KR20230050427A - Nmda 수용체-매개 독성을 예측 및 조절하는 신규 수단 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신경퇴행성 과정 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 NMDA 수용체 매개 독성을 연구하고 조절하는데 유용한, GluN2A 및 GluN2B 단백질의 서열 모티프를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 모티프는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열 또는 이의 변이 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이를 코딩하는 핵산, 및 각각의 (숙주) 세포 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드에 결합하는 화합물, 및 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 개체의 민감도를 평가하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경퇴행성 과정 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 NMDA 수용체 매개 독성을 연구하고 조절하는데 유용한, GluN2A 및 GluN2B 단백질의 서열 모티프를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 모티프는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열 또는 이의 변이 서열을 갖는다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 이를 코딩하는 핵산, 및 각각의 (숙주) 세포 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드에 결합하는 화합물, 및 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 개체의 민감도(susceptibility)를 평가하는 방법에 관한 것이다.
신경퇴행성 질환은 뉴런의 구조 및 기능의 진행성 손실, 결국 뉴런의 사멸에 관여하는 치명적인 질병이다. 신경퇴행은 급성 또는 서서히 진행될 수 있지만, 두가지 유형의 신경퇴행 모두가 증가된 세포외 글루타메이트 농도 또는 NMDA 수용체의 시냅스외 부위로 재편재화에 의해 야기된 시냅스외 NMDA 수용체에 의한 사멸 신호전달 증가를 종종 수반한다. NMDA 수용체는 칼슘에 대해 투과성인 글루타메이트- 및 전압- 개폐 이온 채널이다. 이들은 이들의 세포이하(subcellular) 위치에 따라 시냅스(synaptic) 및 시냅스외(extrasynaptic) NMDA 수용체로 분류될 수 있다. 통상적인 글루타메이트 이온성 수용체 NMDA 유형 서브유닛 1 (GluN1; Glutamate Ionotropic Receptor NMDA Type Subunit 1) 서브유닛을 운반하는 것 이외에, 시냅스외 NMDA 수용체는 GluN2B 서브유닛을 우선적으로 함유하고, 반면에 GluN2A는 시냅스 NMDA 수용체에서 우세한 서브유닛이지만, 시냅스 접촉 내부 및 외부 수용체의 서브유닛 조성은 유사하다. 시냅스 대 시냅스외 NMDA 수용체 자극의 세포 결과는 극적으로 상이하다. 시냅스 NMDA 수용체는 시냅스 전송의 효능에서 생리학적 변화를 개시한다. 또한 그들은 사실상 모든 행동 적응의 장기적 이행에 중요한 유전자 발현 반응을 활성화시키는 세포 핵으로의 칼슘 신호전달 경로를 촉발한다. 가장 중요하게는, 핵 칼슘을 통해 작용하는, 시냅스 NMDA 수용체는 뉴런 구조-보호 및 생존-증진 유전자의 강력한 활성제이다. 두드러지게 대조적으로, 시냅스외 NMDA 수용체는 세포 사멸 경로를 촉발한다. 시냅스외 NMDA 수용체 활성화 후 몇 분 이내, 미토콘드리아 막 전위가 붕괴되고, 미토콘드리아 투과성 전환(transition)이 이어진다. 또한 시냅스외 NMDA 수용체는, 그들이 싸이클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP)-반응 요소-결합 단백질 (CREB) 차단 경로를 촉발하고, 세포외 신호-조절 카이네이즈 (ERK)-MAPK 신호전달을 불활성화시키며, 클래스 Ⅱa 히스톤 디아세틸라제 (HDACs) 및 프로-아폽토틱 전사인자 Foxo3A의 핵 이동을 초래하기 때문에, 여기(excitation)-전사 커플링을 강력하게 길항하고, 핵-칼슘-중심의 적응유전학(adaptogenomics)을 방해한다. 이것은 복잡한 수지상 구조 및 시냅스 연결의 유지 및 신경보호 방패의 구축에 필수적인, 뇌-유래 신경영양인자(Bdnf) 및 혈관 내피 성장인자 D(Vegfd)를 포함하는, 많은 유전자들의 활성 조절에 영향을 미친다. 또한, 활성화된 ERK1/2의 짧은 도달 범위를 감안하면, 시냅스외 NMDA 수용체에 의한 그들의 차단은 시냅스 전송의 효능을 제어하는 수지상 mRNA 번역 및 AMPA (α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산) 수용체 수송을 포함하는 중요한 국부적 신호전달 이벤트를 방해한다. 따라서, 시냅스외 NMDA 수용체 신호전달은 미토콘드리아 기능이상, 전사 조절완화, 및 뉴런 구조 및 연결의 완전성 손실을 갖는 병리적 삼징후(triad) 개시를 특징으로 한다.
그러나, 지금까지 NMDA 수용체의 독성 신호전달의 분자적 기초는 알려지지 않았다. 이것은 불행한 일인데, 예를 들어 NMDA 수용체 신호전달과 관련된 신경퇴행성 과정이 발생하거나 겪을 위험을 결정하기 위한 진단 툴에 대해 기술분야에서의 니즈가 있기 때문이다. 따라서, 본 발명에 의해 해결하고자 하는 문제는 NMDA 수용체-매개 독성을 연구, 예측 및/또는 조절하기 위한 새로운 수단을 제공하는 것이다.
이 문제는 첨부된 특허청구범위 및 하기 설명에 기재된 내용에 의해 해결된다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 GluN2A 및 GluN2B의 세포내 막 근처 부분 내에 위치한 4개의 규칙적인 간격의 이소류신을 갖는 18개 아미노산의 진화적으로 고도로 보존된 스트레치(stretch)가 NMDA 수용체-매개 독성에 책임이 있다는 것을 발견하였다. 상응하는 서열을 가진 폴리펩타이드는 NMDA 수용체-매개 독성을 유도하기에 충분하고, 이는 신경 세포 사멸을 야기한다. 본 발명자들은 18개 아미노산의 고도로 보존된 스트레치 내에서 이소류신 뿐만 아니라 이소류신 옆에 있는 특정 아미노산이 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포를 포함하는 비신경세포에서 NMDA 수용체 채널의 독성을 결정한다는 것을 돌연변이 분석에서 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 독성이 더 적거나 더 많은, GluN2A/GluN2B 단백질의 상기 폴리펩타이드 모티프의 변이를 발견하였다. 이러한 변이 중 일부는 인간 군의 유전자 풀에 존재하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)에 해당한다. 이러한 변이로 인해 다른 인간들보다 NMDA 수용체 매개 독성에 더 취약하여, 이에 따라 신경퇴행성 과정에 더 취약하여, 상기 질병의 진단 및 예후에 영향을 미치는 인간 대상체가 있는 것으로 고려된다. 또한, 이러한 변이로 인해 다른 인간들보다 NMDA 수용체 매개 독성에 덜 취약하여, 이에 따라 신경퇴행성 과정에 덜 취약하여, 뉴런에 유해한 조건에서 뉴런 사멸을 겪지 않거나 덜 겪는 '이점'을 갖는 인간 대상체도 있는 것으로 고려된다. 상기 조건은 저산소성 허혈 상태, 외상성 뇌 손상, 녹내장, 뇌 미세혈관병증, 당뇨병과 같은 대사 질환으로 인한 신경병증, 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 포함한 신경퇴행성 질환에 대한 유전적 또는 비유전적 소인을 포함한다.
