ES2309332T3 - Proteina de union a cap. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4, y que se une a la proteína asociada c-Cbl (CAP); (b) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se delecionan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP; (c) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP; o (d) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP.

Description

Proteína de unión a CAP.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo polipéptido que se une a la proteína asociada a c-Cbl (CAP), un nuevo polinucleótido que codifica el polipéptido y un método de detección.

Técnica antecedente

La insulina se secreta a partir de células \beta de los islotes de Langerhans pancreáticos y disminuye el nivel de azúcar en sangre actuando de forma predominante en músculo, hígado y grasa, para permitir que el azúcar en sangre se incorpore a la célula, se almacene en la misma y se consuma. La diabetes está causada por una función insuficiente de la insulina y existen dos tipos de pacientes, es decir, el tipo 1 que tiene un trastorno en la producción y/o secreción de insulina, y el tipo 2 que tiene dificultad en la aceleración del metabolismo del azúcar por la insulina. En cualquiera de estos pacientes, el nivel de azúcar en sangre es superior que en personas sanas. Sin embargo, la insulina sanguínea es absolutamente deficiente en el tipo 1, mientras que en el tipo 2 se desarrolla resistencia a la insulina, en la que la incorporación y el consumo de azúcar sanguínea no se aceleran independientemente de la presencia de insulina. La diabetes de tipo 2 es la denominada enfermedad relacionada con el estilo de vida, que es el resultado de una sobrealimentación, falta de ejercicio, estrés y similares, además de una predisposición hereditaria. Actualmente, los pacientes diabéticos de tipo 2 han aumentado rápidamente a medida que se eleva la ingesta calórica en los países desarrollados y en Japón, representando dichos pacientes el 95% de los pacientes diabéticos. Por lo tanto, los fármacos terapéuticos para la diabetes no sólo deberían ser agentes hipoglucemiantes sencillos, sino que ha aumentado la necesidad de estudios de terapias dirigidas a la diabetes de tipo 2, en la que el metabolismo de la glucosa se acelere a través de la mejora de la resistencia a la insulina.

Actualmente, para la terapia de los pacientes diabéticos de tipo 1 se prescribe una formulación de insulina para inyección. Por otro lado, los ejemplos de agentes hipoglucemiantes conocidos prescritos para los pacientes diabéticos de tipo 2 incluyen: agentes hipoglucemiantes de sulfonilurea (agentes de SU) que actúan sobre las células \beta pancreáticas para acelerar la secreción de insulina; agentes hipoglucemiantes de biguanida, que tienen actividad para aumentar la utilización del azúcar por la actividad glucolítica anaerobia, para suprimir la gluconeogénesis y para suprimir la absorción intestinal de azúcar; así como inhibidores de la \alpha-glucosidasa que retardan la digestión y absorción de hidratos de carbono, además de las formulaciones de insulina para inyección. Aunque estos agentes mejoran indirectamente la resistencia a la insulina, en los últimos años se han usado derivados de tiazolidina como agentes que mejoran directamente la resistencia a la insulina. Su actividad consiste en incorporar la glucosa a las células y acelerar la utilización de la glucosa en el interior de las células. Se ha demostrado que el derivado de tiazolidina actúa como un agonista del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PPAR\gamma) (documento no de patente 1). Sin embargo, se sabe que el derivado de tiazolidina presenta no sólo el efecto mejorador sobre la resistencia a la insulina, sino que también presenta un efecto secundario de causar edema (documentos no de patente 2-3). Puesto que la inducción de edema es un grave efecto secundario que da como resultado una hipertrofia cardiaca, con el fin de mejorar la resistencia a la insulina, se han deseado moléculas diana útiles para el desarrollo de nuevos fármacos que puedan ser una alternativa al PPAR\gamma.

La señal de la función de la insulina se transduce hacia el interior de una célula a través de un receptor de insulina en la membrana celular. En la ruta de acción de la insulina existen dos rutas, es decir, la primera y la segunda ruta (documento no de patente 4). En la primera ruta, la señal se transduce de forma secuencial desde el receptor de insulina activado a través de IRS-1 e IRS-2, PI3 quinasa, PDK1 a Akt1 (PKB\alpha) o Akt2 (PKB\beta) o PKC\lambda o PKC\zeta. Como resultado, se acelera la incorporación de azúcar desde el exterior de la célula por translocación de un transportador de glucosa GLUT4, que está presente en el interior de una célula, hacia la membrana celular (documento no de patente 5). Por otro lado, en la segunda ruta, la señal se transduce de forma secuencial desde el receptor de insulina a través de c-Cbl y CAP a Crk II, C3G y TC10 y, por consiguiente, se acelera la incorporación de azúcar por GLUT4 (documento no de patente 6). Sin embargo, todavía no están claros en parte los detalles de la ruta de transducción de señales de la insulina y, particularmente, no está claro qué mecanismo está implicado en última instancia en estas señales para acelerar la incorporación celular de azúcar a través del transportador de glucosa.

CAP es una proteína adaptadora que existe en la segunda ruta de la señalización de la insulina y se expresa mucho en hígado, músculo esquelético, riñón y corazón, que son tejidos sensibles a la insulina (documento no de patente 7). Además, se ha sabido que la expresión de CAP se potencia por un derivado de tiazolidina que es un agonista de PPAR\gamma (documento no de patente 8). CAP se une a c-Cbl a través de un dominio SH3 en su extremo C-terminal. El complejo CAP/c-Cbl responde la señal de insulina, activando de este modo a TC10 a través de un complejo CrkII-C3G para acelerar la translocación del transportador de glucosa GLUT4 a la membrana celular. Se describió que aunque el CAP que tiene deficiencia de SH3, que es un dominio de unión a c-Cbl (CAP \DeltaSH3), no afecta a la actividad de la quinasa PI3, inhibe la incorporación celular de azúcar (documento no de patente 9). A partir de estos descubrimientos, se piensa que CAP es un factor mediador de señales que actúa en la incorporación de azúcar a las células dependiendo de la unión a c-Cbl, y que la inhibición de su función puede dar como resultado una resistencia a la insulina a través de un bloqueo parcial de la transducción de la señal de la insulina, causando de este modo la patología diabética de tipo 2.

A partir de la base de datos EMBL, 4 de abril de 2002, se conoce una secuencia de ADNc humano que comprende un polinucleótido 07 de la SEC ID Nº: 1. Además, se conoce un vector y células hospedadoras.

Además, en Cronshaw J. M. et al. Journal Cell. Biol. Vol. 158, nº 5, septiembre de 2002, págs. 915-927, se describe una proteína nuclear P30.

Documento de patente 1

Folleto de Publicación Internacional Nº 01/75067.

Documento de patente 2

Memoria descriptiva de la Publicación de Patente de Estados Unidos Nº 2002/0119919.

Documento de patente 3

Folleto de la Publicación Internacional Nº 00/58473.

Documento no de patente 1

The Journal of Biological Chemistry, (Estados Unidos), 1995, Vol. 270, págs. 12953-12956.

Documento no de patente 2

Diabetes Frontier, (Estados Unidos), 1999, Vol. 10, págs. 811-818.

Documento no de patente 3

Diabetes Frontier, (Estados Unidos), 1999, Vol. 10, págs. 819-824.

Documento no de patente 4

The Journal of Clinical Investigation, (Estados Unidos,), 2000, Vol. 106, Nº 2, págs. 165-169.

Documento no de patente 5

The Journal of Biological Chemistry, (Estados Unidos), 1999, Vol. 274, Nº 4, págs. 1865-1868.

Documento no de patente 6

Nature, (Reino Unido), 2001, Vol. 410, Nº 6831, págs. 944-948.

Documento no de patente 7

Molecular and Cellular Biology, (Estados Unidos), 1998, Vol. 18, Nº 2, págs. 872-879.

Documento no de patente 8

The Journal of Biological Chemistry, (Estados Unidos), 2000, Vol. 275, Nº 13, págs. 9131-9135.

Documento no de patente 9

The Journal of Biological Chemistry, (Estados Unidos), 2001, Vol. 276, Nº 9, págs. 6065-6068.

Documento no de patente 10

Molecular and Cellular Biology, (Estados Unidos), 2002, Vol. 22, Nº 11, págs. 3599-3609.

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Descripción de la invención

Los inventores pensaban que la resistencia a la insulina podía mejorarse si se potenciaba la actividad de CAP, basándose en los descubrimientos descritos anteriormente. Además, se imaginó que este objeto puede lograrse por identificación de un factor intracelular que se una a CAP, que es una proteína adaptadora, y controle la acción de CAP, regulando de este modo la acción del mismo. Por consiguiente, los inventores identificaron una proteína que se une a CAP mediante un sistema de doble híbrido en levadura. Por consiguiente, se clonó con éxito un ADNc procedente de un ser humano que tenía una nueva secuencia de nucleótidos que codifica una proteína CAPBP1 (proteína de unión a CAP 1), que se expresa en músculo esquelético, que es un tejido sensible a la insulina. Además, se descubrió que la proteína es un factor causal de una patología diabética en base a los descubrimientos: que el nivel de expresión del ortólogo de ratón de la proteína en tejidos musculares de un ratón de modelo diabético se aumenta extraordinariamente en comparación con el de individuos normales; que cuando la proteína se sobreexpresa en adipocitos, se inhibe la incorporación de azúcar al interior de la célula; y que la proteína interacciona con la proteína GSK3, que es una quinasa, e inactiva a la glucógeno sintasa. Los inventores proporcionan por la presente un nuevo polipéptido que es útil para la detección de un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa, un polinucleótido que codifica el polipéptido, un vector de expresión que comprende el polinucleótido, una célula transformada con el vector de expresión, un método para la detección de un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa, y un método para la producción de una composición farmacéutica para mejorar la resistencia a la insulina y/o mejorar el metabolismo de la glucosa.

Por consiguiente la presente invención se refiere a:

Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a la proteína asociada a c-Cbl (CAP); (b) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se delecionan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP; (c) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o superior con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP; o (d) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP.

