ES2319977T3 - Represor de la diferenciacion del musculo esqueletico, acido nucleico que lo codifica y su uso en diagnostico y terapia. - Google Patents
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Abstract
Uso de un anticuerpo que se une específicamente in vitro a un epítopo de un polipéptido con la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº 3 para la detección de GRIM1 en células, caracterizado porque las células se seleccionan a partir de células del músculo esquelético y de preadipocitos.
Description
Represor de la diferenciación del músculo
esquelético, ácido nucleico que lo codifica y su uso en diagnóstico
y terapia.
Objeto de la presente invención es el uso de un
anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido
con la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº:3, para la detección de
un corepresor en células del músculo esquelético y
preadipocitos.
La denominación GRIM1 elegida para el
co-represor representa la abreviatura de la
denominación anglófona "Global Repressor
Involved in Myogenic Differentiation". Este nombre
fue elegido porque el factor clonado juega un importante papel
especialmente durante la diferenciación del músculo esquelético.
En los últimos años se encontraron un gran
número de moléculas que parecen ser responsables de la inmediata
regulación transcripcional. Junto a los factores ligantes de ADN
(designados en sentido más estricto como factores de transcripción)
hay moléculas reguladoras que, como co-activadores,
facilitan la expresión génica o, como corepresores, provocan
activamente un descanso tanscripcional. Los cofactores son de
carácter promiscuo, pueden ser reclutados en diferentes
combinaciones por diferentes partícipes ligantes de ADN. El cambio
entre complejos co-activadores y complejos
correpresores asociados es un importante paso regulador dentro de
los procesos de la diferenciación
celular.
celular.
Tomando como ejemplo la diferenciación del
músculo esquelético, se ha determinado en el transcurso de los años
una cascada de factores de transcripción que son necesarios para la
miogénesis. Junto a otros factores de transcripción las proteínas
bHLH MyoD, myf5, MRF4 y miogenina provocan que en una célula
precursora de mioblastos, proliferante, se lleve a cabo el programa
genético que dé lugar a una célula funcional terminalmente
diferenciada del músculo esquelético. En el transcurso de esta
filogénesis, la célula pasa por un arresto del ciclo celular, se
fusiona con otras células musculares determinadas para dar
mioblastos multinucleares y expresa enzimas estructurales y
metabólicas, específicas del músculo esquelético.
Los cofactores asociados que intervienen durante
este proceso sólo fueron investigados a partir de los últimos años.
La expresión positivamente regulada de genes miógenos específicos
tiene lugar, por ejemplo, por una asociación funcional de MyoD con
la proteína co-activadora p300. La myoD acetilada
actúa transcripcionalmete de modo mucho más activo que la proteína
no modificada.
Por otra parte, existen determinados
co-represores que evitan activamente en células
proliferantes una represión preestablecida de la expresión de genes
específicos musculares. Así, se descubrió, por ejemplo, una
asociación funcional entre MyoD y el co-represor
N-CoR y colocó de este modo a los
co-factores sólo adscritos hasta el momento a los
receptores nucleares de hormonas en un nuevo campo de acción. Aparte
de esto, se ha descrito que miembros de la familia de la
desacetilasa de la histona (HDAC) están implicados en la
diferenciación del músculo esquelético (modelo de cultivo celular
C2C12) y en los primeros pasos de la diferenciación presentan una
relocalización
subcelular.
subcelular.
La relación de los HDAC con una represión activa
se considera como uno de los pilares fundamentales de la regulación
transcripcional negativa, puesto que la reacción catalizada por los
HDAC se transmite directamente a la cromatina y explica
mecánicamente los efectos observados.
El documento WO 01/57190 A2 describe un gran
número de ácidos nucleicos y polipéptidos que son codificados por
estos ácidos nucleicos. Estos ácidos nucleicos se identificaron en
un procedimiento de "sceening".
Los datos mostrados en esta solicitud describen
GRIM1 como un nuevo represor transcripcional "bona fide" con
un nuevo mecanismo de represión. GRIM1 no está asociado a una
actividad HDAC y la represión propiciada por GRIM1 no se deja
influenciar por inhibidores HDAC específicos. GRIM1 puede inhibir
directamente la acetilación del N-terminal de la
histona (una de las premisas para la activación transcripcional
dirigida) a través de dominios ácidos en los
N-terminal y C-terminal. Dominios de
represión no caracterizados con detalle hasta el momento dentro de
GRIM1 tienen igualmente un elevado potencial para reprimir la
actividad de transcripción. En transfecciones transitorias, GRIM1
tiene el potencial para reprimir en función de la dosis tanto
promotores mínimos complejos como también sintéticos. En base a
estos datos, el nuevo factor clonado se designó como GRIM1 (Global
Repressor Involved in Myogenic differentiation).
GRIM1 manifiesta una relocalización durante la
diferenciación del músculo esquelético, no obstante en un instante
claramente más tardío que el que se describió hasta el momento para
los HDAC 4, 5 y 7 en relación con la transcripción específica de
MEF2. Los presentes datos sugieren que el potencial de represión de
GRIM1 se tiene que desconectar en instantes más tardíos de la
diferenciación del músculo esquelético para que los miotubos se
puedan diferenciar terminalmente. Además de esto, GRIM1 muestra
igualmente durante la diferenciación de los preadipocitos una
modificación subcelular de la localización.
Una función de GRIM1 es que, como represor,
regula conjuntamente la diferenciación de las células del músculo
esquelético. Los datos muestran que GRIM1 muestra un papel
claramente diferente al de los factores partícipes hasta ahora
descritos. La explicación del papel in vivo de GRIM1 tiene
lugar a través de animales "noqueados" a través de GRIM1 y de
ratones transgénicos. En los animales transgénicos se expresarán
mutantes de GRIM1 bajo promotores específicos del músculo
esquelético, los cuales ya no alcanzan el núcleo o no pueden ser
transportados fuera del núcleo. El fenotipo de los ratones, que se
origina por la localización atípica del GRIM1 creada, va a seguir
contribuyendo al entendimiento de la función de GRIM1 dentro de los
procesos de diferencia-
ción.
ción.
La aplicación de la presente invención se
encuentra sobre todo en el sector de las enfermedades musculares
degenerativas o en el control de la pérdida muscular en el hombre en
vías de envejecimiento. La modificación terapéutica de la función
del GRIM1 puede contrarrestar en este caso una pérdida muscular
anticipada o intervenir activamente en los procesos constructivos
de los músculos.
Por lo tanto, en la presente solicitud se
describen polipéptidos que presentan una secuencia de al menos 20
aminoácidos sucesivos de la secuencia del hsGRIM1 (hs = homo
sapiens) con la secuencia ID nº 3.
Los polipéptidos descritos muestran
preferentemente una secuencia de al menos 40 aminoácidos
sucesivos.
De modo más preferente, los polipéptidos
muestran una secuencia de al menos 80 aminoácidos sucesivos y, de
modo aún más preferente, una secuencia de al menos 120 aminoácidos
sucesivos y, muy preferentemente, los polipéptidos descritos
muestran una secuencia de al menos 200 aminoácidos sucesivos de la
secuencia Seq. Id nº 3.
Aparte de esto, en la presente solicitud se
describen polipéptidos que muestran una secuencia de al menos 20
aminoácidos sucesivos de la secuencia mmGRIM1 (mm = mus
musculus) con la Seq.ID nº 4.
De modo más preferente, estos polipéptidos
muestran una secuencia de al menos 40 aminoácidos sucesivos y, de
modo aún más preferente, una secuencia de al menos 120 aminoácidos
sucesivos y muy preferentemente una secuencia de al menos 200
aminoácidos sucesivos de la secuencia Seq.Id nº 4.
En la presente solicitud se describen igualmente
anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo de un
polipéptido conforme a la invención. Los anticuerpos descritos se
pueden preparar según métodos estándar habituales. Los polipéptidos
que codifican GRIM1 pueden servir bien sea para la inmunización de
animales de laboratorio adecuados tales como, por ejemplo, conejos
o cabras y, de esta manera se pueden preparar anticuerpos
policlonales adecuados. Los anticuerpos pueden estar dirigidos
contra epítopos, como epítopos de conformación, pero también contra
los péptidos descritos.
Alternativamente a esto, anticuerpos
monoclonales adecuados se pueden preparar según métodos bien
conocidos desde la publicación de Köhler y Milstein en el año 1975
y que pertenecen al repertorio estándar de un biólogo molecular de
tipo medio.
Este tipo de anticuerpos pueden encontrar
aplicación en terapia. Pero para ello, por lo regular es necesario
que se preparen anticuerpos humanizados, puesto que los anticuerpos
con componentes procedentes de animales pueden provocar reacciones
secundarias no deseadas. Cuando se secuencian las regiones ligantes
de un anticuerpo adecuado, estas secuencias pueden ser
incorporadas a una estructura de base de un anticuerpo humano, y un
anticuerpo de este tipo se puede utilizar terapéuticamente.
Un campo de aplicación alternativo para este
tipo de anticuerpos representa el diagnóstico. Para ello, pueden
ser absolutamente suficientes simples anticuerpos policlonales, con
los cuales se pueda determinar cualitativa y/o cuantitativamente la
presencia de polipéptidos GRIM1 en las células o compartimentos de
células que interesen. Con este tipo de anticuerpos, el experto
medio en la materia puede llevar a cabo los métodos diagnósticos
adecua-
dos.
dos.
Los medicamentos que contienen un polipéptido
aquí descrito, se pueden emplear para el tratamiento de
perturbaciones en la diferenciación del músculo esquelético, así
como para el tratamiento de perturbaciones en la diferenciación de
los adipocitos.
Los medicamentos pueden contener un polipéptido
con la secuencia de GRIM1 completa o con una parte adecuada de la
secuencia. Los medicamentos se administran de forma adecuada a los
pacientes a tratar. Para ello, son adecuadas las formulaciones
farmacéuticas orales o preferentemente parenterales.
El mecanismo de acción de los medicamentos parte
de una modulación de la función de GRIM1. Durante la diferenciación
del músculo esquelético se transporta GRIM1 desde el núcleo al
citoplasma. Los medicamentos pueden intervenir en este proceso de
diferenciación porque o bien la importación se bloquea de forma
preestablecida o porque se bloquea la exportación. Esto se puede
conseguir incorporando las secciones adecuadas de los polipéptidos
en las correspondientes formulaciones para que se pueda alcanzar el
punto diana que interese.
En el marco de la presente invención se
descubrió también que GRIM1 participa en otros procesos de
diferenciación. GRIM1 muestra una relocalización subnuclear durante
la diferenciación de los adipocitos. Una participación de GRIM en
otros procesos de regulación diferentes resulta de los
descubrimientos de la presente invención, especialmente de los
datos experimentales, los cuales muestran que GRIM1 manifiesta una
represión de los complejos más diferentes y de los promotores
sintéticos, y que existe una expresión ubicuitaria de GRIM1.