따라서, 본 발명은 제1 양태에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, 및 SEQ ID NO:8, 또는 이의 변이 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것으로서, 상기 변이 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상의 서열 상동성, 더 바람직하게는 85% 이상의 서열 상동성, 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 폴리펩타이드는 바람직하게는 643개 이하, 바람직하게는 625개 이하 아미노산 길이이다. SEQ ID NO:1은 마우스, 래트 및 인간 GluN2A 단백질 내에서 보존된 서열 모티프이며, 이의 C-말단 세포질 도메인의 부분이다. 상기 18개 아미노산 길이 서열 성분(element)은 여기서 "표준(canonical)" GluN2A라고 지칭하는데, 그 이유는 이것이 전장 길이의 GluN2A 단백질에 대한 UniProt 데이터베이스의 각 데이터베이스 엔트리에서 발견되는 "표준(canonical)" 이소폼이기 때문이다(UniProtKB - Q12879; NMDE1_HUMAN; 1996년 11월 1일의 서열 버전 1). Grin2B 단백질에서 SEQ ID NO:1에 상응하는 서열은 SEQ ID NO:7이다. 상기 18개 아미노산 길이 서열 성분은 여기서 "표준(canonical)" GluN2B라고 지칭하는데, 그 이유는 이것이 UniProt 데이터베이스의 각 데이터베이스 엔트리에서 발견되는 "표준(canonical)" 이소폼이기 때문이다(UniProtKB - Q13224; NMDE2_HUMAN; 2001년 6월 20일의 서열 버전 3). 본 발명자들은 상기 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 NMDA 수용체-매개 독성을 유도하기에 충분하다는 것을 보여주었다. SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3은 (즉, GluN2A로부터 유래된) SEQ ID NO:1의 인위적으로 창조된, 변이된 버전이며, 이는 여전히 몇몇 독성 특성을 보여준다. SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6은 인간에게서 발생하는 (즉, GluN2A로부터 유래된) SEQ ID NO:1의 자연 발생 변이체이다. 상기 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 또한 독성이며, NMDA 수용체 매개 독성을 유도한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 전술한 본 발명의 코어 모티프 외에 GluN2A- 또는 GluN2B 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 플랭킹 영역을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 GluN2A 또는 GluN2B의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11(또는 그 이상)의 추가 아미노산을 각각 포함할 수 있으며, 이는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7의 표준 서열 모티프에 대해 N-말단에서 직접 인접하여 발견된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들어 GluN2A 또는 GluN2B의 1, 2, 3 또는 4(또는 그 이상)의 추가 아미노산을 또한 또는 부가적으로 포함할 수 있으며, 이는 상기 단백질에서 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7의 본 발명의 서열 모티프에 대해 C-말단에서 직접 인접하여 발견된다. 따라서, 본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩타이드는 예를 들어 GluN2A 측면에서 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. GluN2B의 측면에서, 본 발명의 제1 양태의 폴리펩타이드는 예를 들어 SEQ ID NO:15에 따른 서열 또는 SEQ ID NO:16에 따른 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열 및 이들의 구조적 관계의 예시는 도 1에 제공된다. 본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩타이드는 예컨대, 신경 세포에서, NMDA 수용체 매개된 독성, 특히 상기 과정에 수반되는 규제 및 상호작용을 연구하고 유도하기 위해 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:7에서 보여지는 GluN2A 및 GluN2B의 표준 아미노산 서열 모티프는 인간 특유의 것이 아니라, 하기 표 1 및 2에서 보여지는 것처럼 포유류에서, 심지어 척추동물에 걸쳐 고도로 보존된 것이다.
| 종(Species) | 강(Class) | 상동성 | |
| 1 | 칼로린쿠스 밀리이(Callorhinchus milii) | 콘드리히티스(Chondrichthyes) | 78% |
| 2 | 린코돈 타이푸스(Rhincodon typus) | 83% | |
| 3 | 라리미크티스 크로세아(Larimichthys crocea) | 오스테이크타이에스(Osteichthyes) | 94% |
| 4 | 온코르힌쿠스 마이키스(Oncorhynchus mykiss) | 94% | |
| 5 | 시포포러스 마쿨라투스(Xiphophorus maculatus) | 100% | |
| 6 | 나노라나 파르케리(Nanorana parkeri) | 앰피비아(Amphibia) | 100% |
| 7 | 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) | 100% | |
| 8 | 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis) | 100% | |
| 9 | 아놀리스 카롤리넨시스(Anolis carolinensis) | 렙틸리아(Reptilia) | 100% |
| 10 | 포고나 비티셉스(Pogona vitticeps) | 100% | |
| 11 | 프로토보스로프스 무크로스쿠아마투스(Protobothrops mucrosquamatus) | 100% | |
| 12 | 아마조나 아에스티바(Amazona aestiva) | 아베스(Aves) | 100% |
| 13 | 콜룸바 리비아(Columba livia) | 100% | |
| 14 | 드로마이우스 노바에홀란디애(Dromaius novaehollandiae) | 100% | |
| 15 | 갈루스 갈루스(Gallus gallus) | 100% | |
| 16 | 파루스 마조르(Parus major) | 100% | |
| 17 | 피고셀리스 아델리애(Pygoscelis adeliae) | 100% | |
| 18 | 보스 타우루스(Bos Taurus) | 마말리아(Mammalia) | 100% |
| 19 | 카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) | 100% | |
| 20 | 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus) | 100% | |
| 21 | 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) | 100% | |
| 22 | 에쿠우스 카발루스(Equus caballus) | 100% | |
| 23 | 에리나세우스 유로패우스(Erinaceus europaeus) | 100% | |
| 24 | 펠리스 카투스(Felis catus) | 100% | |
| 25 | 고릴라 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla gorilla) | 100% | |
| 26 | 헤테로세팔루스 글라베르(Heterocephalus glaber) | 100% | |
| 27 | 호모 사피엔스(Homo sapiens) | 100% | |
| 28 | 익티도미스 트리데셈리네아투스(Ictidomys tridecemlineatus) | 100% | |
