CN116194468A - 预测和操纵nmda受体介导的毒性的新手段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及神经变性过程领域。特别地，本发明涉及一种包含GluN2A和GluN2B蛋白的序列基序的多肽，所述基序具有根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体序列，所述多肽可用于研究和调节NMDA受体介导的毒性。本发明还涉及包含所述多肽的融合蛋白、编码它们的核酸以及相应的(宿主)细胞和组合物。本发明还涉及与所述多肽结合的化合物，以及用于评估个体对NMDA受体介导的毒性的易感性的方法。

Description

预测和操纵NMDA受体介导的毒性的新手段
本发明涉及神经变性过程领域。特别地，本发明涉及一种包含GluN2A和GluN2B蛋白的序列基序的多肽，所述基序具有根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体序列，所述多肽可用于研究和调节NMDA受体介导的毒性。本发明还涉及包含所述多肽的融合蛋白、编码它们的核酸以及相应的(宿主)细胞和组合物。本发明还涉及与所述多肽结合的化合物，以及用于评估个体对NMDA受体介导的毒性的易感性的方法。
神经变性疾病是破坏性疾病，涉及神经元结构和功能的逐步丧失并且最终导致神经元的死亡。神经变性可能是急性的或缓慢进行性的，但是这两种类型的神经变性通常都涉及由胞外谷氨酸浓度升高或NMDA受体重新定位于突触外部位引起的通过突触外NMDA受体的死亡信号传导增加。NMDA受体是钙可透过的谷氨酸门控离子通道和电压门控离子通道。可以根据其亚细胞定位将它们分类为突触和突触外NMDA受体。突触触点内外的受体的亚基组成是相似的，但是除了携带共同的谷氨酸离子通道型受体NMDA型亚基1(GluN1)亚基外，突触外NMDA受体优先含有GluN2B亚基，而GluN2A是突触NMDA受体中的主要亚基。突触与突触外NMDA受体刺激的细胞性后果是截然不同的。突触NMDA受体启动突触传递功效的生理变化。它们还触发了通往细胞核的钙信号传导途径，所述途径激活对于长期实施几乎所有行为适应至关重要的基因表达反应。最重要的是，通过核钙起作用的突触NMDA受体是神经元结构保护基因和存活促进基因的强激活剂。与之形成鲜明对比的是，突触外NMDA受体触发细胞死亡途径。突触外NMDA受体激活后数分钟内，线粒体膜电位崩溃，随后发生线粒体通透性转换。突触外NMDA受体还强烈拮抗兴奋-转录偶联并破坏核钙驱动的适应基因组学(adaptogenomics)，因为它们会触发环磷酸腺苷(cAMP)应答元件结合蛋白(CREB)阻断途径，使细胞外信号调节激酶(ERK)-MAPK信号传导失活，并导致IIa类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)和促凋亡转录因子Foxo3A的核输入。这会影响许多基因的活性调节，包括脑源性神经营养因子(Bdnf)和血管内皮生长因子D(Vegfd)，这些基因对于维持复杂的树突结构和突触连接性以及建立神经保护盾至关重要。此外，鉴于激活的ERK1/2的可及范围小，它们被突触外NMDA受体阻断会破坏重要的局部信号传导事件，所述事件包括树突状mRNA翻译和控制突触传递功效的AMPA(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸)受体运输。因此，突触外NMDA受体信号转导的特征是具有线粒体功能障碍、转录失调以及神经元结构的完整性和连接性丧失的病理性三联征。
然而，到目前为止，NMDA受体的毒性信号传导的分子基础仍然是未知的。这是不幸的，因为本领域需要例如诊断工具来确定患上或遭受与NMDA受体信号传导相关的神经变性过程的风险。因此，本发明要解决的问题是提供研究、预测和/或调节NMDA受体介导的毒性的新手段。
如所附权利要求和以下说明书中所述的主题解决了这一问题。
本发明的诸位发明人已经出乎意料地发现，位于GluN2A和GluN2B的细胞内近膜部分内的具有四个规则间隔的异亮氨酸的18个氨基酸的进化高度保守的延伸负责NMDA受体介导的毒性。具有相应序列的多肽足以诱导NMDA受体介导的毒性，导致神经元细胞死亡。诸位发明人在突变分析中发现，在18个氨基酸的高度保守延伸内，异亮氨酸以及侧接异亮氨酸的某些氨基酸决定了非神经元细胞(包括人胚肾293(HEK293)细胞)中NMDA受体通道的毒性。此外，他们发现GluN2A/GluN2B蛋白的这种多肽基序的变体，所述变体或多或少具有毒性。这些变体中的一些对应于人类群体基因库中存在的单核苷酸多态性(SNP)。预期的是，有些人类受试者由于这种变异而比其他人类受试者更容易发生NMDA受体介导的毒性，从而更容易发生神经变性过程，从而对此类疾病的诊断和预后产生影响。还可以预期，有些人类受试者由于这种变异而比其他受试者更不容易发生NMDA受体介导的毒性，从而更不容易发生神经变性过程，因此具有在对神经元有害的病症中不发生或较少发生神经元死亡的“优点”。这些病症包括缺氧缺血性病症、创伤性脑损伤、青光眼、脑微血管病、由于代谢性疾病(如糖尿病)引起的神经病，以及对神经变性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化(ALS))的遗传性倾向或非遗传性倾向。
因此，本发明在第一方面涉及一种多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7和SEQ ID NO:8，或其变体序列，其中所述变体序列展现出与选自以下的序列的至少80％序列同一性，更优选至少85％序列同一性，最优选至少90％序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。所述多肽优选至多643个，优选至多625个氨基酸长。SEQ ID NO:1是在小鼠、大鼠和人GluN2A蛋白中保守的序列基序，并且是其C末端胞质结构域的一部分。所述18个氨基酸长序列元件在本文中被称为“规范”GluN2A，因为它是在UniProt数据库中全长GluN2A蛋白的相应数据库条目(UniProtKB-Q12879；NMDE1_HUMAN；1996年11月1日的序列版本1)中发现的“规范”亚型。Grin2B蛋白中对应于SEQ ID NO:1的序列是SEQ ID NO:7。所述18个氨基酸长序列元件在本文中被称为“规范”GluN2B，因为它是在UniProt数据库的相应数据库条目(UniProtKB-Q13224；NMDE2_HUMAN；2001年6月20日的序列版本3)中发现的“规范”亚型。本发明的诸位发明人已经表明，包含这些序列的多肽足以诱导NMDA受体介导的毒性。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1的人工创建的突变版本(即，源自GluN2A)，它们仍然显示一些毒性特性。SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6是在人体中存在的SEQID NO:1的天然存在的变体(即，源自GluN2A)。包含此序列的多肽也具有毒性，并且诱导NMDA受体介导的毒性。
在优选的实施方案中，除了上述本发明的核心基序之外，根据本发明的创造性多肽还包含GluN2A蛋白或GluN2B蛋白的N末端和/或C末端侧翼区。例如，所述多肽可以分别包含GluN2A或GluN2B的多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个(或甚至更多个)另外的氨基酸，发现所述另外的氨基酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的规范序列基序的N末端直接相邻。本发明的多肽可以例如还包含或另外包含GluN2A或GluN2B的多达1、2、3或4个(或甚至更多个)另外的氨基酸，发现所述另外的氨基酸与这些蛋白质中的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的创造性序列基序的C末端直接相邻。因此，在GluN2A的情况下，根据本发明的第一方面的多肽可以包含例如选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。在GluN2B的情况下，本发明的第一方面的多肽可以例如包含根据SEQ ID NO:15的序列或根据SEQ ID NO:16的序列。这些序列及其结构关系的展示提供于图1中。根据本发明的第一方面的多肽可用于但不限于研究和诱导例如神经元细胞中的NMDA受体介导的毒性，特别是在所述过程中涉及的调节和相互作用。
SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7所示的GluN2A和GluN2B的规范氨基酸序列基序不是人类独有的，但是在哺乳动物中甚至在脊椎动物中是高度保守的，如下表1和表2所示：
表1：脊椎动物中创造性GluN2A基序(SEQ ID NO:1)的序列同一性
Figure BDA0004113344360000021
Figure BDA0004113344360000031
表2：脊椎动物中创造性GluN2B基序(SEQ ID NO:7)的序列同一性
Figure BDA0004113344360000032
Figure BDA0004113344360000041
从上面的表1和表2可以明显看出，目的基序在多种脊椎动物并且特别是在哺乳动物物种中的保守性良好。因此，很容易地假设，针对一种脊椎动物，特别是哺乳动物物种，如小鼠或大鼠所获得的结果也适用于其他脊椎动物物种，特别是哺乳动物物种。在此情况下，诸位发明人已经表明，最初源自小鼠GluN2A/GluN2B的序列可以用于人HEK293细胞和小鼠原代培养的神经元两者中，这表明所述创造性多肽在脊椎动物且特别是哺乳动物物种之间保守的功能和因此保守的效用。
优选地，本发明的多肽是有毒的，优选地对其中优选表达TRPM4蛋白的有丝分裂后神经元和有丝分裂癌细胞两者都是有毒的。如本文所用，如果化合物在体外和体内均诱导细胞死亡，则所述化合物是“有毒的”。标准的体外测试涉及在原代神经元中用这些多肽处理10天或使这些多肽表达10天，或者在诸如神经母细胞瘤细胞的细胞系中进行所述处理或表达，然后评估细胞死亡(参见例如图2和图5)。标准的体内测试是在表达创造性多肽3周后通过对变性神经元进行染色(例如，用FluoJade C染色)来评估神经元死亡。与合适的对照(即，盐水溶液、仅溶剂、无活性的突变体)相比，体外或体内测量的细胞死亡率的统计学相关差异表明了毒性。
根据本发明的第一方面的多肽的长度将优选不超过625个氨基酸的长度。尽管不限于此，但是此长度将允许使用GluN2A或GluN2B的基本上整个胞质结构域。然而，在大多数情况下，所述创造性多肽将更短。所述多肽可以例如是至多约625个氨基酸长、至多约600个氨基酸长、至多约500个氨基酸长、至多约400个氨基酸长、至多约300个氨基酸长、至多约250个氨基酸长、至多约200个氨基酸长、至多约150个氨基酸长、至多约125个氨基酸长、至多约100个氨基酸长、至多约90个氨基酸长、至多约85个氨基酸长、至多约80个氨基酸长、至多约75个氨基酸长、至多约70个氨基酸长、至多约65个氨基酸长、至多约60个氨基酸长、至多约55个氨基酸长、至多约50个氨基酸长、至多约45个氨基酸长、至多约40个氨基酸长、至多约35个氨基酸长、至多约30个氨基酸长、至多约25个氨基酸长、至多约20个氨基酸长。在一个优选的实施方案中，所述创造性多肽为18至约30个氨基酸长。应注意，虽然认为所述创造性多肽并不限于GluN2A或GluN2B的片段，但是这种丛(constellation)是根据本发明第一方面的多肽的优选实施方案。
在第二方面，本发明涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含根据本发明第一方面的创造性多肽以及至少一个与根据本发明第一方面的氨基酸序列异源的其他氨基酸序列。“异源”意味着，所产生的融合蛋白在自然界中并不以这种形式存在。例如，这可能是融合蛋白代表改组的GluN2A或GluN2B变体的情况，其中(例如不同物种的)GluN2A和/或GluN2B序列已经以新的人工创建的亚型(包括混合形式的GluN2A和GluN2B序列)组合，或在一个更优选的实施方案中，因为所述其他氨基酸序列与GluN2A或GluN2B蛋白完全不相关。术语“融合蛋白”并不意味着由融合产生的多肽的特定长度。不限于此，所述至少一个其他氨基酸序列的长度可以是至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少50个、至少100个氨基酸、至少250个氨基酸、或至少500或更多个氨基酸。典型地，但不是必须地，所述其他氨基酸序列将为所述多肽/所得融合蛋白提供另外的功能性。例如，所述其他氨基酸序列可以选自膜锚定部分、蛋白质转导结构域和标签。如果所述融合蛋白(且因此本发明的多肽)要在细胞中表达，则膜锚定部分是特别有用的，因为GluN2A和GluN2B是膜锚定受体。特别优选的膜锚定部分选自CaaX盒基序(用于异戊二烯化)、糖基磷脂酰肌醇(GPI)信号锚定序列(SEQ ID NO:17)以及K-Ras4B(Ras)蛋白的C末端靶向信号(SEQ ID NO:18)。关于CaaX盒基序：C是被异戊二烯化的半胱氨酸，a是任何脂肪族氨基酸，并且X的身份决定了哪种酶应作用于所述蛋白质。法尼基转移酶识别X＝M、S、Q、A或C的CaaX盒，而香叶基香叶基转移酶I识别X＝L或E的CaaX盒。然而，也可以将所述创造性多肽例如通过将其与蛋白质转导结构域(即，促进多肽跨细胞膜运输，从而允许所述多肽穿过细胞膜并进入细胞的胞质溶胶中的肽序列)融合而从外部施用于细胞。优选的蛋白质转导结构域是根据SEQ ID NO:19的TAT蛋白。另外地或可替代地，将本发明的多肽用标签标记以允许例如多肽/融合蛋白的检测或纯化可能是有用的。优选的标签是完全不影响所述创造性多肽的活性的HA标签(SEQID NO:20)或荧光蛋白标签，如绿色荧光蛋白(GFP)。根据本发明的第二方面的融合蛋白优选地也是有毒的。
不限于此，根据本发明的第二方面的融合蛋白优选地是至多约600个氨基酸长、至多约500个氨基酸长、至多约400个氨基酸长、至多约300个氨基酸长、至多约250个氨基酸长、至多约200个氨基酸长、至多约150个氨基酸长、至多约125个氨基酸长、至多约100个氨基酸长、至多约90个氨基酸长、至多约85个氨基酸长、至多约80个氨基酸长、至多约75个氨基酸长、至多约70个氨基酸长、至多约65个氨基酸长、至多约60个氨基酸长、至多约55个氨基酸长、至多约50个氨基酸长、至多约45个氨基酸长、至多约40个氨基酸长、至多约35个氨基酸长、至多约30个氨基酸长、至多约25个氨基酸长、至多约20个氨基酸长。