Otro objetivo de la presente invención es un
procedimiento para la identificación de sustancias que influyen
sobre la función biológica de un polipéptido aquí descrito. Para
ello, la sustancia a identificar se pone en contacto con el
polipéptido en un sistema de ensayo. A través de este sistema de
ensayo se pueden identificar aquellas sustancias que interaccionan
con el polipéptido GRIM1 y que inhiben o fomentan la función
biológica de GRIM1.
En los sistemas utilizados conforme a la
invención se trata preferentemente de sistemas de diferenciación
celular, que se sirven especialmente de células C2C12 miógenas o de
células 10T_{^{1}/_{2}} MyoD-ER diferenciantes
rápida e induciblemente. La detección de GRIM1 o, respectivamente,
de la localización de GRIM1 se puede efectuar, por ejemplo,
inmunohistológicamente. Métodos adecuados son entre otros el uso de
anticuerpos acoplados a fluorescencia o a enzimas, en una etapa de
tinción directa.
También se pueden preparar líneas celulares
adecuadas que contengan una construcción genética correspondiente
con un gen GRIM1. Después, las sustancias a examinar se pueden poner
en contacto con las células y, a través los respectivos ensayos
comparativos, se puede determinar entonces el efecto de la sustancia
a examinar.
En otra forma de ejecución, se pueden introducir
en animales de laboratorio construcciones genéticas adecuadas y los
animales transgénicos se pueden utilizar para los procedimientos de
ensayo.
En otra forma de ejecución de la invención,
fragmentos de GRIM1 preparados de forma recombinante en sistemas de
ensayo exentos de células se pueden incubar con las sustancias a
examinar y por el empleo de una molécula informadora adecuada, se
puede obtener el resultado del ensayo deseado.
El cADN que codifica hsGRIM1 (homo
sapiens), el cual presenta una secuencia de al menos 1200
nucleótidos sucesivos de la Seq.ID nº 1, se describe aquí
igualmente.
Se describe, además, el cADN que codifica mmGRIM
(mus musculus) el cual presenta una secuencia de al menos
1200 nuclótidos sucesivos de la Seq.ID nº 2.
Los cADN descritos se pueden emplear en vectores
de transfección que presenten uno de estos cADN. En este caso, se
puede tratar preferentemente de un vector adenoviral.
Estos vectores de transcripción se utilizan para
la preparación de células que fueron transfectadas con un vector de
este tipo.
En los ejemplos descritos a continuación con más
detalle, junto a los métodos estándar habituales utilizados se
utilizaron preferentemente los siguientes métodos, de los que a
continuación se explican con más detalle los sectores subrayados de
los mismos:
\vskip1.000000\baselineskip
Método
1
Las células se cultivaron bajo condiciones
estériles en cápsulas para cultivos celulares de 15 cm, en los
medios recomendados por ATCC. Cada dos a tres días las células se
subcultivaron en una relación de 1:5 hasta 1:20, y se mantuvieron
en un máximo de 60% de confluencia. Se separa el medio usado, las
células se lavan con tampón PBS y se tratan con solución de
tripsina/EDTA (0,25% de tripsina, 0,04% de EDTA en tampón PBS)
hasta el desprendimiento de la cápsula de cultivo. Las células se
aíslan en medio reciente y se subcultivan en nuevas cápsulas de
cultivo
celular.
celular.
- Tampón PBS
- NaCl 137 mM; KCl 2,7 mM; Na_{2}HPO_{4} 8 mM; KH_{2}PO_{4} 1,8 mM.
- Medios utilizados:
- DMEM (Gibco BRL), 100 IU de penicilina G/ml; 100 \mug/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM, 10% de suero fetal de ternera. Como medio de diferenciación en el caso de células C2C12 y L6 se reemplazó el 10% de FCS por 2% de suero equino. Células 1oT½ MyoD-ER se cultivaron en suero exento de hormonas, como medio de diferenciación se suplementaron estradiol 1 \muM, 10 \mug/ml de insulina y 10 \mug/ml de transferrina.
Para determinar las propiedades
transcripcionales de las proteínas hsGRIM1 en células eucariotas se
cotransfectaron plásmidos de expresión pCMX-hsGRIM1
con plásmidos informadores de Luciferasa-(LUC). En un plásmido de
expresión pCMX la expresión de la respectiva proteína hsGRIM1 se
encuentra bajo el control del promotor del citomegalovirus. En los
plásmidos informadores LUC utilizados, la expresión de la luciferasa
se controla bien sea por el promotor de la timidinquinasa (TK), un
promotor mínimo E1b (TATA-Box), o bien por los
promotores complejos respectivamente indicados.
La transfección tiene lugar por el método del
fosfato cálcico o con el método de los liposomas DOTAP (Roche
Diagnostics, información del producto). En placas de 12 pocillos se
siembran, si no se indica de otro modo, 10^{5} células/pocillo en
1 ml de medio de cultivo. En el método de CaPO_{4}, el plásmido de
ADN a transfectar se coprecipita con fosfato de calcio, y el
precipitado se reparte sobre las células capacitadas para la
división. Para la preparación del precipitado de fosfato de calcio
se prepara la tanda indicada más abajo, para valores dobles, en
placas de 12
pocillos:
pocillos:
- Plásmido informador
- 1 \mug
- Plásmido de expresión hsGRIM1
- 10-400 ng
- Soporte de ADN (pUC18)
- hasta 8 \mug
- Solución de CaCl_{2} (2,5 M)
- 20 \mul
- H_{2}O dd
- hasta 80 \mul
A esta tanda se añaden gota a gota bajo
agitación (Vortex), lenta y constantemente 80 \mul de tampón
2xBES. El precipitado se incuba durante 10 min a TA y se reparte
homogéneamente sobre las células (80 \mul por pocillo) y al cabo
de 8 horas se separa por lavado con PBS. Las células se siguen
incubando durante 18 a 24 h en medio de cultivo reciente.
- Tampón BES (2 veces):
- ácido N,N-bis-[2-hidroxietil]-2-aminoetanosulfónico 50 mM NaCl 280 mM; Na_{2}HPO_{4}\cdot 2H_{2}O 1,5 mM; pH 6,95.
La transfección estable de células de cultivos
celulares se lleva a cabo con el sistema pcDNA6-His
de la razón social Invitrogen. Las células se transfieren tal como
se indicó anteriormente y la integración estable de los plásmidos
utilizados se detecta mediante el antibiótico de selección
blasticidina S. Se toman clones individuales, se expanden y se
ensayan en cuanto a expresión estable mediante Western Blotting e
inmunodetección.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
2
Ensayos de interacción con levadura
di-híbrida, THS de mamíferos, análisis
pull-down, inmunoprecipitación de proteínas
celulares seguida de inmunodetección o en combinación con
partícipes de interacción marcados con
^{35}S-metionina, trasladados in vitro,
sistema Phast-gel.
\vskip1.000000\baselineskip
Una proteína se expresa en E. coli como
proteína de fusión GST, se inmoviliza en un material soporte ligante
de GST y se incuba con el partícipe potencial de interacción,
marcado por lo regular radiactivamente. En las subsiguientes etapas
de lavado se lavan las proteínas no interactivas o débilmente
interactivas del material soporte o, respectivamente, de la
proteína de fusión GST ligada al material soporte. La cantidad de
partícipe de interacción asociada se puede determinar por
separación de las proteínas mediante SDS-PAGE y una
subsiguiente autoradiografía. Para el control de la especificidad
de la interacción entre el partícipe potencial de interacción y la
proteína de fusión GST, se examina la interacción con sólo GST.
Partes alícuotas de fragmentos de GST-GRIM1 o
lisado bruto de E. Coli que contiene GST se mezclan con
respectivamente 30 \mul de
glutation-(GSH)-sefarosa y se incuban durante 1 h a
4ºC sobre un Bohemian Wheel. La GSH-sefarosa se
"peletiza" por centrifugación (1' a 2000 rpm) y se lava dos
veces en tampón Pulldown. El "pelet" se vuelve a suspender a
continuación en 500 \mul de tampón Pulldown y se incuba con el
partícipe potencial de interacción marcado con
^{35}S-metionina, trasladado in vitro,
durante 1 h a 4ºC sobre el Bohemian Whell. Después de lavar por tres
veces con tampón Pulldown el pelet de GSH-sefarosa
se disuelve por ebullición en 30 \mul de tampón de muestra SDS,
las proteínas se separan por SDS-PAGE y, después de
secado el gel, se somete a una
autoradiografía.
autoradiografía.
- Tampón Pulldown:
- HEPES 20 mM (pH 7,7); KCl 150 mM; EDTA 0,1 mM; MgCl_{2} 25 mM; DTT 10 mM, 0,15% (v/v) de NP40.
\vskip1.000000\baselineskip
Si dos proteínas interaccionan en solución,
entonces el complejo estable de las dos proteínas se puede
precipitar con un anticuerpo que esté dirigido contra sólo uno de
los dos partícipes de interacción. El aislamiento del complejo
proteína-anticuerpo de la solución se efectúa en
este caso con ayuda de un material soporte ligante del anticuerpo
(\gamma-bind G sefarosa, Pharmacia). Para examinar
las interacciones entre GRIM1 y partícipes putativos de interacción
se mezclan bien sea extractos celulares nativos o extractos
celulares que contienen GRIM1 con proteínas-diana
marcadas con ^{35}S-metionina, trasladados in
vitro, en 500 \mul de tampón IP. Se añaden respectivamente 5
\mug de anti-GRIM1 o de anticuerpo no específico
(IgG_{1} de conejo) junto con 30 \mul de
\gamma-bind G sefarosa preequilibrada y el
conjunto se incuba durante 60 min a 4ºC sobre un Bohemian Wheel. A
continuación se "peletiza" la G-sefarosa
durante 1' a 2000 rpm, se lava tres veces con respectivamente 300
\mul de tampón IP enfriado con hielo y, finalmente, el pelet se
disuelve por ebullición en 30 \mul de tampón de muestra SDS. Las
muestras se separan finalmente por SDS-PAGE y la
interacción se detecta bien sea mediante
Western-Blotting o, en el caso de las proteínas
trasladadas in vitro en presencia de
^{35}S-metionina, a través de autoradiografía.
- Tampón IP:
- TrisHCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, EDTA 5 mM, 0,3% (v/v) NP40, Pefablock 0,5 mM
- Tampón de lísis celular:
- TrisHCl 50 mM (pH 8,0), NaCl 170 mM, 0,1% NP40, NaF 50 mM, NaO_{3}V_{4} 2 mM, DTT 0,2 mM, Pefablock 0,1 mM, 1 \mug/ml de aprotinina, 10% de glicerol.