| 29 | 마카카 네메스트리나(Macaca nemestrina) | 100% | |
| 30 | 메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus) | 100% | |
| 31 | 무스 카롤리(Mus caroli) | 100% | |
| 32 | 무스 무스쿨루스(Mus musculus) | 100% | |
| 33 | 오비스 아리에스(Ovis aries) | 100% | |
| 34 | 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes) | 100% | |
| 35 | 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus) | 100% | |
| 36 | 수스 스크로파(Sus scrofa) | 100% |
| 종(Species) | 강(Class) | 상동성 | |
| 1 | 칼로린쿠스 밀리이(Callorhinchus milii) | 콘드리히티스(Chondrichthyes) | 89% |
| 2 | 린코돈 타이푸스(Rhincodon typus) | 78% | |
| 3 | 라리미크티스 크로세아(Larimichthys crocea) | 오스테이크타이에스(Osteichthyes) | 94% |
| 4 | 온코르힌쿠스 마이키스(Oncorhynchus mykiss) | 94% | |
| 5 | 시포포러스 마쿨라투스(Xiphophorus maculatus) | 94% | |
| 6 | 나노라나 파르케리(Nanorana parkeri) | 앰피비아(Amphibia) | 89% |
| 7 | 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) | 94% | |
| 8 | 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis) | 89% | |
| 9 | 아놀리스 카롤리넨시스(Anolis carolinensis) | 렙틸리아(Reptilia) | 94% |
| 10 | 포고나 비티셉스(Pogona vitticeps) | 94% | |
| 11 | 프로토보스로프스 무크로스쿠아마투스(Protobothrops mucrosquamatus) | 94% | |
| 12 | 아마조나 아에스티바(Amazona aestiva) | 아베스(Aves) | 100% |
| 13 | 콜룸바 리비아(Columba livia) | 100% | |
| 14 | 드로마이우스 노바에홀란디애(Dromaius novaehollandiae) | 100% | |
| 15 | 갈루스 갈루스(Gallus gallus) | 100% | |
| 16 | 피코이데스 푸베센스(Picoides pubescens) | 100% | |
| 17 | 피고셀리스 아델리애(Pygoscelis adeliae) | 100% | |
| 18 | 보스 타우루스(Bos Taurus) | 마말리아(Mammalia) | 100% |
| 19 | 카니스 루푸스 파밀리아리스(Canis lupus familiaris) | 100% | |
| 20 | 카비아 포르셀루스(Cavia porcellus) | 100% | |
| 21 | 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) | 100% | |
| 22 | 에쿠우스 아시누스(Equus asinus) | 100% | |
| 23 | 에리나세우스 유로패우스(Erinaceus europaeus) | 100% | |
| 24 | 펠리스 카투스(Felis catus) | 100% | |
| 25 | 고릴라 고릴라 고릴라(Gorilla gorilla gorilla) | 100% | |
| 26 | 헤테로세팔루스 글라베르(Heterocephalus glaber) | 100% | |
| 27 | 호모 사피엔스(Homo sapiens) | 100% | |
| 28 | 익티도미스 트리데셈리네아투스(Ictidomys tridecemlineatus) | 100% | |
| 29 | 마카카 물라타(Macaca mulatta) | 100% | |
| 30 | 메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus) | 100% | |
| 31 | 무스 카롤리(Mus caroli) | 100% | |
| 32 | 무스 무스쿨루스(Mus musculus) | 100% | |
| 33 | 오비스 아리에스(Ovis aries) | 100% | |
| 34 | 판 트로글로다이테스(Pan troglodytes) | 100% | |
| 35 | 라투스 노르베지쿠스(Rattus norvegicus) | 100% | |
| 36 | 수스 스크로파(Sus scrofa) | 100% |
상기 표 1 및 2에서 알 수 있듯이 관심 대상인 모티프는 다양한 척추동물, 특히 포유류 종에 걸쳐 잘 보존되어 있다. 따라서 하나의 척추동물, 특히 마우스 또는 래트와 같은 포유류 종에 대해 수득된 결과는 다른 척추동물 종, 특히 포유류 종에 대해서도 적용 가능한 것으로 용이하게 추정된다. 이와 관련하여, 본 발명자는 마우스 GluN2A/GluN2B로부터 원래 유래된 서열이 인간 HEK293 세포와 마우스 일차 배양된 뉴런 모두에서 사용될 수 있음을 보여주었으며, 이는 척추동물, 특히 포유류 종 경계에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 보존된 기능, 및 이에 따른 유용성을 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 유사분열 후 뉴런 및 유사분열 암 세포 모두에 대해 독성이며, 여기서 TRPM4 단백질이 발현된 것이 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이, 화합물이 시험관내 및 생체내 세포 사멸 모두를 유도한다면, 상기 화합물은 "독성(toxic)"이다. 표준 시험관내 테스트는 10일 동안 일차 뉴런에서 또는 신경아세포종 세포와 같은 세포주에서 이들 폴리펩타이드로 처리 또는 발현을 포함하며, 이어서 세포 사멸을 평가한다(예를 들어, 도 2, 및 도 5 참조). 표준 생체내 테스트는 본 발명의 폴리펩타이드를 3주 동안 발현시킨 후 퇴행성 뉴런을 (예컨대, FluoJade C 염색으로) 염색하여 뉴런 사멸을 평가하는 것이다. 적절한 대조군(즉, 식염수, 용매만, 비활성 변이체)과 비교하여 시험관내 또는 생체내에서 측정된 세포 사멸률의 통계학적으로 관련된 차이는 독성을 나타낸다.
본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩타이드의 길이는 바람직하게는 625개 아미노산 길이를 초과하지 않을 것이다. 이에 제한되지는 않지만, 상기 길이는 GluN2A 또는 GluN2B의 전체 세포질 도메인을 본질적으로 사용할 수 있도록 할 것이다. 그러나 대부분의 경우 본 발명의 폴리펩타이드는 더 짧을 것이다. 폴리펩타이드는 예를 들어 약 625개 아미노산 길이 이하, 약 600개 아미노산 길이 이하, 약 500개 아미노산 길이 이하, 약 400개 아미노산 길이 이하, 약 300개 아미노산 길이 이하, 약 250개 아미노산 길이 이하, 약 200개 아미노산 길이 이하, 약 150개 아미노산 길이 이하, 약 125개 아미노산 길이 이하, 약 100개 아미노산 길이 이하, 약 90개 아미노산 길이 이하, 약 85개 아미노산 길이 이하, 약 80개 아미노산 길이 이하, 약 75개 아미노산 길이 이하, 약 70개 아미노산 길이 이하, 약 65개 아미노산 길이 이하, 약 60개 아미노산 길이 이하, 약 55개 아미노산 길이 이하, 약 50개 아미노산 길이 이하, 약 45개 아미노산 길이 이하, 약 40개 아미노산 길이 이하, 약 35개 아미노산 길이 이하, 약 30개 아미노산 길이 이하, 약 25개 아미노산 길이 이하, 약 20개 아미노산 길이 이하일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 18 내지 약 30 아미노산 길이이다. 