Un polinucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos que consiste en la SEC ID Nº: 1 o en la SEC ID
Nº: 3.

Un método para detectar un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa, que comprende:

- dejar que una célula que exprese el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 contacte con una sustancia de ensayo, y

- medir el cambio de la cantidad de expresión del polipéptido.

Un método para detectar un agente que proporciona la inhibición de la unión entre el polipéptido de acuerdo con la descripción anterior y CAP, que comprende

- dejar que el polipéptido contacte con una sustancia de ensayo,

- medir el cambio de la unión entre el polipéptido y CAP y

- seleccionar una sustancia que inhiba la unión.

El método para la detección de acuerdo con lo anterior, en el que el agente que proporciona la inhibición de la unión es un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa.

Se describen secuencias de nucleótidos que tienen una homología con el polinucleótido de la presente memoria descriptiva en del documento de patente 1 al documento de patente 3. En el documento de patente 1 y en el documento de patente 3, se describen numerosas secuencias de nucleótidos, así como la secuencia de 1137 bases o 1515 bases que incluye la secuencia que tiene una homología con el polinucleótido de la presente memoria descriptiva. Aunque se describe que pueden usarse todas ellas en el diagnóstico y la detección, no se describe un uso específico de las secuencias individuales. El documento de patente 2 describe numerosas secuencias de nucleótidos y, entre ellas, se describe una secuencia de 32204 bases que comprende la secuencia que tiene una homología con el polinucleótido de la presente memoria descriptiva. Aunque se describe que está implicada en muchas enfermedades, particularmente en enfermedades alimentarias, no se demuestra ningún soporte experimental. Se describen secuencias que tienen una homología con el polinucleótido y el polipéptido de la presente memoria descriptiva como Nº de entrada AF514992 en la base de datos de secuencias de GenBank y GenPept, sin embargo, no se describe un uso específico de las mismas. Además, el documento de patente 3 describe secuencias que tienen una homología con el polipéptido de la presente memoria descriptiva y se describe que muchas secuencias pueden usarse para el diagnóstico y la detección, de forma similar al polinucleótido mencionado anteriormente. Sin embargo, no se describe en absoluto el uso específico de secuencias individuales. Además, el folleto del documento WO 03/023002 que se publicó después de la fecha de prioridad de la solicitud describe numerosas secuencias que comprenden secuencias que tienen una homología con el polipéptido y polinucleótido de la presente memoria descriptiva, y describe muchos nombres de enfermedades, incluyendo la diabetes, como enfermedades en las que pueden estar implicadas. Sin embargo, actualmente no existe ninguna descripción específica de la obtención de estas secuencias y no se encuentra en absoluto ningún soporte experimental del uso. Por lo tanto, los inventores descubrieron por primera vez el polipéptido y polinucleótido de la presente memoria descriptiva y elucidaron por primera vez que un aumento en la proteína explica la patología diabética. Además, el método para la detección de acuerdo con la presente invención, en el que se utiliza la unión del polipéptido de la presente invención y CAP, se descubrió por los inventores por primera vez.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un dibujo que muestra la comparación del nivel de expresión de CAPBP1 en tejidos musculares en ratones de modelo diabético KKA^{y} y db/db y ratones normales. El eje vertical indica el nivel de expresión relativa en músculo de ratón. Se muestran los resultados de la muestra de ratones C57BL/6J mediante la barra A, de ratones KKA^{y}/Ta mediante la barra B, de ratones C57BL/KsJ-dbm m+/m+ mediante la barra C y de ratones C57BL/KsJ-dbm db/db mediante la barra D.

La Figura 2 es un dibujo que ilustra la inhibición de la actividad de captación de glucosa en adipocitos en los que se sobreexpresa CAPBP1. El eje vertical en la figura indica la cantidad de incorporación (cpm) de 2-desoxi-glucosa y el eje horizontal indica la concentración de insulina.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención se explicará en detalle a continuación.

El polipéptido y el polinucleótido de la presente memoria descriptiva, que tienen una propiedad de unirse a CAP y que aumentan en su cantidad de expresión en afecciones diabéticas, son útiles en el diagnostico de la diabetes. Además, el polipéptido, el polinucleótido, el vector de expresión y la célula de la presente memoria descriptiva son útiles en la detección de un agente para tratar la diabetes. El diagnóstico de la diabetes se permite mediante la utilización de un cebador para PCR que puede detectar el polinucleótido de la presente memoria descriptiva.

Polipéptido de la presente invención

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención incluyen:

(1) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4;

(2) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP, o un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se delecionan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5 y, aun más preferiblemente, de 1 a 3) aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP (en lo sucesivo, denominado como producto modificado equivalente funcional); y

(3) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología del 90% o superior con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que es una proteína que se une a CAP (en lo sucesivo, denominado como polipéptido homólogo).

El polipéptido homólogo de la presente invención no está particularmente limitado siempre que consista en una secuencia de aminoácidos que tenga una homología del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y sea un polipéptido que se una a CAP y es, preferiblemente, un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de preferiblemente el 95% o más y se prefiere, aún más preferiblemente, del 98% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4. Por referencia, el término "homología" en la presente memoria descriptiva significa el valor de identidades obtenidas usando un parámetro proporcionado por defecto de acuerdo con la búsqueda en el programa Clustal (Higgins y Sharp, Gene 73, 237-244, 1988; Thomson et al. Nucl. Acids Res. 22, 4673-4680, 1994). Los parámetros se describen a continuación:

K tuple 1

Penalización por huecos 3

Ventana 5

Diagonales salvadas 5

como Parámetros de Alineamiento en Parejas.

Además, el polipéptido de la presente invención también incluye a los procedentes de otros vertebrados (por ejemplo, ratón, rata, conejo, caballo, oveja, perro, mono, gato, oso, cerdo, pollo y similares).

Polinucleótido de la presente invención

El polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 ó 3.

Los métodos artificiales que conducen a la producción del mutante como se ha descrito anteriormente incluyen, por ejemplo, procedimientos de ingeniería genética tales como métodos de sustitución de bases específicas (Methods in Enzymology, (1987) 154, 350, 367-382), así como medios sintéticos químicos tales como métodos de triéster del ácido fosfórico y método de fosfato de amidida (Science (1968) 165, 178). Por combinación de estos, puede obtenerse un ADN acompañado de una sustitución deseada de una base. Como alternativa, se permite provocar la sustitución de una base inespecífica en una molécula de ADN por una operación de repetición de un método de PCR, o dejando que exista ión manganeso o similar en el líquido de reacción.

El polinucleótido y el polipéptido de la presente memoria descriptiva pueden producirse y obtenerse fácilmente por un procedimiento de ingeniería genética general en base a la información de secuencia descrita de acuerdo con la presente memoria descriptiva.

El polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente memoria descriptiva puede obtenerse, por ejemplo, de la forma siguiente, y no se limita a la misma. Además, puede obtenerse por un procedimiento conocido como en "Molecular Cloning", Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Por ejemplo, puede ilustrarse (1) un método en el que se use PCR, (2) un método en el que se use un procedimiento de ingeniería genética general (es decir, un proceso de selección de una cepa transformada que incluye un aminoácido deseado entre cepas transformadas que se han transformado con una genoteca de ADNc) o (3) un proceso de síntesis química. Cada método para la producción puede llevarse a cabo de forma similar a la que se describe en el documento WO 01/34785.

En el proceso en el que se utiliza PCR, el polinucleótido descrito en la presente memoria descriptiva puede producirse de acuerdo con el procedimiento descrito en, por ejemplo 1) un método de producción de un gen proteico, a) el primer método de producción en el "Modo de llevar a cabo la invención" del documento de patente anterior. En la descripción, los ejemplos de la "célula o tejido humano que tiene una capacidad para producir la proteína de la invención" incluyen, por ejemplo, músculo esquelético humano. Se extrae ARNm de músculo esquelético humano. Después, se lleva a cabo una reacción con transcriptasa inversa con el ARNm en presencia de un cebador aleatorio o un cebador de oligo dT para sintetizar una primera cadena de ADNc. Por lo tanto, la primera cadena de ADNc resultante se somete a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando dos clases de cebadores que tienen una región parcial de interposición del gen deseado interpuesto, por lo tanto, capaces de obtener el polinucleótido de la presente invención o una parte del mismo. Más específicamente, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede producirse de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1.

En el método en el que se usa un procedimiento de ingeniería genética de rutina, por ejemplo, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención puede producirse de acuerdo con el procedimiento descrito en, por ejemplo, 1) un método de producción de un gen proteico, b) el segundo método de producción en el "Modo de llevar a cabo la invención" del documento de patente anterior.

En el proceso en el que se utiliza un método de síntesis química, por ejemplo, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente memoria descriptiva puede producirse de acuerdo con el procedimiento descrito en, por ejemplo, 1) un método de producción de un gen proteico, c) el tercer método de producción o d) el cuarto método de producción en el "Modo de llevar a cabo la invención" del documento de patente anterior.

A través de la utilización de la secuencia de nucleótidos parcial o completa resultante del polinucleótido de la presente invención, puede detectarse específicamente el nivel de expresión del polinucleótido de la presente invención en individuos o en diversos tejidos.

Los ejemplos de método de dicha detección incluyen métodos de RT-PCR (transcripción inversa/reacción en cadena de la polimerasa), análisis de transferencia de Northern, hibridación in situ y similares. El cebador para usar en la detección del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente memoria descriptiva por RT-PCR no está particularmente limitado, siempre que pueda amplificar específicamente el polinucleótido solo y que puede determinarse de forma apropiada en base a la información de secuencia del polinucleótido de la presente invención. El cebador que amplifica específicamente el polinucleótido de la presente invención puede utilizarse como un cebador específico y una sonda específica para detectar el polinucleótido de la presente invención.