\vskip1.000000\baselineskip
Método
3
Se siembran células con la densidad celular
deseada sobre portaobjetos tratados en autoclave y se fijan al
soporte con 5% de paraformaldehído durante 10'. Membranas celulares
se hacen permeables a los anticuerpos por medio de 10' de
incubación en 0,2% de TritonX100. Antes de la incubación, las
células se bloquean con los anticuerpos primarios durante 1 h a la
TA en 0,2% de gelatina (en PBS). Anticuerpos
anti-hsGRIM1 se diluyen 1:500 en solución de
gelatina al 0,2% y se incuban durante 1 h a TA. Después de lavar
tres veces con PBS durante 5' en cada caso se añade el
correspondiente anticuerpo secundario acoplado a fluorocromo, 1:2000
en 0,2% de solución de gelatina y se incuba en la oscuridad durante
30' a TA. Después de las etapas de lavado se
contra-tiñe el núcleo sobre DAPI (1 \mug/ml de
PBS, Roche Diagnostics) y finalmente las células se lavan 2 veces en
0,1% de TritonX100, para minimizar la autofluorescencia. Los
portaobjetos se conservan en Flouromount M (Southem Biotechnology
Associates) y se analizan con un microscopio de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
A través de la lisis hipotónica de la membrana
celular se pueden aislar núcleos intactos y lisarlos por separado.
Las células se recolectan en PBS enfriado con hielo, se
"peletizan" y se expanden en tampón de lisis hipotónico (LB).
Por adición de NP40 hasta 0,1% se hace permeable la membrana celular
y por suave agitación e incubación sobre hielo durante 15' se
liberan los componentes citoplasmáticos. Los núcleos intactos se
peletizan por centrifugación a 14.000 rpm durante 15', se separa
cuantitativamente la fracción de CP y se determina la concentración
de proteína. Los núcleos se lisan por incubación durante 15' y
tratamiento en Vortex en tampón de lisis nuclear (KLB). El resto se
peletiza y se separa el preparado nuclear soluble. La calidad del
preparado se examina mediante Western Blotting e inmunodetección
con marcadores específicos de núcleos (por ejemplo TIF2) y
citoplasmáticos (por ejemplo
RasGAP).
RasGAP).
- LB:
- HEPES 10 mM (pH 7,9), MgCl_{2} 1,5 mM; KCl 10 mM; DTT 0,5 mM, Pefablock 0,5 mM
- KLB:
- HEPES 20 mM (pH 7,9), NaCl 420 mM, MgCl_{2} 1,5 mM; EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, Pefablock 0,5 mM, 10% de glicerol
\vskip1.000000\baselineskip
Método
4
Las reacciones de desacetilación de histona
llevadas a cabo se realizaron en el marco de un "kit" obtenido
de Upstate Biotechnology (histona H3 marcada con ^{3}H en el
N-terminal, como sustrato). Como sustratos
alternativos se utilizaron histonas marcadas con p300
^{14}C-acetilo o histonas maracadas in vivo
(gentilmente puestas a disposición por Dr. Martin Göttlicher,
Kernforschungszentrum Karlsruhe).
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos INHAT se llevaron a cabo tal como se
describe por Eckner et al. y por Seo et al. (Eckner
et al., 1996, Genes and development 10 (19), págs.
2478-2490, Seo et al., 2001, Cell 104 (1),
págs. 119-130). Las histonas o mezclas de histonas
se incuban previamente con los respectivos péptidos en un total de
50 \mul de tampón HAT, después se mezclan con dominios
p300-Hat expresados bacterialmente y 0,5\muCi
^{14}C-acetil-coenzima-A
y se incuban durante 2 h a 30ºC y 1000 rpm. Las reacciones se
detienen por adición de tampón SDS-Laemmli, las
proteínas se separan en SDS-PAGE desnaturalizado y
los geles se incuban durante 1 h en Amplify (NEN). Las
acetilaciones se comprueban en autoradiografías.
\vskip1.000000\baselineskip
Células transfectadas transitoriamente se lavan
una vez con PBS y se lisan por adición de 50 \mul de tampón
informador de lisis (Promega) y por congelación a -80ºC se siguen
abriendo.
Los lisados celulares se traspasan a recipientes
de reacción Eppendorf y los residuos celulares se "peletizan"
durante 2' a 14000 rpm. Para determinar la actividad de la
luciferasa se pipetean en cada caso 10 \mul de los lisados en
placas para microtitulación de 96 pocillos. El ensayo de la
luciferasa tuvo lugar en un EG&G Bethold Microluminomat. A los
10 \mul de lisados celulares se inyectan 40 \mul de tampón de
ensayo de la luciferasa y la quimioluminiscencia resultante se
determinó en una integral de tiempo de 10''. Los valores medidos de
la actividad de la luciferasa se equipararon con la cantidad de
proteína existente en el lisado celular. Para ello, se dispusieron
en cada caso 3 \mul de los lisados en placas para microtitulación
de 96 pocillos con 100 \mul de reactivo de ensayo Bradford
(BioRad) diluido con H_{2}O a 1:5, y se determinó la absorción de
la solución a 595 nm. Actividades relativas de la luciferasa se
obtienen de la relación entre la actividad de la luciferasa y la
absorción protéica.
- Tampón de ensayo con luciferasa:
- Tricine 200 mM; (MgCO_{3})\cdot4Mg(OH)_{2} 1,07 mM; MgSO_{4} 0,1 mM, EDTA 10 mM (pH 8,0); DTT 33 mM; ATP 0,5 M; acetil-coencima A 270 mM; luciferina de luciérnaga 470 mM.
La invención se explica con más detalle por los
siguientes ejemplos:
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Ejemplo
1
La proteína humana GRIM1 clonada comprende 2250
pares de bases y codifica 749 aminoácidos. La secuencia de GRIM1
humano, clonada y obtenida por secuenciación se depositó
primeramente en 1999 bajo el número de acceso AL050019 (proteína
DKFZp564c186) en el marco de un proyecto de secuenciación EST
randomizado del DKFZ en Heidelberg, como cADN desconocido. Una
secuencia más elaborada se depositó en marzo de 2001 (Wiemann et
al., 2001). Hasta el momento, aún no ha tenido lugar una
descripción de la función de la proteína DKFZp564c186. El cADN
conforme a la invención se representa en la Figura 1. La secuencie
tiene la Seq.ID
nº 1.
nº 1.
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Ejemplo
2
A partir de bancos de datos de ratones EST se
pudo calcular, por análisis comparativo con la secuencia aa del
hsGRIM1 procedente de EST independientes, la longitud completa de
una proteína con un total de 750 aminoácidos, la cual presenta un
total del 60% de restos idénticos y, en más del 85%, homólogos a la
conocida secuencia de hsGRIM1. Análisis de cADN de ratón y de
bancos genómicos de ratón (Celera) han confirmado la secuencia aa
de mmGRIM1, calculada y esperada. El cADN ficticio pudo ser
confirmado por análisis RT-PCR. La longitud total
de cADN de mmGRIM1 aún no se ha descrito ni depositado. La secuencia
con la Seq. ID nº 2 se representa en la Figura 2.
La Seq.ID nº 2 se obtuvo por "screening" de
mmEST-dbs con la secuencia aa de hsGRIM1. Los datos
obtenidos se compararon con
mm-cADN-dbs y
dbs-genómico de ratón, y se estableció el cADN
virtual mmGRIM1. La secuencia se confirmó a través de
RT-PCR y secuenciación genómica, así como a través
de una comparación directa de la secuencia con el banco de datos
genómicos de ratón de Celera Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una representación homóloga entre hs y mmGRIM1
sobre cADN y a nivel protéico se muestra en la Figura 3. En la
Figura 3 se muestra una representación homóloga de las secuencias de
aminoácidos de mmGRIM1 y hsGRIM1, incluidos los motivos de
secuencia conservados.
\newpage
La secuencia de aminoácidos de mmGRIM1 (ratón)
es Seq. ID nº 4 y la secuencia de aminoácidos de hsGRIM1 (humano)
es Seq. ID nº 3.
Todos los motivos funcionales y potencialmente
interesantes de la secuencia descritos detalladamente a continuación
se conservan de forma secuencialmente idéntica dentro de la
proteína de ratón y de la proteína humana (señal de localización
nuclear NLS, señal de exportación nuclear NES, los denominados
"CoRNR-box" pueden interaccionar con los
co-represores con sus factores de transcripción
asociados). Otros motivos son los dominios parecidos a
HMG-box dentro de los C- y
N-terminales de GRIM1 de ambas especies, los cuales
eventualmente pueden conseguir establecer contacto con ADN y/o
histonas. Además de esto, dentro de la secuencia primaria hsGRIM1 aa
están contenidos un total de 5 motivos denominados LXXLL o motivos
emparentados, una estructura alfa-helicoidal, que
fue descrita como responsable solitaria del contacto de
co-factores con sus factores de transcripción
asociados. Dentro de la secuencia primara mmGRIM1 sólo se conservan
2 de estos motivos frente a la secuencia humana. Hasta ahora faltan
datos funcionales respecto a estos motivos. En base a cálculos,
hsGRIM1 es principalmente de estructura
alfa-helicoidal (programa
PHD-Predict de la Universidad Columbia) y
no-globular (GLOBE del
PredictProtein-Servers de la Universidad Columbia).
GRIM1 se localiza nuclearmente en células proliferativas, dentro de
sistemas de diferenciación celular (por ejemplo en células C2C12,
L6, 10T1/2 y 3T3-L1) GRIM1 se relocaliza fuera del
núcleo en el citoplasma.
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Ejemplo
4
En base al cADN, en el marco de la presente
invención se trabajó solamente con hsGRIM1. Se parte sin embargo de
que en el caso de emplear cADN de ratón se obtienen resultados
correspondientes. A través de mutagénesis puntuales específicas en
cuanto a deleción y secuencia se prepararon diferentes
construcciones para la caracterización funcional detallada del
GRIM1 humano, que se han recopilado en las siguientes Tablas.
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Muchos de los mutantes utilizados portan Tags
específicos tales como los dominios de unión
Gal4-ADN del factor de transcripción GAL4 de la
levadura [Gal4-DBD], proteína de fluorescencia verde
[GFP], la proteína transactiva 16 [VP16] del Herpes Simplex
Virus, las secuencias de señales específicas de anticuerpos
FLAG-tag [FLAG], Xpress-tag
[XPRESS], c-myc-tag [MYC], epítopo
His-tag [His] ligante de níquel, epítopos [MBP]
ligantes de maltosa, partes ligantes de glutation de la transferasa
de glutation-S [GST]. El uso de proteínas así
modificadas se caracteriza por el uso del nombre del epítopo en la
construcción de GRIM1 empleada. Por medio de estos ensayos se
investigó la función de las regiones individuales de los
polipéptidos conformes a la invención.
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Ejemplo
5
Análisis de bancos de datos han puesto de
manifiesto que proteínas homólogas a hsGRIM1 se pueden encontrar en
numerosas especies. En Shizosaccharomyces pombe, Saccharomyces
cerevisiae, Rattus spec., Bos bovis, Mus musculus, Drosophila
melanogaster, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, así como
también en Arabidopsis thaliana se puede encontrar
secuencias homólogas. Un aspecto resumido se obtiene de los bancos
de datos UNIGENE (National Center for Biotechnological Information,
NCBI) y del PredictProtein-Servers de la Universidad
de Columbia) y se representan en la siguiente Tabla 3:
Se indican números de Swissprot Accession,
números de UNIGENE-Accession, región examinada y
máxima homología (ratón Q9WV70 no es el clon en su longitud total,
compárese para ello el descrito con el clon de ratón descrito bajo
Seq.ID nº4).