이러한 배열이 본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩타이드의 바람직한 구현예이더라도, 본 발명의 폴리펩타이드는 GluN2A 또는 GluN2B의 단편으로 제한되는 것으로 이해되어서는 안 된다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 제1 양태에 따른 본 발명의 폴리펩타이드 및 본 발명의 제1 양태에 따른 아미노산 서열에 대해 이종성인 하나 이상의 추가 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. "이종성(heterologous)"은 생성된 융합 단백질이 자연계에 이런 형태로 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 예를 들어 융합 단백질이 GluN2A 및/또는 GluN2B 서열, 예컨대 다른 종의 서열이 (GluN2A 및 GluN2B 서열의 혼합된 형태를 포함하는) 새롭고 인위적으로 창조된 이소폼에서 조합된, 또는, 더 바람직한 구현예에서는 추가 아미노산 서열이 GluN2A 또는 GluN2B 단백질과 더 이상 연관되지 않기 때문에, 셔플된 GluN2A 또는 GluN2B 변이체를 나타내는 것일 수 있다. 용어 "융합 단백질"은 융합으로부터 생성된 폴리펩타이드의 특정 길이를 의미하지 않는다. 하나 이상의 추가 아미노산 서열은 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 50개 이상, 100개 이상 아미노산, 250개 이상 아미노산, 또는 적어도 500개 이상 아미노산 길이일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 반드시 그런 것은 아니지만 통상적으로, 추가 아미노산 서열은 폴리펩타이드/생성된 융합 단백질에 추가 기능을 제공할 것이다. 예를 들어, 추가 아미노산 서열은 멤브레인 앵커 모이어티, 단백질 형질도입 도메인 및 태그로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. GluN2A 및 GluN2B는 멤브레인 앵커된 수용체이기 때문에, 융합 단백질, 및 이에 따른 본 발명의 폴리펩타이드가 세포에서 발현되는 경우에, 멤브레인 앵커 모이어티가 특히 유용하다. 특히 바람직한 멤브레인 앵커 모이어티는 CaaX 박스 모티프(프레닐화용), 글라이코실포스파티딜이노시톨(GPI) 신호 앵커 서열(SEQ ID NO:17) 및 K-Ras4B(Ras) 단백질의 C-말단 표적 신호(SEQ ID NO:18)로 이루어진 군으로부터 선택된다. CaaX 박스 모티프와 관련하여: C는 프레닐화된 시스테인이고, a는 임의의 지방족 아미노산이며, X의 아이덴티티는 어떤 효소가 단백질에 작용할지를 결정한다. 파르네실트랜스페라제(farnesyltransferase)는 X = M, S, Q, A 또는 C인 CaaX 박스를 인식하는 반면, 제라닐제라닐트랜스페라제(geranylgeranyltransferase) I는 X = L 또는 E인 CaaX 박스를 인식한다. 다만, 본 발명의 폴리펩타이드는 또한 예를 들어 단백질 형질도입 도메인, 즉 세포막을 가로질러 폴리펩타이드의 수송을 용이하게 하여 폴리펩타이드가 세포막을 통과하고 세포의 세포질에 들어갈 수 있게 하는 펩타이드 서열에 그것을 융합시킴으로써 외부로부터 세포로 투여될 수 있다. 바람직한 단백질 형질도입 도메인은 SEQ ID NO:19에 따른 TAT 단백질이다. 추가적으로, 또는 선택적으로, 예를 들어 폴리펩타이드/융합 단백질의 검출 또는 정제를 가능하게 하기 위해 태그로 본 발명의 폴리펩타이드를 라벨링하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 태그는 본 발명의 폴리펩타이드의 활성에 전혀 영향을 미치지 않는 HA 태그(SEQ ID NO:20)이거나, 녹색형광단백질(GFP)과 같은 형광 단백질 태그이다. 본 발명의 제2 양태에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 또한 독성이다.
본 발명의 제2 양태에 따른 융합 단백질은 바람직하게는 약 600개 아미노산 길이 이하, 약 500개 아미노산 길이 이하, 약 400개 아미노산 길이 이하, 약 300개 아미노산 길이 이하, 약 250개 아미노산 길이 이하, 약 200개 아미노산 길이 이하, 약 150개 아미노산 길이 이하, 약 125개 아미노산 길이 이하, 약 100개 아미노산 길이 이하, 약 90개 아미노산 길이 이하, 약 85개 아미노산 길이 이하, 약 80개 아미노산 길이 이하, 약 75개 아미노산 길이 이하, 약 70개 아미노산 길이 이하, 약 65개 아미노산 길이 이하, 약 60개 아미노산 길이 이하, 약 55개 아미노산 길이 이하, 약 50개 아미노산 길이 이하, 약 45개 아미노산 길이 이하, 약 40개 아미노산 길이 이하, 약 35개 아미노산 길이 이하, 약 30개 아미노산 길이 이하, 약 25개 아미노산 길이 이하, 약 20개 아미노산 길이 이하이며, 이에 한정되는 것은 아니다.
제3 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 본 발명의 하나 이상의 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 본 발명의 제2 양태에 따른 하나 이상의 융합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 핵산은 핵산에 대해 고려할 수 있는 모든 형태일 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 핵산은 RNA, DNA 또는 이들의 하이브리드일 수 있다. 이는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 이는 작은 전사체의 크기 또는 바이러스 게놈과 같은 전체 게놈의 크기를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 센스 가닥을 반영하는 핵산일 수 있다. 마찬가지로, 안티센스 가닥도 "인코딩"이라는 용어의 범위에 포함된다. 핵산은 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 위한 이종(즉, 비(non)- GluN2A 또는 GluN2B) 프로모터, 예를 들어 바이러스 프로모터 또는 박테리아 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산은 전장 길이의 GluN2A 또는 GluN2B 유전자를 인코딩할 수 없는 것으로 여겨진다(본 발명의 제1 양태에 따른 폴리펩타이드는 더 짧고, 융합 단백질은 GluN2A 및 GluN2B에 대해 이종성인 아미노산 서열을 포함함).
제4 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어 바이러스 발현 벡터일 수 있다. 상기 발현은 구성적이거나 유도적일 수 있다. 벡터는 또한 클로닝 목적을 위해 본 발명의 핵산의 서열을 포함하는 클로닝 벡터일 수 있다.
제5 양태에서, 본 발명은 대상체에서 질병을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 특히 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 및/또는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 암은 신경아세포종과 같은 신경 조직의 암이다. 암을 치료하는 방법은 NMDA 수용체 매개 세포 사멸을 유도하여 암을 치료하는 방법일 수 있다. "NMDA 수용체 매개 세포 사멸 유도"라는 용어는 본 발명의 본 양태에서 달성하려는 기술적 효과, 즉 일반적으로 (시냅스외) NMDA 수용체 신호전달에 의해 유도되고 각 세포의 사멸을 야기하는, 각 세포 사멸 경로의 유도를 나타내기 위해 사용되는 것으로 여겨진다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질, 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 발현을 제공하는 핵산 또는 벡터를 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 대상체는 일반적으로 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간 대상체이다. 투여 경로는 각 암에 적합한 것으로 통상의 기술자가 고려하는 임의의 투여 경로일 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 또는 벡터는 종양내로 투여된다.
제6 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 및/또는 벡터를 포함하는 (바람직하게는 단리된) 세포에 관한 것이다.