在第三方面，本发明涉及一种编码根据本发明第一方面的本发明的一种或多种创造性多肽和/或根据本发明第二方面的一种或多种融合蛋白的核酸。所述创造性核酸可以采用针对核酸可想到的所有形式。特别地，根据本发明的核酸可以是RNA、DNA或其杂合体。它们可以是单链或双链的。它们可以具有小转录物或整个基因组(例如病毒基因组)的大小。如本文所用，编码本发明的一种或多种创造性多肽或融合蛋白的核酸可以是反映有义链的核酸。同样，反义链也涵盖在术语“编码”的范围内。所述核酸可以涵盖用于表达所述创造性多肽的异源(即，不是GluN2A或GluN2B的)启动子，如病毒启动子或细菌启动子。应理解，根据本发明的核酸不能编码全长GluN2A或GluN2B基因(根据本发明第一方面的多肽较短，并且融合蛋白包含与GluN2A和GluN2B异源的氨基酸序列)。
在第四方面，本发明涉及一种包含根据本发明的核酸的载体。这样的载体可以例如是允许表达创造性多肽或融合蛋白的表达载体。这样的载体可以例如是病毒表达载体。所述表达可以是组成型的或诱导型的。所述载体也可以是用于克隆目的的包含本发明核酸序列的克隆载体。
在第五方面，本发明涉及一种根据本发明的多肽、融合蛋白、核酸和/或载体，其用于治疗受试者的疾病的方法中，特别是用于治疗受试者的癌症的方法中。优选地，所述癌症是神经组织的癌症，如神经母细胞瘤。治疗癌症的方法可以是通过诱导NMDA受体介导的细胞死亡来治疗癌症的方法。注意，术语“诱导NMDA受体介导的细胞死亡”在本发明的这一方面的情况下用于定义要实现的技术效果，即诱导相应的细胞死亡途径，其通常由(突触外)NMDA受体信号传导诱导并且导致相应细胞死亡。所述方法包括向需要治疗的受试者施用有效量的本发明的多肽或融合蛋白或者提供这种多肽或融合蛋白在需要治疗的受试者中的表达的核酸或载体。所述受试者典型地是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人类受试者。施用途径可以是本领域技术人员认为适合相应癌症的任何施用途径。优选地，所述多肽、融合蛋白、核酸或载体是瘤内施用。
在第六方面，本发明涉及一种(优选分离的)细胞，其包含根据本发明的多肽、融合蛋白、核酸和/或载体。
在第七方面，本发明涉及一种重组表达GluN2A和/或GluN2B蛋白的(优选分离的)细胞，其中所述GluN2A或GluN2B蛋白分别包含分别代替SEQ ID NO:1(GluN2A)和SEQ IDNO:7的规范序列基序的其变体序列，或者其中所述前述序列基序是缺失的。所述变体序列典型地展现出与SEQ ID NO:1(GluN2A)和SEQ ID NO:7大致相同的序列长度，例如约16至约20个氨基酸，优选约17至19个氨基酸，最优选18个氨基酸。与规范GluN2A和GluN2B相比，本发明的此方面的细胞的GluN2A/GluN2B蛋白优选地分别展现出降低的毒性活性水平。例如，所述变体序列可以在SEQ ID NO:1的序列中展现出以下变体氨基酸残基中的一个或多个：I3A、I7A、I11A、H15A。关于SEQ ID NO:7，变体序列可以例如展现出以下变体氨基酸残基中的一个或多个：I7A、I11A、H12R、A15H。可以在本发明的第七方面的情况下使用的GluN2A和GluN2B蛋白的例子分别是展现出以下变体序列之一的GluN2A和/或GluN2B蛋白：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22。当然，所述变体序列可能仍分别被GluN2A和GluN2B的侧翼序列所包围。因此，本发明的此方面的GluN2A蛋白可以包含例如以下序列之一：SEQ ID NO:23(即，GluN2A缺失突变体)、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:24。本发明的此方面的GluN2B蛋白可以例如包含以下序列之一：SEQ ID NO:25(即，GluN2B缺失突变体)、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28。如本文所用，“重组表达GluN2A和/或GluN2B蛋白”旨在涵盖人工诱导的GluN2A表达和/或GluN2B表达的所有形式，无论现在是瞬时表达还是组成型表达。例如，GluN2A和/或GluN2B序列可能已经借助基因工程人工提供给细胞。GluN2A或GluN2B蛋白可以源自任何物种，但是优选源自哺乳动物物种，优选小鼠或人GluN2A或GluN2B，最优选人GluN2A或GluN2B。应理解，这属于GluN2A/GluN2B序列的其余部分的情况，而不是SEQ ID NO:1(GluN2A)和SEQ ID NO:7的变体序列或其缺失突变体。术语“GluN2A和/或GluN2B蛋白”还涵盖给定物种中的GluN2A或GluN2B蛋白的所有变体，即，不限于所述物种的规范序列。应注意，本发明此方面的GluN2A和/或GluN2B蛋白优选地保留形成谷氨酸门控离子通道和电压门控离子通道以及启动突触传递功效的生理变化，触发通往细胞核的钙信号传导途径和/或激活神经元结构保护基因和存活促进基因的能力。
本发明的第六和第七方面的细胞可以特别地选自细菌细胞和酵母细胞(例如，用于生产目的)以及哺乳动物细胞(例如，用于研究目的，但也可能用于生产目的和其他目的)。哺乳动物细胞可能是神经元以及非神经元哺乳动物细胞。在一个特别优选的实施方案中，所述细胞是人胚肾293(HEK293)细胞。这样的HEK293细胞可以包含例如如上所述的GluN2A和/或GluN2B蛋白。
在第八方面，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含本发明(根据第六或第七方面)的多肽、融合蛋白、核酸、载体或细胞。所述组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个优选的实施方案中，所述组合物可以包含纳米颗粒，所述纳米颗粒包含根据本发明的所述多肽、融合蛋白、核酸、载体和/或细胞。所述纳米颗粒可以被设计成随时间释放所述多肽、融合蛋白、核酸、载体和/或细胞。
在第九方面，本发明涉及一种抗体、纳米抗体或anticalin，特别是抗体或纳米抗体，其分别与GluN2A或GluN2B蛋白的C末端胞质结构域结合，但是不与GluN2A或GluN2B缺失突变体结合，所述突变体分别缺乏对应于氨基SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7(即，UniProtKB条目-Q12879的氨基酸861-878；NMDE1_HUMAN；1996年11月1日的序列版本1；和GluN2B的氨基酸862-879；UniProtKB-Q13224；NMDE2_HUMAN；2001年6月20日的序列版本3)的区域。这种抗体、纳米抗体或anticalin将分别对GluN2A和GluN2B蛋白的创造性区域具有特异性，所述创造性区域已经被诸位发明人鉴定为与NMDA受体介导的毒性的诱导有关。所述抗体可以例如与选自以下的多肽序列结合：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。优选地，所述抗体、纳米抗体或anticalin防御、诱导或改善NMDA受体介导的毒性(例如，NMDA或谷氨酸诱导的神经元死亡、糖氧剥夺诱导的神经元死亡、中风的动物模型)，例如通过防止GluN2A和GluN2B的所述子区域与参与触发NMDA受体介导的毒性的其他蛋白质或相互作用配偶体(特别是TRPM4蛋白)的相互作用来实现。这种抗体、纳米抗体或anticalin可以分别被认为是拮抗剂或阻断抗体、纳米抗体或anticalin。如本文所用，纳米抗体是单结构域抗体(sdAb)，即由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。
在第十方面，本发明涉及本发明的多肽、融合蛋白、核酸、载体、细胞、组合物和/或抗体、纳米抗体或anticalin用于研究NMDA受体介导的毒性的用途。如在本申请的实施例中所证明的，本发明的诸位发明人鉴定了GluN2A蛋白和GluN2B蛋白内足以诱导NMDA受体介导的毒性的关键区域。这将使科学家和研究人员能够更详细地研究触发NMDA受体介导的毒性的事件的分子基础。
在第十一方面，本发明涉及一种对受试者的基因组核酸样品中的GRIN2A基因(即，编码GluN2A蛋白的基因)的部分序列和/或GRIN2B基因(即，编码GluN2B蛋白的基因)的部分序列进行测序的方法，其中所述测序的GRIN2A基因的部分序列至少包含通常编码SEQ IDNO:1的规范序列(即，人GluN2A蛋白的氨基酸861-878)的基因区，并且其中所述测序的GRIN2B基因的部分序列包含通常编码SEQ ID NO:7的规范序列(即，人GluN2B蛋白的氨基酸862-879)的基因区。本发明的诸位发明人已经表明，除了规范序列之外，(例如人的)基因库中还存在GluN2A蛋白和GluN2B蛋白的变体(即，类型)，并且对NMDA受体介导的毒性的易感性根据GluN2A和/或GluN2B的遗传变体(即，类型)而各不相同。因此，确定GluN2A和/或GluN2B的类型可以具有临床相关性，因此，本发明第十一方面的方法旨在提供关于受试者的GluN2A和GluN2B类型的序列信息(分别关于GluN2A和GluN2B的胞质结构域中的创造性序列)。优选地，测序的GRIN2A基因和/或GRIN2B基因的部分序列覆盖编码的GluN2A和GluN2B蛋白的至多100个、甚至更优选至多75个、甚至更优选至多50个氨基酸。优选地，所述测序利用基于聚合酶链反应的扩增和测序。应注意，在人类基因组中，创造性氨基酸序列基序分布在两个外显子上，即被内含子打断。因此，对所述区域进行测序的手段将需要考虑这一事实。本发明的第十一方面的方法可以例如通过对外显子-内含子边界处的两个适当的区域进行测序来进行。在使用标准引物进行PCR的情况下，用于扩增人类基因组中的GRIN2A靶序列的合适的引物例如提供于SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30(GRIN2A第1区的正向和反向引物)以及SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32(GRIN2A第2区的正向和反向引物)中。然后，可以用SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34表示的测序引物对所述扩增的核酸进行测序。对于人类基因组中的GRIN2B靶序列，SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36是第1区的合适的正向和反向引物，并且SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38是第2区的合适的正向和反向引物。然后，可以例如用SEQID NO:39和SEQ ID NO:40表示的测序引物对所述扩增的核酸进行测序。本发明的第十一方面的方法优选地适于基于测序的基因组核酸样品而允许确定受试者是否展现出以下中的一种或多种(所有位置指示相对于UniProtKB-Q12879或UniProtKB-Q13224的序列来提供)：
-规范GluN2A(还参见SEQ ID NO:1)，
-GluN2A(I867M)(还参见SEQ ID NO:4)，
-GluN2A(S869R)(还参见SEQ ID NO:5)，
-GluN2A(I876N)(还参见SEQ ID NO:6)，
-规范GluN2B(还参见SEQ ID NO:7)，
-GluN2B(I872M)(还参见SEQ ID NO:8)，
-GluN2B(H873R)(还参见SEQ ID NO:22)。
本发明的诸位发明人发现，上述GluN2A和GluN2B变体(由各自基因中的不同SNP引起)在HEK293细胞系中导致对NMDA受体介导的毒性的不同易感性水平，如实施例中所证明的。因此，上文提及的本发明的第十一方面的方法还可以是一种用于评估受试者对NMDA受体介导的毒性的易感性的方法，所述方法包括对受试者的基因组核酸样品中的GRIN2A基因(即，编码GluN2A蛋白的基因)的部分序列和/或GRIN2B基因(即，编码GluN2B蛋白的基因)的部分序列进行测序，其中所述测序的GRIN2A基因的部分序列至少包含通常编码SEQ ID NO:1的规范序列(即，人GluN2A蛋白的氨基酸861-878)的基因区，并且其中所述测序的GRIN2B基因的部分序列包含通常编码SEQ ID NO:7的规范序列(即，人GluN2B蛋白的氨基酸862-879)的基因区，并且其中：
a)具有规范GluN2A(SEQ ID NO:1)和/或规范GluN2B(SEQ ID NO:7)序列的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的常规易感性，
b)具有GluN2A(I867M)突变(还参见SEQ ID NO:4)的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的增加的易感性，
c)具有GluN2A(S869R)突变(还参见SEQ ID NO:5)的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的常规易感性，
d)具有GluN2A(I876N)突变(还参见SEQ ID NO:6)的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的增加的易感性，
e)具有GluN2B(I872M)突变(还参见SEQ ID NO:8)的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的常规易感性，并且
f)具有GluN2B(H873R)突变(还参见SEQ ID NO:22)的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的降低的易感性。
优选地，本发明的第十一方面的方法是离体方法，即不在人体或动物身体上进行。提供样品的受试者优选是哺乳动物，优选选自人、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、猴、马、仓鼠、豚鼠、猪、绵羊、山羊、兔等。最优选地，所述受试者是人类。