Vector y célula de expresión

El polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente memoria descriptiva, obtenido como se ha descrito anteriormente, puede utilizarse para la expresión del polipéptido de la presente invención in vitro o en células de ensayo por ligación cadena abajo de un promotor apropiado, de acuerdo con el método descrito en "Molecular Cloning" (Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) y similares.

En concreto, la adición del polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente memoria descriptiva, obtenido como se ha descrito anteriormente, cadena abajo de un polinucleótido que incluye una secuencia promotora en particular permite la expresión del polipéptido de la presente invención por medio de la transcripción y traducción del gen en un sistema sin células, usando este producto como molde.

Como alternativa, cuando el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente memoria descriptiva descrito anteriormente se incorpora en un plásmido vector apropiado, seguido de la introducción en la forma de un plásmido en el interior de una célula hospedadora, se permite la expresión del polipéptido de la presente invención en la célula. De otra forma, puede obtenerse y usarse una célula que tiene un ADN cromosómico con dicha construcción incorporada en la misma. Más específicamente, un fragmento que incluye un polinucleótido aislado puede usarse para transformar células hospedadoras eucariotas y procariotas a través de la incorporación en un plásmido vector apropiado de nuevo. Además, a través de la introducción de un promotor apropiado y una secuencia implicada en la expresión fenotípica en dicho vector, se permite la expresión del polipéptido de la presente invención en cada célula hospedadora. La célula hospedadora no está particularmente limitada y puede ser una cualquiera siempre que se permita la detección de la cantidad de expresión del polipéptido de la presente invención a nivel del ARN mensajero o a nivel de proteína. Se prefiere más que se use como la célula hospedadora una célula procedente de grasa o una célula procedente de músculo que sea rica en CAP endógeno.

Puede llevarse a cabo un proceso para transformar la célula hospedadora para permitir que el gen se exprese de acuerdo con el método descrito en, por ejemplo, 2) el método de producción de vector, célula hospedadora y proteína recombinante de la presente invención en el "Modo para llevar a cabo la invención" del documento de patente anterior. El vector de expresión no está particularmente limitado siempre que se incluya un polinucleótido deseado. Los ejemplos del vector incluyen un vector de expresión obtenido por inserción de un polinucleótido deseado en un vector de expresión conocido seleccionado apropiadamente dependiendo de la célula hospedadora. La célula de la presente memoria descriptiva puede obtenerse, por ejemplo, por transfección de una célula hospedadora deseada con el vector de expresión mencionado anteriormente. Más específicamente, puede obtenerse un vector de expresión de una proteína deseada, por ejemplo, por incorporación de un polinucleótido deseado en un vector de expresión pcDNA 3.1 en células animales de mamíferos, como se describe en el Ejemplo 2, y la célula transformada de la presente memoria descriptiva puede producirse dejando que el vector de expresión se incorpore en células COS-1 mediante el uso de un reactivo de lipofectamina.

La célula transformada deseada obtenida como se ha descrito anteriormente puede cultivarse de acuerdo con un procedimiento común, y la proteína deseada se produce por el cultivo. Como el medio usado para el cultivo puede seleccionarse apropiadamente cualquier tipo que se use comúnmente dependiendo de la célula hospedadora empleada. Por ejemplo, en el caso de la célula COS-1, puede usarse medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con un componente de suero tal como suero fetal bovino (FBS) al que se añade G418.

Mediante el cultivo de la célula de la presente memoria descriptiva, el polipéptido de la presente invención producido en las células puede detectarse, identificarse cuantitativamente y, además, purificarse. El polipéptido de la presente invención puede detectarse y purificarse mediante, por ejemplo, un método de transferencia de Western o un método de inmunoprecipitación en el que se usa un anticuerpo que se une al polipéptido de la presente invención. Como alternativa, dejando que el polipéptido de la presente invención se exprese como una proteína de fusión con una proteína marcadora apropiada, tal como glutatión-S-transferasa (GST), proteína A, \beta-galactosidasa o proteína de unión a maltosa (MBP), el polipéptido de la presente invención puede detectarse mediante un método de transferencia de Western o un método de inmunoprecipitación, usando un anticuerpo específico para la proteína marcadora y puede purificarse utilizando la proteína marcadora. De otro modo, la purificación también puede llevarse a cabo por cualquiera de diversos métodos de separación que utilizan una propiedad física o propiedad química de la proteína, si se desea. En concreto, puede usarse la utilización de ultrafiltración, centrifugación, filtración en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía líquida de alto rendimiento.

El polipéptido de la presente invención puede producirse de acuerdo con un procedimiento de síntesis química común en base a la información de la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4. En concreto, pueden incluirse procedimientos de síntesis de péptidos por un método en fase líquida y en fase sólida. Tras la síntesis, los aminoácidos pueden unirse de una forma seriada uno por uno o pueden unirse después de sintetizar un fragmento peptídico que consiste en varios aminoácidos. El polipéptido de la presente invención obtenido de esta forma puede purificarse de acuerdo con uno cualquiera de diversos métodos descritos anteriormente.

Método para la detección de la presente invención

Un método para la detección de una sustancia que tiene una actividad para mejorar el metabolismo de la glucosa puede construirse usando el polipéptido de la presente invención, en el que se usa un cambio en la unión entre CAP y c-Cbl como un marcador que utiliza la interacción del polipéptido de la presente invención con CAP.

Se puso de manifiesto que el polipéptido de la presente invención controla negativamente la señal de la insulina a través de la unión con CAP a partir de los descubrimientos de que: CAPBP1, que es uno de los polipéptidos de la presente invención, se une a CAP; la expresión del ortólogo de ratón se potencia en ratones de modelo diabético; y la incorporación de azúcar se inhibe en adipocitos en los que se permite la sobreexpresión de CAPBP1. Por lo tanto, la detección de un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa puede llevarse a cabo por el método para la detección mencionado anteriormente.

En una realización del método para la detección como se ha descrito anteriormente, se proporciona un método para la detección de una sustancia que tiene una actividad para mejorar el metabolismo de la glucosa en el que se usa una célula de ensayo que expresa una región de longitud parcial o completa del polipéptido de la presente invención, seguido de permitir que la célula de ensayo coexista con una sustancia de ensayo, y después se usa el cambio cuantitativo o cualitativo de la unión entre CAP y c-Cbl causado por la sustancia de ensayo en la célula de ensayo como un marcador.

La sustancia de ensayo para el uso en el método para la detección de la presente invención no está particularmente limitada e incluye compuestos como los disponibles en el mercado que incluyen péptidos, diversos compuestos conocidos introducidos en Archivos Químicos que incluyen péptidos, compuestos obtenidos por técnicas de química combinatoria (N. Terrett et al., Drug Discov. Today, 4 (1): 41, 1999), cultivo de sobrenadantes de microorganismos, elementos naturales obtenidos de plantas u organismos marinos, extractos de tejidos animales o compuestos químicamente o biológicamente modificados que incluyen péptidos de los compuestos que incluyen péptidos seleccionados por el método para la detección de la presente invención.

Aunque el método para la detección, como se ha descrito anteriormente, no está particularmente limitado, en concreto se muestran los siguientes métodos para la detección.

1) Método para la detección en el que se utiliza la unión entre el polipéptido de la presente invención y CAP

Puesto que el polipéptido de la presente invención controla negativamente la señal de la insulina a través de la unión a CAP, se usa el siguiente método para la detección en el que se usa como un marcador la unión entre el polipéptido de la presente invención y CAP. En concreto, una célula de ensayo que expresa una región de longitud parcial o completa del polipéptido de la presente invención, o una región de longitud parcial o completa del polipéptido de la presente invención fusionada a un marcador tal como GST, Flag o HIS se trata o no con la sustancia de ensayo. Las células de ensayo son preferiblemente células sensibles a la insulina y, más específicamente, se prefieren adipocitos, células hepáticas o células procedentes de músculo esquelético. La inmunoprecipitación de la célula usando un anticuerpo anti-CAP permite la concentración de la proteína CAP y de la proteína unida a la misma. Se desea que la misma sustancia de ensayo que la que se usa para el tratamiento de la célula descrita anteriormente se incluya en el líquido de reacción en esta etapa de concentración. El líquido concentrado del CAP y de la proteína de unión al mismo se separa por un método de electroforesis en gel de poliacrilamida de acuerdo con un proceso conocido y, después, se mide la cantidad del polipéptido de la presente invención por transferencia de Western usando un anticuerpo. Por consiguiente, puede seleccionarse una sustancia de ensayo que inhiba la unión entre el polipéptido de la presente invención y CAP. Los ejemplos del anticuerpo que puede usarse en la presente memoria incluyen anticuerpos contra el polipéptido de la presente invención producidos con el polipéptido de la presente invención o con una secuencia parcial del mismo (por ejemplo, anticuerpos anti-CAPBP1), o anticuerpos que reconozcan el marcador. Además, de forma similar al proceso descrito anteriormente, también puede seleccionarse una sustancia de ensayo que inhiba la unión entre CAP y el polipéptido de la presente invención por combinación de un método de precipitación in vitro, en el que se usa una proteína CAP purificada a través del marcado, tal como con GST (Experimental engineering (Zikken Kogaku), Vol. 13, Nº 6, 1994, págs. 528, Matsushime et al.), del extracto celular que expresa el polipéptido de la presente invención al que se añade o no una sustancia de ensayo, y una transferencia de Western similar a la descrita anteriormente. Como alternativa, sin el uso de un extracto celular que exprese el polipéptido de la presente invención, una sustancia de ensayo que inhiba la unión entre CAP y el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, CAPBP1) puede seleccionarse también de una forma similar en casos en los que se use una mezcla de proteína producida por la transcripción y traducción directa in vitro de una proteína que es el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, proteína CAPBP1) usando un kit de TNT (Promega Corporation) a partir de un plásmido de expresión del polipéptido de la presente memoria descriptiva (por ejemplo, plásmido de expresión de CAPBP1 producido en el Ejemplo 1 (5)), a la que se añade o no una sustancia de ensayo. De acuerdo con uno cualquiera de estos métodos, se permite la detección de muchas sustancias de ensayo llevando a cabo una transferencia de Western puntual conocida sin el uso de un método de electroforesis en poliacrilamida. Además, es posible la detección para seleccionar una sustancia de ensayo que inhiba la unión entre CAP y el polipéptido de la presente invención de acuerdo con un método de ELISA conocido, que comprende la adición de una sustancia de ensayo a un lisado celular en el que se expresen al mismo tiempo el polipéptido de la presente invención después de la fusión con un marcador y CAP. Además, utilizando un sistema de doble híbrido (Clontech) en una célula de mamífero conocida, puede detectarse y seleccionarse una sustancia de ensayo que inhiba la unión entre CAP y el polipéptido de la presente invención a partir de una gran población, mediante la disposición de CAP fusionado a una región de unión a ADN de GAL4 como un cebo y el polipéptido de la presente invención fusionado a una región promotora de la transcripción de VP16 en el lado de presa, mediante la detección de CAT preexistente o una actividad luciferasa.

