JPWO2004015103A1 - Akt2結合蛋白質 - Google Patents
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Abstract
インスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニングに有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターでトランスフェクトされた細胞を開示する。前記ポリペプチドは骨格筋で特異的に発現する蛋白質であり、同蛋白質を高発現させた脂肪細胞では糖の取り込み能が増大する。前記ポリペプチドを用いたインスリン抵抗性改善薬及び糖代謝改善薬のスクリーニング方法並びに該スクリーニング方法により得られる物質を有効成分とするインスリン抵抗性改善用及び糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を開示する。
Description
本発明は、Akt2に結合する新規なポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードする新規なポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び該ベクターを含有する形質転換細胞に関する。
インスリンは膵臓ランゲルハンス島のβ細胞より分泌され、主に筋肉、肝臓、脂肪に作用して血中の糖を細胞に取り込ませて貯蔵、消費させることにより血糖値を降下させる。糖尿病は、このインスリンの作用不足から引き起こされるが、患者にはインスリンの生産・分泌に障害をもつ1型と、インスリンによる糖代謝促進が起こりにくい2型の2つのタイプが存在する。いずれの患者でも血糖値が健常人より高くなるが、1型では血中インスリンが絶対的に不足するのに対して、2型ではインスリンの存在にもかかわらず血糖の取り込み・消費が促進されないインスリン抵抗性が生じている。2型糖尿病は遣伝的素因に加えて過食や運動不足、ストレスなどが原因となり惹起されるいわゆる生活習慣病である。今日先進諸国では摂取カロリーの増大に伴いこの2型糖尿病患者が急激に増加しており、日本では糖尿病患者の95%をしめている。そのため糖尿病の治療薬には単純な血糖降下剤のみでなく、インスリン抵抗性改善により糖代謝を促進する2型糖尿病の治療を対象とした研究の必要性が高まっている。
現在1型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方2型患者にも処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤(SU剤)や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナイド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内でのブドウ糖利用が促進されるとともに、細胞内へのブドウ糖の取り込みが促進される。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ(peroxisome proliferator activated receptor:PPARγ)のアゴニストとしてとして作用することが示されている(非特許文献1参照)。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている(非特許文献2参照、非特許文献3参照)。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用であり、インスリン抵抗性改善のために、PPARγにかわるより有用な創薬標的分子が求められていた。
インスリンの作用は細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内へとシグナルが伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の2経路が存在する(非特許文献4参照)。第一経路は活性化したインスリン受容体からIRS−1、IRS−2、P13キナーゼ、及びPDK1を介してAkt1(PKBα)若しくはAkt2(PKBβ)、またはPKCλ若しくはPKCζへ順次シグナルが伝達され、結果として細胞膜上のグルコーストランスポーターGLUT4を介した細胞外からの糖の取り込みを促進する(非特許文献5参照)。一方、第二経路ではインスリン受容体からc−CbI蛋白質及びCAP蛋白質を介してCrK II,C3G,及びTC10へ順次シグナルが伝達され、結果GLUT4による糖の取り込みを促進する(非特許文献6参照)。これらインスリンシグナル伝達経路の詳細はいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。
Akt2は前述のインスリンシグナル第一経路に存在し、インスリンの刺激によりPDK1を介してリン酸化され活性化する。活性化したAkt2はキナーゼとして基質となる蛋白質をリン酸化することによりシグナルを伝達する。Akt2蛋白質をコードする遺伝子を人為的に欠失させたホモノックアウトマウスは主に筋肉、肝臓においてインスリンの感受性が低下し2型糖尿病様の表現形を示すことが報告されている(非特許文献7参照)。これらの事実から、Akt2はインスリンシグナルに応答した細胞内への糖取り込みに関与するシグナル仲介因子であり、その機能の欠損はインスリンによるシグナル伝達を部分的に遮断させるためにインスリン抵抗性を惹起し、2型糖尿病様態を引き起こすと考えられている。
一方Akt2と直接相互作用してその活性を調節する分子はこれまでに知られていなかった。
「(ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー)The Journal of Biological Chemistry」、(米国)、1995年、第270巻、p.12953−12956 「ダイアビーティーズ フロンティア(Diabetes Frontier)」(米国)、1999年、第10巻、p.811−818 「ダイアビーティーズ フロンティア(Diabetes Frontier)」、(米国)、1999年、第10巻、p.819−824 「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション(The Journal of Clinical Investigation)」、(米国)、2000年、第106巻(2)、p.165−169 「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)」、(米国)、1999年、第274巻(4)、p.1865−1868 「ネイチャー(Nature)」(英国)、2000年、第407巻(6801)、p.202−207 「サイエンス(Science)」、(米国)、2002年、第292巻、p.1728−1731
現在1型糖尿病患者の治療にはインスリン注射製剤が処方されている。一方2型患者にも処方される血糖降下剤としては、インスリン注射製剤に加えて膵臓のβ細胞に作用してインスリンの分泌を促すスルホニル尿素系血糖降下剤(SU剤)や、嫌気的解糖作用による糖利用の増大や糖新生の抑制、及び糖の腸管吸収を抑制する作用を持つビグアナイド系血糖降下剤の他、糖質の消化吸収を遅らせるα−グルコシダーゼ阻害剤が知られている。これらは間接的にインスリン抵抗性を改善するが、近年より直接的にインスリン抵抗性を改善する薬剤としてチアゾリジン誘導体が使われるようになった。その作用は細胞内でのブドウ糖利用が促進されるとともに、細胞内へのブドウ糖の取り込みが促進される。このチアゾリジン誘導体はペルオキシソーム増殖剤応答性受容体ガンマ(peroxisome proliferator activated receptor:PPARγ)のアゴニストとしてとして作用することが示されている(非特許文献1参照)。しかしチアゾリジン誘導体はインスリン抵抗性を改善するのみでなく、浮腫を惹起する副作用が知られている(非特許文献2参照、非特許文献3参照)。この浮腫の惹起は心肥大をもたらす重篤な副作用であり、インスリン抵抗性改善のために、PPARγにかわるより有用な創薬標的分子が求められていた。
インスリンの作用は細胞膜上にあるインスリン受容体を介して細胞内へとシグナルが伝達される。このインスリンの作用経路には第一と第二の2経路が存在する(非特許文献4参照)。第一経路は活性化したインスリン受容体からIRS−1、IRS−2、P13キナーゼ、及びPDK1を介してAkt1(PKBα)若しくはAkt2(PKBβ)、またはPKCλ若しくはPKCζへ順次シグナルが伝達され、結果として細胞膜上のグルコーストランスポーターGLUT4を介した細胞外からの糖の取り込みを促進する(非特許文献5参照)。一方、第二経路ではインスリン受容体からc−CbI蛋白質及びCAP蛋白質を介してCrK II,C3G,及びTC10へ順次シグナルが伝達され、結果GLUT4による糖の取り込みを促進する(非特許文献6参照)。これらインスリンシグナル伝達経路の詳細はいまだ不明な部分が多く、特にこれらのシグナルが最終的にどのような機構を経てグルコーストランスポーターを介した細胞の糖取り込みを促進するのか明らかではない。
Akt2は前述のインスリンシグナル第一経路に存在し、インスリンの刺激によりPDK1を介してリン酸化され活性化する。活性化したAkt2はキナーゼとして基質となる蛋白質をリン酸化することによりシグナルを伝達する。Akt2蛋白質をコードする遺伝子を人為的に欠失させたホモノックアウトマウスは主に筋肉、肝臓においてインスリンの感受性が低下し2型糖尿病様の表現形を示すことが報告されている(非特許文献7参照)。これらの事実から、Akt2はインスリンシグナルに応答した細胞内への糖取り込みに関与するシグナル仲介因子であり、その機能の欠損はインスリンによるシグナル伝達を部分的に遮断させるためにインスリン抵抗性を惹起し、2型糖尿病様態を引き起こすと考えられている。
一方Akt2と直接相互作用してその活性を調節する分子はこれまでに知られていなかった。
「(ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー)The Journal of Biological Chemistry」、(米国)、1995年、第270巻、p.12953−12956 「ダイアビーティーズ フロンティア(Diabetes Frontier)」(米国)、1999年、第10巻、p.811−818 「ダイアビーティーズ フロンティア(Diabetes Frontier)」、(米国)、1999年、第10巻、p.819−824 「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション(The Journal of Clinical Investigation)」、(米国)、2000年、第106巻(2)、p.165−169 「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー(The Journal of Biological Chemistry)」、(米国)、1999年、第274巻(4)、p.1865−1868 「ネイチャー(Nature)」(英国)、2000年、第407巻(6801)、p.202−207 「サイエンス(Science)」、(米国)、2002年、第292巻、p.1728−1731
本発明者らは、上述の知見からAkt2の働きを増強させることができれば、インスリン抵抗性を改善する方向に作用すると考えた。この目的のためにはAkt2自身の活性を増大させるか、あるいはAkt2の活性を制御している細胞内因子を同定してその作用を調節するかの何れかの方法が考えられた。しかしAkt2はキナーゼであり、その酵素活性を薬剤によって増強する方向に調節することは困難である。そこで、本発明者らは、Akt2に結合する蛋白質を、酵母ツーハイブリッドシステムにより同定した。その結果、骨格筋で特異的に発現する蛋白質AKBP1(Akt2 Binding Protein 1)をコードする新規な塩基配列のcDNAのクローニングに成功した。さらに同蛋白質マウスオルソログは糖尿病モデルマウスの脂肪組織において血糖値の変動に関わらず発現量が顕著に減少していること、同蛋白質を脂肪細胞で過剰に発現させると糖の取り込みが促進されることを明らかにすることにより、同蛋白質の減少及び同蛋白質とAkt2との結合の減少が糖尿病態の原因であることを見出した。
これらの結果、本発明者らはインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、インスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、並びに、インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
[1](1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Akt2と結合するポリペプチド、あるいは(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもAkt2と結合するポリペプチド、
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合する蛋白質であるポリペプチド、
[3]配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
[4][1]乃至[3]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
[5][4]に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
[6][5]に記載の発現ベクターで形質転換された細胞
[7][1]乃至[3]に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程、及び
前記結合を促進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとAkt2との結合促進剤をスクリーニングする方法、
[8]結合促進剤がインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬である[7]に記載のスクリーニングする方法、
[9][1]乃至[3]に記載のポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるAkt2の変化を測定する工程である[7]又は[8]に記載のスクリーニングする方法、
[10][7]乃至[9]に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
Akt2と直接相互作用してその活性を調節する分子はこれまでに知られていなかった。また、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性の高い配列はこれまでに知られていなかった。本発明者らは本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、その蛋白質の減少及びAkt2との結合の減少が糖尿病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドとAkt2との結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らが初めて見出した方法である。
これらの結果、本発明者らはインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬の探索に有用な新規なポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された細胞、インスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法、並びに、インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法を提供し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