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ORGANISMOS MODELO SELECCIONADOS EN UNA
REPRESENTACIÓN DE SIMILITUDES PROTÉICAS.
Organismo, proteína, identidad porcentual y
longitud de la región comparada.
- H. sapiens: sp:
- Q9Y3T9 - YU20 PROTEÍNA HIPOTÉTICA HUMANA 84,9 KDA
- \quad
- DKFZP564Cl86 100% sobre 753 aminoácidos (conforme a la invención)
- M. musculus: sp:
- Q9WV70 - YU20 PROTEÍNA HIPOTÉTICA DE RATON
- \quad
- 73% sobre 267 aminoácidos
- R. norvegicus: sp:
- - [segmento 1 de 2] CADENA ALFA I (I) DE COLÁGENO, 29% sobre 328 aminoácidos
- A. thaliana: sp:
- Q9ZPV5 - YU20 UNA PROTEÍNA HIPOTÉTICA DE RATA
- \quad
- T3OD6,27 IN CROMOSOMA II 27% sobre 722 aminoácidos
- C. elegans sp:
- O 17580 - YTB2 _ PROTEÍNA HIPOTÉTICA DE CAEEL 82 O KDA
- \quad
- CO7E3: 2 IN CROMOSOMA II 27% sobre 656 aminoácidos
- D. melanogaster: sp:
- Q9VIF0 - YU20 PROTEÍNA HIPOTÉTICA DROME CG9246
- \quad
- 37% sobre 681 aminoácidos
- S. cerevisiae: sp:
- P39744 - Y026 _ YEAST HYPOTHETICAL 81,6 KDA PROTEIN IN DEDI-RETI INTERGENIC REGION 29% sobre 674 aminoácidos
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En la Figura 4 se representa una comparación de
los aminoácidos y la determinación de una secuencia de consenso.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
La característica de las secuencias genómicas de
mmGRIM1 y hsGRIM1 se confrontan en la siguiente Tabla 4. La
secuencia genómica de las dos especies, incluidos los detallados
límites de exon-intron se indican en las Figuras
5
y 6.
y 6.
En la Figura 5 se representa la secuencia
genómica de hsGRIM1 (NCBI Human Genome Server, Chromosome 1 map
view, build 27, diciembre 2001). Los exones tienen el fondo
sombreado y el lugar putativo poly-A está subrayado.
La secuencia corresponde a Seq.ID nº 5.
En la Figura 6 se representa la secuencia
genómica de mmGRIM1 inclusive las secuencias 5,5 kb flanqueantes
(obtenido a través del NCBI público del genoma-db de
ratón y del genoma-db de ratón Celera). Los exones
tienen el fondo sombreado y las secuencias intrónicas se
representan con fondo más claro. Tansposiciones exon/intron se
representan más marcadas. El lugar putativo poly-A y
el inicio de transcripción putativo están subrayados. Fragmentos
secuenciales no ensamblados totalmente se representan con "N".
La secuencia genómica del ratón tiene la Seq.ID nº 6.
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Ejemplo
7
Para la expresión de la proteína GRIM1
recombinante se ensayaron muchas estrategias y sistemas de expresión
diferentes, sin embargo sólo transcurrió con éxito la expresión de
fragmentos protéicos cortos ya sea en el contexto His_{6x} o el
contexto GST. Los siguientes listados resumen brevemente los
resultados y los métodos empleados.
Sistemas bacterianos: todos los sistemas
utilizados emplean cepas de seguridad de Escherichia coli
obtenidas a partir de Stratagene.
BL21(DE3)lysGOLD
His-fusionado: expresión en el sistema pRSET o en un
vector pRSET modificado con "Tag" singular de hexahistidina,
purificación a través de una matriz de afinidad de níquel (TALON,
Clontech). Co-expresión con GrpESL y chaperonas
hspHJK.
BL21(DE3)lysGOLD
GST-fusionado: expresión en pGEX4 o Sistema 6 de
Pharmacia, purificación a través de columnas de afinidad GSH.
Expresión inducible a través de IPTG, co-expresión
con GroESL y chaperonas hspHJK.
BL21(DE3)lysGOLD
NusA-fusionado: aumento de la solubilidad de la
proteína diana a través de la parte NusA, purificación por GPC
(Tratagene, Novagen).
BL21(DE3)lysGOLD
MBP-fusionado: expresión periplasmática por lo cual
toxicidad reducida (sistema pMAL Stratagene, New England
Biolabs)
BL21(DE3)lysRIL: codón optimizado
cepa BL21 (stratagene). Expresión protéica fusionada tanto con
hexahistidina como también con GST.
ABLE C: cepa de seguridad, que regula
disminuyendo en un factor 4 el número de copias de plásmidos
endógenos (Stratagene). Expresión protéica fusionada tanto con
hexahistidina como también con GST.
ABLE K: cepa de seguridad, que regula
disminuyendo en un factor 4 el número de copias de plásmidos
endógenos (Stratagene). Expresión protéica fusionada tanto con
hexahistidina como también con GST.
Musgo Physcomitrella patens: integración
estable de un plásmido de expresión incorporado en CaMV para
GST-hsGRIM1
(pRT99/35S-GST-hsGRIM1) a través de
recombinación no homóloga. Triple selección por dos antibióticos de
selección diferentes y varias siembras (en cooperación con Prof.
Ralf Haski, Institut für Pflanzenbiotechnologie de la Universidad
Freiburg).
Expresión de la proteína de fusión GST en un
cultivo celular de células eucariotas bajo control de un promotor
CMV constructivamente activo.
Fragmentos protéicos cortos de hsGRIM1 se
obtuvieron tanto como proteínas de fusión de hexahistidina y también
de GST sólo en BL21(DE3)lysGOLD sin
co-expresión de chaperonas. La siguiente Tabla
recopila los resultados obtenidos de la expresión, los fragmentos
no incluidos en la lista no pudieron ser expresados (compárese para
ello la Tabla de las construcciones hsGRIM1 utilizadas):
Ejemplo
8
Para la preparación de anticuerpos específicos
de hsGRIM1 se expresaron en E. coli dos fragmentos protéicos
de hsGRIM1 fusionados con hexahistidina, se purificaron y se
emplearon para la inmunización de conejos. Como epítopos de los
anticuerpos sirvieron los aminoácidos 3-147 y
609-749 de hsGRIM1.
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Estas regiones corresponden a los dominios
putativos INHAT de hsGRIM1 y se caracterizan particularmente por
(cluster poliE/poliD) ácidos. Las correspondientes regiones de la
secuencia del cADN de hsGRIM1 se generaron por digestión de
restricción con puntos de corte EcoRi- (aa147) y X veces (aa609), y
los productos se clonaron en el vector pRSET-B
(Invitrogen) (aa 609-749) o
pRSET-N^{*}/H basado en el
pRSET-B, con la diferencia de que se separaron
varios "tags" y que la proteína sólo se expresa con tag de
hexahistidina (aa 3-147). Los fragmentos protéicos
de hsGRIM1 (aa 3-147 "E", aa
609-749 "I") fusionados con hexahistidina se
sobreexpresaron en E. coli BL21(DE3)lysGOLD y
tras la apertura de las bacterias se purificaron por cromatografía
de afinidad TALON. Después del aislamiento y purificación a partir
de E. coli los dos polipéptidos presentaban una pureza
estimada en 80-90%. La inmunización de conejos se
llevó a cabo con los polipéptidos y el antisuero obtenido fue
purificado. Los anticuerpos monoespecíficos purificados contra aa
3-147 (2719, 2720) y contra aa
609-749 (2910 y 2911) se caracterizaron
funcionalmente.
Los anticuerpos obtenidos en este caso se
emplearon en diferentes procedimientos de ensayos inmunológicos e
hicieron posible la detección de la expresión de GRIM1. Los dos
anticuerpos dirigidos contra el N-terminal muestran
la localización de GRIM1 exclusivamente nuclear en compartimentos
subnucleares, los cuales se denominan genéricamente como
"speckles". El número y tamaño de los speckles nucleares varía
de una línea celular a otra, sólo es común la exclusiva
localización nuclear de GRIM1 en células proliferativas. Los dos
anticuerpos dirigidos contra el C-terminal
reconocen exclusivamente GRIM1 nuclear en células proliferativas,
pero no en speckles, sino que en una localización
pan-nuclear en todo el nucleoplasma.
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Ejemplo
9
La expresión de cADN de hsGRIM1 es ubicuitario
según el informe del banco de datos Unigene (UniGene Cluster Hs.
134200, proteína de Homo sapiens DKFZP564C 186/DKFZP564C 186
con el cADN de biblioteca 2334BT0407 utilizada). Expresión
comprobada en:
cerviz, páncreas, amnios_normal, hueso,
médula ósea, cerebro, seno, cerviz, colon, colon_est, colon_ ins,
denis drash, oído, tumor_epidérmico, esófago, ojo, tracto
genito-urinario, células germinales, cabeza_cuello,
corazón, riñón, tumor_renal, hígado, pulmón, pulmón_normal,
tumor_pulmonar, linfa, músculo, nervio_normal, ovarios, páncreas,
placenta, mezcla, mezclado, cerebro mezclado, pulmón, testículos,
colon mezclado, riñón, estómago, pulmón y bazo mezclados,
próstata, tumor_prostático, glándula salivar, piel, intestino
delgado, estómago, testículos, línea celular testicular, timo
mezclado, tonsila, útero, tumor_uterino, embrión completo.
La muestra de expresión de hsGRIM1 se representó
por medio de Northern Blot-Analyse (CLONTECH hsMTN I
y hsMTN II, Sonda: tanto longitud total de cADN de hGRIM1,
respectivamente los fragmentos N- y C-terminales).
El tamaño de transcripción de hsGRIM1 es aproximadamente 3.3 kb (en
conformidad con la longitud total de mARN depositada bajo el Acc #
AL 050019):
corazón (1), cerebro (2), placenta (3),
pulmón (4), hígado (5), músculo esquelético (6), riñón (7), glándula
suprarrenal (8), bazo (9), timo (10), próstata (11), testículos
(12), ovarios (13), intestino delgado (14), intestino grueso (15),
linfocitos periféricos (16).
La expresión de mmGRIM1 en diferentes tejidos de
ratón adulto (4-6 semanas) se determinó a través de
RT-PCR. Los siguientes tejidos y órganos se
clasificaron como mmGRIM1 positivos:
La expresión de mARN de mmGRIM1 en el desarrollo
embrionario se determinó por RT-PCR con mARN
embrionario completo. En todos los instantes se detecta una clara
señal de mmGRIM1, durante el desarrollo no se observa una fuerte
modificación de la expresión del mARN de mmGRIM1.