2) Método para la detección en el que se utiliza la medición de la cantidad de expresión del polipéptido de la presente invención

El método para la detección de un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa puede incluir un método para la detección mediante la medición de la cantidad de expresión del polipéptido de la presente invención, además del método descrito en el párrafo anterior (1). A partir de los descubrimientos de que la expresión del ortólogo de ratón de CAPBP1 se estimula en ratones de modelo diabético (Ejemplo 4), y de que se disminuye la incorporación de azúcar en los adipocitos que sobreexpresan CAPBP1 (Ejemplo 6), se espera que una sustancia de ensayo tenga una actividad para mejorar la resistencia a la insulina cuando la cantidad de expresión de CAPBP1 endógeno pueda reducirse por la sustancia de ensayo. En concreto, dicha sustancia puede seleccionarse por el método siguiente.

En primer lugar, puede prepararse ARN a partir de una célula tratada o no tratada con una sustancia de ensayo, de acuerdo con el método que se demuestra en el Ejemplo 4 (1). Las células son preferiblemente células sensibles a insulina y, más específicamente, se prefieren adipocitos, células hepáticas o células procedentes de músculo esquelético. Después de separar el ARN mediante electroforesis en gel de agarosa del líquido de la preparación de ARN de acuerdo con un método conocido, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa que se analiza mediante un análisis de transferencia de Northern usando una sonda de ADN de cadena corta marcada que incluye una secuencia del polinucleótido de la presente memoria descriptiva, por lo que se permite la detección del cambio de la cantidad de expresión de ARN que tiene una secuencia del polinucleótido de la presente memoria descriptiva causado por la sustancia de ensayo. Por consiguiente, puede llevarse a cabo la detección de una sustancia, que suprime la cantidad de expresión del polipéptido de la presente invención, entre una población de sustancias de ensayo. De otro modo, también puede detectarse cuantitativamente un cambio de la cantidad de expresión del ARN que tiene una secuencia del polinucleótido de la presente memoria descriptiva causado por una sustancia de ensayo mediante un método de PCR a tiempo real, usando un cebador de ADN de cadena corta que incluye una secuencia del polinucleótido de la presente memoria descriptiva. Más específicamente, la PCR a tiempo real puede llevarse a cabo por el método descrito en el Ejemplo 4. Por consiguiente, puede llevarse a cabo la detección de una sustancia que suprime la cantidad de expresión del polipéptido de la presente invención entre una población de sustancias de ensayo. El polinucleótido de la presente memoria descriptiva puede usarse en el método para la detección.

Método de producción de una composición farmacéutica para mejorar la resistencia a la insulina y/o mejorar el metabolismo de la glucosa

Pueden prepararse formulaciones que contienen la sustancia obtenida por el método para la detección de la presente memoria descriptiva como un ingrediente activo, dependiendo del tipo del ingrediente activo, usando un vehículo, un excipiente y/o otros aditivos que se usan habitualmente para la formulación.

La administración puede ser, por ejemplo, administración por vía oral mediante un comprimido, píldora, cápsula, gránulo, gránulo fino, polvos o formulación líquida o similar para administración oral, o puede ser una administración por vía parenteral mediante una inyección, por ejemplo, con una inyección intravenosa, inyección intramuscular o inyección intraarticular, un supositorio, una preparación para administración transcutánea o una preparación para administración transmucosa. En particular, en casos de péptidos que se digieren en el estómago, se prefiere la administración por vía parenteral, tal como una inyección intravenosa.

Las composiciones sólidas para administración por vía oral pueden incluir una o más sustancias activas y al menos un diluyente inerte mezclado con las mismas tal como, por ejemplo, lactosa, manitol, glucosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa, almidón, polivinilpirrolidona o aluminometasilicato de magnesio. La composición puede contener aditivos distintos del diluyente inerte, tales como, por ejemplo, un lubricante, un disgregante, un agente estabilizante o un solubilizante o agente solubilizante, de acuerdo con un método conocido. Los comprimidos o píldoras pueden recubrirse con una película tal como un recubrimiento de azúcar, o gástrico o entérico si es necesario.

Las composiciones líquidas para administración por vía oral pueden incluir, por ejemplo, emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes o elixires y pueden contener un diluyente inerte usado en general, por ejemplo, agua purificada o etanol. La composición puede contener aditivos distintos del diluyente inerte tales como, por ejemplo, un agente humectante, un agente de suspensión, edulcorantes, un aromatizante o antiséptico.

Las inyecciones para administración por vía parenteral pueden incluir soluciones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas asépticas. Las soluciones o suspensiones solubles en agua pueden incluir, por ejemplo, agua destilada para inyección, solución salina fisiológica o similar como un diluyente. Como el diluyente de soluciones o suspensiones insolubles en agua, por ejemplo, puede incluirse propilenglicol, polietilenglicol, un aceite vegetal (por ejemplo, aceite de oliva), un alcohol (por ejemplo, etanol), polisorbato 80 o similar. La composición puede incluir además un agente humectante, un agente emulsionante, un dispersante, un agente estabilizante, un solubilizante o agente solubilizante o un conservante. La composición puede esterilizarse mediante, por ejemplo, filtración por paso a través de un filtro para eliminar bacterias, mezcla con un bactericida o irradiación. Además, cuando se produce y se usa una composición sólida estéril, puede disolverse en agua estéril u otro medio estéril para inyección y puede usarse.

La dosis puede determinarse apropiadamente tomando en cuenta la intensidad de la actividad del ingrediente activo, es decir, la sustancia obtenida de acuerdo con el método para la detección de la presente invención, síntomas, edad del sujeto al que se va a administrar o sexo.

Por ejemplo, en el caso de una administración oral, la dosis puede ser habitualmente de aproximadamente 0,1 a 100 mg y, preferiblemente, de 0,1 a 50 mg por adulto (postulando que el peso corporal sea de 60 kg) por día. En casos de administración parenteral, la dosis puede ser de 0,01 a 50 mg y, preferiblemente, de 0,01 a 10 mg por día en la forma de dosificación de una inyección.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se explica en detalle mediante Ejemplos. A menos que se indique específicamente, la presente invención puede llevarse a cabo de acuerdo con un método conocido ("Molecular Cloning", Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y similares). Además, cuando se usa un reactivo o kit disponible en el mercado, puede llevarse a cabo de acuerdo con el protocolo adjunto al producto comercial.

Ejemplo 1 Clonación del gen CAPBP1 y construcción del vector de expresión (1) Clonación de CAP

Con respecto a una secuencia de ADNc que codifica una región de longitud completa de CAP de ratón (proteína asociada a c-Cbl) descrita como Nº de entrada U58883 de la base de datos de genes GenBank, se diseñaron los siguientes cuatro oligonucleótidos denominados mCAP-5HS, mCAP-1, mCAP-2 y mCAP-3SE como cebadores (SEC ID Nº: 5 a 8). Para mCAP-5HS, se añade un sitio para la enzima de restricción HindIII y para mCAP-3SE, se añade un sitio para la enzima de restricción EcoRI en el extremo 5' de cada cebador.

Se preparó el ARN total a partir del músculo esquelético de ratones C57BL/6J macho de 15 semanas de edad (CLEA Japan, Inc) y se produjo ADNc de cadena sencilla mediante transcripción inversa para usar como un molde de PCR para la clonación del gen de CAP. El ARN total se preparó usando un reactivo para extraer el ARN (Isogen: NIPPON GENE CO., LTD.) de acuerdo con el manual de instrucciones. Por lo tanto, el ARN total preparado se trató después con desoxirribonucleasa (NIPPON GENE CO., LTD.), seguido de tratamiento con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. El precipitado se disolvió en agua estéril. La transcripción inversa de ARN total a ADNc de cadena sencilla se llevó a cabo con 1 \mug del ARN total usando un kit para una reacción de transcripción inversa (Advantage^{TM}, RT-for-PCR Kit; Clontech) en un sistema de 20 \mul.

Se amplificó un gen que codifica para una mitad N-terminal de CAP con una combinación de cebadores de la SEC ID Nº: 5 y la SEC ID Nº: 6 y se amplificó un gen que codifica para una mitad de C-terminal de CAP con una combinación de cebadores de la SEC ID Nº: 7 y la SEC ID Nº: 8 usando PCR, respectivamente. La PCR se realizó en un sistema de reacción de 50 \mul de volumen total usando 5 \mul del ADNc de cadena sencilla, 0,5 \mul de Pyrobest ADN polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.) y 50 pmol de cada uno de los cebadores. Las condiciones de temperatura para permitir la reacción eran: dejar que se mantuviera a 95ºC durante 3 minutos, seguido de una repetición de 40 ciclos de la etapa que consiste en tres etapas de 98ºC durante 10 s, 60ºC durante 30 s y 74ºC durante 90 s y, por último, 74ºC durante 7 min.