제7 양태에서, 본 발명은 GluN2A 및/또는 GluN2B 단백질을 재조합적으로 발현하는 (바람직하게는 단리된) 세포에 관한 것으로, 여기서 GluN2A 또는 GluN2B 단백질 각각은 SEQ ID NO:1 (GluN2A) 및 SEQ ID NO:7의 표준 서열 모티프 각각을 대신하여 이들의 변이 서열을 포함하거나, 또는 상기 언급된 서열 모티프가 결실된다. 변이 서열은 일반적으로 SEQ ID NO:1(GluN2A) 및 SEQ ID NO:7과 거의 동일한 서열 길이를 나타낼 것이며, 예를 들어 약 16 내지 약 20 아미노산, 바람직하게는 약 17 내지 19 아미노산, 가장 바람직하게는 18 아미노산 길이를 나타낸다. 본 발명의 이 양태의 세포의 GluN2A/GluN2B 단백질은 바람직하게는 표준 GluN2A 및 GluN2B 각각과 비교하여 감소된 수준의 독성 활성을 나타낸다. 예를 들어, 변이 서열은 SEQ ID NO:1의 서열에서 변이 아미노산 잔기: I3A, I7A, I11A, H15A 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. SEQ ID NO:7과 관련하여, 변이 서열은 예를 들어 변이 아미노산 잔기: I7A, I11A, H12R, A15H 중 하나 이상을 나타낼 수 있다. 본 발명의 제7 양태 측면에서 사용될 수 있는 각각의 GluN2A 및 GluN2B 단백질의 예는 변이 서열: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:21, 및 SEQ ID NO:22의 하나를 나타내는 GluN2A 및/또는 GluN2B 단백질이다. 물론 변이 서열은 각각 GluN2A 및 GluN2B의 플랭킹 서열에 의해 다시 둘러싸일 수 있다. 따라서 본 발명의 이 측면의 GluN2A 단백질은 예를 들어 다음 서열 중 하나를 포함할 수 있다: SEQ ID NO:23(즉, GluN2A 결실 돌연변이), SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, 및 SEQ ID NO:24. 본 발명의 이 측면의 GluN2B 단백질은 예를 들어 다음 서열 중 하나를 포함할 수 있다: SEQ ID NO:25(즉, GluN2B 결실 돌연변이), SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, 및 SEQ ID NO:28. 본 명세서에 사용된 "GluN2A 및/또는 GluN2B 단백질의 재조합적 발현"은 GluN2A 및/또는 GluN2B 발현의 인위적으로, 일시적이거나 구성적으로, 유도된 발현의 모든 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, GluN2A 및/또는 GluN2B 서열은 유전 공학을 통해 세포에 인위적으로 제공되었을 수 있다. GluN2A 또는 GluN2B 단백질은 임의의 종으로부터 유래된 것일 수 있지만, 바람직하게는 포유류 종, 바람직하게는 마우스 또는 인간 GluN2A 또는 GluN2B, 가장 바람직하게는 인간 GluN2A 또는 GluN2B로부터 유래된 것일 수 있다. 이것은 이들의 결실 변이 또는 SEQ ID NO:1(GluN2A) 및 SEQ ID NO:7의 변이 서열이 아니라 GluN2A/GluN2B 서열의 나머지 부분에 관련된 것으로 이해된다. 용어 "GluN2A 및/또는 GluN2B 단백질"은 또한 주어진 종에서 GluN2A 또는 GluN2B 단백질의 모든 변이체를 포함하며, 즉, 상기 종의 표준 서열로 제한되지 않는다. 본 발명의 이 측면의 GluN2A 및/또는 GluN2B 단백질은 바람직하게는 글루타메이트- 및 전압- 개폐 이온 채널을 형성하고, 시냅스 전달 효능의 생리학적 변화를 개시하여 세포 핵으로의 칼슘 신호 전달 경로를 촉발하고, 및/또는 신경 구조-보호 및 생존-촉진 유전자를 활성화하는 능력을 유지한다는 점에 주목해야 한다.
본 발명의 제6 및 제7 양태의 세포는 (예컨대, 생산 목적을 위해) 박테리아 세포 및 효모 세포 뿐만 아니라 (에컨대, 연구 목적을 위해, 그러나 생산 및 기타 목적을 위해서도 가능) 포유류 세포로 이루어진 군으로부터 특히 선택될 수 있다. 포유류 세포는 신경 세포일 수 있지만 비신경 포유류 세포일 수도 있다. 특히 바람직한 구현예에서 세포는 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포이다. 상기 HEK293 세포는 예를 들어 위에서 설명한 바와 같은 GluN2A 및/또는 GluN2B 단백질을 포함할 수 있다.
제8 양태에서, 본 발명은 본 발명의 (제6 또는 제7 양태에 따른) 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 상기 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 벡터 및/또는 세포를 포함하는 나노입자를 포함할 수 있다. 상기 나노입자는 시간이 경과함에 따라 상기 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 벡터 및/또는 세포를 방출하도록 설계될 수 있다.
제9 양태에서, 본 발명은 각각 GluN2A 또는 GluN2B 단백질의 C-말단 세포질 도메인에 결합하지만, 각각 아미노 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:7에 상응하는 영역(즉, UniProtKB 엔트리 - Q12879; NMDE1_HUMAN; 1996년 11월 1일자 서열 버전 1의 아미노산 861-878; 및 UniProtKB - Q13224; NMDE2_HUMAN; 2001년 6월 20일자 서열 버전 3; GluN2B의 아미노산 862-879)이 결여된 GluN2A 또는 GluN2B 결실 변이체에는 결합하지 않는, 항체, 나노바디 또는 안티칼린(anticalin), 특히 항체 또는 나노바디에 관한 것이다. 상기 항체, 나노바디 또는 안티칼린은 각각 GluN2A 및 GluN2B 단백질의 본 발명의 영역에 대해 특이적이며, 이는 본 발명자에 의해 NMDA 수용체 매개 독성의 유도와 관련이 있는 것으로 입증되었다. 상기 항체는 예를 들어 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, 및 SEQ ID NO:27로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드 서열에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체, 나노바디 또는 안티칼린은 NMDA 수용체 매개 독성(예를 들어, NMDA 또는 글루타메이트 유도 신경 사멸, 산소 글루코오스 박탈 유도 신경 사멸, 뇌졸중의 동물 모델)으로부터 보호, 이를 유도 또는 개선(ameliorate)을 하며, 예를 들어 이는 NMDA 수용체 매개 독성을 유발하는데 관여하는 상호작용 파트너, 특히 TRPM4 단백질 또는 다른 단백질들과 GluN2A 및 GluN2B의 상기 하위 영역의 상호작용을 방지함으로써 이루어진다. 상기 항체, 나노바디 또는 안티칼린은 각각 길항 또는 블록킹 항체, 나노바디 또는 안티칼린인 것으로 고려될 수 있다. 본 명세서에서 나노바디는 단일-도메인 항체(sdAb), 즉 단일 모노머 가변 항체 도메인으로 구성된 항체 단편이다.
제10 양태에서, 본 발명은 NMDA 수용체 매개 독성 연구를 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 융합 단백질, 핵산, 벡터, 세포, 조성물 및/또는 항체, 나노바디 또는 안티칼린의 용도에 관한 것이다. 본 출원의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명자들은 NMDA 수용체 매개 독성의 유도에 충분한 GluN2A 단백질 및 GluN2B 단백질 내의 핵심 영역을 확인하였다. 이것은 과학자와 연구자들이 NMDA 수용체 매개 독성을 유발하는 이벤트의 분자적 기초를 더 자세히 연구할 수 있게 할 것이다.
