Una caracterización funcional de más alcance de los dominios de interacción en el GRIM1 se llevó a cabo mediante análisis Pulldown con los fragmentos expresables de GRIM1. La interacción de GRIM1 con AR es independiente del tipo de ligando utilizado (agonistas, antagonistas o ningún ligando). Los datos existentes se recopilan en el siguiente gráfico:

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TABLA 24 El dominio de interacción de AR de GRIM1 se localiza entre aa460-609

Las regiones de la proteína representadas en blanco aún no fueron expresadas de forma recombinante.

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En contraposición con los datos obtenidos con levadura, el C-terminal de GRIM1 no muestra in vitro ninguna interacción con el AR, sin embargo el fragmento de aa 460 hasta 609 muestra una fuerte interacción independientemente de los ligandos utilizados.

La interacción entre AR y GRIM1 se pudo detectar igualmente en ensayos de interacción in vivo. En co-inmunoprecipitaciones la interacción entre GRIM1 y AR era igualmente independiente de los ligandos y no pudo ser bloqueada de modo significativo incluso en tampón de lavado con NaCl 400 mM. La interacción se pudo mostrar en estudios IP con anticuerpos tanto contra el AR como también contra GRIM1.

El AR es un miembro de la superfamilia de los receptores hormonales nucleares activables por ligandos. Tras la unión del ligando natural de AR 5\alpha-dihidrotestosterona el Ar es transportado desde el citoplasma al núcleo y provoca una activación transcripcional de sus genes diana. Junto a los ligandos activantes existen para cada receptor antagonistas específicos, los cuales provocan igualmente una translocación al núcleo, no obstante provocan una conformación represiva de los dominios de unión de los ligandos del receptor. El receptor antagonista ligado puede reclutar complejos co-represores y reprimir activamente una transcripción. En algunas líneas celulares o en determinadas situaciones patológicas los antagonistas se pueden convertir en agonistas parciales y provocar, de forma no natural, una transactivación por el receptor. En el caso del AR se sabe que en los carcinomas de próstata, las sustancias empleadas terapéuticamente tales como ciproterone-acetato, casodex o hidroxi-flutamida, pueden actuar de forma parcialmente agonista en tumores refractarios a las hormonas.

En sistemas celulares de cultivo se pudo poner de manifiesto que GRIM1 puede reprimir específicamente una transactivación del AR provocada por CPA, casodex u OH-flutamida. AR no ligado o cargado con DHT no es influido transcripcionalmente por GRIM1. El efecto observado oscila en el intervalo entre 2-3 veces la represión de la transcripción de AR provocada por CPA.

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TABLA 25 GRIM1 reprime selectivamente AR activado por antagonistas

Transfecciones transitorias se llevan a cabo en células BHK, en las que los antagonistas utilizados actúan como agonistas parciales. Como informador se utilizó un promotor mínimo con puntos de unión a AR sintéticos (ARE_{2x}-(tk)TATA-LUC. El mismo efecto se consiguió si en lugar de CPA 1\muM se utilizaron casodex u OH-flutamida 1 \muM.

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Otra referencia en relación a la funcionalidad del efecto es que la superactivación del AR cargado con CPA por el co-activador TIF2 en células BHK se puede reprimir o al menos limitar claramente por co-transfección de GRIM1.

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TABLA 26 GRIM1 reprime receptores andrógenos cargados con CPA y superactivados por TIF2

Transfecciones transitorias se llevaron a cabo en células BHK, en las que CPA (1\muM) actúa como agonista parcial. Como informador se utilizó (ARE_{2x}-(tk)TATA-LUC.

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<110> Clínica universitaria Freiburg

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<120> Represor de la diferenciación del músculo esquelético, ácido nucléico que lo codifica y su uso en diagnóstico y terapia

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<130> hsgrim1

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<140>

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<141>

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<160> 8

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<170> PatenIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 2250

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 2253

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<212> DNA

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 749

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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35

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 750

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\hskip0,8cm

36

\hskip0,8cm

37

\hskip0,8cm

38

\hskip0,8cm

39

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<210> 5

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<211> 15105

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip0,8cm

40

\hskip0,8cm

41

\hskip0,8cm

42

\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\hskip0,8cm

45

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 23806

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

46

\hskip0,8cm

47

\hskip0,8cm

48

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

\hskip0,8cm

51

\hskip0,8cm

52

\hskip0,8cm

53

\hskip0,8cm

54

\hskip0,8cm

55

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<210> 7

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<211> 163

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

\hskip0,8cm

56

\hskip0,8cm

57

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<210> 8

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<211> 176

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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\hskip0,8cm

58

Claims (13)

1. Uso de un anticuerpo que se une específicamente in vitro a un epítopo de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº 3 para la detección de GRIM1 en células, caracterizado porque las células se seleccionan a partir de células del músculo esquelético y de preadipocitos.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

4. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo policlonal está dirigido contra los aminoácidos 3 -147 de la SEQ ID nº:3.

5. Uso según la reivindicación 3, caracterizado porque el anticuerpo policlonal está dirigido contra los aminoácidos 609-749 de la SEQ ID nº:3.

6. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se detecta la localización subcelular de GRIM1.

7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque la localización intracelular de GRIM1 se detecta por inmunofluorescencia indirecta.

8. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la detección de GRIM1 o de la localización de GRIM1 tiene lugar inmunohistológicamente.

9. Uso según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utilizan anticuerpos acoplados a fluorescencia o acoplados a enzimas.

10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las células son células del músculo esquelético.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque las células del músculo esquelético son células C2C12.

12. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque las células son preadipocitos.

13. Uso según la reivindicación 12, caracterizado porque los preadipocitos son preadipocitos NIH3T3-L1.