En la Tabla 8 se representa un análisis de la
expresión de EST del banco de datos UNIGENE seleccionado en
homología con la proteína mm/hsGRIM1. Se indican los números de
acceso de los clones IMAGE o de las secuencias parcialmente
desconocidas, así como del tipo de tejido del que fueron aislados
los ADN. GRIM1 parece ser que también a nivel protéico se expresa
ubicuitariamente. En total se encontraron 308 EST, de los cuales a
continuación se presentan listados los que manifiestan una clara
relación con el tejido:
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\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Puesto que diferentes experimentos no se pueden
llevar a cabo, sin más, en el ser humano, se llevaron a cabo
ensayos en cultivos celulares y animales, los cuales sin embargo
presentan también argumentos contundentes para la situación en el
ser humano.
- a)
- La expresión de la proteína mmGRIM1 en células y tejidos primarios se indica a continuación (todas las células indicadas están clasificadas como GRIM1-positivas en Western-Blot (86kD), en el caso de células se examinó la expresión también en IIF). Las señales se obtuvieron con los dos anticuerpos (epítopo N- y C-terminal):
- Fibroblastos embrionales de ratón
- Tejido cardíaco humano (pacientes de DCM y corazón normal)
- Células de músculo liso de ratón (diferenciadas, no diferenciadas y proliferantes)
- Órganos de ratón: testículos, ovarios, bazo, timo y en menor cantidad también en próstata y estómago (representados en la siguiente Figura), cerebro, pulmón, hígado.
- b)
- La expresión de la proteína mmGRIM1 se pudo determinar por inmunohistoquímica in vitro en cortes sagitales de embriones de ratón E10.5. La mmGRIM1 se expresa en estructuras epiteliales, en el dermomiotomo de las extremidades posteriores, en las regiones interepiteliales del tubo neural y en otras colonias celulares, aún no determinadas más de cerca. Sólo en el dermomiotomo se puede detectar una expresión concentrada, en los demás áreas sólo se pueden detectar células mmGRIM1 positivas aisladas. En análisis de mARN y EST se detectó una expresión ubicuitaria de GRIM1. En análisis inmunohistoquímicos in situ en embriones E10.5 de ratón se pudo poner de manifiesto que mmGRIM1 se expresa ciertamente en cada tipo de tejido, pero no en cada célula, sino más bien en colonias celulares especializadas. mmGRIM1 no se expresa en cada tipo de célula, sino que de forma distribuida por todo el organismo en tipos especializados de células.
- c)
- La expresión de mGRIM1 (m = rata) en el cerebro de rata se determinó in situ por inmunohistoquímica en cortes sagitales a través del cerebro de una rata Sprague Dawley (Rattus norvegicus ssp).
- mGRIM1 se expresa en células Purkinje del cerebelo (nuclear y también citoplásmicamente; fuerte inmunoreactividad en 1-2 estructuras sub-nucleares), en células bipolares de la capa mitral del lóbulo olfatorio (nuclear y también citoplasmáticamente; fuerte inmunoreactividad en 1-2 estructuras sub-nucleares); fuerte inmunoreactividad en todas las células del plexo coroide (nuclear y en parte también citoplasmáticamente; fuerte inmunoreactividad en mayormente 2 estructuras sub-nucleares), en células de toda la región del córtex no determinadas con más detalle (nuclear y en parte también citoplasmáticamente; fuerte inmunoreactividad en 1-2 estructuras sub-nucleares), rnGRIM1 no se expresa en cualquier tipo de células, sino distribuido en todo el área craneal en células especializadas.
- d)
- Expresión de la proteína GRIM1 en células de cultivos celulares. Todas las líneas presentadas están clasificadas como GRIM1-positivas en análisis Western-Blot (tamaño abarcado por las especies de aproximadamente 86 kD) y por inmunofluorescencia indirecta (IIF). Los dos análisis se llevaron a cabo con todos los anticuerpos \alpha-GRIM1 disponibles. En estado proliferativo se puede detectar GRIM1 en cada línea celular en las denominadas estructuras "speckle" (tal como se describe también en la bibliografía para muchos co-represores):
- Ratón:
- Fibroblastos NIH3T3, preadipocitos NIH3T3-L1, adipocitos NIH3T3-L1, células C1C12 del músculo esquelético no diferenciadas, células C1C12 del músculo esquelético diferenciadas, células neuronales N2a, células P19 de teratocarcininoma, fibroblastos 10T½, células neuronales gliales Monc-1.
- Ser humano:
- Células HL1 del músculo cardíaco, 293 células renales embrionarias, células LnCaP de carcinoma de próstata, células PC3 de carcinoma de próstata.
- Mono:
- Líneas de células renales COS-7 y CV1.
- Rata:
- Células L6 del músculo esquelético
- Hamster:
- Células renales fetales BHK
- e)
- GRIM1 de Drosófila melanogaster
La expresión de una proteína parecida a hsGRIM1
se estudió por Western Blot, en cuanto a hibridaciones in
situ, en Drosófila melanogaster y en la mosca de la lana
(whole-fly).
Ni en el conjunto de lisado de larvas ni en el
conjunto de extractos celulares de cabezas de mosca se detectó por
Western Blot una señal específica con los anticuerpos específicos
anti-hsGRIM1 (dilución de 36 a 210 kD). Igualmente,
hibridaciones in situ en distintos estados larvarios tampoco
pudieron detectar ninguna señal específica de dmGRIM1 (dm =
drosófila melanogaster) con los anticuerpos de GRIM1 existentes.
\newpage
Ejemplo
11
En los estudios de interacción
proteína-proteína llevados a cabo hasta el momento
se examinaron con los siguientes métodos los siguientes partícipes
potenciales de interacción de mm/hsGRIM1 en relación a una
interacción directa o indirecta:
Los factores subrayados mostraban una
interacción con hs/mmGRIM1 y se describen de forma especial al final
de la exposición (ma = mesocricetus aureus, células
BHK).
\vskip1.000000\baselineskip
hsAR (PD, utflP, tflP, y THS, tT),
hsER\alpha (utflP, tflP), hsER\beta, mGR (tT, tflP), hsMR
(tT), hsPR (tT), PPAR\gamma (tT), hsRAR\alpha (tflP),
mTR\alpha (tT), hsTR\beta-2 (tT), mmERR1
(tflP, tT), mmGCNF (PD, ivIP, tflP, tT), hsRevErbA (tT),
mmRVR (tT, tflP), mmSF1 (tT).
\vskip1.000000\baselineskip
Myogenin (ivlP, tT), MEF2A (ivlP), MEF2B (ivlP),
MEF2C (ivlP, tT), eHand (ivlP), dHand (ivlP), E47 (ivlP), E12
(ivlP), GATA4 (ivlP), MyoD (ivlP, tT), SEV (ivlP, tT), MRF4 (ivlP,
tT), Myf5 (ivlP), Sp1 (tT), CBF (tT).
\vskip1.000000\baselineskip
N-CoR (ivlP, tflP, utflP, PD),
Sin3A (ivlP, tflP, utflP), Sin3B (tflP, utflP),
SuN-CoR (ivlP, tT), SMRT (ivlP, tflP, utflP), HDAC1
(tflP, utflP), HDAC2 (tflP, utflP), RIP140 (ivlP).
\vskip1.000000\baselineskip
p300 (tT), FHL2 (ivlP, PD), FHL3 (PD), TIF2
(ivlP), RIP140 (ivlP)
Otros factores: histonas H3, H4, H2A, H2B
(PD).
Sólo pudo mostrarse hasta el momento una fuerte
interacción directa entre hsGRIM1/mmGRIM1 con el receptor andrógeno
(hsAR) (detectado por tflP en ambas direcciones, utflP
en ambas direcciones, THS, PD y tT). La interacción con el receptor
andrógeno es independiente de los ligandos y no se deja influir por
la presencia de antagonistas (casodex,
hidroxi-flutamida, acetato de ciproterona). GRIM1
interacciona tanto con el AR "normal" con 17 glutaminas, como
también con isoformas de AR, que están asociadas a la enfermedad de
Kennedy y que contienen inserciones (17, 44 y 77 Q) ricas en
poliglutamina, igualmente independiente de los ligandos. Los
análisis PD se llevaron a cabo con los fragmentos
GST-I/E/H/M de GRIM1, interaccionando todos los
fragmentos ensayados, hasta el GRIM1-"E" (aa
3-147) con el AR, en el orden de sucesión
M\geqH>>I. La relevancia fisiológica de la interacción
AR-GRIM1 se describe con más detalle en un capítulo
aparte.
Interacciones débiles se detectaron entre
hsGRIM1 y los Orphan-receptores nucleares Germ Cell
Nuclear Factor (mmGCNF) y el receptor de estrógeno Related
Receptor1 (mmERR1) (sólo IvlP, tflP y PD), así
como una débil interacción con el receptor \alpha de estrógeno
(hsER \alpha; la interacción sólo fue detectada en tflP y
mostró ser independiente de ligandos, tanto en presencia de
agonistas (estradiol), de antagonistas (raloxifen, tamoxifen, ICI)
como también en ausencia de un ligando). En general, la relevancia
fisiológica, co-localización in vivo o
interacción in vivo no está nada clara. En transfecciones
transitorias no se pudo poner de manifiesto una relación directa
entre GRIM1 y mmGCNF, mmERR1 o hsER\alpha.
En análisis GST-Pulldown, GRIM1
muestra una fuerte interacción con las histonas Core H4, H2B, H2A y
H3. Proteínas de fusión GST-GRIM1 expresadas
recombinantemente (GST-aa 3-147 y
GST-aa 609-749) muestran una clara
interacción con todas las cuatro histonas Core, lo que sigue
apoyando la actividad INHAT observada de los dominios de GRIM1 N- y
C-terminales.
Los potenciales partícipes de interacción de
mm/hsGRIM1 se pueden identificar por métodos convencionales. Estos
métodos comprenden Two Hybrid-Screen de levadura con
diversos bancos de cADN y métodos directos
protein-bioquímicos tales como
Co-IP de GRIM1 y proteínas asociadas, separación por
electroforesis en gel de 2 dimensiones, análisis espectrométricos
de masas y secuenciación Mikrospray de las proteínas potencialmente
integrantes de diferentes líneas de cultivos celulares (C2C12
diferenciada, C2C12 no diferenciada, 3T3L1 diferenciada, 3T3L1 no
diferenciada, BHK etc.).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Todos los datos descritos se obtuvieron con el
clon de shGRIM1. GRIM1 es un potente represor transcripcional si se
utiliza como proteína de fusión Gal4-DBD en
transfecciones transitorias. Gal-GRIM1 reprime la
expresión de genes informadores tanto de complejos controlados por
Gal4-RE como de construcciones informadoras
sintéticas mínimas. Por ejemplo, el potencial de represión de GRIM1
es claramente más fuerte en comparación con el
co-represor
Gal-SuN-CoR. En estos experimentos,
los correspondientes co-represores se expresan
transitoriamente en células como proteínas de fusión heterológicas
Ga14-DBD. La capacidad de regresión sobre diferentes
construcciones sintéticas de
informadores-promotores en comparación con las
mismas cantidades transferidas del tipo salvaje de
Gal4-DBD se determina a través de la expresión de
genes informadores con luciferasa.