在进一步的第十二方面，本发明涉及根据本发明的多肽、融合蛋白或根据本发明的细胞在蛋白质-蛋白质相互作用测定中的用途。虽然诸位发明人在本文中公开了GluN2A和GluN2B蛋白中的创造性区域对于NMDA受体介导的毒性的重要性，但是尚不清楚哪些其他蛋白质因子可能参与促进或限制NMDA受体介导的毒性。预期根据本发明的第一和第二方面的多肽/融合蛋白(或根据第六或第七方面的细胞)将特别用于鉴定GluN2A或GluN2B蛋白的其他结合和相互作用配偶体。在此类测定中仔细检查的蛋白质-蛋白质相互作用优选是在由如本文定义的根据SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或它们的变体序列指定的区域内的相互作用。这样的结合配偶体可能具有神经毒性、神经保护性或两者都不具有。在这种情况下，所述多肽/融合蛋白/细胞将不仅提供有关直接相互作用配偶体的见解，还将阐明参与GluN2A/GluN2B信号传导的其他化合物的相互作用，例如，如果某些复合物由于(例如竞争性)抑制作用而不再形成的话。本领域技术人员熟悉用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的大量可能的测定法，包括生物化学方法、生物物理方法和遗传方法。非限制性例子是免疫沉淀、双分子荧光互补(例如分裂-TEV、分裂-GFP)、亲和电泳、免疫电泳、噬菌体展示、串联亲和纯化、化学交联然后质谱分析、表面等离子体共振、荧光共振能量转移、核磁共振成像、与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:7结合消除上述测定中的信号的反向测定、将化合物文库添加到非应答细胞以使其具有反应性的互补测定或者RNAi筛选测定(使反应细胞具有反应性)等。所述蛋白质-蛋白质相互作用测定可以是体外、离体或体内测定。最优选地，所述蛋白质-蛋白质相互作用测定是体外测定。然而，在活体成像的情况下，这种测定还可以是体内测定。在所述测定是体内测定的情况下，其优选不是人类中的测定。
与创造性区域的潜在的相互作用不仅可以通过常规的湿化学手段确定，而且还可以通过新型计算机方法确定。因此，在第十三方面，本发明还涉及一种用于鉴定与GluN2A或GluN2B蛋白的C末端胞质结构域潜在地相互作用的化合物的方法，其中所述方法包括：
i)将候选化合物与根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体进行计算机辅助虚拟对接，所述变体选自GluN2A(I867M)(还参见SEQ ID NO:4)、GluN2A(S869R)(还参见SEQ ID NO:5)、GluN2A(I876N)(还参见SEQ ID NO:6)、GluN2B(I872M)(还参见SEQID NO:8)和GluN2B(H873R)(还参见SEQ ID NO:22)，其中所述氨基酸序列以包含所述氨基酸序列的多肽的虚拟3D结构提供，以及
ii)确定将所述候选化合物与根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体进行虚拟对接的对接得分和/或内应变，以及任选地
iii)将分别包含GluN2A或GluN2B亚基的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体与所述候选化合物在体外或体内接触，以确定所述候选化合物是否调节所述NMDA受体的活性。
如上文已经提及，用于确定NMDA受体活性的方法是本领域已知的(参见例如Zhang等人,2011,J.Neurosci.31,4978-4990；通过引用随同并入)。
用于使候选化合物与蛋白质结构进行计算机模拟对接的方法是本领域熟知的。所述候选化合物可以是任何化合物。典型地，所述化合物将是小分子，但是所述化合物也可能是大生物分子，如蛋白质(例如，抗体等)。化合物的集合例如可从
Figure BDA0004113344360000091
LLC(纽约，纽约州，美国)获得。所述3D结构可以是包含根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体(SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28)的任何结构。所述3D结构可以是任何脊椎动物GluN2A或GluN2B蛋白的任何3D结构，或者包含所述创造性序列基序的这些GluN2A或GluN2B蛋白中任一种的部分的任何3D结构。优选地，所述3D结构是哺乳动物来源的，甚至更优选地是人类来源的。所述3D结构还可以是包含GluN2A或GluN2B蛋白的复合物(例如GluN1和GluN2A或GluN2B的复合物)的结构。在本发明情况下，GluN2A和GluN2B蛋白的各种结构是技术人员可得的，例如可在蛋白质数据库中获得，并且可以用于本发明的第十三方面的方法。所述3D结构可以例如基于通过X射线晶体学分析、NMR光谱分析、冷冻EM获得的结构，或者从同源性建模导出的结构。应理解，根据本发明的第十三方面的方法将涵盖将候选化合物与GluN2A/GluN2B结构中的对应于根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体(特别是上述那些)的区域对接，并且不涵盖与所述结构中与这些氨基酸序列无关的区域对接。然而，如果与具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7或其变体的区域对接需要与所述区域外的其他氨基酸残基平行地相互作用，则根据本发明第十三方面的方法也包括这种对接。对接本身可以通过本领域技术人员已知的多种方法来完成，并且相应的软件是可公开获得的(参见例如，/>
Figure BDA0004113344360000101
LLC，纽约，纽约州，美国)。相应的分析也可以从商业提供商，例如Proteros biostructures GmbH(普拉内格(Planegg)，德国)订购。本发明第十三方面的方法还可用于鉴定NMDA受体介导的毒性的抑制剂。
在进一步的第十四方面，本发明涉及一种向细胞提供产生对NMDA受体介导的毒性的更强抗性的核酸(特别是基因)的方法，所述方法包括将所述细胞中与对NMDA受体介导的毒性的较高易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2B基因组序列用与对NMDA受体介导的毒性的较低易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2B序列替代。例如，可以将与对NMDA受体介导的毒性的高易感性(例如，与规范GRIN2A/GRIN2B相比)相关的GRIN2A基因组序列(参见例如，编码I876N亚型的GRIN2A基因变体；还参见SEQ ID NO:6)用GRIN2A规范基因组序列或用提供与所述规范序列相比甚至更低的对NMDA受体介导的毒性的易感性的序列(例如编码缺失突变体的GRIN2A基因变体；还参见SEQ ID NO:23；或根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:21的序列)替代。类似地，可以将规范GRIN2B基因组序列用提供与所述规范序列相比更低的对NMDA受体介导的毒性的易感性的序列(例如，编码缺失突变体的GRIN2B基因变体；还参见SEQ ID NO:25；或根据SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:22的序列)替代。所述方法优选为体外方法。所述细胞可以是例如神经元细胞、干细胞(特别是胚胎干细胞)、卵母细胞或精母细胞。所述细胞优选地是哺乳动物来源的，甚至更优选地是人类来源的。然而，本发明也特别考虑了非人哺乳动物细胞。在优选的实施方案中，提供对NMDA受体介导的毒性的更强抗性的核酸(或基因)可以是完全缺乏所述创造性序列基序区域的核酸(或基因)(即，缺失突变体)。在一个优选的实施方案中，所述基因替代是通过CRISPR或其他技术介导的基因编辑实现的。所述替代将使神经元对NMDA毒性具有更强的抗性，从而对多种形式的神经变性(包括中风、ALS、阿尔茨海默病、亨廷顿病、视网膜变性(青光眼、糖尿病性视网膜病变)等)具有更强的抗性。
在第十五方面，并且类似于上述第十四方面，本发明涉及一种在GluN2A和GluN2B两者的创造性区域内对细胞、器官、啮齿动物、哺乳动物或人进行定点信使RNA(mRNA)编辑的方法，所述方法通过将与对NMDA受体介导的毒性的较高易感性相关的mRNA改变为与对NMDA受体介导的毒性的较低易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2B mRNA序列，为所述宿主提供对NMDA受体介导的毒性的更强的抗性。定点mRNA编辑是通过酶作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)来完成的，所述酶催化核苷酸腺苷脱氨基为肌苷。肌苷在结构上与鸟嘌呤相似，在翻译过程中模仿鸟苷，并且可能导致蛋白质编码序列的变化。用于定点mRNA编辑的几种技术是可用的(Aquino-Jarquin,2020,Mol Ther Nucleic Acids19,1065-1072；通过引用并入本文)。例如，通过转染或感染方法将与SNAP标签和短(约20nt)指导RNA融合的人ADAR的脱氨酶结构域引入细胞中。所述指导RNA与ADAR-SNAP标签融合蛋白结合，并且将其靶向所需的mRNA。所述指导RNA被设计成在靶位点处含有A:C错配以诱导位点特异性脱氨基作用(Vogel等人,2018,Nat Meth 15,535–538；通过引用并入本文)。简化的方法需要将化学修饰的、稳定的反义寡核苷酸(ASO)转染到细胞中，所述反义寡核苷酸被设计为含有两个区段：决定靶mRNA结合的指导序列和用于指导内源性人ADAR至ASO:mRNA杂合体以编辑转录物的ADAR募集结构域(Merkle等人,2019,Nat Biotech 37,133–138；通过引用并入本文)。创造性靶序列的所需变化包括但不限于以下氨基酸(编辑后：I变为V，H变为R)：I863V、I867V、I871V、I876V、H875R及其组合(均在GluN2A中)；I864V、I868V、I872V、I877V、H873R及其组合(均在GluN2B中)。优选地，本发明的此方面的方法包括将所述细胞中与对NMDA受体介导的毒性的较高易感性相关的GluN2A和或GluN2B mRNA序列用与对NMDA受体介导的毒性的较低易感性相关的GluN2A或GluN2B mRNA序列编辑或替代(也参见上文)。所述方法是体外或体内方法。所述细胞可以是例如神经元细胞、干细胞(特别是胚胎干细胞)、卵母细胞或精母细胞。所述细胞或器官优选为啮齿动物或哺乳动物来源的，甚至更优选为人类来源的。然而，本发明也特别考虑了非人哺乳动物细胞和器官。GluN2A或GluN2B mRNA序列的替代或编辑遵循上述模式。例如，如果细胞含有编码具有根据SEQ ID NO:7的序列基序的GluN2B蛋白的mRNA，则所述mRNA可以被编码具有根据SEQ ID NO:22的mRNA基序的GluN2B蛋白的mRNA替代。在进一步的例子中：如果所述细胞包含编码具有根据SEQ ID NO:6的序列基序的GluN2A蛋白的序列，则所述序列可以例如被编码具有根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:21(与SEQ ID NO:6相比，它们都提供对NMDA受体介导的毒性更低的易感性)的序列基序的GluN2A蛋白的序列替代。在一些实施方案中，提供对NMDA受体介导的毒性的更强抗性的信使RNA(或基因)可以是完全缺乏创造性序列基序的信使RNA(或基因)(即，缺失对应于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的序列的缺失突变体)。在一个优选的实施方案中，mRNA替代是通过CRISPR或其他方法介导的mRNA编辑实现的。如前所述，这样的mRNA替代将使神经元对NMDA毒性具有更强的抗性，从而对许多形式的神经变性(包括中风、ALS、阿尔茨海默病、亨廷顿病、视网膜变性(青光眼、糖尿病性视网膜病)等)具有更强的抗性。
在最终的第十六方面，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含在受试者的基因组核酸样品中确定GRIN2A基因(即，编码GluN2A蛋白的基因)的部分序列和/或GRIN2B基因(即，编码GluN2B蛋白的基因)的部分序列的序列的手段，其中所述测序的GRIN2A基因的部分序列至少包含通常编码SEQ ID NO:1的规范序列(即，人GluN2A蛋白的氨基酸861-878)的基因区，并且其中所述测序的GRIN2B基因的部分序列包含通常编码SEQ ID NO:7的规范序列(即，人GluN2B蛋白的氨基酸862-879)的基因区。所述手段可以是例如允许对GRIN2A基因和/或GRIN2B基因的相应部分序列进行扩增、测序和/或检测的核酸引物或探针。优选地，所述手段允许确定GRIN2A基因和/或GRIN2B基因的部分序列，所述部分序列覆盖编码的GluN2A和GluN2B蛋白的至多100个、甚至更优选至多75个、甚至更优选至多50个氨基酸。合适的手段例如可以选自上述引物，即SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。所述试剂盒可以是用于进行根据本发明的第十一方面的方法的试剂盒。基于测序的基因组核酸样品，所述试剂盒可以允许确定受试者是否展现出以下中的一种或多种(所有位置指示相对于UniProtKB-Q12879或UniProtKB-Q13224的序列来提供)：
-规范GluN2A(还参见SEQ ID NO:1)，
-GluN2A(I867M)(还参见SEQ ID NO:4)，
-GluN2A(S869R)(还参见SEQ ID NO:5)，
-GluN2A(I876N)(还参见SEQ ID NO:6)，
-规范GluN2B(还参见SEQ ID NO:7)，
-GluN2B(I872M)(还参见SEQ ID NO:8)，
-GluN2B(H873R)(还参见SEQ ID NO:22)。
优选地，所述试剂盒至少包含鉴定编码规范GluN2A(SEQ ID NO:1)和规范GluN2B(SEQ ID NO:7)的创造性序列基序的手段。在另一个实施方案中，所述试剂盒可以至少包含检测编码规范GluN2A(SEQ ID NO:1)的创造性序列基序和规范GluN2A的创造性序列基序的一种其他变体(例如选自GluN2A(I867M)、GluN2A(S869R)和GluN2A(I876N))的手段。在另一实施方案中，所述试剂盒可以至少包含检测编码规范GluN2B(SEQ ID NO:7)的创造性序列基序和编码规范GluN2B的创造性序列基序的一种其他变体(例如选自GluN2B(I872M)和GluN2B(H873R))的手段。提供样品的受试者优选是哺乳动物，优选选自人、小鼠、大鼠、狗、猫、牛、猴、马、仓鼠、豚鼠、猪、绵羊、山羊、兔等。最优选地，所述受试者是人类。
如本文所用，术语“包含”不应被解释为限于含义“由……组成”(即，排除另外的其他物质的存在)。而是，“包含”意味着可以任选地存在另外的物质。术语“包含”涵盖“由……组成”(即，排除另外的其他物质的存在)和“包含但并非由……组成”(即，要求存在另外的其他物质)(前者是更优选的)作为落入其范围内的特别设想的实施方案。
附图说明
在下文中，将给出附图的简要描述。附图旨在更详细地说明本发明的各方面。
图1展现了诸位发明人鉴定的创造性序列基序及其变体的比对。创造性序列核心基序位于GluN2A和GluN2B蛋白的胞质结构域中，长度为18个氨基酸，含有四个规则间隔的异亮氨酸残基。所描绘的侧翼序列是人类序列，然而在大鼠和小鼠GluN2A/GluN2B中也可以相同地发现所述序列。