[1](1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Akt2と結合するポリペプチド、あるいは(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもAkt2と結合するポリペプチド、
[2]配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合する蛋白質であるポリペプチド、
[3]配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
[4][1]乃至[3]に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
[5][4]に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、
[6][5]に記載の発現ベクターで形質転換された細胞
[7][1]乃至[3]に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程、及び
前記結合を促進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとAkt2との結合促進剤をスクリーニングする方法、
[8]結合促進剤がインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬である[7]に記載のスクリーニングする方法、
[9][1]乃至[3]に記載のポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるAkt2の変化を測定する工程である[7]又は[8]に記載のスクリーニングする方法、
[10][7]乃至[9]に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法
に関する。
Akt2と直接相互作用してその活性を調節する分子はこれまでに知られていなかった。また、本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドと相同性の高い配列はこれまでに知られていなかった。本発明者らは本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドを初めて見出し、その蛋白質の減少及びAkt2との結合の減少が糖尿病態の原因であることを初めて明らかにした。また、本発明のポリペプチドとAkt2との結合を利用した本発明のスクリーニング方法は本発明者らが初めて見出した方法である。
図1は、培養細胞におけるヒトAKBP1の発現を示す図面である。
図2は、糖尿病モデルマウスKKAy及びdb/dbと正常マウスにおける脂肪組織でのAKBP1発現量の比較を示す図面である。図の縦軸はAKBP1発現量を示す。
図3は、ヒトAKBP1を過剰発現させた脂肪細胞における糖取り込み量を示す図である。
図2は、糖尿病モデルマウスKKAy及びdb/dbと正常マウスにおける脂肪組織でのAKBP1発現量の比較を示す図面である。図の縦軸はAKBP1発現量を示す。
図3は、ヒトAKBP1を過剰発現させた脂肪細胞における糖取り込み量を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
<本発明のポリペプチド>
本発明のポリペプチドには、
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかもAkt2に結合するポリペプチド、あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜10個(好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、更に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもAkt2に結合するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する);及び
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合する蛋白質であるポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する);
が含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号2で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Clustal program(Higgins and Sharp、Gene 73、237−244、1998;Thompson et al.Nucleic Acid Res.22、4673−4680、1994)検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identitiesを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Pairwise Alignment Parametersとして
K tuple 1
Gap Penalty 3
Window 5
Diagonals Saved 5
また、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタなどの哺乳動物由来のものも包含する。
<本発明のポリヌクレオチド>
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、その機能的等価改変体、または、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。また、同じ分子種として同定されるものであればいずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号1に記載の塩基配列である。なお、本明細書におけるポリヌクレオチドには、DNA及びRNAの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、これらによってコードされる本発明のポリペプチドの機能を実質的に変更しないあらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変及び/又は作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記特性を有する全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法(Methods in Enzymology、(1987)154、350,367−382)等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段(Science(1968)150,178)、及びそれらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うDNAを得ることが可能である。あるいはPCR法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりDNA分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Molecular Cloning」[Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年]でも得ることができる。
例えば、(1)PCRを用いた方法、(2)常法の遺伝子工学的手法(すなわちcDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法)を用いる方法、又は(3)化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、WO01/34785に記載されていると同様に実施できる。
PCRを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法a)第1製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト骨格筋を挙げることができる。ヒト骨格筋からmRNAを抽出する。次いで、このmRNAをランダムプライマーまたはオリゴdTプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖cDNAを合成することが出来る。得られた第一鎖cDNAを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例1に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法b)第2製造法に記載された手順により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法c)第3製造法、d)第4製造法に記載された方法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば該ポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法として具体的には、RT−PCR(Reverse transcribed−Polymerase chain reaction)、ノーザンブロッティング解析、in situハイブリダイゼーションなどの常法に従って行うことが出来る。RT−PCRによって本発明のポリヌクレオチドを検出する場合に用いられるプライマーは、該遺伝子のみを特異的に増幅できるものである限り特に制限は無く、本発明のポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することが出来る。本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーは、本発明のポリヌクレオチドを検出するための特異プライマー及び特異プローブとして利用できる。
<本発明の発現ベクター及び細胞>
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning」[Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年]に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で産生する本発明のポリペプチド発現系が構築できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’側にある本発明のポリペプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。例えば、宿主細胞には、限定されるわけではないが、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーRNAレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のAkt2が豊富に存在する脂肪由来細胞、肝由来細胞、あるいは筋由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し、遣伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」2)本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例2に記載のように所望のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターpcDNA3.1に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリポフェクトアミン法を用いてCOS−1細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記COS−1細胞であれば牛胎児血清(FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地にG418を加えたものを使用できる。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。本発明のポリペプチドは公知の方法(例えば、岡田雅人及び宮崎香編、「改訂タンパク質実験ノート上・下」、羊土社、1999)により分離精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、プロテインA、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン(MBP)など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。あるいは所望により、該蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号2に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を1個ずづ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全部または一部を包含する任意のウイルスベクターを作製し、該ベクターを骨格筋組織に感染させて本発明のポリヌクレオチドを作動させることにより、細胞内で本発明のポリヌクレオチドのmRNA発現を強制的に亢進させることが出来る。これにより骨格筋における本発明のポリペプチド蛋白質量を増大させることでAkt2の活性を調整し、インスリンシグナル第一経路を介した糖取り込みを制御することが可能となる。この結果として糖代謝を制御し、つまりは糖尿病の進展を制御することが可能となる。
ウイルスベクター利用において、骨格筋における強制発現の具体的な方法としては、例えば骨格筋アクチン、ミオシン重鎖、クレアチンキナーゼなどのプロモーターの利用を例示できる。
ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター(McLachlin JR(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,91,6186−6196)、アデノウイルスベクター(Tong−Chuan He,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,95,2509−2514)の利用を例示できる。
<本発明のスクリーニングする方法>
本発明のスクリーニングする方法には、本発明のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程、及び前記結合を促進する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとAkt2との結合促進剤をスクリーニングする方法が含まれる。
本発明のポリペプチドの一つであるAKBP1はAkt2と結合すること、糖尿病モデルマウスでマウスオルソログの発現が減弱していること、及びAKBP1を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが亢進していることから、本発明のポリペプチドはAkt2との結合を介してインスリンシグナルを正に制御していることがわかった。従って、上述のスクリーニングする方法によりインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上述のスクリーニングする方法における本発明のポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程は、本発明のポリペプチドとAkt2との結合を直接検出することによって実施でき、また、前記結合の変化によるAkt2の変化を測定することによっても実施できる。