Después, el fragmento amplificado se subclonó en un plásmido pZEr0-2.1 (Invitrogen Corporation) digerido con una enzima de restricción EcoRV. La secuencia de nucleótidos del fragmento génico subclonado se determinó usando un secuenciador (ABI 3700 DNA sequencer, Applied Biosystems, Inc.) y se confirmó que era idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita.

Tanto el extremo 3' del fragmento génico que codifica la mitad N-terminal como el extremo 5' del fragmento génico que codifica la mitad C-terminal amplificados por PCR tenían un sitio para una enzima de restricción SacI, que es el único sitio presente endógenamente en el gen de CAP. Por lo tanto, el fragmento génico que codifica la mitad N-terminal podía obtenerse usando las enzimas de restricción HindIII y SacI, y el fragmento génico que codifica la mitad C-terminal podía obtenerse usando las enzimas de restricción SacI y EcoRI, de los plásmidos subclonados, respectivamente. La longitud completa del gen de CAP de ratón podía clonarse ligándolos simultáneamente con un plásmido pcDNA3.1 (+) (Invitrogen Corporation) digerido con las enzimas de restricción HindIII y EcoRI.

(2) Producción de plásmido de expresión para ensayo de doble híbrido en levadura

Para insertar el ADNc de CAP de ratón en un vector de expresión pDBtrp para el ensayo de doble híbrido en levadura (Invitrogen Corporation), se diseñaron los cebadores representados por la SEC ID Nº: 9 y 10 para dar una secuencia génica de CAP de ratón a la que se añadió una región homóloga con 40 nucleótidos anteroposteriormente al sitio de clonación múltiple del vector pDBtrP en el extremo 5' y en el extremo 3', respectivamente. La PCR se llevó a cabo con el plásmido de CAP de ratón, clonado como se ha descrito anteriormente, como un molde usando una ADN polimerasa (Pyrobest ADN Polimerasa; Takara Shuzo Co., Ltd.) a 98ºC durante un 1 min, seguido de la repetición de 35 ciclos de 98ºC durante 5 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 5 min. Por lo tanto, el fragmento de ADN resultante tiene la región codificante completa del gen de CAP de ratón.

El vector pDBtrp linealizado por digestión con las enzimas de restricción SalI y NcoI y el fragmento de PCR que incluía el ADNc de CAP de ratón obtenido como se ha descrito anteriormente se añadieron al mismo tiempo a una cepa de levadura MaV203 para un ensayo de doble híbrido (Invitrogen Corporation) y se transformaron con un método de acetato de litio (Guthrie C. y Fink R., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic, San Diego, 1991). Como resultado, se provocó una recombinación homóloga en el interior de las células de levadura, formando de este modo un plásmido de pDBtrP que tiene el ADNc de CAP de ratón insertado en el sitio de clonación múltiple (en lo sucesivo, abreviado como pDB-CAP). Las células de levadura que tienen el plásmido se seleccionaron por cultivo en un medio mínimo sintético sólido (DIFCO) (agarosa al 20%) que carece de triptófano, que es un marcador de selección del plásmido. Las células de levadura se trataron con Zymoliasa (Sikagaku Corporation) a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido del aislamiento y purificación del plásmido con un método alcalino. La secuencia de nucleótidos del plásmido se determinó usando un kit de secuenciación (Applied Biosystems, Inc.) y un secuenciador (ABI 3700 DNA sequencer Applied Biosystems, Inc.) y se seleccionó uno que tenía el ADN de CAP en el que la región codificante de la región de unión a ADN GAL4 de pDEtrp estaba insertada conforme a la fase de lectura de traducción.

(3) Detección de doble híbrido en levadura

La cepa de levadura MaV203 para ensayo de doble híbrido transformada con el pDB-CAP mencionado anteriormente se suspendió en 400 ml de medio líquido YPD (DIFCO) y se cultivó a 30ºC durante aproximadamente 6 horas hasta que la absorbancia a una longitud de onda de 590 nm se vuelve de 0,1 a 0,4. Después, se llevó a cabo el método de acetato de litio para obtener células competentes y la cantidad final de las células se suspendió en 1,0 ml de un tampón Tris con litio 0,1 M. Las células se transformaron con cada 20 \mug de una genoteca de ADNc de músculo esquelético humano (Clontech, genoteca de ADNc Match Maker) y las células se seleccionaron por cultivo en un medio mínimo sintético sólido (DIFCO) (agarosa al 20%) que carecía de triptófano y leucina, que son marcadores de selección del plásmido de pDB-CAP y de la genoteca, respectivamente, para obtener una cepa transformada que tiene ambos plásmidos introducidos. Al mismo tiempo, para las mismas células transformadas, se eliminó la histidina del medio además del triptófano y la leucina para seleccionar células en las que estuviese operativo un gen indicador HIS3 que se expresa cuando una proteína de fusión de una región promotora de la transcripción GAL4 se une a una proteína de fusión de una región de unión a ADN GAL4 artificialmente expresada en un sistema de doble híbrido. Además, las células transformadas se cultivaron en un medio mínimo sólido (agarosa al 20%) suplementado con 3AT 20 mM (3-amino-1,2,4-triazol; Sigma), que es un inhibidor de la enzima codificado por HIS3 a 30ºC durante 5 días. En las mismas condiciones, se obtuvo una colonia de levaduras resistentes a 3AT que mostraban la expresión de una proteína que se une a CAP. Después del cultivo de estas células de levadura en un medio sólido YPD durante 24 horas, se examinó la expresión de un gen lacZ, que es un indicador que indica la unión en el sistema de doble híbrido que es diferente de HIS3 con la actividad \beta-galactosidasa como un marcador. En relación con la actividad \beta-galactosidasa, las células de levadura sobre el medio se transfirieron a un filtro de nitrocelulosa, se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y, posteriormente, se descongelaron a temperatura ambiente. El filtro se colocó en un papel de filtro que se había empapado en una solución de X-GAL (Sigma) al 0,4% y se dejó reposar a 37ºC durante 24 horas. Por consiguiente, se midió un cambio del color a azul debido a la \beta-galactosidasa. Mediante la selección de la colonia que incluía el contenido celular transferida sobre el filtro que tenía el color cambiado de blanco a azul, se determinaron las células de levadura que expresaban la proteína unida a CAP, y el plásmido procedente de la genoteca se extrajo de las células de acuerdo con el método en Yeast Protocols Handbook, Clontech. Como resultado de la determinación de la secuencia de nucleótidos del fragmento génico incluido en el mismo usando la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11 (secuencia unida a la región AD de GAL4; Nº de entrada de GenBank U29899, obtenida del vector de clonación pACT2) como un cebador, un kit de secuenciación (Applied Biosystems, Inc.) y un secuenciador (ABI 370 DNA sequencer, Applied Biosystems, Inc.), se confirmó que se incluyeron un clon que contenía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 y dos clones que contenían la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 3, que tenía una inserción de 9 bases desde la posición 64 de la SEC ID Nº: 1.

(4) Clonación de ADNc de longitud completa del gen CAPBP1

Como resultado del párrafo anterior (3), cada uno de los plásmidos que tenían un fragmento génico que contenía la longitud completa de la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 ó 3, y un plásmido que contenía una secuencia posterior a la base de la posición 16 en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 se obtuvieron a partir de la genoteca de ADNc, respectivamente. Por consiguiente, se sugirió la presencia de un factor que se une a CAP. Después, se sintetizó un cebador que tenía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 12 que se corresponde con una cadena complementaria de una secuencia de nucleótidos desde la posición 525 hasta la posición 504 de la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 (Proligo LLC) y se intentó la amplificación de un ADNc de longitud completa con un método de PCR a partir de una genoteca de ADNc procedente de músculo esquelético, como se ha descrito anteriormente, usando el cebador y un cebador que tiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11. La reacción de PCR se llevó a cabo usando una ADN polimerasa (TAKARA LA Taq; Takara Shuzo Co., Ltd.) a 94ºC durante 3 min, seguido de la repetición de 35 ciclos de 94ºC durante 30 s, 58ºC durante 1,5 min y 72ºC durante 4 min. Después, se llevó a cabo una PCR adicional en las mismas condiciones usando el producto de PCR como molde. Como resultado de la separación del producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, se confirmó la amplificación de un fragmento de ADN de aproximadamente 600 pares de bases. Por lo tanto, el fragmento de ADN en el líquido de reacción se clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1/V5-His-TOPO; Invitrogen Corporation) usando el sistema de clonación TOPO TA (Invitrogen Corporation). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN insertado en el plásmido resultante usando un cebador unido a una región promotora T7 en el vector (TOPO TA Cloning kit/Invitrogen Corporation; SEC ID Nº: 13), un kit de secuenciación (Applied Biosystems, Inc.) y un secuenciador (ABI 3700 DNA Sequencer, Applied Biosystems, Inc.). Por consiguiente, se confirmó un clon que contenía la secuencia de ADN representada por la SEC ID Nº: 1 ó 3 y se descubrió la adición de un fragmento de ADN de aproximadamente 250 pares de bases adicionalmente cadena arriba del extremo 5' de la SEC ID Nº: 1 ó 3. Sin embargo, de acuerdo con un triplete del ADN que codifica la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4, no se descubrió otro codón de inicio cadena arriba del primer ATG (codón de inicio) de la SEC ID Nº: 1 y 3 y estaba presenta un triplete del codón de terminación. Por consiguiente, se definió la fase de lectura abierta del gen representado por las SEC ID Nº: 1 y 3. El gen se denominó como gen de CAPBP1.