“-”：缺失的氨基酸残基；粗体字母：偏离规范核心序列。应注意，创造性核心序列基序是相同的，但是在GluN2A中所述核心的位置15处的组氨酸残基除外，而GluN2B在此位置处展现丙氨酸残基。因此，将所述GluN2B丙氨酸残基突变为组氨酸残基将产生GluN2A序列，但是在GluN2B框架中除外，反之亦然。
A)GluN2A蛋白及其变体；其中SEQ ID NO:1表示GluN2A蛋白中的规范创造性序列基序；
B)GluN2B蛋白及其变体：其中SEQ ID NO:7表示GluN2B蛋白中的规范创造性序列基序。
图2展现了创造性序列基序(分别在GluN2A或GluN2B中)的缺失或点突变对HEK293细胞的细胞死亡的影响。A)对照：未转染的细胞或仅用GFP或GluN1转染的细胞均未显示出细胞死亡的诱导。B)GluN2A：GluN1+GluN2A(野生型受体复合物)；GluN1+GluN2AΔSEQ IDNO:1(缺失突变体；SEQ ID NO:41)；GluN1+GluN2AΔ9(缺乏GluN2A的最后9个C末端氨基酸的对照，所述氨基酸与所述创造性序列基序无关)；GluN1+GluN2A+MK-801(在存在非竞争性通用NMDA受体抑制剂MK-801的情况下的野生型受体复合物。C)GluN2B：GluN1+GluN2B(野生型受体复合物)；GluN1+GluN2BΔSEQ ID NO:7(缺失突变体；SEQ ID NO:42)；GluN1+GluN2BΔ9(缺乏GluN2B的最后9个C末端氨基酸的对照，所述氨基酸与所述创造性序列基序无关)；GluN1+GluN2B+MK-801(在存在非竞争性通用NMDA受体抑制剂MK-801的情况下的野生型受体复合物)；n.s.：不显著；*：p<0.05；**：p<0.01。
图3展现了GluN2A和GluN2B突变体在存在GluN1的情况下在转染后48小时诱导HEK293细胞的细胞死亡的能力：从左到右：大鼠野生型GluN2A(UniProt：Q00959)；GluN2AΔSEQ ID NO:1(SEQ ID NO:41；即，缺乏SEQ ID NO:1的缺失突变体)；GluN2A-I2A2(类似于野生型GluN2A(UniProt：Q00959)，但是展现出取代I867A和I871A；还参见SEQ ID NO:2)；展现出取代I863A、I867A和I871A的GluN2A-I3A3(参见SEQ ID NO:3)；展现出取代I867A、I871A和H875A的GluN2A-IAHA(参见SEQ ID NO:21)；大鼠野生型GluN2B(UniProt：Q00960)；缺乏GluN2B中创造性的18个氨基酸的序列基序的GluN2BΔSEQ ID NO:7(参见SEQ ID NO:42；即，缺失突变体)；GluN2B-I2A2(类似于野生型GluN2B(UniProt：Q00960)，但是展现出取代I868A和I872A；还参见SEQ IDNO:21)；以及GluN2B-I2A2AH(类似于野生型GluN2B(UniProt：Q00960)，但是展现出取代I868A、I872A和A876H)；*：p<0.05；**：p<0.01。
图4展现了GluN2A和GluN2B变体序列(在人类基因库中存在)在存在GluN1的情况下在转染后48小时诱导HEK293细胞的细胞死亡的能力：从左到右：大鼠野生型GluN2A(UniProt：Q00959)；GluN2A-I867M(类似于野生型GluN2A(UniProt：Q00959)，但是展现出取代I867M；还参见SEQ ID NO:4)；GluN2A-S869R(类似于野生型GluN2A(UniProt：Q00959)，但是展现出取代S869R；还参见SEQ ID NO:5)；GluN2A-I876N(类似于野生型GluN2A(UniProt：Q00959)，但是展现出取代I876N；还参见SEQ ID NO:6)；大鼠野生型GluN2B(UniProt：Q00960)；GluN2B-I872M(类似于野生型GluN2B(UniProt：Q00960)，但是展现出取代I872N；还参见SEQ ID NO:8)；GluN2B-H873R(类似于野生型GluN2B(UniProt：Q00960)，但是展现出取代H873R；还参见SEQ ID NO:8)。*：p<0.05。
图5展现了包含SEQ ID NO:1的序列的GluN2A来源的多肽(SEQ ID NO:9)或包含SEQ ID NO:7的序列的GluN2B来源的多肽(SEQ ID NO:15)足以诱导小鼠海马和皮质神经元的细胞死亡，而突变版本(SEQ ID NO:10，其包含SEQ ID NO:2的序列；以及SEQ ID NO:26，其包含SEQ ID NO:21的序列)不能诱导细胞死亡。****；p<0.0001。
图6展现了基于智人染色体16的基因组参考联盟人类构建38补丁版本13(GenomeReference Consortium Human Build 38 patch release 13，GRCh38.p13)用于人GRIN2A和GRIN2B基因(即，分别编码GluN2A和GluN2B蛋白的基因)的可能的测序策略。长箭头是指PCR引物，短箭头是指测序引物。黑线表示根据SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的创造性序列区域。如图可见，所述区域被内含子打断。A)GRIN2A：GRIN2A-1区：9768629至9769128，包含SEQID NO:1的前半部分(TGVCSDRPGLLFSISR；SEQ ID NO:43)，PCR(具有引物GRIN2A-1-F，SEQID NO:29和GRIN2A-1-R，SEQ ID NO:30)产生405bp片段。GRIN2A-2区：9764689至9765188，包含SEQ ID NO:1的后半部分(GIYSCIHGVHIEEKKKS；SEQ ID NO:44)，PCR(具有引物GRIN2A-2-F，SEQ ID NO:31和GRIN2A-2-R，SEQ ID NO:32)产生368bp片段。B)GRIN2B：GRIN2B-1区：13566792至13567291，包含SEQ ID NO:7的前半部分(MGVCSGKPGMVFSISR；SEQ ID NO:45)，PCR(具有引物GRIN2B-1-F，SEQ ID NO:35和GRIN2B-1-R，SEQ ID NO:36)产生455bp片段；GRIN2B-2区：13564382至13564881，包含SEQ ID NO:7的后半部分(GIYSCIHGVAIEERQSV；SEQID NO:46)，PCR(具有引物GRIN2B-2-F，SEQ ID NO:37和GRIN2B-2-R，SEQ ID NO:38)将产生395bp片段。
实施例
在下面的特定实施例中，示出了本发明的说明性实施方案和方面。然而，本发明在范围上不应受本文所述的具体实施例的限制。实际上，根据上述说明和以下实施例，除了本文所述的那些修改之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。所有这些修改都落入所附权利要求的范围内。
实施例1：方法和材料
除非另外指出，否则发明人在随后的实施例中使用以下方法和材料。
GRIN1、GRIN2A和GRIN2B(其是编码GluN2A和GluN2B的基因)的原始质粒构建体由Andres Barria&Robert Malinow赠送(Addgene质粒号45446、45445、45447)。本申请中的所有突变体都是通过PCR使用定点诱变产生的。用于产生质粒的引物如下：
对于GrinN2A：
Figure BDA0004113344360000131
Figure BDA0004113344360000141
对于GrinN2B：
Figure BDA0004113344360000142
HEK293细胞培养
将HEK293细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，GibcoTM，10270)、1％丙酮酸钠(GibcoTM，11360070)、1％ MEM NEAA(GibcoTM，11140035)和0.5％青霉素-链霉素(P-S；Sigma，P0781)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM，GibcoTM，41965-039)中培养，并且将第15-25代用于实验。
发光细胞毒性测定
为了测试根据本发明的化合物的细胞毒性，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000，在铺板后24小时，用分别用于GluN1和GluN2A二者或GluN1和GluN2B二者的表达载体(1:1，每6cm培养皿总共2μg质粒)转染HEK293细胞(70％-80％汇合)。根据制造商的说明(略加修改)，使用CytoTox-GloTM细胞毒性测定法(Promega，G9290)在转染后的所指示时间点测量群体中死细胞的相对数量。简而言之，将10％的总培养基与10μL AAF-氨基萤光素混合，用水定容至200μL的最终体积，在96孔白底聚苯乙烯微孔板(Corning
Figure BDA0004113344360000151
3912)中通过GloMax(Promega)测量死细胞相对发光单位(DRLU)。在所有测量之后，将裂解试剂添加到细胞，并将10％的裂解物用于总细胞相对发光单位(TRLU)测量。通过以下等式计算细胞死亡：
Figure BDA0004113344360000152
原代神经元培养
如技术人员已知来制备并且维持原代小鼠海马。简言之，将来自P0 C57Bl/6N小鼠的海马解离并且以1.2*105/cm2的密度铺板在生长培养基(GM)中，所述生长培养基由以下组成：Neurobasal A培养基(GibcoTM，10888022)、2％无血清B27TM补充剂(GibcoTM，17504044)、1％大鼠血清(Biowest，S2150)、0.5mM L-谷氨酰胺(Sigma，G7513)和0.5％ P-S。在DIV3添加胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC；Sigma，C1768；2.8μM)以防止神经胶质细胞增殖。从DIV8开始，每48h将一半的培养基更换为无大鼠血清的GM，直至用于实验。在实验前24h，将GM更换为转染培养基(10mM HEPES(pH 7.4)、114mM NaCl、26.1mM NaHCO3、5.3mMKCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、30mM葡萄糖、1mM甘氨酸、0.5mM C3H3NaO3和0.001％酚红以及10％的不含磷酸盐的伊格尔氏最低必需培养基，补充有7.5μg/ml胰岛素、7.5μg/ml转铁蛋白和7.5ng/ml亚硒酸钠(ITS液体培养基补充剂，Sigma-Aldrich目录号I3146))。
重组腺相关病毒(rAAV)和构建体
如本领域已知来产生并纯化病毒颗粒。表达SEQ ID NO:9(即，包含SEQ ID NO:1)、SEQ ID NO:10(即，包含SEQ ID NO:2)、SEQ ID NO:15(即，包含SEQ ID NO:7)和SEQ ID NO:26(即，包含SEQ ID NO:3)的核酸构建体由人突触素启动子驱动，其与HA标签(SEQ ID NO:20)和GPI锚(SEQ ID NO:17)融合以模拟其天然膜附近的分布。
神经元死亡评估
将神经元固定在具有PBS中4％蔗糖的4％多聚甲醛中持续15min，然后进行Hoechst染色。对于神经元死亡分析，使用配备有10x物镜(NA 0.3)和具有VisiView成像软件(Visitron Systems)的SPOT Insight 14位CCD相机的Leica DMIRBE倒置显微镜获得图像。死神经元被定义为根据Hoechst染色凝聚的、圆形的且收缩的细胞核。通过CellProfiler和Cell Analyzer软件分析细胞死亡。
定量和统计
所有统计工作均通过Prism(GraphPad)进行。所有标绘数据均表示平均值±s.d.。除非另有说明，否则使用双因素ANOVA分析进行统计分析。
试剂
在本研究中使用以下试剂：MK-801马来酸盐(BN338，Biotrend)、DL-APV(BN0858，Biotrend)、NMDA(BN0385，Biotrend)。
实施例2：GluN2A和GluN2B的缺失突变体的产生和测试
为了研究GluN2A和GluN2B在NMDA受体介导的毒性中的作用，诸位发明人已经构建了构建体并且将质粒转染到HEK293细胞中。转染后48小时进行发光细胞毒性测定，细胞死亡(％)示于图2中。
作为结果，单独的GFP和GluN1(两者均作为对照)都不能诱导细胞死亡。野生型大鼠GluN1(UniProtKB-P35439；NMDZ1_RAT；1994年6月1日的序列版本)和GluN2A(UniProtKB-Q00959；NMDE1_RAT，1998年12月15日的序列版本2)(后者包含SEQ ID NO:1的规范序列以及包含侧翼序列的根据SEQ ID NO:9的序列)的组合表达诱导HEK293细胞的细胞死亡，就像GluN1和缺乏大鼠GluN2A的最后9个C末端氨基酸的GluN2A突变体的组合表达一样。然而，GluN1和仅缺乏SEQ ID NO:1的创造性序列基序的大鼠GluN2A突变体(SEQ ID NO:41)的组合表达导致的细胞死亡水平低得多。在存在非竞争性通用NMDA受体抑制剂MK-801的情况下，GluN1和大鼠GluN2A的组合表达没有诱导细胞死亡(对照实验)。GluN2B获得了类似的结果。野生型大鼠GluN1和GluN2B(UniProtKB-Q00960；NMDE2_RAT，1994年6月的序列版本1)(后者包含SEQ ID NO:7的规范序列和侧翼序列，参见SEQ ID NO:15)的组合表达诱导HEK293细胞的细胞死亡，就像缺乏大鼠GluN2B的最后9个C末端氨基酸的缺失突变体一样。GluN1和缺乏SEQ ID NO:7的创造性序列基序的GluN2B突变体(SEQ ID NO:42)的组合表达没有导致细胞死亡的诱导。在存在非竞争性通用NMDA受体抑制剂MK-801的情况下，GluN1和GluN2B的组合表达也没有诱导细胞死亡。
实施例3：GluN2A和GluN2B中的创造性序列基序的突变体产生和测试
在下一步骤中，诸位发明人试图评估异亮氨酸和其他氨基酸残基在创造性序列基序中的重要性。诸位发明人构建了含有上述突变体的构建体，并且将质粒转染到HEK293细胞中。转染后48小时进行发光细胞毒性测定，细胞死亡(％)示于图3中。
作为结果，缺失突变体(GluN2A：缺乏SEQ ID NO:1；GluN2B：缺乏SEQ ID NO:7)基本上丧失了它们诱导HEK293细胞的细胞死亡的能力。具有创造性序列基序中的突变的GluN2A的变体(参见SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:21)展现出至少降低的毒性水平。对于GluN2B，类似的突变基本上消除了任何毒性作用(参见SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:2)。