本発明のスクリーニングする方法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物(ペプチドを含む)、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアル・ケミストリー技術(N.K.Terrett,M.Gardner,D.W.Gordon,R.J.Kobylecki,J.Steele,Tetrahedron,51,8135−73(1995))によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物(ペプチドを含む)を化学的又は生物学的に修飾した化合物(ペプチドを含む)を挙げることができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリーニング方法が挙げられる。
1)Akt2のリン酸化を利用したスクリーニング方法
Akt2は分子内のSer473がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている。これを利用し、Akt2のSer473のリン酸化状態を抗phosphoSer抗体を用いたウエスタンブロットにより検出することでAkt2の活性の有無が検出できる。
本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。試験物質を未処理又は処理した細胞を溶解し、これを試料として抗phosphoSer抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりAkt2のリン酸化、すなわちAkt2の活性の有無を検出することができる。この検出系において、試験物質を未処理の試料に比較してAkt2のリン酸化(すなわちAkt2の活性化)の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のポリペプチドとAkt2との結合を促進する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
2)in vitro kinase法を利用したスクリーニング法
内在性のAkt2基質を用いたin vitro kinase法によってもAkt2活性を検出することができる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Akt2抗体を用いた免疫沈降により活性化したAkt2蛋白質を濃縮することができる。タグをつけて精製したAkt2の内在性基質、例えば、GST−crosstide(Aktが生理的基質としているGSK3−betaの配列のGST融合タンパク)と濃縮Akt2蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてAkt2のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。キナーゼ測定は、トータルキーナーゼアッセイ法(Wagaら、J.Immunol..Methods 190,pp71−77,1996)を利用することにより大規模な数の化合物のスクリーニング方法として使用が可能である。この測定系において、試験物質を未処理の試料に比較してAkt2のキナーゼ活性の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のポリペプチドとAkt2との結合を促進する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
3)本発明のポリペプチドとAkt2との結合を利用したスクリーニング方法
本発明のポリペプチドはAkt2との結合を介してインスリンシグナルを正に制御していることから、本発明のポリペプチドとAkt2との結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域、あるいはGSTやFlag、HISなどのタグを融合させた本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Akt2抗体を用いた免疫沈降によりAkt2蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたAkt2およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより本発明のポリペプチドの量を測定することにより、本発明のポリペプチドとAkt2の結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。ここで用いる抗体は、本発明のポリペプチド或いはその部分配列をもとに作製した本発明のポリペプチドに対する抗体(例えば抗AKBP1抗体)、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。また上述と同様に本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、GSTなどのタグをつけて精製したAkt2蛋白質を用いたin vitroのプルダウン法(実験工学、Vol13、No.6、1994年528頁 松七五三ら)と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもAkt2と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。あるいはここで本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液を用いずに、本発明のポリペプチドの発現プラスミド(例えば実施例1(5)で作製したAKBP1発現プラスミド)から直接本発明のポリペプチドである蛋白質(例えばAKBP1蛋白質)をTNTキット(プロメガ社)等を用いてin vitroで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものを用いても同様にAkt2と本発明のポリペプチド(例えばAKBP1)の結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させた本発明のポリペプチドおよびAkt2を同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のELISA法に従ってもAkt2と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム(クロンテック社)を利用して、ベイトにGAL4のDNA結合領域と融合させたAkt2を、プレイ側にVP16の転写促進領域を融合させた本発明のポリペプチドを配置することにより、既存のCATあるいはルシフェラーゼ活性の検出によりAkt2と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
インスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法として本発明のポリペプチドの発現量を測定することによるスクリーニング方法が挙げられる。糖尿病モデルマウスでAKBP1のマウスオルソログの発現が減弱していること(実施例4)、およびAKBP1を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが亢進していること(実施例6)から、内在性のAKBP1の発現量を試験物質により増加させることが可能であれば、該試験物質はインスリン抵抗性を改善する作用を持つことが予想される。このような物質は具体的には以下の方法によって選択することができる。
まず試験物質で未処理又は処理した細胞から実施例4(1)に示した方法に従ってRNAを調製することができる。該細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。このRNA調製液から公知の方法に従ってアガロースゲル電気泳動によりRNAを分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、これを本発明のポリヌクレオチドの配列を含むラベルした短鎖DNAプローブを用いたノーザンプロット解析により、試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するRNAの発現量の増減を検出できる。これにより本発明ポリペプチドの発現量を増加させる物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることができる。あるいは本発明のポリヌクレオチドの配列を含む短鎖DNAプライマーを用いたリアルタイムPCR法によっても試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するRNAの発現量の増減を定量的に検出できる。リアルタイムPCRはより具体的には実施例4の方法に従って実施できる。これにより本発明のポリペプチドの発現量を増加させる物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることが可能である。本発明のポリヌクレオチドは本スクリーニング方法に利用することができる。
<インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法>
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、1又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えば、オリーブ油)、アルコール類(例えば、エタノール)、又はポリソルベート80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人(体重60kgとして)において、1日につき約0.1〜100mg、好ましくは0.1〜50mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では、1日につき0.01〜50mg、好ましくは0.01〜10mgである。
<本発明のポリペプチド>
本発明のポリペプチドには、
(1)配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかもAkt2に結合するポリペプチド、あるいは、配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜10個(好ましくは1〜7個、より好ましくは1〜5個、更に好ましくは1〜3個)のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもAkt2に結合するポリペプチド(以下、機能的等価改変体と称する);及び
(3)配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合する蛋白質であるポリペプチド(以下、相同ポリペプチドと称する);
が含まれる。
本発明の相同ポリペプチドは、配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合するポリペプチドである限り、特に限定されるものではないが、配列番号2で表されるアミノ酸配列に関して、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。なお、本明細書における前記「相同性」とは、Clustal program(Higgins and Sharp、Gene 73、237−244、1998;Thompson et al.Nucleic Acid Res.22、4673−4680、1994)検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Identitiesを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Pairwise Alignment Parametersとして
K tuple 1
Gap Penalty 3
Window 5
Diagonals Saved 5
また、本発明のポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ブタなどの哺乳動物由来のものも包含する。
<本発明のポリヌクレオチド>
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、その機能的等価改変体、または、その相同ポリペプチドをコードする塩基配列なら何れでもよい。また、同じ分子種として同定されるものであればいずれの種由来のものであってもよい。好ましくは、配列番号2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであり、さらに好ましくは、配列番号1に記載の塩基配列である。なお、本明細書におけるポリヌクレオチドには、DNA及びRNAの両方が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドには、これらによってコードされる本発明のポリペプチドの機能を実質的に変更しないあらゆる変異体を含むことが出来る。より具体的には天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、欠失、置換、付加及び挿入を有する変異体を含むことが出来る。前記の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変及び/又は作製することも出来る。本発明は、上記ポリヌクレオチドの変異の原因及び手段を問わず、上記特性を有する全ての変異遺伝子を包含する。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば塩基特異的置換法(Methods in Enzymology、(1987)154、350,367−382)等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段(Science(1968)150,178)、及びそれらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うDNAを得ることが可能である。あるいはPCR法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりDNA分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明により開示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造、取得することが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作「Molecular Cloning」[Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年]でも得ることができる。
例えば、(1)PCRを用いた方法、(2)常法の遺伝子工学的手法(すなわちcDNAライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のアミノ酸を含む形質転換株を選択する方法)を用いる方法、又は(3)化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、WO01/34785に記載されていると同様に実施できる。
PCRを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法a)第1製造法に記載された手順により、本明細書記載のポリヌクレオチドを製造することができる。該記載において、「本発明の蛋白質を産生する能力を有するヒト細胞あるいは組織」とは、例えば、ヒト骨格筋を挙げることができる。ヒト骨格筋からmRNAを抽出する。次いで、このmRNAをランダムプライマーまたはオリゴdTプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖cDNAを合成することが出来る。得られた第一鎖cDNAを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に供し、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例1に記載の方法により本発明のポリヌクレオチドを製造することが出来る。