(5) Producción de vector de expresión de CAPBP1

De acuerdo con la información de la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 y 3, se amplificó un ADNc de CAPBP1 que codifica la proteína CAPBP1 neta mediante un método de PCR usando la SEC ID Nº: 14 y la SEC ID Nº: 12, a partir de un plásmido que contiene una secuencia de longitud completa del gen CAPBP1 obtenido en el párrafo anterior (4). Estas dos clases de cebadores de ADN tenían secuencias de nucleótidos que son homólogas a una parte del extremo 5' y del extremo 3' del gen de CAPBP1 representado por la SEC ID Nº: 1 ó 3, respectivamente. El cebador representado por la SEC ID Nº: 12 se diseñó de tal modo que se eliminó la secuencia del codón de terminación de CAPBP1 en un intento de permitir que un epítopo V5 procedente del vector (procedente de la proteína V de paramixovirus SV5, Southern J A (1991) J. Gen. Virol., 72, 1551-1557, 1991) y un marcador His6 (Lindner P (1997) BioTechniques 22, 140-149) sigan con la misma fase de lectura que un triplete del gen de CAPBP1 en su 3' después de la clonación. La reacción de PCR se llevó a cabo usando una ADN polimerasa (TAKARA pyrobest; Takara Shuzo Co., Ltd.) a 98ºC durante 1 min, seguido de la repetición de 40 ciclos de 98ºC durante 5 s, 58ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min. Por lo tanto, los fragmentos de ADN resultantes que contenían ADNc de CAPBP1 de 525 pares de bases y 534 pares de bases, respectivamente, se clonaron en el vector de expresión mencionado anteriormente pcDNA3.1/V5-His-TOPO. Las secuencias de nucleótidos del fragmento de ADN insertado de este modo en el plásmido resultante se determinaron de una forma similar al párrafo anterior (4). Por consiguiente, se confirmó que se insertaban los ADN que excluían los codones de terminación del extremo 3' de las secuencias de ADN representadas por la SEC ID Nº: 1 y 3, respectivamente. En lo sucesivo, el plásmido de expresión que contiene la secuencia de la SEC ID Nº: 1 se abrevia como pcDNA-CAPBP1 (-), y el que contiene la secuencia de la SEC ID Nº: 3 se abrevia como pcDNA-CAPBP1 (+3) entre estos plásmidos de expresión.

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Ejemplo 2 Producción de células en cultivo que expresan proteína CAPBP1 (1) Producción de una célula que expresa CAPBP1

Los plásmidos de expresión pcDNA-CAPBP1 (-) y pcDNA-CAPBP1 (+3) producidos en el Ejemplo 1 anterior (5) se introdujeron en células COS-1, respectivamente. Las células COS-1 se cultivaron hasta que tuvieron un estado de confluencia del 70% por adición de 2 ml de un medio esencial mínimo DMEM (GIBCO) suplementado con suero fetal bovino al 10% (Sigma) en cada pocillo de la placa de cultivo de una placa de cultivo de 6 pocillos (diámetro de pocillo de 35 mm). Las células se transfectaron de forma transitoria con pcDNA-CAPBP1 (-) o pcDNA-CAPBP1 (+3) (1,0 \mug/pocillo) mediante un método de fosfato de calcio (Gram et al., Virology, 52, 456, 1973; Naoko Arai, Gene introduction and expression/Analytical method (Kaiseki hou) págs. 13-15, 1994). Después del cultivo durante 48 horas, se retiró el medio y las células se lavaron con un tampón fosfato (en lo sucesivo, abreviado como PBS). Después, las células se lisaron por adición de 0,1 ml de una solución de lisis celular (fosfato de potasio 100 mM (pH 7,8), Triton X-100 al 0,2%) por pocillo.

(2) Detección de proteína CAPBP1

A 10 \mul de la solución de lisis de las células que expresan CAPBP1 en el Ejemplo 2 (1), se añadió un tampón de muestras de SDS concentrado dos veces (Tris-HCl 125 mM (pH 6,8), lauril sulfato sódico al 3%, glicerina al 20%, \beta-mercaptoetanol 0,14 M, azul de bromofenol al 0,02%) y se trató a 100ºC durante 2 minutos. Después, la mezcla se cargó en una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10% para separar las proteínas incluidas en la muestra. Después de transferir las proteínas de la poliacrilamida a una membrana en nitrocelulosa usando un aparato de transferencia de tipo semiseco (BioRad), se llevó a cabo la detección de la proteína CAPBP1 sobre la nitrocelulosa mediante un método de transferencia Western de acuerdo con un procedimiento conocido. Un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítopo V5 (Invitrogen Corporation) fusionado al extremo C-terminal de CAPBP1 se usó como un anticuerpo primario y un anticuerpo de fusión de IgG-HRP de conejo (BioRad) se usó como un anticuerpo secundario. Se confirmó que una proteína de aproximadamente 24 kDa que presentaba una proteína de fusión CAPBP1-V3-His6 que consistía en 220 o 223 aminoácidos, que incluía el marcador del extremo C-terminal que consistía en 45 aminoácidos, se detectaba dependiendo de la presencia del vector de expresión pcDNA-CAPBP1 (-) o pcDNA-CAPBP1 (+3). Por consiguiente, se confirmó que la región de longitud completa del gen CAPBP1 mencionado anteriormente clonado en las células de cultivo se expresaba sin duda alguna y formaba una estructura estable como una
proteína.

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Ejemplo 3 Análisis de la distribución dependiente de tejido de la expresión del gen CAPBP1

Puesto que la proteína CAPBP1 interacciona con CAP, se esperaba que la proteína se expresase en tejidos sensibles a insulina, actuando por lo tanto sobre la señal de la insulina en la segunda ruta. Por lo tanto, se examinó la presencia o ausencia de la expresión de CAPBP1 en diversos tipos de tejido mediante una reacción de PCR a partir de ADNc procedentes de diversos tipos de tejidos para amplificar el fragmento de ADNc de longitud completa del gen de CAPBP1, representado por la SEC ID Nº: 1 ó 3, usando una pareja de cebadores que son homólogos a CAPBP1, representados por la SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 14, como se ha descrito anteriormente. Usando una ADN polimerasa (AmpliTaq® ADN polimerasa; Applied Biosystems, Inc.) con cada uno en una cantidad de 1 \mug de genotecas de ADNc procedentes de médula ósea, cerebro, cartílago, corazón, riñón, leucocitos, hígado, pulmón, linfocitos, glándula mamaria, ovario, páncreas, placenta, glándula prostática, músculo esquelético y células HeLa humanas (Clontech) como molde, se repitió un ciclo de PCR a 98ºC durante 5 s, a 58ºC durante 30 s y a 72ºC durante 1,5 min 35 veces después del tratamiento a 98ºC durante 1 min. Como resultado de la separación del producto de PCR obtenido de este modo mediante electroforesis en gel de agarosa, se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 500 pares de bases que se considera que incluye un fragmento parcial deseado de CAPBP1, a partir de cada genoteca de ADNc procedente de músculo esquelético, células HeLa, cerebro, linfocitos y glándula mamaria. Después de separar cada uno de estos fragmentos de ADN a partir del gel de agarosa, se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN respectivamente usando un cebador representado por la SEC ID Nº: 14, de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1 anterior (4). Por consiguiente, se confirmó que tienen una secuencia que es idéntica a la de CAPBP1, representada por la SEC ID Nº: 1 ó 3. Por lo tanto, se puso de manifiesto que la expresión del presente gen de CAPBP1, representado por la SEC ID Nº: 1 y la SEC ID Nº: 3, estaba controlada específicamente en órganos limitados, incluyendo músculo esquelético, que es sensible a la señal de insulina.

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Ejemplo 4 Medición de la cantidad de expresión de CAPBP1 en ratones normales y de modelo diabético

A partir de los descubrimientos descritos anteriormente, se reveló que la proteína CAPBP1 de la presente invención se unía a CAP y se expresaba en tejidos sensibles a insulina tales como músculo esquelético. Puesto que la proteína CAP es un factor que actúa sobre la señal de la insulina en la segunda ruta, se esperaba implicación del modo de funcionamiento de CAPBP1 de la presente invención en la resistencia a la insulina. Por lo tanto, se midieron y compararon cantidades de expresión de ARN mensajeros (ARNm) del gen CAPBP1 en músculo esquelético de dos clases de ratones de modelo diabético KKA^{y}/Ta (Iwatsuka et al., Endocrinol. Japón., 17, 23-35, 1970, Taketomi et al., Horm. Metab. Res., 7, 242-246, 1975) y C57BL/KsJ-db/db (Chen. et al., Cell, 84, 491-495, 1996; Lee et al., Nature, 379, 632-635, 1996; Kaku et al., Diabetologia, 32, 636-643, 1989).

Con respecto a la cantidad de expresión del gen, se midió la cantidad de expresión del ortólogo de ratón del gen de CAPBP1 de la presente memoria descriptiva y se corrigió en base a la cantidad de expresión del gen de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) medida simultáneamente. Como sistema de medición se usó PRISM^{TM} 7700 Sequence Detection System y SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Inc.). En este sistema de medición, se determinó la cantidad de expresión del gen deseado a través de la detección e identificación cuantitativa de la cantidad de fluorescencia del colorante SYBR Green 1 incorporado por el ADN bicatenario amplificado por PCR.

En concreto, la medición se realizó de acuerdo con el siguiente procedimiento.

(1) Preparación del ARN total

Se preparó el ARN total a partir de músculo esquelético de ratones C57BL/6J, ratones KKA^{y}/Ta, ratones C57BL/
KsJ-dbm m+/m+, ratones C57BL/KsJ-dbm db/db macho de 15 semanas de edad (todos de CLEA Japan, Inc.) usando un reactivo de extracción de ARN (Isogen; NIPPON GENE CO., LTD.) de acuerdo con el manual de instrucciones. Se sabe que los ratones C57BL/6J y los ratones C57BL/KsJ-dbm m+/m+ son ratones sanos, mientras que los ratones KKA^{y}/Ta y los ratones C57BL/KsJ-dmb db/db se sabe que son ratones de un modelo de diabetes de tipo 2. El ARN total preparado se trató posteriormente con desoxirribonucleasa (NIPPON GENE CO., LTD.), se trató con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol, se disolvió en agua estéril y se conservó a -20ºC.