实施例4：其他GluN2A和GluN2B变体对针对NMDA受体介导的毒性的易感性的影响 的评估
鉴于实施例3中针对创造性序列基序的GluN2A和GluN2B突变体获得的结果，诸位发明人进一步测试了人类基因库中所述序列基序中天然存在的变异对针对NMDA受体介导的毒性的易感性的影响。诸位发明人已经构建了含有选自NCBI的SNP数据库的上述突变体的构建体(对于GRIN2A，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？showRare＝on&chooseRs＝coding&go＝Go&locusId＝2903，且对于GRIN2B，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi？showRare＝on&chooseRs＝coding&go＝Go&locusId＝2904)，并将质粒转染到HEK293细胞中。转染后48小时进行发光细胞毒性测定，细胞死亡(％)示于图4中。
作为结果，展现出变体序列的天然存在的变体序列可能对GluN2A和GluN2B蛋白所致的对细胞死亡的易感性产生显著影响。例如，在其GluN2A蛋白中展现出根据SEQ ID NO:6而不是SEQ ID NO:1的序列的受试者可能具有对NMDA介导的细胞死亡显著增加的易感性。相反，在其GluN2B蛋白中展现出SEQ ID NO:8而不是SEQ ID NO:7的受试者可能具有对NMDA介导的细胞死亡显著降低的易感性。
实施例5：包含根据SEQ ID NO:1或根据SEQ ID NO:7的肽的融合蛋白足以诱导 NMDA受体介导的毒性
在下一步骤中，诸位发明人评估了创造性序列基序本身是否足以诱导NMDA受体介导的毒性。出于此目的，GluN2A(SEQ ID NO:1)和GluN2B(SEQ ID NO:7)的创造性核心区域加上侧翼区域通过用重组腺相关病毒感染的方式在小鼠海马神经元中表达。出于此目的，在DIV3将原代小鼠海马神经元用rAAV-SEQ ID NO:9(即，包含SEQ ID NO:1)、rAAV-SEQ IDNO:10(即，包含SEQ ID NO:2)、rAAV-SEQ ID NO:15(即，包含SEQ ID NO:7)和rAAV-SEQ IDNO:26(即，包含SEQ ID NO:3)感染。将神经元在DIV17固定，用Hoechst染色，并且对细胞死亡进行定量。结果表明，包含SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:7的肽足以诱导细胞死亡，并且GluN2A和GluN2B的核心基序中的两个丙氨酸残基的突变将细胞死亡水平极大地降低到大约未转染对照的水平(参见图5)。因此，此实验表明，可以通过仅使用关键核心基序来重现用全长GluN2A和GluN2B受体所获得的结果，因此，认为所述关键核心基序本身足以诱导NMDA受体介导的毒性。
实施例6：根据本发明的诊断试剂盒的实施例
根据本发明的试剂盒可以基本上以与用于DNA亲权认定的标准试剂盒相似的方式配置。所述试剂盒可以含有基因组DNA提取试剂盒和PCR/测序试剂盒。基因组DNA提取试剂盒含有以下：裂解/结合缓冲液、消化缓冲液、洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、洗脱缓冲液、RNA酶A、蛋白酶K、具有收集管和附加收集管的用于基因组DNA结合的离心柱。PCR/测序试剂盒含有用于标准PCR的2x Mastermix以及用于PCR和测序的引物。通过以下引物在两个区域中扩增人GRIN2A的靶区域：
区域1(正向：GGGATCTGCCACAACGAGAA；SEQ ID NO:29；反向：CTCCCGTTTCCTTTCTGCCT；SEQ ID NO:30)
区域1可以用以下引物(SEQ引物1：GCGTATTCTACATGCTGG；SEQ ID NO:33)进行测序。
区域2(正向：CCTATGCTTTGCAACTTGTCTCA；SEQ ID NO:31；反向：TTGGATGAAGTCAGCAGCTCTT；SEQ ID NO:32)
区域2可以用以下引物(SEQ引物2：CAGGGCTCCTGCAAGAAG；SEQ ID NO:34)进行测序。
通过以下引物在两个区域中扩增用于人GRIN2B的SNP检测的靶区域：
区域1(正向：GAAGCTCTCTGGCTCACTGG；SEQ ID NO:35；反向：AACTGCCCAAATCCCACACA；SEQ ID NO:36)
区域1可以用以下引物(SEQ引物3：CACAATGAGAAGAATGAGG；SEQ ID NO:39)进行测序。
区域2(正向：ACCTCAGCTCACCACATGAC；SEQ ID NO:37；反向：GATGACTCCCGTCGGATGAA；SEQ ID NO:38)
区域2可以用以下引物(SEQ引物2：GGTATAAATTAGGCAAACT；SEQ ID NO:40)进行测序。
DNA提取试剂盒使用的样品取自人类受试者，并且可以是血液样品或口拭子。测序概念展示于图6中。
SEQUENCE LISTING
<110> 基本制药有限公司
<120> 预测和操纵NMDA受体介导的毒性的新手段
<130> FMP-002 PCT
<150> EP20190722.7
<151> 2020-08-12
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Glu Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A deletion mutant fragment exhibiting only flanking regions
<400> 23
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Lys Lys Lys Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A motif mutated with 2 Ile residues and one His residue
mutated to Ala residues plus flanking regions
<400> 24
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val Ala Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B deletion mutant fragment exhibiting only flanking regions
<400> 25
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Arg Gln Ser Val
1 5 10 15
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<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B motif mutated with 2 Ile residues mutated to Ala residues
plus flanking regions
<400> 26
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
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<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B motif mutated with 2 Ile residues mutated to Ala residues
and one Ala residue mutated to His plus flanking regions
<400> 27
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val His Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
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<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile Arg Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggatctgcc acaacgagaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
ctcccgtttc ctttctgcct 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
cctatgcttt gcaacttgtc tca 23
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<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
ttggatgaag tcagcagctc tt 22
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
gcgtattcta catgctgg 18
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
cagggctcct gcaagaag 18
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
gaagctctct ggctcactgg 20
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<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Ala Cys Ala
20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
acctcagctc accacatgac 20
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Thr Cys Gly Gly Ala
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala
20
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<212> DNA
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cacaatgaga agaatgagg 19
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ggtataaatt aggcaaact 19
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 41
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1 5 10 15
Val Trp Arg Asp Pro Ala Gln Asn Ala Ala Ala Glu Lys Gly Pro Pro
20 25 30
Ala Leu Asn Ile Ala Val Leu Leu Gly His Ser His Asp Val Thr Glu
35 40 45
Arg Glu Leu Arg Asn Leu Trp Gly Pro Glu Gln Ala Thr Gly Leu Pro
50 55 60
Leu Asp Val Asn Val Val Ala Leu Leu Met Asn Arg Thr Asp Pro Lys
65 70 75 80
Ser Leu Ile Thr His Val Cys Asp Leu Met Ser Gly Ala Arg Ile His
85 90 95
Gly Leu Val Phe Gly Asp Asp Thr Asp Gln Glu Ala Val Ala Gln Met
100 105 110
Leu Asp Phe Ile Ser Ser Gln Thr Phe Ile Pro Ile Leu Gly Ile His
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Met Ile Met Ala Asp Lys Asp Pro Thr Ser Thr Phe
130 135 140
Phe Gln Phe Gly Ala Ser Ile Gln Gln Gln Ala Thr Val Met Leu Lys
145 150 155 160
Ile Met Gln Asp Tyr Asp Trp His Val Phe Ser Leu Val Thr Thr Ile
165 170 175
Phe Pro Gly Tyr Arg Asp Phe Ile Ser Phe Ile Lys Thr Thr Val Asp
180 185 190
Asn Ser Phe Val Gly Trp Asp Met Gln Asn Val Ile Thr Leu Asp Thr
195 200 205
Ser Phe Glu Asp Ala Lys Thr Gln Val Gln Leu Lys Lys Ile His Ser
210 215 220
Ser Val Ile Leu Leu Tyr Cys Ser Lys Asp Glu Ala Val Leu Ile Leu
225 230 235 240
Ser Glu Ala Arg Ser Leu Gly Leu Thr Gly Tyr Asp Phe Phe Trp Ile
245 250 255
Val Pro Ser Leu Val Ser Gly Asn Thr Glu Leu Ile Pro Lys Glu Phe
260 265 270
Pro Ser Gly Leu Ile Ser Val Ser Tyr Asp Asp Trp Asp Tyr Ser Leu
275 280 285
Glu Ala Arg Val Arg Asp Gly Leu Gly Ile Leu Thr Thr Ala Ala Ser
290 295 300