常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法b)第2製造法に記載された手順により、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
化学合成法を用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」1)蛋白質遺伝子の製造方法c)第3製造法、d)第4製造法に記載された方法によって、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを製造することができる。
このようにして得られる本発明のポリヌクレオチドによれば、例えば該ポリヌクレオチドの一部または全部の塩基配列を利用することにより、個体もしくは各種組織における本発明のポリヌクレオチドの発現レベルを特異的に検出することが出来る。
かかる検出方法として具体的には、RT−PCR(Reverse transcribed−Polymerase chain reaction)、ノーザンブロッティング解析、in situハイブリダイゼーションなどの常法に従って行うことが出来る。RT−PCRによって本発明のポリヌクレオチドを検出する場合に用いられるプライマーは、該遺伝子のみを特異的に増幅できるものである限り特に制限は無く、本発明のポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することが出来る。本発明のポリヌクレオチドを特異的に増幅するプライマーは、本発明のポリヌクレオチドを検出するための特異プライマー及び特異プローブとして利用できる。
<本発明の発現ベクター及び細胞>
上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning」[Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年]に記載の方法により、適当なプロモーターの下流に連結することで本発明のポリペプチドを試験管内、あるいは試験細胞内で産生する本発明のポリペプチド発現系が構築できる。
具体的には上述のように得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの5’側にある本発明のポリペプチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳による本発明のポリペプチドの発現が可能である。
あるいは上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で本発明のポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体DNAに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において本発明のポリペプチドを発現させることが可能である。例えば、宿主細胞には、限定されるわけではないが、本発明のポリペプチドの発現量をメッセンジャーRNAレベルで、あるいは蛋白質レベルで検出できるものであればよい。内在性のAkt2が豊富に存在する脂肪由来細胞、肝由来細胞、あるいは筋由来細胞を宿主細胞として用いることがより好ましい。
宿主細胞を形質転換し、遣伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」2)本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。本発明の細胞は、例えば、前記発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランスフェクションすることにより得ることができる。より具体的には、例えば、実施例2に記載のように所望のポリヌクレオチドをほ乳類動物細胞用の発現ベクターpcDNA3.1に組み込むことにより、所望の蛋白質の発現ベクターを得ることができ、該発現ベクターをリポフェクトアミン法を用いてCOS−1細胞に取り込ませて本発明の形質転換細胞を製造することができる。
上記で得られる所望の形質転換細胞は、常法に従い培養することができ、該培養により所望の蛋白質が生産される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば上記COS−1細胞であれば牛胎児血清(FBS)等の血清成分を添加したダルベッコ修飾イーグル最小必須培地(DMEM)等の培地にG418を加えたものを使用できる。
本発明の細胞を培養することにより、細胞中で産生した本発明のポリペプチドを検出、定量、さらには精製することが出来る。本発明のポリペプチドは公知の方法(例えば、岡田雅人及び宮崎香編、「改訂タンパク質実験ノート上・下」、羊土社、1999)により分離精製することが出来る。例えば、本発明のポリペプチドと結合する抗体を用いたウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、精製することが可能である。あるいは、本発明のポリペプチドを、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、プロテインA、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン(MBP)など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質に特異的な抗体を用いてウエスタンブロット法、あるいは免疫沈降法により本発明のポリペプチドを検出、タグ蛋白質を利用して精製することが出来る。あるいは所望により、該蛋白質の物理的性質、化学的性質を利用した各種の分離操作によっても精製できる。具体的には限外濾過、遠心分離、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーの利用を例示することが出来る。
本発明のポリペプチドは、配列番号2に示すアミノ酸配列情報に従って、一般的な化学合成法により製造することが出来る。具体的には液相、及び固相法によるペプチド合成法が包含される。合成はアミノ酸を1個ずづ逐次結合させても、数アミノ酸からなるペプチド断片を合成した後に結合させてもよい。これらの手段により得られる本発明ポリペプチドは前記した各種の方法に従って精製を行うことが出来る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全部または一部を包含する任意のウイルスベクターを作製し、該ベクターを骨格筋組織に感染させて本発明のポリヌクレオチドを作動させることにより、細胞内で本発明のポリヌクレオチドのmRNA発現を強制的に亢進させることが出来る。これにより骨格筋における本発明のポリペプチド蛋白質量を増大させることでAkt2の活性を調整し、インスリンシグナル第一経路を介した糖取り込みを制御することが可能となる。この結果として糖代謝を制御し、つまりは糖尿病の進展を制御することが可能となる。
ウイルスベクター利用において、骨格筋における強制発現の具体的な方法としては、例えば骨格筋アクチン、ミオシン重鎖、クレアチンキナーゼなどのプロモーターの利用を例示できる。
ウイルスベクターの具体例としては、レトロウイルスベクター(McLachlin JR(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,91,6186−6196)、アデノウイルスベクター(Tong−Chuan He,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,95,2509−2514)の利用を例示できる。
<本発明のスクリーニングする方法>
本発明のスクリーニングする方法には、本発明のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、該ポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程、及び前記結合を促進する物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとAkt2との結合促進剤をスクリーニングする方法が含まれる。
本発明のポリペプチドの一つであるAKBP1はAkt2と結合すること、糖尿病モデルマウスでマウスオルソログの発現が減弱していること、及びAKBP1を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが亢進していることから、本発明のポリペプチドはAkt2との結合を介してインスリンシグナルを正に制御していることがわかった。従って、上述のスクリーニングする方法によりインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬をスクリーニングすることができる。
上述のスクリーニングする方法における本発明のポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程は、本発明のポリペプチドとAkt2との結合を直接検出することによって実施でき、また、前記結合の変化によるAkt2の変化を測定することによっても実施できる。
本発明のスクリーニングする方法で使用する試験物質としては、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物(ペプチドを含む)、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物(ペプチドを含む)、コンビナトリアル・ケミストリー技術(N.K.Terrett,M.Gardner,D.W.Gordon,R.J.Kobylecki,J.Steele,Tetrahedron,51,8135−73(1995))によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物、あるいは、本発明のスクリーニング法により選択された化合物(ペプチドを含む)を化学的又は生物学的に修飾した化合物(ペプチドを含む)を挙げることができる。
上記スクリーニングする方法として限定はされないが具体的には以下のスクリーニング方法が挙げられる。
1)Akt2のリン酸化を利用したスクリーニング方法
Akt2は分子内のSer473がリン酸化されてキナーゼ活性が亢進することが知られている。これを利用し、Akt2のSer473のリン酸化状態を抗phosphoSer抗体を用いたウエスタンブロットにより検出することでAkt2の活性の有無が検出できる。
本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。試験物質を未処理又は処理した細胞を溶解し、これを試料として抗phosphoSer抗体を用いるウエスタンブロット法、スポットウエスタンブロット法などを利用することによりAkt2のリン酸化、すなわちAkt2の活性の有無を検出することができる。この検出系において、試験物質を未処理の試料に比較してAkt2のリン酸化(すなわちAkt2の活性化)の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のポリペプチドとAkt2との結合を促進する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
2)in vitro kinase法を利用したスクリーニング法
内在性のAkt2基質を用いたin vitro kinase法によってもAkt2活性を検出することができる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞に試験物質を未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Akt2抗体を用いた免疫沈降により活性化したAkt2蛋白質を濃縮することができる。タグをつけて精製したAkt2の内在性基質、例えば、GST−crosstide(Aktが生理的基質としているGSK3−betaの配列のGST融合タンパク)と濃縮Akt2蛋白質とを混合することにより、基質のリン酸化を指標としてAkt2のキナーゼ活性を測定及び定量化できる。キナーゼ測定は、トータルキーナーゼアッセイ法(Wagaら、J.Immunol..Methods 190,pp71−77,1996)を利用することにより大規模な数の化合物のスクリーニング方法として使用が可能である。この測定系において、試験物質を未処理の試料に比較してAkt2のキナーゼ活性の亢進が観察された試料に処理した物質を本発明のポリペプチドとAkt2との結合を促進する物質として選択することができ、これによりインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬、即ち糖尿病治療効果を有する物質をスクリーニングすることができる。
3)本発明のポリペプチドとAkt2との結合を利用したスクリーニング方法
本発明のポリペプチドはAkt2との結合を介してインスリンシグナルを正に制御していることから、本発明のポリペプチドとAkt2との結合を指標とした以下のスクリーニング方法が挙げられる。具体的には、本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域、あるいはGSTやFlag、HISなどのタグを融合させた本発明のポリペプチドの一部あるいは全長域を発現させた試験用細胞を試験物質で未処理又は処理する。試験用細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。前記細胞から抗Akt2抗体を用いた免疫沈降によりAkt2蛋白質とそこに結合する蛋白質を濃縮することができる。この濃縮過程では反応液中に上記で細胞を処理した同じ試験物質を含有させておくことが望ましい。得られたAkt2およびその結合蛋白質の濃縮液を公知の方法によりポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗体を用いたウエスタンブロティングにより本発明のポリペプチドの量を測定することにより、本発明のポリペプチドとAkt2の結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。ここで用いる抗体は、本発明のポリペプチド或いはその部分配列をもとに作製した本発明のポリペプチドに対する抗体(例えば抗AKBP1抗体)、あるいは上記タグを認識する抗体を利用することができる。また上述と同様に本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液に試験物質を添加あるいは未添加したものから、GSTなどのタグをつけて精製したAkt2蛋白質を用いたin vitroのプルダウン法(実験工学、Vol13、No.6、1994年528頁 松七五三ら)と上述と同様のウエスタンブロッティングを組み合わせるによってもAkt2と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。あるいはここで本発明のポリペプチドを発現させた細胞の抽出液を用いずに、本発明のポリペプチドの発現プラスミド(例えば実施例1(5)で作製したAKBP1発現プラスミド)から直接本発明のポリペプチドである蛋白質(例えばAKBP1蛋白質)をTNTキット(プロメガ社)等を用いてin vitroで転写及び翻訳して作製した蛋白質混合液に試験物質を添加あるいは未添加したものを用いても同様にAkt2と本発明のポリペプチド(例えばAKBP1)の結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択することができる。これらの方法ではいずれもポリアクリルアミド電気泳動法を行わずに公知のスポットウエスタンブロッティングを行うことにより多数の試験物質をスクリーニングすることが可能である。また上述と同様のタグを融合させて発現させた本発明のポリペプチドおよびAkt2を同時に発現させた細胞の溶解液に試験物質を添加することからなる公知のELISA法に従ってもAkt2と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を選択するスクリーニングが可能である。また公知の哺乳類細胞におけるツーハイブリッドシステム(クロンテック社)を利用して、ベイトにGAL4のDNA結合領域と融合させたAkt2を、プレイ側にVP16の転写促進領域を融合させた本発明のポリペプチドを配置することにより、既存のCATあるいはルシフェラーゼ活性の検出によりAkt2と本発明のポリペプチドの結合を促進、あるいは安定させる試験物質を大多数の母集団からスクリーニングし選択することが可能である。
インスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬をスクリーニングする方法として本発明のポリペプチドの発現量を測定することによるスクリーニング方法が挙げられる。糖尿病モデルマウスでAKBP1のマウスオルソログの発現が減弱していること(実施例4)、およびAKBP1を過剰発現させた脂肪細胞で糖の取り込みが亢進していること(実施例6)から、内在性のAKBP1の発現量を試験物質により増加させることが可能であれば、該試験物質はインスリン抵抗性を改善する作用を持つことが予想される。このような物質は具体的には以下の方法によって選択することができる。
まず試験物質で未処理又は処理した細胞から実施例4(1)に示した方法に従ってRNAを調製することができる。該細胞としてはインスリンに応答する細胞が好ましく、より具体的には脂肪細胞、肝細胞、あるいは骨格筋由来細胞が好ましい。このRNA調製液から公知の方法に従ってアガロースゲル電気泳動によりRNAを分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、これを本発明のポリヌクレオチドの配列を含むラベルした短鎖DNAプローブを用いたノーザンプロット解析により、試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するRNAの発現量の増減を検出できる。これにより本発明ポリペプチドの発現量を増加させる物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることができる。あるいは本発明のポリヌクレオチドの配列を含む短鎖DNAプライマーを用いたリアルタイムPCR法によっても試験物質による本発明ポリヌクレオチド配列を有するRNAの発現量の増減を定量的に検出できる。リアルタイムPCRはより具体的には実施例4の方法に従って実施できる。これにより本発明のポリペプチドの発現量を増加させる物質を試験物質の母集団中からスクリーニングすることが可能である。本発明のポリヌクレオチドは本スクリーニング方法に利用することができる。
<インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法>
本発明には、本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用医薬組成物の製造方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、前記有効成分のタイプに応じて、それらの製剤化に通常用いられる担体、賦形剤、及び/又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、又は経口用液剤などによる経口投与、あるいは、静注、筋注、若しくは関節注などの注射剤、坐剤、経皮投与剤、又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができる。特に胃で消化されるペプチドにあっては、静注等の非経口投与が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、1又はそれ以上の活性物質と、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。前記組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、滑沢剤、崩壊剤、安定化剤、又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。錠剤又は丸剤は、必要により糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆することができる。
経口のための液体組成物は、例えば、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、又はエリキシル剤を含むことができ、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば、精製水又はエタノールを含むことができる。前記組成物は、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えば、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、芳香剤、又は防腐剤を含有することができる。
非経口のための注射剤としては、無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、懸濁剤、又は乳濁剤を含むことができる。水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、希釈剤として、例えば、注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。非水溶性の溶液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(例えば、オリーブ油)、アルコール類(例えば、エタノール)、又はポリソルベート80等を含むことができる。前記組成物は、更に湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解若しくは溶解補助剤、又は防腐剤などを含むことができる。前記組成物は、例えば、バクテリア保留フィルターを通す濾過、殺菌剤の配合、又は照射によって無菌化することができる。また、無菌の固体組成物を製造し、使用の際に、無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、使用することもできる。
投与量は、有効成分、すなわち本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、症状、投与対象の年齢、又は性別等を考慮して、適宜決定することができる。
例えば、経口投与の場合、その投与量は、通常、成人(体重60kgとして)において、1日につき約0.1〜100mg、好ましくは0.1〜50mgである。非経口投与の場合、注射剤の形では、1日につき0.01〜50mg、好ましくは0.01〜10mgである。
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法(「Molecular Cloning」Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年、等)に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
(実施例1)AKBP1遣伝子のクローニングと発現ベクターの構築
(1)Akt2のクローニング
遺伝子データベースGenbankのアクセッション番号M95936に記載されたヒトAkt2の全長領域をコードするcDNA配列を参照して設計した配列番号3及び配列番号4で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒト筋肉cDNA(Marathon−ReadyTMcDNA;クロンテック社)を鋳型として、DNAポリメラーゼ(Pyrobest(r)DNA polymerase;宝酒造社)を用いて、95℃3分間の熱変性反応の後、98℃10秒間、60℃30秒間、74℃1分30秒からなるサイクルを40回、さらに74℃7分間の条件で、PCRを行なった。これにより生成した約1.5kbpのDNA断片を、プラスミドpZErOTM−2.1(インビトロジェン社)のEcoRV認識部位に挿入することにより、ヒトAkt2cDNAをクローニングした。ベクター上にクローニングしたAkt2 cDNAの配列は前述の配列番号3及び4に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて塩基配列を決定し、報告された配列と一致することを確認した。
(2)酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
Akt2のcDNAを酵母ツーハイブリッド用発現ベクターpDBtrp(インビトロジェン社、選択マーカーとしてTRP1遺伝子を有する)に挿入するため、Akt2遺伝子配列のそれぞれ5’側及び3’側にpDBtrpベクターのマルチクローニングサイトの前後40ヌクレオチドと相同な領域を付加した配列番号5及び6に示すプライマーを設計した。PCRは上述でクローニングしたAkt2プラスミドを鋳型として、DNAポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase;宝酒造社)を用い、98℃(1分)の後、98℃(5秒)、55℃(30秒)、72℃(3分)のサイクルを35回、繰り返した。その結果得られたDNA断片はAkt2遺伝子の全コード領域を有している。
制限酵素SaII及びNcoIで切断して直鎖上にしたベクターpDBtrp及び上記で得られたAkt2のcDNAを含むPCR断片を同時にツーハイブリッド用酵母株MaV203(インビトロジェン社)へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した(C Guthrie,R Fink Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Academic,San Diego,1991年)。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、pDBtrpのマルチクローニングサイトにAkt2 cDNAが挿入されたプラスミド(以下pDB−Akt2と略称する)が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地(DIFCO社)(20%アガロース)上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース(生化学工業)で室温にて30分処理した後、アルカリ法(「Molecular Cloning」Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年)でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて塩基配列の決定を行い、Akt2のcDNAが、pDBtrpのGAL4 DNA結合領域のコード領域と翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
(3)酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のpDB−Akt2により形質転換したツーハイブリッド用酵母株MaV203を400mlのYPD液体培地(DIFCO社)に懸濁し、波長590ナノメートルの吸光度が0.1から0.4になるまで30℃で約6時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を1.0mlの0.1Mリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞をヒト骨格筋ライブラリー(いずれもクロンテック社Match Maker cDNA library)各20μgで形質転換し、同細胞をpDB−PPARγ及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地(DIFCO社)(20%アガロース)上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたGAL4DNA結合領域の融合蛋白質に、GAL4転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子HIS3が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにHIS3がコードする酵素の阻害剤である3AT(3−AMINO−1,2,4−TRIAZOLE;シグマ社)20mMを添加した固形最小倍地(20%アガロース)上で30℃で5日間培養した。同条件下でAkt2に結合する蛋白質を発現していることを示す3AT耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を24時間YPD固形培地上で成長させた後、HIS3とは別のツーハイブリッドシステムの結合指示レポーターであるlacZ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素に付けて凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを0.4%のX−GAL(シグマ社)溶液を浸した濾紙上にのせて37°Cで24時間静置し、β−ガラクトシダーゼ青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、Akt2に結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からクロンテック社Yeast Protocols Handbookの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号7で表される塩基配列(GAL4AD領域に結合する配列;GenBankアクセッション番号U29899 Cloning vector pACT2由来)をプライマーとし、シーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて決定した結果、配列番号1に示す塩基配列の第268番目の塩基以降の配列が含まれていることを確認した。
(4)AKBP1遺伝子の全長cDNAのクローニング
前述(3)の結果、配列番号1で表される塩基配列の第268番目の塩基以降の配列を含む遺伝子断片を含むライブラリー由来のプラスミドが得られ、Akt2に結合する因子の存在が示された。そこで配列番号1で示された塩基配列の第690番目から第711番目の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号8に示すプライマーを合成(プロリゴ社)し、該プライマーと前述配列番号9で表される塩基配列のプライマーを用いて前述の骨格筋由来cDNAライブラリー中からPCR法により全長cDNAの増幅を試みた。PCRはDNAポリメラーゼ(TAKARA LA Taq;宝酒造社)を用い、94°C(2.5分)の後、94°C(5秒)・72°C(4分)のサイクルを5回、94°C(5秒)・70°C(4分)のサイクルを5回、94°C(5秒)・68°C(4分)のサイクルを25回、それぞれ繰り返した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約800塩基対のDNA断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同DNA断片を発現ベクター(pcDNA3.1/V5−His−TOPO;インビトロジェン社)にTOPO TA Cloningシステム(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入DNA断片の塩基配列を、ベクター上のT7プロモーター領域に結合するプライマー(TOPO TA Cloning kit/インビトロジェン社;配列番号10)とシーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて決定した。その結果、配列番号1に示すDNA配列を含むクローンであることを確認した。配列番号1よりさらに5’側上流に50数塩基対のDNA断片の付随が認められたが、配列番号2に示すアミノ酸配列をコードするDNAのトリプレットに従うと配列番号1の初めにあるATG(開始コドン)より上流には別の開始コドンは認められず、ストップコドンのトリプレットが存在した。これにより配列番号1に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をAKBP1遣伝子と名付けた。