(2) Síntesis de un ADNc de cadena sencilla

Se llevó a cabo la transcripción inversa del ARN total en ADNc de cadena sencilla usando 0,25 \mug de ARN en el sistema de 20 \mul, usando un kit para la reacción de transcripción inversa (Advantage^{TM} RT-for-PCR Kit, Clontech). Después de la transcripción inversa, se añadieron 180 \mul de agua estéril y se almacenó a -20ºC.

(3) Producción del cebador de PCR

Se diseñaron los siguientes 4 oligonucleótidos denominados como CAP1403, CAP1404, G3PDH F y G3PDH R (SEC ID Nº: 15 a 18) como cebadores de PCR descritos en el párrafo (4). Se usó una combinación de la SEC ID Nº: 15 y de la SEC ID Nº: 16 para el gen CAPBP1, mientras que se usó una combinación de la SEC ID Nº: 17 y de la SEC ID Nº: 18 para el gen G3PDH.

(4) Medición de la cantidad de expresión génica

Se llevó a cabo una medición a tiempo real de la amplificación por PCR mediante PRISM® 7700 Sequence Detection System en un sistema de 25 \mul, de acuerdo con el manual de instrucciones. En cada sistema, se usaron 5 \mul del ADNc de cadena sencilla, 12,5 \mul de reactivo SYBR Green 2x y 7,5 pmoles de cada cebador. Además, para la preparación de una curva de calibración, se usaron 5 \mul de ADN genómico de ratón 0,1 \mug/\mul apropiadamente diluido (Clontech) en lugar del ADNc de cadena sencilla. La PCR se llevó a cabo a 50ºC durante 10 min y después a 95ºC durante 10 min, seguido de la repetición de 45 ciclos de dos etapas de 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 60 s.

\newpage

La cantidad de expresión del gen de CAPBP1 de ratón en cada muestra se corrigió con la cantidad de expresión de G3PDH en base a la siguiente fórmula:

[cantidad de expresión de CAPBP1 corregida] = [cantidad de expresión del gen de CAPBP1 (datos sin procesar)] / [cantidad de expresión del gen de G3PDH (datos sin procesar)].

Como resultado, como se muestra en la Figura 1, se puso de manifiesto que la expresión del gen ortólogo de ratón del CAPBP1 de la presente memoria descriptiva se aumenta extraordinariamente en el músculo esquelético de los ratones de modelo diabético. Por lo tanto, se piensa que el CAPBP1 de la presente invención induce la resistencia a la insulina a través de la hiperfunción en el músculo. A partir de lo anterior, se concluye que el CAPBP1 de la presente invención participa enormemente en la resistencia a la insulina.

Además, se descubrió a partir de los resultados del Ejemplo que la medición de la cantidad de expresión de CAPBP1 permite el diagnóstico de patologías diabéticas.

Ejemplo 5 Verificación de la interacción de CAPBP1 y CAP (1) Reclonación del gen de CAP

Usando la secuencia de ADNc que codifica la región de longitud completa de CAP de ratón clonada en el Ejemplo 1 anterior como molde, y los oligonucleótidos representados por la SEC ID Nº: 19 y la SEC ID Nº: 20, diseñados de tal modo que se añade una secuencia FLAG al extremo C-terminal, como un cebador, se llevó a cabo una PCR usando una ADN polimerasa (Pyrobest ADN polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.)) en una condición de una reacción de desnaturalización térmica a 95ºC durante 3 minutos seguida de 40 ciclos de 98ºC durante 10 s, 60ºC durante 30 s y 74ºC durante 1 min y 30 s y, adicionalmente, 74ºC durante 7 min. El fragmento de ADN producido de este modo de aproximadamente 2,5 kb se clonó en un plásmido pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen Corporation). Por lo tanto, el plásmido resultante se denominó como pcDNA-CAP-FLAG. La secuencia de nucleótidos del ADNc de CAP clonado en el vector se determinó usando el oligonucleótido representado por la SEC ID Nº: 13 descrito anteriormente como un cebador, un kit de secuenciación (Applied Biosystems, Inc.) y un secuenciador (ABI 3700 DNA sequencer, Applied Biosysterns, Inc.) y se confirmó que era idéntica a la secuencia descrita.

(2) Producción de plásmido de expresión de CAPBP1 fusionada con GST

Para insertar un ADNc de CAPBP1 humano en un vector de expresión de fusión con GST pGEX-6P-1 (Amersham Biosciences K.K.), el pcDNA-CAPBP1 (-) obtenido como se ha descrito anteriormente se trató con las enzimas BamHI y XhoI para preparar un fragmento de ADNc de CAPBP1. Además, usando oligos enlazadores que forman fragmentos de EcoRI y BamHI en ambos extremos (SEC ID Nº: 21 y 22) se llevó a cabo la recombinación en los sitios EcoRI y XhoIde pGEX-6p-1 para obtener pGEX-CAPBP1.

(3) Purificación de la proteína CAPBP1 fusionada con GST

La transformación del plásmido pGEX-CAPBP1 obtenido en el párrafo anterior (2) se llevó a cabo usando Escherichia coli BL21 con un método de choque térmico y el cultivo con agitación se llevó a cabo en 2,4 ml de cultivo durante una noche. Después, el volumen completo se transfirió a 400 ml de cultivo, seguido de cultivo con agitación a 37ºC durante 3 horas. Después, se añadió IPTG (Sigma) al mismo para dar una concentración final de 2,5 mM, seguido de agitación adicional del cultivo durante 3 horas para inducir la expresión de una proteína CAPBP1 fusionada con GST (en lo sucesivo, abreviada como GST-CAPBP1). Los cuerpos bacterianos se recuperaron y se purificó la GST-CAPBP1 sobre perlas de glutatión-Sepharose (Glutathione Sepharose 4B; Amersham Pharmacia) de acuerdo con un procedimiento conocido (Experimental engineering, Vol. 13, Nº 6. 1994, pág. 528, Matsushime et al.). Como control, se indujo que se expresase una proteína que incluía la parte de GST sola (en lo sucesivo, abreviada como proteína GST) y se purificó de forma similar a la forma que se ha descrito anteriormente a partir de Escherichia coli BL21 transformadas con pGEX-6P-1. Estas proteínas purificadas se sometieron a separación por electroforesis en gel de SDS y tinción con azul brillante de Coomassie de acuerdo con métodos conocidos y, por lo tanto, se confirmó que se purificaban proteínas que tenían el peso molecular esperado (GST-CAPBP1; 50 kDa, proteína GST; 26 kDa).

(4) Confirmación de la unión bioquímica entre la proteína CAP y la proteína CAPBP1

Usando la proteína CAPBP1 fusionada con GST (GST-CAPBP1) producida en el párrafo anterior (3), se confirmó la presencia a ausencia de interacción directa entre la proteína CAPBP1 y la proteína CAP mediante un método de precipitación con GST (Experimental engineering, Vol. 13, Nº 6. 1994, pág. 528, Matsushime et al.).

En primer lugar, se realizó la introducción génica de 15 \mug del pcDNA-CAP-FLAG producido en el párrafo (1) en células 293T cultivadas en una placa de 10 cm usando lipofectamina 2000. Como control negativo se llevó a cabo una operación similar sin ningún plásmido. Después de las 48 horas posteriores a la introducción génica, las células se lisaron en 1 ml de una solución de lisis celular (Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), glicerol al 10%, NaCl 120 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,1 mM, PMSF 0,5 mM, NP-40 al 0,5%). Cada 300 \mul de este lisado celular y cada 30 \mug de la proteína GST o GST-CAPBP1 purificada sobre las perlas de glutatión como en el párrafo anterior (3) se mezclaron y se agitaron a 4ºC durante una hora. Después, la proteína que se unía a la proteína GST o GST-CAPBP1 sobre las perlas se coprecipitó por centrifugación. Este precipitado se suspendió en 0,5 ml de un tampón preparado por cambio de la concentración de NaCl del líquido de lisis celular a 100 mM, y después se coprecipitó de nuevo por centrifugación. Después de repetir estas operaciones cuatro veces, la proteína en el precipitado se separó por electroforesis en gel de SDS de acuerdo con un procedimiento conocido y se analizó mediante un método de transferencia de Western usando un anticuerpo anti-FLAG (Sigma). Como resultado, se detectó una banda que tenía un tamaño que se supone se correspondía con el de CAP-FLAG mediante el anticuerpo anti-FLAG solo en el caso en el que se mezcló el lisado de células a las que se había introducido pcDNA-CAP-FLAG y la GST-CAPBP1. Esto sugiere que CAP se une a CAPBP1 para dar como resultado la coprecipitación. Como se ha descrito anteriormente, se puso de manifiesto que la CAPBP1 de la presente invención interaccionaba con la proteína CAP. Por lo tanto, se piensa que la CAPBP1 de la presente invención participa en la inducción de la resistencia a la insulina a través de la interacción con una proteína CAP.

Ejemplo 6 Medición de la actividad de la captación de glucosa en células con CAPBP1 altamente expresado (1) Producción de virus con elevada expresión de CAPBP1 usando un vector de adenovirus

Se obtuvo un fragmento génico que codifica CAPBP1 humana usando las enzimas de restricción BamHI y PstI a partir de un vector pcDNA-CAPBP1 (-) y, además, se insertó en un sitio de clonación múltiple (BamHI y NotI) de un vector adenoviral pAdTrack-CMV (obtenido del Cancer Center en Johns Hopkins) usando oligos enlazadores que forman fragmentos de escisión PstI y NotI en ambos extremos y que contienen una secuencia FLAG (SEC ID Nº: 23 y 24). Por consiguiente, se obtuvo un vector CAPBP1/pAdTrack-CMV.

A partir de entonces, de acuerdo con un protocolo conocido ("A Practical Guide for using the AdEasy system", HYPERLINK http://www.coloncancer.org/adeasy.htm, "http://www.coloncancer.org/adeasy/protocol2.htm"), se llevó a cabo la preparación de un líquido adenoviral que tenía un elevado título para expresar CAPBP1. Se preparó adenovirus para usar como control a partir de pAdTrack-CMV.