Ser Met Leu Glu Lys Phe Ser Tyr Ile Pro Glu Ala Lys Ala Ser Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Ala Glu Lys Pro Glu Thr Pro Leu His Thr Leu His Gln
325 330 335
Phe Met Val Asn Val Thr Trp Asp Gly Lys Asp Leu Ser Phe Thr Glu
340 345 350
Glu Gly Tyr Gln Val His Pro Arg Leu Val Val Ile Val Leu Asn Lys
355 360 365
Asp Arg Glu Trp Glu Lys Val Gly Lys Trp Glu Asn Gln Thr Leu Ser
370 375 380
Leu Arg His Ala Val Trp Pro Arg Tyr Lys Ser Phe Ser Asp Cys Glu
385 390 395 400
Pro Asp Asp Asn His Leu Ser Ile Val Thr Leu Glu Glu Ala Pro Phe
405 410 415
Val Ile Val Glu Asp Ile Asp Pro Leu Thr Glu Thr Cys Val Arg Asn
420 425 430
Thr Val Pro Cys Arg Lys Phe Val Lys Ile Asn Asn Ser Thr Asn Glu
435 440 445
Gly Met Asn Val Lys Lys Cys Cys Lys Gly Phe Cys Ile Asp Ile Leu
450 455 460
Lys Lys Leu Ser Arg Thr Val Lys Phe Thr Tyr Asp Leu Tyr Leu Val
465 470 475 480
Thr Asn Gly Lys His Gly Lys Lys Val Asn Asn Val Trp Asn Gly Met
485 490 495
Ile Gly Glu Val Val Tyr Gln Arg Ala Val Met Ala Val Gly Ser Leu
500 505 510
Thr Ile Asn Glu Glu Arg Ser Glu Val Val Asp Phe Ser Val Pro Phe
515 520 525
Val Glu Thr Gly Ile Ser Val Met Val Ser Arg Ser Asn Gly Thr Val
530 535 540
Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Pro Phe Ser Ala Ser Val Trp Val Met
545 550 555 560
Met Phe Val Met Leu Leu Ile Val Ser Ala Ile Ala Val Phe Val Phe
565 570 575
Glu Tyr Phe Ser Pro Val Gly Tyr Asn Arg Asn Leu Ala Lys Gly Lys
580 585 590
Ala Pro His Gly Pro Ser Phe Thr Ile Gly Lys Ala Ile Trp Leu Leu
595 600 605
Trp Gly Leu Val Phe Asn Asn Ser Val Pro Val Gln Asn Pro Lys Gly
610 615 620
Thr Thr Ser Lys Ile Met Val Ser Val Trp Ala Phe Phe Ala Val Ile
625 630 635 640
Phe Leu Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Met Ile Gln Glu
645 650 655
Glu Phe Val Asp Gln Val Thr Gly Leu Ser Asp Lys Lys Phe Gln Arg
660 665 670
Pro His Asp Tyr Ser Pro Pro Phe Arg Phe Gly Thr Val Pro Asn Gly
675 680 685
Ser Thr Glu Arg Asn Ile Arg Asn Asn Tyr Pro Tyr Met His Gln Tyr
690 695 700
Met Thr Arg Phe Asn Gln Arg Gly Val Glu Asp Ala Leu Val Ser Leu
705 710 715 720
Lys Thr Gly Lys Leu Asp Ala Phe Ile Tyr Asp Ala Ala Val Leu Asn
725 730 735
Tyr Lys Ala Gly Arg Asp Glu Gly Cys Lys Leu Val Thr Ile Gly Ser
740 745 750
Gly Tyr Ile Phe Ala Ser Thr Gly Tyr Gly Ile Ala Leu Gln Lys Gly
755 760 765
Ser Pro Trp Lys Arg Gln Ile Asp Leu Ala Leu Leu Gln Phe Val Gly
770 775 780
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805 810 815
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820 825 830
Ile Thr Phe Ile Trp Glu His Leu Phe Tyr Trp Lys Leu Arg Phe Cys
835 840 845
Phe Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Lys Lys Lys Ser
850 855 860
Pro Asp Phe Asn Leu Thr Gly Ser Gln Ser Asn Met Leu Lys Leu Leu
865 870 875 880
Arg Ser Ala Lys Asn Ile Ser Asn Met Ser Asn Met Asn Ser Ser Arg
885 890 895
Met Asp Ser Pro Lys Arg Ala Thr Asp Phe Ile Gln Arg Gly Ser Leu
900 905 910
Ile Val Asp Met Val Ser Asp Lys Gly Asn Leu Ile Tyr Ser Asp Asn
915 920 925
Arg Ser Phe Gln Gly Lys Asp Ser Ile Phe Gly Asp Asn Met Asn Glu
930 935 940
Leu Gln Thr Phe Val Ala Asn Arg His Lys Asp Asn Leu Ser Asn Tyr
945 950 955 960
Val Phe Gln Gly Gln His Pro Leu Thr Leu Asn Glu Ser Asn Pro Asn
965 970 975
Thr Val Glu Val Ala Val Ser Thr Glu Ser Lys Gly Asn Ser Arg Pro
980 985 990
Arg Gln Leu Trp Lys Lys Ser Met Glu Ser Leu Arg Gln Asp Ser Leu
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Asn Gln Asn Pro Val Ser Gln Arg Asp Glu Lys Thr Ala Glu Asn
1010 1015 1020
Arg Thr His Ser Leu Lys Ser Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Glu Val
1025 1030 1035
Ala His Ser Asp Ile Ser Glu Thr Ser Ser Arg Ala Thr Cys His
1040 1045 1050
Arg Glu Pro Asp Asn Asn Lys Asn His Lys Thr Lys Asp Asn Phe
1055 1060 1065
Lys Arg Ser Met Ala Ser Lys Tyr Pro Lys Asp Cys Ser Asp Val
1070 1075 1080
Asp Arg Thr Tyr Met Lys Thr Lys Ala Ser Ser Pro Arg Asp Lys
1085 1090 1095
Ile Tyr Thr Ile Asp Gly Glu Lys Glu Pro Ser Phe His Leu Asp
1100 1105 1110
Pro Pro Gln Phe Val Glu Asn Ile Thr Leu Pro Glu Asn Val Gly
1115 1120 1125
Phe Pro Asp Thr Tyr Gln Asp His Asn Glu Asn Phe Arg Lys Gly
1130 1135 1140
Asp Ser Thr Leu Pro Met Asn Arg Asn Pro Leu His Asn Glu Asp
1145 1150 1155
Gly Leu Pro Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Leu Tyr Ala Lys His Phe
1160 1165 1170
Thr Leu Lys Asp Lys Gly Ser Pro His Ser Glu Gly Ser Asp Arg
1175 1180 1185
Tyr Arg Gln Asn Ser Thr His Cys Arg Ser Cys Leu Ser Asn Leu
1190 1195 1200
Pro Thr Tyr Ser Gly His Phe Thr Met Arg Ser Pro Phe Lys Cys
1205 1210 1215
Asp Ala Cys Leu Arg Met Gly Asn Leu Tyr Asp Ile Asp Glu Asp
1220 1225 1230
Gln Met Leu Gln Glu Thr Gly Asn Pro Ala Thr Arg Glu Glu Val
1235 1240 1245
Tyr Gln Gln Asp Trp Ser Gln Asn Asn Ala Leu Gln Phe Gln Lys
1250 1255 1260
Asn Lys Leu Arg Ile Asn Arg Gln His Ser Tyr Asp Asn Ile Leu
1265 1270 1275
Asp Lys Pro Arg Glu Ile Asp Leu Ser Arg Pro Ser Arg Ser Ile
1280 1285 1290
Ser Leu Lys Asp Arg Glu Arg Leu Leu Glu Gly Asn Leu Tyr Gly
1295 1300 1305
Ser Leu Phe Ser Val Pro Ser Ser Lys Leu Leu Gly Asn Lys Ser
1310 1315 1320
Ser Leu Phe Pro Gln Gly Leu Glu Asp Ser Lys Arg Ser Lys Ser
1325 1330 1335
Leu Leu Pro Asp His Ala Ser Asp Asn Pro Phe Leu His Thr Tyr
1340 1345 1350
Gly Asp Asp Gln Arg Leu Val Ile Gly Arg Cys Pro Ser Asp Pro
1355 1360 1365
Tyr Lys His Ser Leu Pro Ser Gln Ala Val Asn Asp Ser Tyr Leu
1370 1375 1380
Arg Ser Ser Leu Arg Ser Thr Ala Ser Tyr Cys Ser Arg Asp Ser
1385 1390 1395
Arg Gly His Ser Asp Val Tyr Ile Ser Glu His Val Met Pro Tyr
1400 1405 1410
Ala Ala Asn Lys Asn Thr Met Tyr Ser Thr Pro Arg Val Leu Asn
1415 1420 1425
Ser Cys Ser Asn Arg Arg Val Tyr Lys Lys Met Pro Ser Ile Glu
1430 1435 1440
Ser Asp Val
1445
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<211> 1464
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
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<400> 42
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Ala Val Leu Ala Val Ser Gly Ser Lys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Pro
20 25 30
Pro Ser Ile Gly Ile Ala Val Ile Leu Val Gly Thr Ser Asp Glu Val
35 40 45
Ala Ile Lys Asp Ala His Glu Lys Asp Asp Phe His His Leu Ser Val
50 55 60
Val Pro Arg Val Glu Leu Val Ala Met Asn Glu Thr Asp Pro Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ile Thr Arg Ile Cys Asp Leu Met Ser Asp Arg Lys Ile Gln Gly
85 90 95
Val Val Phe Ala Asp Asp Thr Asp Gln Glu Ala Ile Ala Gln Ile Leu
100 105 110
Asp Phe Ile Ser Ala Gln Thr Leu Thr Pro Ile Leu Gly Ile His Gly
115 120 125
Gly Ser Ser Met Ile Met Ala Asp Lys Asp Glu Ser Ser Met Phe Phe
130 135 140