(5)AKBP1発現ベクターの作製
前述(4)で得られたAKBP1遣伝子の全長配列を含むプラスミドから、配列番号1に示す塩基配列情報に従い、正味AKBP1蛋白質をコードするAKBP1 cDNAを、配列番号9、及び配列番号8を用いてPCR法により増幅した。これら2種類のDNAプライマーはそれぞれ配列番号1に示すAKBP1遺伝子の5’側、3’側の短い配列部分と相同な塩基配列を有する。これらのプライマーはAKBP1蛋白質のN末端側にFlagタグ(DYKDDDDK)が、C末端側にベクター由来のV5エピトープ(paramyxovirus SV5のV protein由来、Sourhern J A(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10104−10108)及びHIS6タグ(Lindner P(1997)BioTechniques 22,140−149)がそれぞれ融合されるように設計した。したがって配列番号9に示すプライマーはクローニング後、AKBP1のN末端側のFlagタグが翻訳されるように開始コドンを該タグの直前へ移動するよう設計した。配列番号8に示すプライマーはクローニング後3’側にベクター由来のV5エピトープがAKBP1遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くようにAKBP1のストップコドン配列が除かれるよう設計した。PCR反応はDNAポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase;宝酒造社)を用い、98℃(1分)の後、98°C(5秒)、55°C(30秒)、72°C(3分)のサイクルを35回繰り返した。その結果得られた743塩基対のAKBP1 cDNAをふくむDNA断片を前述の発現ベクターpcDNA3.1/V5−His−TOPOにクローニングした。得られたプラスミド中の挿入DNA断片の塩基配列を上述(4)と同様にして決定した結果、配列番号1に示すDNA配列の3’側のストップコドンを除いたDNAが挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをpcDNA−AKBP1と略記する。
(実施例2)AKBP1蛋白質を発現する培養細胞の作製
(1)AKBP1発現細胞の作製
上述の実施例1(5)で作製した発現プラスミドpcDNA−AKBP1をCOS−1細胞に導入した。COS−1細胞は6ウェル培養プレート(ウェル直径35mm)の培養皿に各ウェル2mlの10%牛胎児血清(シグマ社)を含む最少必須培地DMEM(ギブコ社)を加えて70%コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法(Graham Lら Virology、52巻456頁1973年、新井直子、遺伝子導入と発現/解析法13−15頁1994年)により、pcDNA−AKBP1(1.0μg/ウェル)を一過性にトランスフェクトした。48時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液(以下PBSと略称する)で洗浄した後にウェルあたり0.1mlの細胞溶解液(100mM リン酸カリウム(pH7.8)、0.2%トリトンX−100)を添加して細胞を溶解した。
(2)AKBP1蛋白質の検出
上述<実施例2>(1)のAKBP1発現細胞の溶解液10μlに10μlの2倍濃度SDSサンプルバッファー(125mMトリス塩酸(pH6.8)、3%ラウレル硫酸ナトリウム、20%グリセリン、0.14M βメルカプトエタノール、0.02%ブロムフェノルブルー)を添加し、100℃で2分間処理した後、10%のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置(バイオラッド社)を用いてポリアクリルアミド中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のAKBP1蛋白質の検出を行った。一次抗体にはAKBP1のC末端に融合させたV5エピトープを認識するモノクローナル抗体(インビトロジェン社)を用い、二次抗体にはラビットIgG−HRP融合抗体(バイオラッド社)を用いた。結果図1に示す通り、290アミノ酸からなるFlag−AKBP1−V3−HIS6融合蛋白質を示す約32kDaの蛋白質が発現ベクターpcDNA−AKBP1の存在に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のAKBP1遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとることが明らかになった。
(実施例3)AKBP1遺伝子の組織別発現分布解析
AKBP1蛋白質はAkt2と相互作用することから、該蛋白質はインスリンに応答する組織で発現し、インスリンシグナル第一経路に作用することが予想された。そこで配列番号11、及び配列番号12に示すAKBP1に相同な一対のプライマーを用いて、配列番号1に示すAKBP1遺伝子の第360番目から第647番目までの288塩基対のAKBP1部分DNA断片を、各種組織由来cDNAからPCR反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるAKBP1の発現の有無を調べた。ヒト骨髄、脳、軟骨、心臓、腎臓、白血球、肝臓、肺、リンパ球、乳腺、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、骨格筋、HeLa細胞由来のcDNAライブラリー(クロンテック社)各1μgをテンプレートとしてDNAポリメラーゼ(AmpliTaq(r)DNA polymerase;アプライドバイオシステム社)を用い、94°C(2.5分)の後、94°C(30秒)、55°C(30秒)、72°C(1分)のPCRサイクルを35回繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、HeLa細胞、乳腺由来の各cDNAライブラリーからは所望するAKBP1の部分断片を含むと思われる約300塩基対のDNA断片が増幅されたが、骨髄、脳、肺、胎盤由来の各cDNAライブラリーからは約500塩基対のDNA断片、軟骨、白血球のそれらからは約400塩基対のDNA断片、前立腺のそれからは約1000塩基対のDNA断片がそれぞれ増幅された。これらのDNA断片を各々アガロースゲル中から分離した後、上述の<実施例1>(4)に記した方法に従い該DNA断片の塩基配列をそれぞれ決定した。骨髄、脳、肺、胎盤由来の各cDNAから増幅された断片、軟骨、白血球由来cDNAから得られた断片、前立腺から得られた断片、乳腺から得られた断片、及びHeLa細胞由来の断片は、それぞれ配列番号13〜17に示される、各500塩基対、400塩基対、1000塩基対の配列であった。配列番号1に示したAKBP1と同一の配列を有するものは骨格筋由来cDNAから増幅されたもののみであり、骨髄、脳、肺、胎盤、軟骨、白血球、前立腺において発現しているものは該由来組織に特有のAKBP1のスプライシングバリアントであることが明らかになった。
これら配列番号13から17に示される上述の組織由来のポリヌクレオチドを配列番号1に示されたAKBP1遺伝子の第360番目の塩基から647番目の塩基部分に置き換えると、上述の組織由来のAKBP1スプライシングバリアントは、配列番号2に示されたAKBP1蛋白質の第121番目に相当するアミノ酸以降からストップコドンまでそれぞれ配列番号18〜22に示されるポリペプチドをコードしており、いずれもAKBP1蛋白質と同一のものを発現する配列は存在しなかった。このことから、配列番号1及び2で示される本発明AKBP1遺伝子及びAKBP1蛋白質の発現は、インスリンシグナルに応答する骨格筋などごく限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
(実施例4)正常及び糖尿病モデルマウスにおけるAKBP1発現量の測定
上述の知見に基づき、本発明のAKBP1蛋白質はAkt2と相互作用し、その発現は骨格筋などの、インスリン応答組織で特異的に制御されていることが判明し、本発明AKBP1蛋白質はインスリンシグナル第一経路に作用する因子であり、その作動の様態がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで2種類の糖尿病モデルマウスKKAy/Ta(Iwatsuka et al.Endocrinol.Japon.,17,23−35,1970、Taketomiet et al.,Horm.Metab.Res.,7,242−246,1975)、C57BL/KsJ−db/db(Chen et al.,Cell,84,491−495,1996、Lee et la.,Nature,379,632−635,1996、Kaku et al.,Diabetologia,32,636−643,1989)の脂肪における本発明のAKBP1遺伝子のマウスオルソログ遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)発現量を測定し、その比較を行った。
遺伝子発現量の測定は本発明AKBP1遺伝子のマウスオルソログの部分配列に対して行い、同時にグリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase(G3PDH))遺伝子の発現量を測定して補正した。測定はのPRISMTM7700 Sequence Detection SystemとSYBR Green PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社)を用いて測定した。この原理は、PCRで増幅された2本鎖DNAがとりこむSYBR Green I色素の蛍光量をリアルタイムに定量することにより遣伝子発現量を検出するシステムである。
具体的には、以下の手順により測定した。
(1)全RNAの調製
全RNAはRNA抽出用試薬(Isogen;ニッポンジーン社)を用いて説明書に従い、15週齢のオスのC57BL/6Jマウス、KKAy/Taマウス、C57BL/KsJ−dbm m+/m+マウス、C57BL/KsJ−dbm db/dbマウス(いずれも日本クレアより購入)の副睾丸脂肪から調製した。C57BL/6JマウスとC57BL/KsJ−dbm m+/m+マウスは健常マウス、KKAy/TaマウスとC57BL/KsJ−dbm db/dbマウスは2型糖尿病モデルマウスとしてよく知られている。調製した全RNAはその後デオキシリボヌクレアーゼ[deoxyribonuclease(DNase;ニッポンジーン社)]処理を行い、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し−20℃で保存した。
(2)1本鎖cDNAの合成
RNAから1本鎖cDNAへの逆転写は、0.25μgのRNAを逆転写反応用キット(AdvantageTMRT−for−PCR Kit;クロンテック社)を用いて20μlの系で行った。逆転写後、−20℃で保存した。以下に述べる遺伝子発現量の測定には100倍希釈したcDNAを使用した。
(3)PCRプライマーの作製
配列番号1に示すAKBP1遺伝子の全長配列をマウス遺伝子のデータベースに対してホモロジー検索(NCBI Blast)を行い、配列番号23に示すマウスAKBP1オルソログの遣伝子断片を見出した。該マウスAKBP1オルソログのポリヌクレオチド配列は配列番号1のヒトAKBP1遺伝子の第299番目から第421番目の塩基までの配列部分に相当する。この配列情報をもとに配列番号24及び25に示すマウスAKBP1オルソログの遺伝子断片を増幅できるプライマー一対を設計した。配列番号24及び25に示すプライマー対により、実施例3に示したスプライシングバリアントのオルソログは増幅されず、AKBP1オルソログのみ特異的に増幅される。別にマウスG3PDHの遺伝子断片を増幅するプライマー(配列番号26及び27)を設計した。これら配列番号24、25、及び配列番号26、27に示した各一対のプライマーを組み合わせ、PRISMTM7700 Sequence Detection SystemによるPCRでマウスAKBP1オルソログ及びマウスG3PDHの各遺伝子断片を増幅した。
(4)遺伝子発現量の測定
PRISMTM7700 Sequence Detection SystemによるPCR増幅のリアルタイム測定は25μlの系で説明書に従って行った。各系において先述の100倍希釈した1本鎖cDNAは5μl、2xSYBR Green試薬を12.5μl、各プライマーは7.5pmol使用した。なお検量線作成には、1本鎖cDNAに代えて0.1μg/μlのマウスゲノムDNA(クロンテック社)を10倍から30000倍まで適当に希釈したものを5μl用いた。PCRは、50℃10分に続いて95℃10分の後、95℃15秒、60℃1分間の2ステップからなる工程を40サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスAKBP1遺伝子の発現量は、下記式に基づいてG3PDH遣伝子の発現量で補正した。
[AKBP1補正発現量]=[AKBP1遺伝子の発現量(生データ)]/[G3PDH遺伝子の発現量(生データ)]
上述の結果、図2に示すとおり、糖尿病病態マウスの副睾丸脂肪において本発明AKBP1のマウスオルソログ遺伝子の発現は顕著な減少が認められた。
従って本発明のAKBP1はその機能低下によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のAKBP1の関与が大きいと結論づけられる。
本実施例の結果より、AKBP1発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
(実施例5)AKBP1高発現細胞における糖取り込み能の測定
(1)アデノウイルスベクターを利用したAKBP1高発現ウイルスの作製
ヒトAKBP1をコードする遺伝子断片を、pcDNA−AKBP1ベクターより制限酵素BgIII、NotIを用いて切り出し、アデノウイルスベクターpAdTrack−CMVベクター(HeT.C.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,95,2509−2514,1998)のマルチクローニングサイト(BgIIIおよびNotI)に挿入し、AKBP1/pAdTrack−CMVベクターを得た。
以下、公知のプロトコール[“A Practical Guide for using the AdEasy System”](HYPERLINK“http://www.coloncancer.org/adeasy.htm”“http://www.coloncancer.org/adeasy/protocol2.htm”)]に従い、AKBP1を発現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、pAdTrack−CMVより調製した。
なおウイルス量は260nmにおける吸光度(A260)を測定し、下記の計算式で換算した。
[式] 1 A260=1.1×1012ウイルス粒子=3.3×1011pfu/ml
(2)肪細胞の分化とヒトAKBP1発現アデノウイルスの添加