제11 양태에서, 본 발명은 GRIN2A 유전자(즉, GluN2A 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열 및/또는 GRIN2B 유전자(즉, GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열을 대상체의 게놈 핵산 샘플에서 시퀀싱하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 GRIN2A 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:1(즉, 인간 GluN2A 단백질의 아미노산 861-878)의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하고, GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:7(즉, 인간 GluN2B 단백질의 아미노산 862-879)의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 포함한다. 본 발명의 발명자들은 표준 서열 외에도 (예컨대, 인간의) 유전자 풀에서 GluN2A 단백질 및 GluN2B 단백질의 변이체(즉, 타입)가 있고, GluN2A 및/또는 GluN2B의 유전적 변이체(즉, 타입)에 의존적으로 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 민감도가 달라진다는 것을 보여주었다. 따라서, GluN2A 및/또는 GluN2B의 타입을 결정하는 것은 임상적 관련성을 가질 수 있고, 이에 따라 본 발명의 제11 양태의 방법은 (GluN2A 및 GluN2B 각각의 세포질 도메인에서 본 발명의 서열과 관련하여) 대상체의 GluN2A 및 GluN2B 타입에 대한 서열 정보를 제공하기 위한 것이다. 바람직하게는, GRIN2A 유전자 및/또는 GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 인코딩된 GluN2A 및 GluN2B 단백질의 100개 이하, 더 바람직하게는 75개 이하, 더 바람직하게는 50개 이하의 아미노산을 커버한다. 바람직하게는, 시퀀싱은 폴리머라제 연쇄 반응 기반 증폭 및 시퀀싱을 사용한다. 인간 게놈에서 본 발명의 아미노산 서열 모티프는 2개의 엑손에 걸쳐 분포, 즉, 인트론에 의해 차단된다는 점에 주목한다. 따라서, 상기 영역을 시퀀싱하는 수단은 이러한 사실을 고려할 필요가 있을 것이다. 본 발명의 제11 양태의 방법은, 예를 들어, 엑손-인트론 경계에서 2개의 적절한 영역을 시퀀싱함으로써 수행될 수 있다. 표준 프라이머를 사용하는 PCR의 경우, 인간 게놈에서 GRIN2A 타겟 서열의 증폭에 적합한 프라이머는 예를 들어 SEQ ID NO:29 및 SEQ ID NO:30(GRIN2A, 제1영역의 정방향 및 역방향 프라이머)과 SEQ ID NO:31 및 SEQ ID NO:32(GRIN2A, 제2영역의 정방향 및 역방향 프라이머)에서 제공된다. 이어서, 상기 증폭된 핵산은 SEQ ID NO:33 및 SEQ ID NO:34로 표시되는 시퀀싱 프라이머로 시퀀싱될 수 있다. 인간 게놈에서 GRIN2B 타겟 서열의 경우, SEQ ID NO:35 및 SEQ ID NO:36이 제1영역에 적합한 정방향 및 역방향 프라이머이고, SEQ ID NO:37 및 SEQ ID NO:38은 제2영역에 적합한 정방향 및 역방향 프라이머이다. 이어서, 상기 증폭된 핵산은 예를 들어 SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:40으로 표시되는 시퀀싱 프라이머로 시퀀싱될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 제11 양태의 방법은 - 시퀀싱된 게놈 핵산 샘플에 기초하여 - 대상체가 하기의 하나 이상을 나타내는지 여부를 결정할 수 있도록 하는 것에 적합하다(모든 위치 표시는 UniProtKB - Q12879 또는 UniProtKB - Q13224의 서열과 관련하여 제공됨):
- 표준 GluN2A (SEQ ID NO:1 참조),
- GluN2A (I867M) (SEQ ID NO:4 참조),
- GluN2A (S869R) (SEQ ID NO:5 참조),
- GluN2A (I876N) (SEQ ID NO:6 참조),
- 표준 GluN2B (SEQ ID NO:7 참조),
- GluN2B (I872M) (SEQ ID NO:8 참조),
- GluN2B (H873R) (SEQ ID NO:22 참조).
본 발명의 발명자들은 상기 GluN2A 및 GluN2B 변이체(각각의 유전자에서 상이한 SNP에 의해 유발됨)가 실시예에서 입증된 바와 같이 HEK293 세포주에서 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 민감도를 상이한 수준으로 야기한다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 제11 양태의 상기 언급된 방법은 또한 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 대상체의 민감도(susceptibility)를 평가하기 위한 방법일 수 있으며, 이 방법은 GRIN2A 유전자(즉, GluN2A 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열 및/또는 GRIN2B 유전자(즉, GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열을 대상체의 게놈 핵산 샘플에서 시퀀싱하는 것을 포함하며, 여기서 GRIN2A 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:1(즉, 인간 GluN2A 단백질의 아미노산 861-878)의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하고, GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:7(즉, 인간 GluN2B 단백질의 아미노산 862-879)의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 포함하며, 대상체는:
a) 표준 GluN2A (SEQ ID NO:1) 및/또는 표준 GluN2B (SEQ ID NO:7) 서열은 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 보통의 민감도(regular susceptibility)를 나타내고,
b) GluN2A (I867M) 돌연변이(SEQ ID NO:4 참조)는 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 증가된 민감도를 나타내고,
c) GluN2A (S869R) 돌연변이(SEQ ID NO:5 참조)는 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 보통의 민감도를 나타내고,
d) GluN2A (I876N) 돌연변이(SEQ ID NO:6 참조)는 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 증가된 민감도를 나타내고,
e) GluN2B (I872M) 돌연변이(SEQ ID NO:8 참조)는 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 보통의 민감도를 나타내고,
f) GluN2B (H873R) 돌연변이(SEQ ID NO:22 참조)는 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 감소된 민감도를 나타낸다.