Gln Phe Gly Pro Ser Ile Glu Gln Gln Ala Ser Val Met Leu Asn Ile
145 150 155 160
Met Glu Glu Tyr Asp Trp Tyr Ile Phe Ser Ile Val Thr Thr Tyr Phe
165 170 175
Pro Gly Tyr Gln Asp Phe Val Asn Lys Ile Arg Ser Thr Ile Glu Asn
180 185 190
Ser Phe Val Gly Trp Glu Leu Glu Glu Val Leu Leu Leu Asp Met Ser
195 200 205
Leu Asp Asp Gly Asp Ser Lys Ile Gln Asn Gln Leu Lys Lys Leu Gln
210 215 220
Ser Pro Ile Ile Leu Leu Tyr Cys Thr Lys Glu Glu Ala Thr Tyr Ile
225 230 235 240
Phe Glu Val Ala Asn Ser Val Gly Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Thr Trp
245 250 255
Ile Val Pro Ser Leu Val Ala Gly Asp Thr Asp Thr Val Pro Ser Glu
260 265 270
Phe Pro Thr Gly Leu Ile Ser Val Ser Tyr Asp Glu Trp Asp Tyr Gly
275 280 285
Leu Pro Ala Arg Val Arg Asp Gly Ile Ala Ile Ile Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Ser Asp Met Leu Ser Glu His Ser Phe Ile Pro Glu Pro Lys Ser Ser
305 310 315 320
Cys Tyr Asn Thr His Glu Lys Arg Ile Tyr Gln Ser Asn Met Leu Asn
325 330 335
Arg Tyr Leu Ile Asn Val Thr Phe Glu Gly Arg Asn Leu Ser Phe Ser
340 345 350
Glu Asp Gly Tyr Gln Met His Pro Lys Leu Val Ile Ile Leu Leu Asn
355 360 365
Lys Glu Arg Lys Trp Glu Arg Val Gly Lys Trp Lys Asp Lys Ser Leu
370 375 380
Gln Met Lys Tyr Tyr Val Trp Pro Arg Met Cys Pro Glu Thr Glu Glu
385 390 395 400
Gln Glu Asp Asp His Leu Ser Ile Val Thr Leu Glu Glu Ala Pro Phe
405 410 415
Val Ile Val Glu Ser Val Asp Pro Leu Ser Gly Thr Cys Met Arg Asn
420 425 430
Thr Val Pro Cys Gln Lys Arg Ile Ile Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu
435 440 445
Glu Pro Gly Tyr Ile Lys Lys Cys Cys Lys Gly Phe Cys Ile Asp Ile
450 455 460
Leu Lys Lys Ile Ser Lys Ser Val Lys Phe Thr Tyr Asp Leu Tyr Leu
465 470 475 480
Val Thr Asn Gly Lys His Gly Lys Lys Ile Asn Gly Thr Trp Asn Gly
485 490 495
Met Ile Gly Glu Val Val Met Lys Arg Ala Tyr Met Ala Val Gly Ser
500 505 510
Leu Thr Ile Asn Glu Glu Arg Ser Glu Val Val Asp Phe Ser Val Pro
515 520 525
Phe Ile Glu Thr Gly Ile Ser Val Met Val Ser Arg Ser Asn Gly Thr
530 535 540
Val Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Pro Phe Ser Ala Asp Val Trp Val
545 550 555 560
Met Met Phe Val Met Leu Leu Ile Val Ser Ala Val Ala Val Phe Val
565 570 575
Phe Glu Tyr Phe Ser Pro Val Gly Tyr Asn Arg Cys Leu Ala Asp Gly
580 585 590
Arg Glu Pro Gly Gly Pro Ser Phe Thr Ile Gly Lys Ala Ile Trp Leu
595 600 605
Leu Trp Gly Leu Val Phe Asn Asn Ser Val Pro Val Gln Asn Pro Lys
610 615 620
Gly Thr Thr Ser Lys Ile Met Val Ser Val Trp Ala Phe Phe Ala Val
625 630 635 640
Ile Phe Leu Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Met Ile Gln
645 650 655
Glu Glu Tyr Val Asp Gln Val Ser Gly Leu Ser Asp Lys Lys Phe Gln
660 665 670
Arg Pro Asn Asp Phe Ser Pro Pro Phe Arg Phe Gly Thr Val Pro Asn
675 680 685
Gly Ser Thr Glu Arg Asn Ile Arg Asn Asn Tyr Ala Glu Met His Ala
690 695 700
Tyr Met Gly Lys Phe Asn Gln Arg Gly Val Asp Asp Ala Leu Leu Ser
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Gly Asp Gly Glu Met Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Leu Thr Gly Ile
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835 840 845
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850 855 860
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Leu Arg Leu Leu Arg Thr Ala Lys Asn Met Ala Asn Leu Ser Gly Val
885 890 895
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900 905 910
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965 970 975
Gly Ser Thr Ser Ser Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Cys Asp Asn Pro Pro
980 985 990
Phe Thr Thr Gln Pro Arg Ser Ile Ser Lys Lys Pro Leu Asp Ile Gly
995 1000 1005
Leu Pro Ser Ser Lys His Ser Gln Leu Ser Asp Leu Tyr Gly Lys
1010 1015 1020
Phe Ser Phe Lys Ser Asp Arg Tyr Ser Gly His Asp Asp Leu Ile
1025 1030 1035
Arg Ser Asp Val Ser Asp Ile Ser Thr His Thr Val Thr Tyr Gly
1040 1045 1050
Asn Ile Glu Gly Asn Ala Ala Lys Arg Arg Lys Gln Gln Tyr Lys
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
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1100 1105 1110
Phe Tyr Leu Asp Gln Phe Arg Thr Lys Glu Asn Ser Pro His Trp
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1130 1135 1140
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1160 1165 1170
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1175 1180 1185
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Gln Ala Cys Ile Arg Cys Glu Ala Cys Lys Lys Ala Gly Asn Leu
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Tyr Asp Ile Ser Glu Asp Asn Ser Leu Gln Glu Leu Asp Gln Pro
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Ala Ala Pro Val Ala Val Thr Ser Asn Ala Ser Ser Thr Lys Tyr
1250 1255 1260
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Lys Leu Arg Arg Gln His Ser Tyr Asp Thr Phe Val Asp Leu Gln
1280 1285 1290
Lys Glu Glu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ser Val Ser Leu Lys Asp
1295 1300 1305
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Ser Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Arg Val Thr Gln Asn Pro Phe Ile
1355 1360 1365
Pro Thr Phe Gly Asp Asp Gln Cys Leu Leu His Gly Ser Lys Ser
1370 1375 1380
Tyr Phe Phe Arg Gln Pro Thr Val Ala Gly Ala Ser Lys Thr Arg
1385 1390 1395
Pro Asp Phe Arg Ala Leu Val Thr Asn Lys Pro Val Val Val Thr
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Leu His Gly Ala Val Pro Gly Arg Phe Gln Lys Asp Ile Cys Ile
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Gly Asn Gln Ser Asn Pro Cys Val Pro Asn Asn Lys Asn Pro Arg
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
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1 5 10 15
Ser
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
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<400> 45
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1 5 10 15
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
1 5 10 15
Val
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaSEQ ID NO:1 forward primer
<400> 47
ccgggctgct ccacattgaa gaaaagaaga 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaSEQ ID NO:1 reverse primer
<400> 48
tcttcaatgt ggagcagccc gggccggtca 30
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaC9 forward primer
<400> 49
cgctaaagag tcctaggtat ct 22
<210> 50
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaC9 reverse primer
<400> 50
gtctgctcga agcggccgct tacttgtaca ctcgtctatt g 41
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2 forward primer
<400> 51
ctccatcagc aggggcgcct atagttgcgc ccatgg 36
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2 reverse primer
<400> 52