3T3−L1細胞を用いてヒトAKBP1の糖とりこみに対する効果を評価した。3T3−L1細胞を10%ウシ胎児血清(FCS)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に懸濁し、1.6×105個/穴になるようにコラーゲンコートした24穴プレート(旭テクノグラス社)にまいた。翌日、10μg/mlインスリン、250nMデキサメサゾン、0.5mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)を加えたDMEM(10%FCS)に培地を交換して3T3−L1細胞の分化を誘導した。その2日後、培地を0.4mlのDMEM(10%FCS)に戻した。その4日後、コントロール用アデノウイルス又はAKBP1を発現させるアデノウイルスを1穴あたり1.6×1010pfuの濃度で培地に添加した。
(3)ヒトAKBP1高発現細胞における糖取り込み能の測定
アデノウイルス添加して36時間後、ウシ胎児血清を含まないDMEMに交換して3時間おいた。その後、糖取り込みに対する効果を評価した。まず培地を所定濃度のインスリンを含むKRP緩衝液(136mM NaCl,4.7mM KCl,1.25mM CaCl2,1.25mM MgSO4,5mM Na2HPO4,pH7.4)0.25mlに交換し、37℃で20分インキュベートした。次に1mMの2−デオキシ−D−グルコースを含むKRPに1mlあたり15μlの2−デオキシ−D−[U−14C]グルコース(アマシャムバイオサイエンス社)を加えたものを用意し、各穴に50μlずつ添加して37℃で10分インキュベートした。その後、冷えたリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で3回洗い、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて細胞を溶解し、2mlのシンチレーター(Aquazol−2、パッカードバイオサイエンス社)と混合して、細胞内に取り込まれたグルコース量を液体シンチレーションアナライザー(トライカーブB2500TR、パッカード社)を用いて測定した。
結果を図3に示す。図中の記号「*」はStuden’s t−testにおける評価を示す。「**」は、コントロール群に対する有意差がp<0.01であることを、「***」は同有意差がp<0.001であることを意味している。図の縦軸は2−D−グルコース取り込み量を示し、横軸はインスリン濃度を示す。白塗りのバーはコントロールの値を、黒塗りのバーはAKBP1高発現細胞の値を示す。図3に示す通り、本発明のAKBP1遺伝子を脂肪細胞に高発現させると低インスリン濃度下で糖取り込み量が増加することが判明した。
(実施例1)AKBP1遣伝子のクローニングと発現ベクターの構築
(1)Akt2のクローニング
遺伝子データベースGenbankのアクセッション番号M95936に記載されたヒトAkt2の全長領域をコードするcDNA配列を参照して設計した配列番号3及び配列番号4で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒト筋肉cDNA(Marathon−ReadyTMcDNA;クロンテック社)を鋳型として、DNAポリメラーゼ(Pyrobest(r)DNA polymerase;宝酒造社)を用いて、95℃3分間の熱変性反応の後、98℃10秒間、60℃30秒間、74℃1分30秒からなるサイクルを40回、さらに74℃7分間の条件で、PCRを行なった。これにより生成した約1.5kbpのDNA断片を、プラスミドpZErOTM−2.1(インビトロジェン社)のEcoRV認識部位に挿入することにより、ヒトAkt2cDNAをクローニングした。ベクター上にクローニングしたAkt2 cDNAの配列は前述の配列番号3及び4に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて塩基配列を決定し、報告された配列と一致することを確認した。
(2)酵母ツーハイブリッド用発現プラスミドの作製
Akt2のcDNAを酵母ツーハイブリッド用発現ベクターpDBtrp(インビトロジェン社、選択マーカーとしてTRP1遺伝子を有する)に挿入するため、Akt2遺伝子配列のそれぞれ5’側及び3’側にpDBtrpベクターのマルチクローニングサイトの前後40ヌクレオチドと相同な領域を付加した配列番号5及び6に示すプライマーを設計した。PCRは上述でクローニングしたAkt2プラスミドを鋳型として、DNAポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase;宝酒造社)を用い、98℃(1分)の後、98℃(5秒)、55℃(30秒)、72℃(3分)のサイクルを35回、繰り返した。その結果得られたDNA断片はAkt2遺伝子の全コード領域を有している。
制限酵素SaII及びNcoIで切断して直鎖上にしたベクターpDBtrp及び上記で得られたAkt2のcDNAを含むPCR断片を同時にツーハイブリッド用酵母株MaV203(インビトロジェン社)へ添加し、リチウム酢酸法により形質転換した(C Guthrie,R Fink Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Academic,San Diego,1991年)。その結果同酵母細胞内で相同組換えが生じ、pDBtrpのマルチクローニングサイトにAkt2 cDNAが挿入されたプラスミド(以下pDB−Akt2と略称する)が形成された。同プラスミドを有する酵母細胞を、プラスミドの選択マーカーであるトリプトファンを欠乏させた固形合成最小培地(DIFCO社)(20%アガロース)上にて培養することにより選択し、同酵母細胞をザイモリエース(生化学工業)で室温にて30分処理した後、アルカリ法(「Molecular Cloning」Sambrook,Jら、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年)でプラスミドを単離精製し、シーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて塩基配列の決定を行い、Akt2のcDNAが、pDBtrpのGAL4 DNA結合領域のコード領域と翻訳フレームが一致して挿入されているものを選択した。
(3)酵母ツーハイブリッドスクリーニング
上述のpDB−Akt2により形質転換したツーハイブリッド用酵母株MaV203を400mlのYPD液体培地(DIFCO社)に懸濁し、波長590ナノメートルの吸光度が0.1から0.4になるまで30℃で約6時間振とう培養した後、リチウム酢酸法でコンピテントセルとし、最終量を1.0mlの0.1Mリチウム−トリス緩衝液に懸濁した。同細胞をヒト骨格筋ライブラリー(いずれもクロンテック社Match Maker cDNA library)各20μgで形質転換し、同細胞をpDB−PPARγ及びライブラリーそれぞれのプラスミドの選択マーカーであるトリプトファン、ロイシンを欠乏させた固形合成最小培地(DIFCO社)(20%アガロース)上にて培養することにより選別し、両プラスミドが導入された形質転換株を得た。同時に同じ形質転換細胞をトリプトファン、ロイシンのほかに、ツーハイブリッドシステムにおいて人工的に発現させたGAL4DNA結合領域の融合蛋白質に、GAL4転写促進領域の融合蛋白質が結合した場合に発現するレポーター遺伝子HIS3が作動した細胞を選択するため、ヒスチジンを培地から除き、さらにHIS3がコードする酵素の阻害剤である3AT(3−AMINO−1,2,4−TRIAZOLE;シグマ社)20mMを添加した固形最小倍地(20%アガロース)上で30℃で5日間培養した。同条件下でAkt2に結合する蛋白質を発現していることを示す3AT耐性の酵母のコロニーを取得した。これらの酵母細胞を24時間YPD固形培地上で成長させた後、HIS3とは別のツーハイブリッドシステムの結合指示レポーターであるlacZ遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ活性を指標として調べた。β−ガラクトシダーゼ活性は培地上の酵母細胞をニトロセルロースフィルターに移し取り、液体窒素に付けて凍結させた後、室温で解凍し、フィルターを0.4%のX−GAL(シグマ社)溶液を浸した濾紙上にのせて37°Cで24時間静置し、β−ガラクトシダーゼ青色変化を測定した。フィルター上に写し取った細胞内容物が白色から青色に変化したコロニーを選択することにより、Akt2に結合する蛋白質を発現している酵母細胞を特定し、同細胞からクロンテック社Yeast Protocols Handbookの方法に従ってライブラリー由来のプラスミドを抽出した。そこに含まれる遺伝子断片の塩基配列を、配列番号7で表される塩基配列(GAL4AD領域に結合する配列;GenBankアクセッション番号U29899 Cloning vector pACT2由来)をプライマーとし、シーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて決定した結果、配列番号1に示す塩基配列の第268番目の塩基以降の配列が含まれていることを確認した。
(4)AKBP1遺伝子の全長cDNAのクローニング
前述(3)の結果、配列番号1で表される塩基配列の第268番目の塩基以降の配列を含む遺伝子断片を含むライブラリー由来のプラスミドが得られ、Akt2に結合する因子の存在が示された。そこで配列番号1で示された塩基配列の第690番目から第711番目の塩基配列の相補鎖に相当する配列番号8に示すプライマーを合成(プロリゴ社)し、該プライマーと前述配列番号9で表される塩基配列のプライマーを用いて前述の骨格筋由来cDNAライブラリー中からPCR法により全長cDNAの増幅を試みた。PCRはDNAポリメラーゼ(TAKARA LA Taq;宝酒造社)を用い、94°C(2.5分)の後、94°C(5秒)・72°C(4分)のサイクルを5回、94°C(5秒)・70°C(4分)のサイクルを5回、94°C(5秒)・68°C(4分)のサイクルを25回、それぞれ繰り返した。PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、約800塩基対のDNA断片が増幅されたことを確認した。そこで反応液中の同DNA断片を発現ベクター(pcDNA3.1/V5−His−TOPO;インビトロジェン社)にTOPO TA Cloningシステム(インビトロジェン社)を用いてクローニングした。得られたプラスミド中の挿入DNA断片の塩基配列を、ベクター上のT7プロモーター領域に結合するプライマー(TOPO TA Cloning kit/インビトロジェン社;配列番号10)とシーケンシングキット(アプライドバイオシステム社)及びシーケンサー(ABI 3700 DNA sequencerアプライドバイオシステムズ社)を用いて決定した。その結果、配列番号1に示すDNA配列を含むクローンであることを確認した。配列番号1よりさらに5’側上流に50数塩基対のDNA断片の付随が認められたが、配列番号2に示すアミノ酸配列をコードするDNAのトリプレットに従うと配列番号1の初めにあるATG(開始コドン)より上流には別の開始コドンは認められず、ストップコドンのトリプレットが存在した。これにより配列番号1に示す遺伝子のオープンリーディングフレームを確定した。この遺伝子をAKBP1遣伝子と名付けた。
(5)AKBP1発現ベクターの作製
前述(4)で得られたAKBP1遣伝子の全長配列を含むプラスミドから、配列番号1に示す塩基配列情報に従い、正味AKBP1蛋白質をコードするAKBP1 cDNAを、配列番号9、及び配列番号8を用いてPCR法により増幅した。これら2種類のDNAプライマーはそれぞれ配列番号1に示すAKBP1遺伝子の5’側、3’側の短い配列部分と相同な塩基配列を有する。これらのプライマーはAKBP1蛋白質のN末端側にFlagタグ(DYKDDDDK)が、C末端側にベクター由来のV5エピトープ(paramyxovirus SV5のV protein由来、Sourhern J A(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,10104−10108)及びHIS6タグ(Lindner P(1997)BioTechniques 22,140−149)がそれぞれ融合されるように設計した。したがって配列番号9に示すプライマーはクローニング後、AKBP1のN末端側のFlagタグが翻訳されるように開始コドンを該タグの直前へ移動するよう設計した。配列番号8に示すプライマーはクローニング後3’側にベクター由来のV5エピトープがAKBP1遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くようにAKBP1のストップコドン配列が除かれるよう設計した。PCR反応はDNAポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase;宝酒造社)を用い、98℃(1分)の後、98°C(5秒)、55°C(30秒)、72°C(3分)のサイクルを35回繰り返した。その結果得られた743塩基対のAKBP1 cDNAをふくむDNA断片を前述の発現ベクターpcDNA3.1/V5−His−TOPOにクローニングした。得られたプラスミド中の挿入DNA断片の塩基配列を上述(4)と同様にして決定した結果、配列番号1に示すDNA配列の3’側のストップコドンを除いたDNAが挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをpcDNA−AKBP1と略記する。
(実施例2)AKBP1蛋白質を発現する培養細胞の作製
(1)AKBP1発現細胞の作製
上述の実施例1(5)で作製した発現プラスミドpcDNA−AKBP1をCOS−1細胞に導入した。COS−1細胞は6ウェル培養プレート(ウェル直径35mm)の培養皿に各ウェル2mlの10%牛胎児血清(シグマ社)を含む最少必須培地DMEM(ギブコ社)を加えて70%コンフルエントの状態になるまで培養した。この細胞にリン酸カルシウム法(Graham Lら Virology、52巻456頁1973年、新井直子、遺伝子導入と発現/解析法13−15頁1994年)により、pcDNA−AKBP1(1.0μg/ウェル)を一過性にトランスフェクトした。48時間培養した後、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝液(以下PBSと略称する)で洗浄した後にウェルあたり0.1mlの細胞溶解液(100mM リン酸カリウム(pH7.8)、0.2%トリトンX−100)を添加して細胞を溶解した。
(2)AKBP1蛋白質の検出
上述<実施例2>(1)のAKBP1発現細胞の溶解液10μlに10μlの2倍濃度SDSサンプルバッファー(125mMトリス塩酸(pH6.8)、3%ラウレル硫酸ナトリウム、20%グリセリン、0.14M βメルカプトエタノール、0.02%ブロムフェノルブルー)を添加し、100℃で2分間処理した後、10%のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、試料中に含まれている蛋白質を分離した。セミドライ式ブロッティング装置(バイオラッド社)を用いてポリアクリルアミド中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写した後、常法に従いウエスタンブロッティング法により該ニトロセルロース上のAKBP1蛋白質の検出を行った。一次抗体にはAKBP1のC末端に融合させたV5エピトープを認識するモノクローナル抗体(インビトロジェン社)を用い、二次抗体にはラビットIgG−HRP融合抗体(バイオラッド社)を用いた。結果図1に示す通り、290アミノ酸からなるFlag−AKBP1−V3−HIS6融合蛋白質を示す約32kDaの蛋白質が発現ベクターpcDNA−AKBP1の存在に依存して検出されることを確認した。これにより、培養細胞中でクローニングした前述のAKBP1遺伝子は全長領域が確かに発現し、蛋白質として安定な構造をとることが明らかになった。
(実施例3)AKBP1遺伝子の組織別発現分布解析