바람직하게는, 본 발명의 제11 양태의 방법은 생체외(ex vivo) 방법이며, 즉, 인간 또는 동물 신체에서 수행되지 않는다. 샘플을 제공하는 대상체는 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 원숭이, 말, 햄스터, 기니피그, 돼지, 양, 염소, 토끼 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
또한, 제12 양태에서, 본 발명은 단백질-단백질 상호작용 어세이에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 융합 단백질 또는 본 발명에 따른 세포의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 GluN2A 및 GluN2B 단백질에서의 본 발명의 영역의 중요성을 본 명세서에 공개하지만, 다른 단백질 인자들이 NMDA 수용체 매개 독성을 촉진 또는 제한하는데 관여할 수 있는지는 명확하지 않다. 본 발명의 제1 및 제2 양태에 따른 폴리펩타이드/융합 단백질(또는 제6 또는 제7 양태에 따른 세포)는 GluN2A 또는 GluN2B 단백질의 추가 결합 및 상호작용 파트너를 확인하는데 매우 유용할 것으로 여겨진다. 상기 어세이에서 조사 대상인 단백질-단백질 상호작용은 바람직하게는 SEQ ID NO:1 및/또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 이들의 변이 서열에 의해 특정되는 영역 내의 상호작용이다. 상기 결합 파트너는 신경독성, 신경보호성 또는 그 어느 것도 아닌 것으로 판명될 수 있다. 이러한 측면에서, 예를 들어 특정 복합체가 (예컨대, 경쟁적) 억제에 기인하여 더 이상 형성될 수 없다면, 폴리펩타이드/융합 단백질/세포는 직접적인 상호작용 파트너에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 GluN2A/GluN2B 신호전달에 관련되는 다른 화합물의 상호작용에 대해서도 규명할 것이다. 통상의 기술자는 생화학적, 생물물리학적 및 유전적 방법을 포함한, 단백질-단백질 상호작용을 결정하기 위한 다수의 가능한 어세이와 친숙하다. 비-제한적인 예에는 면역침전, 이분자 형광 상보(예를 들어 스플릿-TEV, 스플릿-GFP), 친화성 전기영동, 면역전기영동, 파지 디스플레이, 텐덤 친화도 정제, 화학적 가교 후 질량 스펙트로메트리 분석, 표면 플라스몬 공명, 형광 공명 에너지 전이, 핵 자기 공명 이미징, SEQ ID NO:1 및/또는 SEQ ID NO:7에 대한 결합이 상기 언급된 어세이에서 신호를 제거하는 역 어세이, 화합물 라이브러리를 비-반응 세포에 추가하여 이를 반응성으로 만드는 상보 어세이, 또는 RNAi 스크리닝 어세이(반응 세포를 반응성으로 만들기) 등이다. 상기 단백질-단백질 상호작용 어세이는 시험관내, 생체외 또는 생체내 어세이일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 단백질-단백질 상호작용 어세이는 시험관내 어세이이다. 그러나, 라이브 이미징의 측면에서 이러한 어세이는 또한 생체내 어세이일수 있다. 상기 어세이가 생체내 어세이인 경우, 바람직하게는 인간에 대한 어세이가 아니다.
본 발명의 영역과의 잠재적인 상호작용은 종래의 웨트(wet) 화학 수단에 의해 결정될 수 있을 뿐만 아니라 새로운 인 실리코 접근법에 의해서도 결정될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 제13 양태에서 GluN2A 또는 GluN2B 단백질의 C-말단 세포질 도메인과 잠재적으로 상호작용하는 화합물을 동정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
i)
SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열 또는 이의 변이체에 후보 화합물을 컴퓨터-지원 가상 도킹하는 단계로서, 상기 변이체는 GluN2A (I867M) (SEQ ID NO:4 참조), GluN2A (S869R) (SEQ ID NO:5 참조), GluN2A (I876N) (SEQ ID NO:6 참조), GluN2B (I872M) (SEQ ID NO:8 참조), 및 GluN2B (H873R) (SEQ ID NO:22 참조) 중에서 선택되며, 상기 아미노산 서열은 상기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 가상 3D 구조에서 제공되는 단계, 및
ii) 후보 화합물을 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열, 또는 이의 변이체에 가상으로 도킹하기 위한 도킹 스코어 및/또는 내부 스트레인을 결정하는 단계, 및 선택적으로
iii) 시험관내 또는 생체내에서 GluN2A 또는 GluN2B 서브유닛 각각을 포함하는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 수용체를 후보 화합물과 접촉시켜 상기 후보 화합물이 상기 NMDA 수용체의 활성을 조절하는지 또는 조절하지 않는지를 결정하는 단계.
전술한 바와 같이, NMDA 수용체 활성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 Zhang et al., 2011, J. Neurosci. 31, 4978-4990 참조; 이는 본 명세서에 참조로 삽입됨).
단백질 구조에 대한 후보 화합물의 인 실리코 도킹을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 후보 화합물은 임의의 화합물일 수 있다. 통상적으로, 상기 화합물은 소분자일 것이지만, 상기 화합물은 단백질(예컨대, 항체 등)과 같은 큰 생체분자인 것도 가능하다. 화합물 집단은 예를 들면 Schrodinger LLC (New York, NY, USA)에서 이용가능하다. 3D 구조는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7 또는 이의 변이체(SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27 및 SEQ ID NO:28)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 임의의 구조일 수 있다. 3D 구조는 임의의 척추동물 GluN2A 또는 GluN2B 단백질 또는 본 발명의 서열 모티프를 포함하는 것들의 일부의 임의의 3D 구조일 수 있다. 바람직하게는, 3D 구조는 포유류 기원이며, 더 바람직하게는 인간 기원이다. 상기 3D 구조는 또한 GluN2A 또는 GluN2B 단백질을 포함하는 복합체의 구조일 수 있으며, 예를 들어 GluN1 및 GluN2A 또는 GluN2B의 복합체의 구조일 수 있다. 본 발명의 경우, GluN2A 및 GluN2B 단백질의 다양한 구조는 통상의 기술자에게, 예를 들어 Protein Data Bank에서 이용 가능하고, 본 발명의 제13 양태의 방법에 사용될 수 있다. 상기 3D 구조는 예를 들면 x-선 결정학 분석, NMR 분광학 분석, 저온 전자현미경(cryo-EM)에 의해 얻은 구조를 기반으로 하거나, 또는 상동성 모델링으로부터 유래된 구조를 기반으로 할 수 있다. 본 발명의 제13 양태에 따른 방법은, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열 또는 이의 변이체(특히, 전술한 것들)에 상응하는, GluN2A/GluN2B 구조의 영역에 후보 화합물을 도킹하는 것을 포함하며, 상기 아미노산 서열과 관련되지 않는 구조의 영역에 도킹하는 것을 포함하지 않는다. 그러나, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7 또는 이의 변이체를 갖는 영역에 대한 도킹이 상기 영역 외부의 다른 아미노산 잔기와 병렬(parallel) 상호작용을 필요로 하는 경우, 이러한 도킹은 또한 본 발명의 제13 양태에 따른 방법에 포함된다. 도킹 그 자체는 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있고, 각각의 소프트웨어는 대중적으로 이용가능하다 (예를 들면 Schrodinger LLC, New York, NY, USA 참조). 각각의 분석은 또한 상업적 공급자, 예를 들면 Proteros biostructures GmbH(Planegg, 독일)에게 주문할 수 있다. 본 발명의 제13 양태의 방법은 또한 NMDA 수용체 매개 독성의 억제제를 동정하는데 사용될 수 있다.