ccatgggcgc aactataggc gcccctgctg atggag 36
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I3A3 forward primer
<400> 53
ggctgctctt ctccgccagc aggggcgcct at 32
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I3A3 reverse primer
<400> 54
ataggcgccc ctgctggcgg agaagagcag cc 32
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2HA forward primer
<400> 55
tgcgcccatg gggtagccat tgaagaaaag 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2HA reverse primer
<400> 56
cttttcttca atggctaccc catgggcgca 30
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I867M forward primer
<400> 57
catcagcagg ggcatgtata gttgcatcca t 31
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I867M reverse primer
<400> 58
atggatgcaa ctatacatgc ccctgctgat g 31
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-S869R forward primer
<400> 59
ggcatctata gatgcatcca tgg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-S869R reverse primer
<400> 60
ccatggatgc atctatagat gcc 23
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I876N forward primer
<400> 61
catccatggg gtacacaatg aagaa 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I876N reverse primer
<400> 62
ttcttcattg tgtaccccat ggatg 25
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2BdeltaSEQ ID NO:7 forward primer
<400> 63
tggcatggtc gccatagagg agcgcca 27
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2BdeltaSEQ ID NO:7 reverse primer
<400> 64
cctctatggc gaccatgcca ggcttgcca 29
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial seqeunce
<220>
<223> GRIN2BdeltaC9 forward primer
<400> 65
gtggattggg aggaccggtc tgg 23
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2BdeltaC9 reverse primer
<400> 66
ggcaagaatt ctcactcata aacatgtcca ttg 33
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2 forward primer
<400> 67
ctccatcagc agaggtgcct acagctgtgc ccatgg 36
<210> 68
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2 reverse primer
<400> 68
ccatgggcac agctgtaggc acctctgctg atggag 36
<210> 69
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2AH forward primer
<400> 69
tgtgcccatg gggtacacat agaggagcgc c 31
<210> 70
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2AH reverse primer
<400> 70
ggcgctcctc tatgtgtacc ccatgggcac a 31
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I872M forward primer
<400> 71
atctacagct gtatgcatgg ggtagcc 27
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I872M reverse primer
<400> 72
ggctacccca tgcatacagc tgtagat 27
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-H873R forward primer
<400> 73
ctacagctgt atccgtgggg tagccataga 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-H873R reverse primer
<400> 74
tctatggcta ccccacggat acagctgtag 30

Claims (16)

1.一种多肽，所述多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，或包含其变体序列，其中所述变体序列展现出与选自以下的序列的至少80％序列同一性：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且其中所述多肽为至多125个氨基酸长。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽包含选自以下的序列：SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含根据权利要求1或权利要求2所述的多肽和至少一种与根据权利要求1所述的氨基酸序列异源的其他氨基酸序列，特别地其中所述异源多肽序列选自以下中的一种或多种：膜锚定多肽序列、蛋白质转导结构域序列和标签序列。
4.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1或2所述的多肽或根据权利要求3所述的融合蛋白。
5.根据权利要求1或2所述的多肽、根据权利要求3所述的融合蛋白或根据权利要求4所述的核酸，其用于在治疗受试者的癌症的方法中使用，特别是用于治疗神经母细胞瘤。
6.一种细胞，所述细胞包含以下中的一种或多种：
a)根据权利要求1或权利要求2所述的多肽，
b)根据权利要求3所述的融合蛋白，
c)根据权利要求4所述的核酸；
d)重组表达的GluN2A蛋白，其中所述GluN2A蛋白包含代替SEQ ID NO:1的规范序列基序的其变体序列，或者其中所述SEQ ID NO:1的前述序列基序是缺失的；其中所述变体序列导致与包含SEQ ID NO:1的规范序列基序的GluN2A蛋白相比展现出降低的毒性活性的GluN2A蛋白；
e)重组表达的GluN2B蛋白，其中所述GluN2B蛋白包含代替SEQ ID NO:7的规范序列基序的其变体序列，或者其中所述SEQ ID NO:7的前述序列基序是缺失的；其中所述变体序列导致与包含SEQ ID NO:7的规范序列基序的GluN2B蛋白相比展现出降低的毒性活性的GluN2B蛋白。
7.根据权利要求6所述的细胞，其中所述SEQ ID NO:1的变体序列展现出相对于所述SEQ ID NO:1的序列的以下变体氨基酸残基中的一个或多个：I3A、I7A、I11A、H15A；和/或其中所述SEQ ID NO:7的变体序列展现出所述SEQ ID NO:7的序列中的以下变体氨基酸残基中的一个或多个：I7A、I11A、H12R、A15H。
8.一种抗体、纳米抗体或anticalin，所述抗体、纳米抗体或anticalin与GluN2A或GluN2B蛋白的C末端胞质结构域结合，但是不与缺乏对应于氨基SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的区域的GluN2A或GluN2B缺失突变体结合，特别地其中所述抗体、纳米抗体或anticalin与选自以下的序列结合：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27。
9.根据权利要求8所述的抗体、纳米抗体或anticalin，其中所述抗体、纳米抗体或anticalin防御、诱导或改善NMDA受体介导的毒性。
10.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽、根据权利要求3所述的融合蛋白、根据权利要求4所述的核酸、根据权利要求6所述的细胞和/或根据权利要求8或9所述的抗体、纳米抗体或anticalin用于研究NMDA受体介导的毒性的用途。
11.一种对受试者的基因组核酸样品中的GRIN2A基因(即，编码GluN2A蛋白的基因)的部分序列和/或GRIN2B基因(即，编码GluN2B蛋白的基因)的部分序列进行测序的离体方法，其中所述测序的GRIN2A基因的部分序列至少包含通常编码SEQ ID NO:1蛋白的规范序列的基因区，并且其中所述测序的GRIN2B基因的部分序列至少包含通常编码SEQ ID NO:7的规范序列的基因区。
12.一种用于评估受试者对NMDA受体介导的毒性的易感性的方法，所述方法包括对受试者的基因组核酸样品中的GRIN2A基因(即，编码GluN2A蛋白的基因)的部分序列和/或GRIN2B基因(即，编码GluN2B蛋白的基因)的部分序列进行测序，其中所述测序的GRIN2A基因的部分序列至少包含通常编码人GluN2A蛋白中SEQ ID NO:1的规范序列的基因区，并且其中所述测序的GRIN2B基因的部分序列至少包含通常编码人GluN2B蛋白的SEQ ID NO:7的规范序列的基因区，并且其中：
a)具有规范GluN2A(SEQ ID NO:1)和/或规范GluN2B(SEQ ID NO:7)序列的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的常规易感性，
b)具有GluN2A(I867M)突变的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的增加的易感性，
c)具有GluN2A(S869R)突变的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的常规易感性，
d)具有GluN2A(I876N)突变的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的增加的易感性，
e)具有GluN2B(I872M)突变的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的常规易感性，并且
f)具有GluN2B(H873R)突变的受试者展现出对NMDA受体介导的毒性的降低的易感性。
13.根据权利要求1或权利要求2所述的多肽或根据权利要求3所述的融合蛋白在蛋白质-蛋白质相互作用测定中的用途。
14.一种用于鉴定与GluN2A或GluN2B蛋白的C末端胞质结构域潜在地相互作用的化合物的方法，其中所述方法包括：
i)将候选化合物与根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体进行计算机辅助虚拟对接，所述变体选自GluN2A(I867M)(还参见SEQ ID NO:4)、GluN2A(S869R)(还参见SEQ ID NO:5)、GluN2A(I876N)(还参见SEQ ID NO:6)、GluN2B(I872M)(还参见SEQ IDNO:8)和GluN2B(H873R)(还参见SEQ ID NO:22)，其中所述氨基酸序列以包含所述氨基酸序列的多肽的虚拟3D结构提供，以及
ii)确定将所述候选化合物与根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:7的氨基酸序列或其变体进行虚拟对接的对接得分和/或内应变，以及任选地
iii)将分别包含GluN2A或GluN2B亚基的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体与所述候选化合物在体外或体内接触，以确定所述候选化合物是否调节所述NMDA受体的活性。
15.一种试剂盒，所述试剂盒包括确定受试者的基因组核酸样品中的GRIN2A基因的部分序列和/或GRIN2B基因的部分序列的序列的手段，其中所述测序的GRIN2A基因的部分序列至少包含通常编码GluN2A蛋白的SEQ ID NO:1的规范序列的基因区，并且其中所述测序的GRIN2B基因的部分序列包含通常编码GluN2B蛋白的SEQ ID NO:7的规范序列的基因区，特别地其中所述试剂盒包含选自以下的引物：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40。
16.一种向细胞提供产生对NMDA受体介导的毒性的更强抗性的核酸的方法，所述方法包括：
i)将所述细胞中与对NMDA受体介导的毒性的较高易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2B基因组序列用与对NMDA受体介导的毒性的较低易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2B序列替代；或者
ii)将所述细胞中与对NMDA受体介导的毒性的较高易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2BmRNA转录物定点mRNA编辑为与对NMDA受体介导的毒性的较低易感性相关的GRIN2A和/或GRIN2B mRNA序列。
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