Se transfectaron células 293 con el informador
G5E1bTATA-LUC y las cantidades indicadas de
co-represores. El mismo efecto se puede observar
cuando se ensayan promotores complejos
(Gal4_{3x}-tk-LUC).
Gal-GRIM1 es un represor
igualmente fuerte que un gran número de
co-represores descritos tales como, por ejemplo,
Gal-HDAC1-10,
Gal-CBF1, Gal-Alien y reprime tan
sólo de forma insignificantemente más débil que
Gal-N-CoR-RD o
Gal-SMRT-RD. El potencial de
represión de Gal-GRIM1 se examinó en combinación con
los complejos de construcciones informador/promotor
Gal4_{3x}-tk-LUC y
Gal-MMTV-LUC y en combinación con
las construcciones informador/promotor-mínimo
Gal_{5x}-E1b-TATA-box
y
Gal_{3x}-\betaglobin-TATA-LUC.
Además de esto, se examinó la capacidad de represión de
Gal-GRIM1 frente a un dominio autónomo de
transactivación VP-16 unido a ADN mediante
LexA-DBD a través de un informador
LexA_{8x}Gal_{5x}-LUC (puesto a disposición por
Dr. S. Khochbhin). Los datos obtenidos de Gal-GRIM1
se ensayaron experimentalmente en las siguientes líneas celulares:
A7r5, C2C12, CV1, BHK, 293, N2a, COS-7. En la
siguiente Figura se muestran resultados representativos de células
BHK y C2C12.
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\vskip1.000000\baselineskip
La represión de Gal-GRIM1 no se
perjudica por adición de los inhibidores específicos de la
desacetilasa de histona (HDAC) Tricostatin A (TSA, 300nM) y de
butirato de sodio (Na-But, 5 mM), lo que sugiere
fundamentalmente otros mecanismos de represión que los descritos
para otros co-represores. Casos comparables se
describieron para otros represores, sin embargo no se describe
ninguna explicación metódica. Además, los factores descritos no
muestran participación alguna en la diferenciación del músculo
esquelético o en adipogénesis. En la siguiente Figura se
representan a modo de ejemplo datos de la independencia de los HDAC
en transfecciones transitorias, para células BHK. La actividad
transcripcional de Gal-GRIM1 no se ve influenciada
por TSA en ninguna línea celular ya ensayada.
\vskip1.000000\baselineskip
Transfecciones transitorias se llevaron a cabo
en células BHK con un plásmido informador
Gal4-tk-LUC.
Para la determinación de los dominios de GRIM1
participantes en la represión se construyeron un total de 11
mutantes de deleción de GRIM1 y todos fueron ensayados en el
contexto de Gal4-DBD en cuanto a su potencial de
represión en todos los sistemas informadores descritos. Todos los
dominios de GRIM1 utilizados muestran represión transcripcional en
la región de 2x (Gal-E y Gal-I)
hasta 15-20x (longitud total de
Gal-Gram1). Todos los mutantes de deleción
ensayados se mostraban insensibles frente a los inhibidores de
HDAC.
En resumen, se pudo poner de manifiesto que
GRIM1 posee al menos 5 dominios de represión independientes,
encontrándose los 3 dominios de represión principales en la región
hidrófuga del núcleo de la proteína (mutQ, mutR, mutP). Sin
embargo, cada mutante de deleción analizado en el contexto
Gal4-DBR muestra una capacidad de represión situada
significativamente sobre el plano general.
\newpage
Los subdominios "E" e "I" de GRIM1
descritos dentro de la sección "actividad INHAT" muestran en
los ensayos transcripcionales como fusiones
Gal4-DBD el menor efecto represivo, pero participan
en la inhibición de la acetilación de histona por p300. No hay más
informaciones relativas a los dominios Q, P y R, no se pudo
confirmar una participación directa en el reclutamiento de
co-represores adicionales a través de los estudios
de interacción anteriormente expuestos. Momentáneamente no existen
más que especulaciones sobre el mecanismo de represión aplicado por
GRIM1, no obstante, se puede excluir una participación de los HDAC,
y parece ser que se utilizan al menos dos mecanismos diferentes (E
e I en contraposición con Q, R y P).
Mutantes de deleción se examinaron en
transfecciones transitorias en cuanto a su potencial de represión.
El dominio de represión central del GRIM1 se encuentra en la región
comprendida entre aa 246-609 (representado en
blanco). El RD central, a través de otros estudios de deleción, se
puede seguir dividiendo en un total de tres dominios independientes
(representados en color oscuro).
Los resultados obtenidos con el sistema
LexA_{8x}Gal_{5x} confirman estos resultados, pero muestran otra
represión relativa de los fragmentos aislados examinados (no se
muestran datos).
GRIM1 en toda su longitud está en condiciones de
reprimir promotores mínimos complejos tanto de origen natural como
los sintéticos. En transfecciones transitorias se ensayaron los
siguientes sistemas: GRIM1 y los promotores complejos (p21
(-4542)LUC, SKA-LUC,
Calponin-LUC, Myogenin-LUC,
Promotor-LUC próximo a Myogenin,
Timidin-quinasa-LUC,
Probasin-LUC, MMTV-LUC uvm.).
GRIM1 reprime en función de la dosis el
promotor ApoA1, el promotor Calponin (-3000), el promotor SKA, así
como el promotor Myogenin y su elemento próximo (myogenin
133-LUC).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
GRIM1 reprime en función de la dosis el promotor
Calponin (-3000), el promotor SKA el promotor p21 (-4542), así como
el promotor Myogenin.
Co-transfecciones de GRIM1 y
E1b-TATA-Box que contienen
promotores mínimos con puntos de unión TF sintéticos (puntos de
unión AR, Gal4 y SEF) o con los promotores complejos MMTV conducen a
una represión de la actividad transcripcional basal (todas las
transcripciones mostradas se llevaron a cabo en células BHK).
\vskip1.000000\baselineskip
En transfecciones transitorias de células BHK se
utilizaron 500 ng de construcción informadora.
G5E1bTATA-LUC es un adenovirus que contiene una
construcción mínima de E1b TATA-Box con 5 puntos de
unión Gal4, ARE2x(tk)TATA-LUC es una
construcción mínima con 2 copias de un punto de unión AR delante de
una timidinquinasa TATA-Box,
E-Box(tk)TATA-LUC
contiene un punto de unión para el factor de transcripción bHlH SEF
en el mismo contexto y MMTV describe el promotor complejo del virus
Moloney del tumor de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La represión de GRIM 1 en el caso de promotores
mínimos sin puntos de unión TF sintéticos no se puede representar
con más exactitud por los bajos valores basales de las
construcciones utilizadas.
El potencial de represión de GRIM1 sobre
construcciones informadoras del promotor de luciferasa, las cuales
fueron integradas de forma estable en el genoma de la respectiva
línea celular (HRL+N con RARE_{3x}-LUC, NIH3T3
con cyca-LUC, 293 con
NF\kappaB-RE_{4x}-LUC) se
recopila en la siguiente Figura. La transfección de las células con
GRIM1 no muestra en estado inducido y en estado basal influencia
alguna sobre la transcripción del gen infor-
mador.
mador.
\newpage
A. células HRL+N con promotor inducible con
ácido retínico integrado de forma estable. B. células NIH3T3 con
promotor CycA-LUC integrado de forma estable. C.
Células 293 con promotor NFkB inducible con TPA.
Además, en transfecciones transitorias se
examinaron efectos directos de GRIM1 sobre diversos factores de
transcripción (compárese también con Ejemplo 11). Junto al AR se
analizaron experimentalmente, en especial mmGCNF, mmERR1 y mmRVR,
como proteínas con longitud total con las correspondientes
construcciones informadoras, en cuanto a una interacción funcional
con GRIM1. En ninguna de las transfecciones se pudo observar un
efecto significativo.
Se examinaron interacciones de GRIM1 con otros
factores de transcripción o co-factores en el
contexto basado en Gal4-DBD,
co-transfectándose el respectivo factor fusionado
con Gal4-DBD en cantidad constante al ir aumentando
la cantidad de GRIM1 tipo salvaje. Los factores examinados dentro de
este sistema son: Gal4-p300,
Gal4-DBD,
Gal-Sp1-4,
Gal4-CBF). Tampoco aquí pudo observarse un efecto
significativo en ninguna de las transfecciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
El mecanismo de represión más extendido hasta el
momento a través del reclutamiento de desacetilasas de histona
(HDAC) no parece estar implicado en el caso de GRIM1. No se
perjudica el potencial de represión de
Gal4-DBD-GRIM1 en transfecciones
transitorias a través del empleo de inhibidores específicos de HDAC
en una concentración de hasta 5 veces mayor que el K_{D}
(concentración final de tricostatin A 300 nM, de butirato de sodio 5
mM). GRIM1 purificado de manera inmune a la afinidad y lavado de
forma muy astringente no presenta ninguna actividad HDAC endógena.
Tampoco los complejos asociados que mediante suaves condiciones de
lavado fueron co-precipitados con GRIM1 de forma
inmune mostraron ningún tipo de actividad HDAC. Además de esto, a
través de estudios Co-IP se excluyó una
participación directa en complejos
HDAC/N-CoR/SMRT.
\vskip1.000000\baselineskip
La radioactividad liberada sobre el fondo de
850 cpm se evalúa como actividad de HDAC. Las muestras se lavaron o
bien 3 veces fisiológicamente (SC) o con cantidad creciente de NaCl
(300 y 400 mM). Se parte de que con 400 mM de sal no
co-precipitaron ningunas proteínas asociadas
(confirmado por Western-Blot y
tinciones-S de Ponceau). La Figura recoge 5 ensayos
HDAC llevados a cabo independientemente. El nombre Arco utilizado
se refiere a la proteína GRIM1.
Otra posibilidad para la represión
transcripcional consiste en el enmascaramiento directo de los
N-terminales de la histona, de modo que se impide
una acetilación y, con ello, un esponjamiento de la cromatina de la
región afectada. A través de análisis de bancos de datos se
encontró que el N-terminal (aa
25-135) y el C-terminal absoluto
(aa 638-749) de hsGRIM1 disponen de dominios ácidos,
que presentan una homología con un dominio INHAT descrito de la
proteína Set. INHAT es un acrónimo de dominios proteicos/proteínas,
que están en condiciones de ligar lisina e impedir, por ello, una
acetilación de la histona.