AKBP1蛋白質はAkt2と相互作用することから、該蛋白質はインスリンに応答する組織で発現し、インスリンシグナル第一経路に作用することが予想された。そこで配列番号11、及び配列番号12に示すAKBP1に相同な一対のプライマーを用いて、配列番号1に示すAKBP1遺伝子の第360番目から第647番目までの288塩基対のAKBP1部分DNA断片を、各種組織由来cDNAからPCR反応を用いて増幅を試み、各種組織におけるAKBP1の発現の有無を調べた。ヒト骨髄、脳、軟骨、心臓、腎臓、白血球、肝臓、肺、リンパ球、乳腺、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、骨格筋、HeLa細胞由来のcDNAライブラリー(クロンテック社)各1μgをテンプレートとしてDNAポリメラーゼ(AmpliTaq(r)DNA polymerase;アプライドバイオシステム社)を用い、94°C(2.5分)の後、94°C(30秒)、55°C(30秒)、72°C(1分)のPCRサイクルを35回繰り返した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分離した結果、骨格筋、HeLa細胞、乳腺由来の各cDNAライブラリーからは所望するAKBP1の部分断片を含むと思われる約300塩基対のDNA断片が増幅されたが、骨髄、脳、肺、胎盤由来の各cDNAライブラリーからは約500塩基対のDNA断片、軟骨、白血球のそれらからは約400塩基対のDNA断片、前立腺のそれからは約1000塩基対のDNA断片がそれぞれ増幅された。これらのDNA断片を各々アガロースゲル中から分離した後、上述の<実施例1>(4)に記した方法に従い該DNA断片の塩基配列をそれぞれ決定した。骨髄、脳、肺、胎盤由来の各cDNAから増幅された断片、軟骨、白血球由来cDNAから得られた断片、前立腺から得られた断片、乳腺から得られた断片、及びHeLa細胞由来の断片は、それぞれ配列番号13〜17に示される、各500塩基対、400塩基対、1000塩基対の配列であった。配列番号1に示したAKBP1と同一の配列を有するものは骨格筋由来cDNAから増幅されたもののみであり、骨髄、脳、肺、胎盤、軟骨、白血球、前立腺において発現しているものは該由来組織に特有のAKBP1のスプライシングバリアントであることが明らかになった。
これら配列番号13から17に示される上述の組織由来のポリヌクレオチドを配列番号1に示されたAKBP1遺伝子の第360番目の塩基から647番目の塩基部分に置き換えると、上述の組織由来のAKBP1スプライシングバリアントは、配列番号2に示されたAKBP1蛋白質の第121番目に相当するアミノ酸以降からストップコドンまでそれぞれ配列番号18〜22に示されるポリペプチドをコードしており、いずれもAKBP1蛋白質と同一のものを発現する配列は存在しなかった。このことから、配列番号1及び2で示される本発明AKBP1遺伝子及びAKBP1蛋白質の発現は、インスリンシグナルに応答する骨格筋などごく限定された臓器で特異的に制御されていることが判明した。
(実施例4)正常及び糖尿病モデルマウスにおけるAKBP1発現量の測定
上述の知見に基づき、本発明のAKBP1蛋白質はAkt2と相互作用し、その発現は骨格筋などの、インスリン応答組織で特異的に制御されていることが判明し、本発明AKBP1蛋白質はインスリンシグナル第一経路に作用する因子であり、その作動の様態がインスリン抵抗性に関わることが予想された。そこで2種類の糖尿病モデルマウスKKAy/Ta(Iwatsuka et al.Endocrinol.Japon.,17,23−35,1970、Taketomiet et al.,Horm.Metab.Res.,7,242−246,1975)、C57BL/KsJ−db/db(Chen et al.,Cell,84,491−495,1996、Lee et la.,Nature,379,632−635,1996、Kaku et al.,Diabetologia,32,636−643,1989)の脂肪における本発明のAKBP1遺伝子のマウスオルソログ遺伝子のメッセンジャーRNA(mRNA)発現量を測定し、その比較を行った。
遺伝子発現量の測定は本発明AKBP1遺伝子のマウスオルソログの部分配列に対して行い、同時にグリセルアルデヒド 3−リン酸脱水素酵素(Glyceraldehyde 3−phosphate dehydrogenase(G3PDH))遺伝子の発現量を測定して補正した。測定はのPRISMTM7700 Sequence Detection SystemとSYBR Green PCR Master Mix(アプライドバイオシステムズ社)を用いて測定した。この原理は、PCRで増幅された2本鎖DNAがとりこむSYBR Green I色素の蛍光量をリアルタイムに定量することにより遣伝子発現量を検出するシステムである。
具体的には、以下の手順により測定した。
(1)全RNAの調製
全RNAはRNA抽出用試薬(Isogen;ニッポンジーン社)を用いて説明書に従い、15週齢のオスのC57BL/6Jマウス、KKAy/Taマウス、C57BL/KsJ−dbm m+/m+マウス、C57BL/KsJ−dbm db/dbマウス(いずれも日本クレアより購入)の副睾丸脂肪から調製した。C57BL/6JマウスとC57BL/KsJ−dbm m+/m+マウスは健常マウス、KKAy/TaマウスとC57BL/KsJ−dbm db/dbマウスは2型糖尿病モデルマウスとしてよく知られている。調製した全RNAはその後デオキシリボヌクレアーゼ[deoxyribonuclease(DNase;ニッポンジーン社)]処理を行い、フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿して滅菌水に溶解し−20℃で保存した。
(2)1本鎖cDNAの合成
RNAから1本鎖cDNAへの逆転写は、0.25μgのRNAを逆転写反応用キット(AdvantageTMRT−for−PCR Kit;クロンテック社)を用いて20μlの系で行った。逆転写後、−20℃で保存した。以下に述べる遺伝子発現量の測定には100倍希釈したcDNAを使用した。
(3)PCRプライマーの作製
配列番号1に示すAKBP1遺伝子の全長配列をマウス遺伝子のデータベースに対してホモロジー検索(NCBI Blast)を行い、配列番号23に示すマウスAKBP1オルソログの遣伝子断片を見出した。該マウスAKBP1オルソログのポリヌクレオチド配列は配列番号1のヒトAKBP1遺伝子の第299番目から第421番目の塩基までの配列部分に相当する。この配列情報をもとに配列番号24及び25に示すマウスAKBP1オルソログの遺伝子断片を増幅できるプライマー一対を設計した。配列番号24及び25に示すプライマー対により、実施例3に示したスプライシングバリアントのオルソログは増幅されず、AKBP1オルソログのみ特異的に増幅される。別にマウスG3PDHの遺伝子断片を増幅するプライマー(配列番号26及び27)を設計した。これら配列番号24、25、及び配列番号26、27に示した各一対のプライマーを組み合わせ、PRISMTM7700 Sequence Detection SystemによるPCRでマウスAKBP1オルソログ及びマウスG3PDHの各遺伝子断片を増幅した。
(4)遺伝子発現量の測定
PRISMTM7700 Sequence Detection SystemによるPCR増幅のリアルタイム測定は25μlの系で説明書に従って行った。各系において先述の100倍希釈した1本鎖cDNAは5μl、2xSYBR Green試薬を12.5μl、各プライマーは7.5pmol使用した。なお検量線作成には、1本鎖cDNAに代えて0.1μg/μlのマウスゲノムDNA(クロンテック社)を10倍から30000倍まで適当に希釈したものを5μl用いた。PCRは、50℃10分に続いて95℃10分の後、95℃15秒、60℃1分間の2ステップからなる工程を40サイクル繰り返すことにより行った。
各試料におけるマウスAKBP1遺伝子の発現量は、下記式に基づいてG3PDH遣伝子の発現量で補正した。
[AKBP1補正発現量]=[AKBP1遺伝子の発現量(生データ)]/[G3PDH遺伝子の発現量(生データ)]
上述の結果、図2に示すとおり、糖尿病病態マウスの副睾丸脂肪において本発明AKBP1のマウスオルソログ遺伝子の発現は顕著な減少が認められた。
従って本発明のAKBP1はその機能低下によりインスリン抵抗性を惹起すると考えられる。以上のことからインスリン抵抗性に本発明のAKBP1の関与が大きいと結論づけられる。
本実施例の結果より、AKBP1発現量の測定により糖尿病病態の診断が出来ることが明らかとなった。
(実施例5)AKBP1高発現細胞における糖取り込み能の測定
(1)アデノウイルスベクターを利用したAKBP1高発現ウイルスの作製
ヒトAKBP1をコードする遺伝子断片を、pcDNA−AKBP1ベクターより制限酵素BgIII、NotIを用いて切り出し、アデノウイルスベクターpAdTrack−CMVベクター(HeT.C.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,95,2509−2514,1998)のマルチクローニングサイト(BgIIIおよびNotI)に挿入し、AKBP1/pAdTrack−CMVベクターを得た。
以下、公知のプロトコール[“A Practical Guide for using the AdEasy System”](HYPERLINK“http://www.coloncancer.org/adeasy.htm”“http://www.coloncancer.org/adeasy/protocol2.htm”)]に従い、AKBP1を発現する高力価アデノウイルス液の調製を行った。コントロール用アデノウイルスは、pAdTrack−CMVより調製した。
なおウイルス量は260nmにおける吸光度(A260)を測定し、下記の計算式で換算した。
[式] 1 A260=1.1×1012ウイルス粒子=3.3×1011pfu/ml
(2)肪細胞の分化とヒトAKBP1発現アデノウイルスの添加
3T3−L1細胞を用いてヒトAKBP1の糖とりこみに対する効果を評価した。3T3−L1細胞を10%ウシ胎児血清(FCS)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に懸濁し、1.6×105個/穴になるようにコラーゲンコートした24穴プレート(旭テクノグラス社)にまいた。翌日、10μg/mlインスリン、250nMデキサメサゾン、0.5mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチン(IBMX)を加えたDMEM(10%FCS)に培地を交換して3T3−L1細胞の分化を誘導した。その2日後、培地を0.4mlのDMEM(10%FCS)に戻した。その4日後、コントロール用アデノウイルス又はAKBP1を発現させるアデノウイルスを1穴あたり1.6×1010pfuの濃度で培地に添加した。
(3)ヒトAKBP1高発現細胞における糖取り込み能の測定
アデノウイルス添加して36時間後、ウシ胎児血清を含まないDMEMに交換して3時間おいた。その後、糖取り込みに対する効果を評価した。まず培地を所定濃度のインスリンを含むKRP緩衝液(136mM NaCl,4.7mM KCl,1.25mM CaCl2,1.25mM MgSO4,5mM Na2HPO4,pH7.4)0.25mlに交換し、37℃で20分インキュベートした。次に1mMの2−デオキシ−D−グルコースを含むKRPに1mlあたり15μlの2−デオキシ−D−[U−14C]グルコース(アマシャムバイオサイエンス社)を加えたものを用意し、各穴に50μlずつ添加して37℃で10分インキュベートした。その後、冷えたリン酸緩衝生理食塩液(PBS)で3回洗い、0.1%ラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて細胞を溶解し、2mlのシンチレーター(Aquazol−2、パッカードバイオサイエンス社)と混合して、細胞内に取り込まれたグルコース量を液体シンチレーションアナライザー(トライカーブB2500TR、パッカード社)を用いて測定した。
結果を図3に示す。図中の記号「*」はStuden’s t−testにおける評価を示す。「**」は、コントロール群に対する有意差がp<0.01であることを、「***」は同有意差がp<0.001であることを意味している。図の縦軸は2−D−グルコース取り込み量を示し、横軸はインスリン濃度を示す。白塗りのバーはコントロールの値を、黒塗りのバーはAKBP1高発現細胞の値を示す。図3に示す通り、本発明のAKBP1遺伝子を脂肪細胞に高発現させると低インスリン濃度下で糖取り込み量が増加することが判明した。
本発明のポリペプチドはインスリンシグナルに関わる新たな新規分子であり、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、発現ベクター及び細胞は、Akt2の働きを増強させる物質のスクリーニングに有用である。該スクリーニングにより選択される物質はインスリン抵抗性改善薬並びに糖尿病改善薬の候補物質として有用である。また、糖尿病態において血糖値の変動に関わらず発現量が低下する本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは糖尿病の診断に有用である。
以下の配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号3、4、5、6、8、9、10、11、24、25、26、27の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。配列番号7の配列で表される塩基配列は、クローニングベクターpACT2(GenBank U29899)の第5183番目(5’)〜第5162番目(3’)の塩基からなる配列である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (10)
- (1)配列番号2で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Akt2と結合するポリペプチド、あるいは(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、1〜10個のアミノ酸が欠失、置換、及び/又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかもAkt2と結合するポリペプチド。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列との相同性が90%以上であるアミノ酸配列からなり、しかも、Akt2に結合する蛋白質であるポリペプチド。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 請求の範囲1乃至請求の範囲3に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求の範囲4に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求の範囲5に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
- 請求の範囲1乃至請求の範囲3に記載のポリペプチドと試験物質とを接触させる工程、
該ポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程、及び
前記結合を促進する物質を選択する工程
を含むことを特徴とする前記ポリペプチドとAkt2との結合促進剤をスクリーニングする方法。 - 結合促進剤がインスリン抵抗性改善薬及び/又は糖代謝改善薬である請求の範囲7に記載のスクリーニングする方法。
- 請求の範囲1乃至請求の範囲3に記載のポリペプチドとAkt2との結合を測定する工程が、前記結合の変化によるAkt2の変化を測定する工程である請求の範囲7又は請求の範囲8に記載のスクリーニングする方法。
- 請求の範囲7乃至請求の範囲9に記載のスクリーニングする方法を用いてスクリーニングする工程、及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、インスリン抵抗性改善用及び/又は糖代謝改善用医薬組成物の製造方法。
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