Con respecto a la cantidad del virus, se midió la absorbancia 260 nm (A260) y se convirtió de acuerdo con la siguiente fórmula:

[fórmula] 1A260 = 1,1 x 10^{12} partículas virales = 3,3 x 10^{11} ufp/ml.

(2) Diferenciación de adipocitos y adición de adenovirus que expresa CAPBP1

Se evaluó el efecto de CAPBP1 sobre la incorporación de azúcar usando células 3T3-L1. Se suspendieron células 3T3-L1 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero fetal de ternero al 1% (FCS) y se dispensaron en una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno (ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION) para dar 1,6 x 10^{5} células/pocillo. Al día siguiente, el medio se cambió a DMEM (FCS al 10%) suplementado con insulina 10 \mug/ml, dexametasona 250 nM y 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (IBMX) para inducir la diferenciación de las células 3T3-L1. Dos días después, el medio se reemplazó por 0,4 ml de DMEM (FCS al 10%) de nuevo. Cuatro días después, se añadió al medio adenovirus a una densidad de 1,6 x 10^{10} ufp por pocillo para permitir que se expresara CAPBP1. Como control, se usó adenovirus para permitir que se expresara eGFP sola.

(3) Medición de la actividad de captación de glucosa en células con una elevada expresión de CAPBP1

Después de 36 horas de la adición de adenovirus, el medio se cambió a DMEM sin suero fetal de ternero y se dejó reposar durante 3 horas. Después, se evalúo el efecto sobre la incorporación de azúcar. En primer lugar, el medio se cambio a 0,25 ml de tampón KRP (NaCl 136 mM, KCl 4,7 mM, CaCl_{2} 1,25 mM, MgSO_{4} 1,25 mM, Na_{2}HPO_{4} 5 mM, a pH 7,4) que contenía insulina a una concentración predeterminada y se incubó a 37ºC durante 20 min. Después, se proporcionó KRP que contenía 2-desoxi-D-glucosa 1 mM suplementado con 15 \mul de 2-desoxi-D-[U-^{14}C]glucosa (Amersham Biosciences K.K) por ml y del que se añadieron 50 \mul a cada pocillo y se incubaron a 37ºC durante 10 minutos. Después, las células se lavaron con solución salina fisiológica tamponada con fosfato helada (PBS) tres veces y se lisaron con lauril sulfato sódico al 0,1% (SDS). Después de la mezcla con 2 ml de un aparato de centelleo (Aquazol-2, Packard BioScience Company Inc.), se midió la cantidad de glucosa incorporada en las células usando un analizador de centelleo líquido (Tri-Carb B2500TR, Packard). Como se muestra en la Figura 2, la expresión de CAPBP1 disminuyó significativamente la cantidad de glucosa que se incorporaba en las células. Por tanto, se demostró que la CAPBP1 de la presente invención actúa como un factor que empeora las afecciones diabéticas por medio de su sobreexpresión, impidiendo la incorporación de azúcar en las células. Por referencia, el símbolo "*" en la Figura representa la evaluación en el ensayo t de Student. "*" significa que la diferencia significativa del grupo de control es p < 0,05, mientras que "***" significa que la diferencia significativa es p < 0,001.

Ejemplo 7 Detección de la interacción entre CAPBP1 y GSK-3\alpha

A partir de los resultados descritos anteriormente, se reveló que CAPBP1 inhibe la incorporación de azúcar en las células a través de la unión a CAP aguas abajo de la señal de insulina. Si CAPBP1 está implicada en el metabolismo de la glucosa en las células, se espera que también actúe sobre las proteínas relacionadas con el metabolismo de la glucosa distintas de CAP. Por lo tanto, como resultado del examen de las interacciones de múltiples proteínas relacionadas con el metabolismo de la glucosa con CAPBP1, se descubrió recientemente que la proteína se une a una proteína GSK-3\alpha que tiene una actividad para inactivar la glucógeno sintasa a través de fosforilación.

(1) Clonación del gen de GSK-3\alpha

Se obtuvo el ADNc de longitud completa de GSK3\alpha con la información de la secuencia del gen de GSK3\alpha humana del Nº de entrada de GenBank NM_019884, a partir de una genoteca de ADNc de músculo liso humano (Clontech), usando cebadores oligonucleotídicos de ADN representados por la SEC ID Nº: 25 y la SEC ID Nº: 26 (Proligo LLC), de acuerdo con los métodos de PCR y de clonación idénticos a los demostrados en el Ejemplo 1 anterior (4), y se clonó en un vector de expresión (pcDNA3.1/V5-His-TOPO; Invitrogen Corporation). Tras este procedimiento, el diseño se ejecutó de tal modo que se insertó un marcador FLAG en el extremo N-terminal de GSK3\alpha. El plásmido de expresión se denominó como pcDNA3.1-FLAG-GSK3\alpha.

(2) Detección de la unión bioquímica entre CAPBP1 y GSK3\alpha

Tanto el pcDNA-CAPBP1 (-) producido en el Ejemplo 1 anterior (5) como el pcDNA3.1-FLAG-GSK3\alpha mencionado anteriormente se cotransfectaron en células COS-1 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2 anterior (1), y se cultivaron durante 48 horas. Después de recuperar las células, la proteína unida a GSK3\alpha se separó usando un anticuerpo anti-FLAG (Sigma), de acuerdo con un procedimiento de inmunoprecipitación conocido (Experimental Medicine (Jikken Igaku) volumen complementario, Biomanual series 7, YODOSHA CO., LTD., 1994, pág. 91, Michinari Hamaguchi). Se examinó la presencia de la proteína de fusión CAPBP1-V3-His6 en la proteína separada por electroforesis en poliacrilamida SDS y un método de transferencia de Western en el que se usaba un anticuerpo anti-V5 (Invitrogen Corporation). Por consiguiente, se detectó una banda de 24 kDa de la proteína de fusión CAPBP1-V3-His6 sólo a partir de la fracción celular, en la que la proteína y FLAG-GSK3\alpha se expresan simultáneamente. Por consiguiente, se demostró la unión entre ambas proteínas.

GSK-3 inactiva la glucógeno sintasa a través de fosforilación para suprimir la incorporación de azúcar en las células. Además, GSK-3\alpha se fosforila por PKB, que se activa por la señal de insulina y, por lo tanto, su actividad se suprime. A partir de estos hechos, se considera que la proteína es la molécula que actúa negativamente sobre la señal de insulina (Biochem J., 1993, 294 (3): págs. 625-629). A partir del hecho de la unión a GSK3\alpha, se descubrió que la CAPBP1 de la presente invención participaba en la inducción de afecciones diabéticas a través del control negativo de la señal de insulina.

Aplicabilidad industrial

CAPBP1 es una nueva molécula implicada en la señal de insulina y, por lo tanto, el polipéptido y el polinucleótido de la presente invención pueden usarse para la identificación y detección de un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar la diabetes. Además, los polinucleótidos de la presente invención que presentan la cantidad de expresión aumentada en una afección diabética son útiles en el diagnóstico de la diabetes.

Texto libre de la lista de secuencias

El número de referencia <223> en la Lista de Secuencias a continuación es para describir la explicación de "Secuencia Artificial". En concreto, cada secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 5 a 10, 12 a 18, 23 y 24 en la Lista de Secuencias es una secuencia de cebador sintetizada artificialmente. La secuencia de nucleótidos representada por la secuencia de la SEC ID Nº: 11 es una secuencia que consiste en las bases desde la posición 5183 (5') a la posición 5162 (3') de un vector de clonación pACT2 (GenBank U29899).

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd

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<120> Proteína de unión CAP

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<130> Y0357-PCT

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<150> JP2002-298549

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<151> 11-10-2002

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<160> 26

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 528

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(525)

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<223> Inventores: Oda, Tamaki; Endoh, Hideki; Ueda, Yoshitaka; Inabe, Kaz unor i

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<400> 1

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1

2

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<210> 2

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<211> 175

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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3

4

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<210> 3

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<211> 537

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(534)

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<223>

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<400> 3

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5

6

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<210> 4

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<211> 178

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

7

8

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<210> 5

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<211> 45

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 5

9

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<210> 6

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 6

10

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<210> 7

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 7

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11

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<210> 8

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<211> 44

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<212> ADN

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 8

12

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<210> 9

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<211> 62

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 9

13

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<210> 10

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<211> 64

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 10

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14

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<210> 11

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: la secuencia de las bases 5183 (5') a 5162 (3') en el vector de clonación pACT2 (GenBank U29899)

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<400> 11

15

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<210> 12

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 12

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<210> 13

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<210> 14

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<212> ADN

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<210> 15

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<212> ADN

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<400> 17

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<400> 18

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Mus sp.

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Mus sp.

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<400> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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<210> 22

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

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<210> 23

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 23

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<210> 24

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<223> Descripción de Secuencia Artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

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<400> 24

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<210> 25

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<211> 44

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

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<210> 26

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

30

Claims (5)

1. Un polipéptido seleccionado del grupo constituido por (a) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4, y que se une a la proteína asociada c-Cbl (CAP); (b) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se delecionan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP; (c) un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad del 90% o más con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP; o (d) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 2 ó 4 y que se une a CAP.

2. Un polinucleótido que consisten en la secuencia de nucleótidos que consiste en la SEC ID Nº: 1 o en la SEC ID Nº: 3.

3. Un método para detectar un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa, que comprende:

- dejar que una célula que expresa el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 contacte con una sustancia de ensayo y

- medir el cambio de la cantidad de expresión del polipéptido.

4. Un método para detectar un agente que proporcione la inhibición de la unión entre el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 y CAP, que comprende:

- dejar que el polipéptido contacte con una sustancia de ensayo,

- medir el cambio de la unión entre el polipéptido y CAP y

- seleccionar una sustancia que inhiba la unión.

5. El método para la detección de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el agente que proporciona la inhibición de la unión es un agente para mejorar la resistencia a la insulina y/o un agente para mejorar el metabolismo de la glucosa.