En análisis GST-Pulldown se pudo
demostrar que los fragmentos N- y C-terminales de
hsGRIM1 se pueden asociar directamente in vitro con
histonas. Además, en ensayos de acetilación in vitro se pudo
demostrar que GRIM1 aa 3-147 y aa
609-749 expresados recombinantemente bloquean
eficientemente la acetilación de las cuatro histonas Core (H3, H2A,
H2B y H4) por p300. Por ello, se pudo poner de manifiesto que un
posible mecanismo de la represión mediada por GRIM1 se podría
garantizar por enmascaramiento de la histona.
La inhibición de la acetilación de histonas
individuales por GRIM1 tiene lugar con diferente eficacia. Hasta
ahora, sólo se pudo confirmar unívocamente el bloqueo de la
acetilación de H2A y H2B.
La metilación de lisinas específicas en los
N-terminales libres de la histona (H3K9, H3K4) son
responsables de una compactación de la estructura de cromatina,
inhibiendo una acetilación de las lisinas reguladoras importantes e
inhibiendo, por ello, un esponjamiento de la cromatina. Además, las
lisinas metiladas representan un punto de unión muy afín para la
proteína HP1 (proteína heterocromática 1). Por consiguiente, HP1
puede reclutar ADM-metilasas, MeCPs y también HDACs
y llevar a una formación dirigida de hetercromatina transitoria o
constructiva y reprimir, por consiguiente, los procesos
transcripcionales. Las HMTasas hasta ahora descritas son, por
ejemplo, Suv39h1, Suv39h2 y PRMT1.
Análisis homológicos muestran que en la
secuencia de GRIM1 no existe ningún dominio SET conservado, que son
responsables de la actividad de metiltransferasa de la histona
(HMTasa). Por ello se supone que GRIM1 no posee ninguna actividad
endógena de HMTasa.
Otra posibilidad de la represión dirigida sería
el reclutamiento preestablecido de complejos reorganizantes de
cromatina (por ejemplo BRG, SWI/SNF, CHRAC, ARC, RSC, etc.). A
través de la reorganización activa de la cromatina se pueden
envolver en cromatina compacta regiones del promotor de los genes a
reprimir, de tal modo que el inicio de la transcripción se
dificulta claramente.
No se puede excluir que GRIM1 establece una
interacción funcional con uno de los componentes de un complejo de
remodelación.
Otra forma de represión es la inhibición o
impedimento de la formación del complejo de preiniciación (PIC) al
inicio de la transcripción. Una iniciación plena de éxito sólo puede
tener lugar cuando la parte ligante del TATA-Box de
TFIID puede reclutar el holocomplejo de la polimerasa en el punto
del inicio de la transcripción y cuando todos los factores basales
de transcripción participantes están disponibles en suficiente
cantidad. Otro requisito previo para el éxito de una transcripción
es que el C-terminal del RNAPII tiene que ser
fosforilizado para que se pueda abandonar el punto de
iniciación.
En un experimento habitual para el experto en la
materia se puede poner en claro si GRIM1 interacciona directamente
con uno de los factores de transcripción basales o factores de
elongación, bloqueando por ello una transcripción eficiente
(sistema bi-híbrido de levadura, análisis Pulldown).
Mediante análisis homológicos no se puede encontrar un dominio de
fosfatasa dentro de la estructura de GRIM1, no se tiene todavía la
demostración experimental de que GRIM1 podría desfosforilizar el
RNAPII.
El potencial de GRIM1 de inactivar
co-activadores basales o generales por ligamiento y
reprimir así el proceso de iniciación o de elongación, se examina
ahora a través de la búsqueda de potenciales partícipes de
interacción de hsGRIM1.
Dentro de la proteína GRIM1, en transfecciones
transitorias se detectaron al menos un total de 5 dominios de
represión independientes (RDs). Los fragmentos E e I de GRIM1
muestran en transcripciones transitorias el potencial de represión
más bajo, pero su función en la represión por GRIM1 fue confirmada
en los análisis INHAT.
No obstante, los mutantes de deleción P, Q, R y
también S muestran una función represora mucho más potente en
transfecciones basadas en Gal, lo cual aparte de los hechos
conocidos, sugiere aún otros mecanismos. Por experimentos
habituales se puede calcular el aporte a la represión que ofrecen
las demás regiones de GRIM1. En este caso, se deberían identificar
proteínas interaccionantes, partícipes de GRIM1, para descubrir si
existe una asociación con componentes no-HDAC de
complejos co-represores transcripcionales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Motivos funcionales dentro de la estructura de
hsGRIM1 se encontraron mediante análisis homológicos de bancos de
datos. Una recopilación de los motivos encontrados, su localización
dentro de la proteína global y la estrategia experimental utilizada
se representa en la siguiente Tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
LxxLL: motivo de interacción a través del cual
interaccionan los co-activadores con los NHR. NES:
señal de exportación nuclear. NLS: señal de localización nuclear.
CoRNR-Box: motivo de interacción a través del cual
interaccionan los co-represores con los NHRs.
HMG-Box: contacto de proteínas HMG con ADN e
histonas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para el análisis directo del motivo se
inactivaron las cuatro lisinas relevantes por medio de mutagénesis
puntual dirigida, de modo que se destruyó la estructura
\alpha-helicoidal del NES. Las mutaciones
inactivantes se representan en la siguiente Figura. Una
inactivación dirigida sólo de las dos lisinas situadas en 3' resultó
no ser suficiente para destruir la funcionalidad del NES.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la funcionalidad de la señal de
exportación se fusionaron fragmentos protéicos de HsGRIM1 con GFP
(Green Fluorescent Protein) (representados en la siguiente Figura) y
se expresaron en células mediante transfección transitoria. La
localización de los respectivos fragmentos de determinó por
radioscopía de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
\DeltaNES designa las mutaciones puntuales
descritas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Sólo GFP mostraba una localización
pan-celular, la longitud total de
GFP-hsGRIM1 estaba localizada exclusivamente de
forma nuclear por la dominancia de NLS igual que el mutante de
deleción de la NES y el fragmento al que fue deleccionada una
región flanqueante de NES (hsGRIM1
\Deltaaa246-334). Si el fragmento de hsGRIM1 que
contiene el NES se fusionaba con GFP (hsGRIM1
aa246-334), la proteína resultante mostraba
exclusivamente una localización citoplasmática. Si el fragmento de
aa 246-334 mutado puntualmente se acoplaba a GFP, se
reestablecía la localización pan-celular, de manera
que se pudo confirmar la funcionalidad del motivo.
Para el análisis del motivo, junto a los
mutantes de deleción expuestos más abajo, se inactivaron el conjunto
de los siete radicales básicos relevantes mediante mutagénesis
puntual dirigida. Una inactivación sólo de los 3 radicales básicos
situados en 3' resultó no ser suficiente para inactivar el NSL.
Para determinar la funcionalidad de la señal de
importación se fusionaron fragmentos protéicos de hsGRIM1 con GFP
(representados en la siguiente Figura) y se expresaron en células
mediante transfección transitoria. La localización de los
respectivos fragmentos de determinó por radioscopía de
fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Sólo GFP mostraba una localización
pan-celular, la longitud total de
GFP-hsGRIM1 estaba localizada exclusivamente de
forma nuclear. Si se deleccionaban los últimos 140 aminoácidos
(hsGRIM1 aa1-609), la proteína de fusión GFP
mostraba una localización tanto citoplasmática como también
débilmente nuclear, la correspondiente parte contraria fusionada a
GFP (GFP-hsGRIM1 aa609-749) mostraba
exclusivamente una localización nuclear. La longitud total de
hsGRIM1 con la mutación puntual realizada siete veces dentro del NLS
presentaba el mismo motivo de distribución que el mutante de
deleción de hsGRIM1 aa1-609 y confirmaba la
funcionalidad del NSL. Si el fragmento de aa609-749
mutado puntualmente se acoplaba a GFP, la proteína de
fusión-celular se localizaba igualmente de manera
citoplasmática.
Para el análisis de los
CoRNR-Box se reemplazaron el conjunto de las tres
isoleucinas altamente conservadas y necesarias en el Core hidrófugo
de la hélice, por alanina o respectivamente una serina: 1436A,
1437S, 1444A. Una caracterización funcional más extensa de las
mutaciones puntuales establecidas sólo ha dado como resultado que
el potencial de represión de hsGRIM1 no se perjudica y que la
interacción con el AR por destrucción de la
Core-Box no se perjudica.
GRIM1 muestra una modificación de su
localización subcelular dentro de procesos de diferenciación
específicos. En sistemas de cultivos celulares, durante la
diferenciación del músculo esquelético de células C2C12 de ratón,
GRIM1 es transportado desde el núcleo al citoplasma circundante. El
marco temporal de la translocación de GRIM1 observada se sitúa en
el intervalo de la expresión del factor miogénico de transcripción
bHLH miogenina (Myf4) y de la proteína estructural del músculo
esquelético Myosin-Heavy-chain
(MHC), es decir en un instante de la diferenciación muscular más
avanzado que el de los factores descritos hasta ahora tales como
HDAC4, HDAC5 y HDAC7. En el intervalo de 6-8 días,
las células C2C12 se diferencian en condiciones bajas de suero, de
mioblastos proliferantes a miotubos multinucleares fusionados. En
este caso, las células inician un arresto-G_{o},
el CDK-inhibidor p21 se regula al alza y una cascada
ordenada de factores de transcripción miogénicos tales como Myf5,
MyoD y miogenina dan lugar a la premisa transcripcional de la
miogénesis. Al cabo de aproximadamente 6 a 8 días, GRIM1 en células
C2C12 en diferenciación del músculo esquelético abandona los núcleos
de los miotubos fusionados, mientras que, por el contrario, GRIM1
en mioblastos mononucleares permanece siempre localizado en el
núcleo. La expresión de la proteína estructural del músculo MHC
tiene lugar en el instante en el que se pueden observar los
primeros núcleos libres de GRIM1, y fue utilizada en los IIF como
marcador temporal para la relocalización de GRIM1.
Los datos determinados para C2C12 valen también
para otros sistemas celulares de diferenciación del músculo
esquelético. El mismo efecto se pudo constatar también en células L6
del músculo esquelético de rata. Las células tienen otra cinética
de diferenciación y se fusionan sólo al cabo de
10-12 días en medio de diferenciación (DM). GRIM1
se relocaliza también en células L6, los núcleos libres de GRIM1 se
pueden detectar en DM sólo a partir del día 16. En otro sistema de
diferenciación se transfectaron de forma estable fibroblastos 10T1/2
de ratón con un "caset" de expresión de MyoD, inducible con
estrógenos (células puestas gentilmente a disposición por Dr. D.
Bergstrom). Tras la adición de 1 \muM de estradiol se garantiza la
diferenciación del músculo esquelético a través de la expresión de
MyoD. Al cabo de casi 3-4 días en DM ya se pueden
detectar muchas células en forma de miotubos
multinucleares.
multinucleares.
Durante la diferenciación del músculo
esquelético la proteína GRIM1 no se degrada ni se destruye, sino que
se encuentra también en toda su amplitud en el citoplasma. En
análisis Western Blot con extractos de células C2C12 completas que
fueron diferenciadas a miotubos durante 8 días en DM (el 8º día,
después de la adición de DM \geq 60% de todas las células
presentes eran miotubos), se puede detectar que la inmunoreactividad
de GRIM1 permanece inalterada. Los resultados se pueden confirmar
también en gran medida por fraccionamientos de células. Aparte de
esto, los análisis RT-PCR han confirmado que la
cantidad de mmGRIM1-mRNA no ha variado durante la
diferenciación de C2C12.
Como un control más se examinó si GRAM1 también
sufría una relocalización subcelular durante la diferenciación del
músculo liso. Para este fin se obtuvieron, ex vivo, células
de músculo liso de ratón y se diferenciaron mediante adición de
factor de crecimiento. Adicionalmente, en un medio de diferenciación
se siguieron diferenciando células in vitro a células de
músculo liso. Los resultados muestran que GRIM1 durante la
diferenciación del músculo liso no abandona el núcleo. Además de
esto, se utilizó un cultivo celular con sistema de diferenciación
de músculo liso (células Monc1) para obtener in vitro datos
sobre una eventual relocalización de GRIM1. Tal como ya se mostró
también para las células ex vivo, no se pudo observar durante
los tiempos de diferenciación examinados ninguna relocalización de
GRIM1 en células de músculos lisos.
Otro modelo de diferenciación in vitro,
que se utilizó para análisis de relocalización de GRIM1, es la
diferenciación de preadipocitos 3T3-L1 a adipocitos
maduros. En un total de tres protocolos de diferenciación llevados
a cabo, GRIM1 mostraba dos veces una re-localización
detectable desde el núcleo al citoplasma, en un caso, no se pudo
detectar variación alguna de la localización de la inmunoreactividad
de GRIM1. Ensayos Western Blot han puesto de manifiesto que en
ninguno de los tres protocolos se pudo detectar una disminución de
la inmunoreactividad de GRIM1 en extractos celulares completos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
No se dispone aún de resultados experimentales
completos para la regulación de la función de GRIM1 y para las vías
de señales que pudieran participar en la relocalización subcelular.
Hasta ahora no se pudo identificar unívocamente ninguna vía de
señales que module la actividad transcripcional de GRIM1. Tampoco
existen pruebas experimentales de la participación de una cascada
de señales que intervenga en el proceso de relocalización de GRIM1.
A continuación se resumen brevemente los datos existentes sobre este
tema.
\bullet En inmediata proximidad de NES dentro
de la secuencia de GRIM1 se encuentra un punto de fosforilación de
PKS de consenso (serina 308). La actividad transcripcional de
Gal-GRIM1 se examinó en transfecciones transitorias
en diferentes líneas celulares. Ni un tratamiento de las células con
el inhibidor de PKC específico Gö6850 (Parke-Davis,
antes Gödecke AG) ni una estimulación con el agente TPA activante de
PKC dio lugar a una variación de la actividad transcripcional.
\bullet La única evidencia experimental de una
modificación de GRIM1 es la detección de una acetilación directa de
GRIM1 (aa3-147, así como la longitud completa de
GRIM1) por el dominio HAT de p300.
\bullet Una co-transfección de
la longitud completa de p300 y Gal-GRIM1 no muestra
variación alguna del modelo de represión, la adición de
tricostatina A (TSA) refuerza la transcripción general, pero la
represión relativa por Gal-GRIM1 permanece
invariable.
\bullet Una co-transfección
con Gal-GRIM1 en combinación con una versión
constitutivamente activa de la Rho-GTPasa (RhoAV14)
no muestra igualmente variación alguna de la actividad.
\bullet La exportación nuclear de
GFP-GRIM1 o, respectivamente, del mutante
GFP-GRIM1 aa234-336 no se influye
por tratamiento de las células con la toxina bacteriana leptomicina
B (LMB. 20 nm 6 h antes de la recogida de las células y análisis
por IIF). LMB es un inhibidor específico del factor de exportación
exportin 1/Crm1, de modo que a partir del experimento se puede
deducir que tiene que existir un mecanismo de transporte
independiente de exportin.
\bullet Las proteínas
14-3-3 son responsables de que
durante la diferenciación muscular los HDACs 4, 5 y 7 se alejan
activamente del núcleo y se retienen en el citoplasma. Mediante
estudios Co-IP se pudo excluir una interacción
entre GRIM1 y las proteínas 14-3-3
(miembros familiares zeta, beta, tau).
\bullet El tratamiento de células C2C12
diferenciadas del músculo esquelético con diversos inhibidores de
las vías de transducción de señales centrales, no tienen efecto
alguno sobre la relocalización o el número de "speckles"
nucleares de GRIM1 dentro de la diferenciación examinada desde el
día 0 a día 6 después de la adición del medio de diferenciación.
Inhibidores ensayados: inhibidores pan-HDAC TSA y
butirato de sodio, inhibidores de protein-quinasas
Gö6850 (inhibidor de PKC específico, 1 \muM), LY294002 (inhibidor
de PI3quinasa específico, 10 \muM), Ro31-8220
(inhibidor de PKC de banda ancha, 0,5 \muM), PD98059 (inhibidor de
MEK1, 10 \muM), fasudil (Inhibidor de
Rock-quinasa, 10 \muM), SB203580 (inhibidor de
p38\alpha/\beta). La sobreacetilación y el bloqueo de las
cascadas de señales centrales tuvo visibles consecuencias
morfológicas, en parte drásticas, para las células, pero la
relocalización o el número de speckles de GRIM1 detectables no se
vio influenciada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
En un ensayo de interacción en
levadura-dihidruro se pudo detectar una interacción
de GRIM1 con el receptor de hormonas nucleares, receptor de
andrógenos (AR). El dominio de interacción de GRIM1 en el ensayo
basado en la levadura se encuentra en el C-terminal
entre aa 606 hasta 749. Una caracterización funcional de más
alcance de los dominios de interacción en el GRIM1 se llevó a cabo
mediante análisis Pulldown con los fragmentos expresables de GRIM1.
La interacción de GRIM1 con AR es independiente del tipo de ligando
utilizado (agonistas, antagonistas o ningún ligando). Los datos
existentes se recopilan en el siguiente gráfico:
\vskip1.000000\baselineskip
Las regiones de la proteína representadas en
blanco aún no fueron expresadas de forma recombinante.
En contraposición con los datos obtenidos con
levadura, el C-terminal de GRIM1 no muestra in
vitro ninguna interacción con el AR, sin embargo el fragmento
de aa 460 hasta 609 muestra una fuerte interacción
independientemente de los ligandos utilizados.
La interacción entre AR y GRIM1 se pudo detectar
igualmente en ensayos de interacción in vivo. En
co-inmunoprecipitaciones la interacción entre GRIM1
y AR era igualmente independiente de los ligandos y no pudo ser
bloqueada de modo significativo incluso en tampón de lavado con
NaCl 400 mM. La interacción se pudo mostrar en estudios IP con
anticuerpos tanto contra el AR como también contra GRIM1.
El AR es un miembro de la superfamilia de los
receptores hormonales nucleares activables por ligandos. Tras la
unión del ligando natural de AR
5\alpha-dihidrotestosterona el Ar es transportado
desde el citoplasma al núcleo y provoca una activación
transcripcional de sus genes diana. Junto a los ligandos activantes
existen para cada receptor antagonistas específicos, los cuales
provocan igualmente una translocación al núcleo, no obstante
provocan una conformación represiva de los dominios de unión de los
ligandos del receptor. El receptor antagonista ligado puede
reclutar complejos co-represores y reprimir
activamente una transcripción. En algunas líneas celulares o en
determinadas situaciones patológicas los antagonistas se pueden
convertir en agonistas parciales y provocar, de forma no natural,
una transactivación por el receptor. En el caso del AR se sabe que
en los carcinomas de próstata, las sustancias empleadas
terapéuticamente tales como ciproterone-acetato,
casodex o hidroxi-flutamida, pueden actuar de forma
parcialmente agonista en tumores refractarios a las hormonas.
En sistemas celulares de cultivo se pudo poner
de manifiesto que GRIM1 puede reprimir específicamente una
transactivación del AR provocada por CPA, casodex u
OH-flutamida. AR no ligado o cargado con DHT no es
influido transcripcionalmente por GRIM1. El efecto observado oscila
en el intervalo entre 2-3 veces la represión de la
transcripción de AR provocada por CPA.
\vskip1.000000\baselineskip
Transfecciones transitorias se llevan a cabo en
células BHK, en las que los antagonistas utilizados actúan como
agonistas parciales. Como informador se utilizó un promotor mínimo
con puntos de unión a AR sintéticos
(ARE_{2x}-(tk)TATA-LUC. El mismo efecto se
consiguió si en lugar de CPA 1\muM se utilizaron casodex u
OH-flutamida 1 \muM.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Otra referencia en relación a la funcionalidad
del efecto es que la superactivación del AR cargado con CPA por el
co-activador TIF2 en células BHK se puede reprimir o
al menos limitar claramente por co-transfección de
GRIM1.
\vskip1.000000\baselineskip
Transfecciones transitorias se llevaron a cabo
en células BHK, en las que CPA (1\muM) actúa como agonista
parcial. Como informador se utilizó
(ARE_{2x}-(tk)TATA-LUC.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Clínica universitaria Freiburg
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Represor de la diferenciación del
músculo esquelético, ácido nucléico que lo codifica y su uso en
diagnóstico y terapia
\vskip0.400000\baselineskip
<130> hsgrim1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatenIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2250
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 2253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 749
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 750
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15105
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23806
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
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\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip0,8cm
\hskip0,8cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 176
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0,8cm
Claims (13)
1. Uso de un anticuerpo que se une
específicamente in vitro a un epítopo de un polipéptido con
la secuencia de aminoácidos SEQ ID nº 3 para la detección de GRIM1
en células, caracterizado porque las células se seleccionan
a partir de células del músculo esquelético y de preadipocitos.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
3. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo
policlonal.
4. Uso según la reivindicación 3,
caracterizado porque el anticuerpo policlonal está dirigido
contra los aminoácidos 3 -147 de la SEQ ID nº:3.
5. Uso según la reivindicación 3,
caracterizado porque el anticuerpo policlonal está dirigido
contra los aminoácidos 609-749 de la SEQ ID
nº:3.
6. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque se detecta la localización
subcelular de GRIM1.
7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6,
caracterizada porque la localización intracelular de GRIM1
se detecta por inmunofluorescencia indirecta.
8. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque la detección de GRIM1 o de
la localización de GRIM1 tiene lugar inmunohistológicamente.
9. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, caracterizado porque se utilizan anticuerpos
acoplados a fluorescencia o acoplados a enzimas.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado porque las células son células del músculo
esquelético.
11. Uso según la reivindicación 10,
caracterizado porque las células del músculo esquelético son
células C2C12.
12. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 9,
caracterizado porque las células son preadipocitos.
13. Uso según la reivindicación 12,
caracterizado porque los preadipocitos son preadipocitos
NIH3T3-L1.
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