또한, 제14 양태에서, 본 발명은 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 더 많은 저항성을 제공하는 핵산, 특히 유전자를 갖는 세포를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 세포에서 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 높은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B 게놈 서열을 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 낮은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B 서열로 대체하는 것을 포함한다. 예를 들어, NMDA 수용체 매개 독성에 대한 (예컨대, 표준 GRIN2A/GRIN2B에 비해) 높은 민감도로 연결된 GRIN2A 게놈 서열(예를 들어, I876N 서브타입을 인코딩하는 GRIN2A 유전자 변이체; SEQ ID NO:6 참조)은 GRIN2A 표준 게놈 서열로 대체되거나, 또는 표준 서열보다 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 훨씬 더 낮은 민감도를 제공하는 서열로 대체될 수 있다(예를 들어, 결실 변이체를 인코딩하는 GRIN2A 유전자 변이; SEQ ID NO:23 참조; 또는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 또는 SEQ ID NO:21에 따른 서열). 마찬가지로, 표준 GRIN2B 게놈 서열은 표준 서열보다 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 낮은 민감도를 제공하는 서열로 대체될 수 있다(예를 들어 결실 변이체를 인코딩하는 GRIN2B 유전자 변이체; SEQ ID NO:25 참조; 또는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, 또는 SEQ ID NO:22에 따른 서열). 상기 방법은 바람직하게는 시험관내 방법이다. 세포는 예를 들어 신경 세포, 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포, 난모세포 또는 정모세포일 수 있다. 세포는 바람직하게는 포유류 기원이고, 더 바람직하게는 인간 기원이다. 그러나, 비인간 포유류 세포도 본 발명에서 구체적으로 또한 고려된다. 바람직한 구현예에서, NMDA 수용체 매개 독성에 대해 더 많은 저항성을 제공하는 핵산(또는 유전자)은 본 발명의 서열 모티프 영역이 완전히 결여된 핵산(또는 유전자)(즉, 결실 변이체)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유전자 대체는 CRISPR 또는 다른 기술-매개 유전자 편집에 의해 달성된다. 상기 대체는 뉴런이 NMDA 독성에 대해 더 저항성이 되도록 하고 결과적으로 여러 형태의 (뇌졸중, ALS, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 망막 변성(녹내장, 당뇨병성 망막병증) 등을 포함하는) 신경퇴행에 대해 더 저항성을 갖게 한다.
제15 양태에서, 그리고 전술한 제14 양태와 유사하게, 본 발명은 GluN2A 및 GluN2B 모두의 본 발명 영역 내에서 세포, 기관, 설치류, 포유류 또는 인간의 부위-지정(site-directed) 메신저 RNA(mRNA) 편집 방법에 관한 것이며, NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 높은 민감도로 연결된 mRNA를 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 낮은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B mRNA 서열로 변경함으로써 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 많은 저항성을 숙주에게 제공한다. 위치-지정 mRNA 편집은 뉴클레오타이드 아데노신의 이노신으로의 탈아미노화를 촉매하는 효소 ADAR(adenosine deaminase acting on RNA)로 달성된다. 이노신은 구아닌과 구조적으로 유사하고, 번역하는 동안 구아노신을 모사하며, 이로 인해 단백질 코딩 서열에서 변화를 일으킬 수 있다. 위치-지정 mRNA 편집을 위한 여러 기술들이 이용가능하다(Aquino-Jarquin, 2020, Mol Ther Nucleic Acids 19, 1065-1072; 본 명세서에 참조로 삽입됨). 예를 들어, SNAP 태그에 융합된 인간 ADAR의 탈아미나아제 도메인과 짧은(약 20-nt) 가이드 RNA가 형질감염 또는 감염 방법에 의해 세포에 도입되는 것이다. 가이드 RNA는 ADAR-SNAP 태그 융합 단백질에 결합하여, 그것을 원하는 mRNA에 타겟팅한다. 가이드 RNA는 표적 부위에서 A:C 미스매치를 포함하도록 설계되어 부위-특이적 탈아미노화를 유도한다(Vogel et al., 2018, Nat Meth 15, 535-538; 본 명세서에 참조로 삽입됨). 단순화된 방법은 두 개의 세그먼트를 포함하도록 설계된 화학적으로 변형되고 안정화된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)의 세포로의 형질감염을 필요로 한다: 표적 mRNA 결합을 결정하는 가이드 서열 및 내인성 인간 ADAR을 ASO:mRNA 하이브리드로 가이드하여 전사체를 편집하는 ADAR 모집 도메인(Merkle et al., 2019, Nat Biotech 37, 133-138; 본 명세서에 참조로 삽입됨). 본 발명의 타겟 서열에서 바람직한 변화는 하기 아미노산을 포함하나 이에 제한되지 않는다(편집 후, I는 V가 되고, H는 R이 됨): I863V, I867V, I871V, I876V, H875R 및 이들의 조합(모두 GluN2A에서); I864V, I868V, I872V, I877V, H873R 및 이들의 조합(모두 GluN2B에서). 바람직하게는, 본 발명의 이 양태의 방법은 상기 세포에서 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 높은 민감도로 연결된 GluN2A 및/또는 GluN2B mRNA 서열을 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 낮은 민감도로 연결된 GluN2A 또는 GluN2B mRNA 서열로 편집하거나 또는 대체하는 것을 포함한다(또한, 상기 참조). 상기 방법은 시험관내 또는 생체내 방법이다. 세포는 예를 들어 신경 세포, 줄기 세포, 특히 배아 줄기 세포, 난모세포 또는 정모세포일 수 있다. 세포 또는 기관은 바람직하게는 설치류 또는 포유류 기원이고, 더 바람직하게는 인간 기원이다. 그러나, 비인간 포유류 세포 및 기관도 본 발명에서 구체적으로 또한 고려된다. GluN2A 또는 GluN2B mRNA 서열의 대체 또는 편집은 전술한 내용을 따른다. 예를 들어, 세포가 SEQ ID NO:7에 따른 서열 모티프를 가진 GluN2B 단백질을 인코딩하는 mRNA를 포함하는 경우, 이는 SEQ ID NO:22에 따른 mRNA 모티프를 가진 GluN2B 단백질을 인코딩하는 mRNA로 대체될 수 있다. 추가 예에서, 세포가 SEQ ID NO:6에 따른 서열 모티프를 가진 GluN2A 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 경우, 이는 예를 들어 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, 또는 SEQ ID NO:21(이들 모두는 SEQ ID NO:6보다 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 더 낮은 민감도를 제공함)에 따른 서열 모티프를 가진 GluN2A 단백질을 인코딩하는 서열에 의해 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, NMDA 수용체 매개 독성에 대해 더 많은 저항성을 제공하는 메신저 RNA(또는 유전자)는 본 발명의 서열 모티프가 완전히 결여된 메신저 RNA(또는 유전자)(즉, SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 상응하는 서열이 결실된 결실 변이체)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, mRNA 대체는 CRISPR 또는 다른 방법-매개 mRNA 편집에 의해 달성된다. 전술한 바와 같이, 상기 mRNA 대체는 뉴런이 NMDA 독성에 대해 더 저항성이 되도록 하고 결과적으로 여러 형태의 (뇌졸중, ALS, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 망막 변성(녹내장, 당뇨병성 망막병증) 등을 포함하는) 신경퇴행에 대해 더 저항성을 갖게 한다.
마지막 제16 양태에서, 본 발명은 GRIN2A 유전자(즉, GluN2A 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열 및/또는 GRIN2B 유전자(즉, GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열을 대상체의 게놈 핵산 샘플에서 결정하는 수단을 포함하는 키트에 관한 것으로서, 여기서 GRIN2A 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:1(즉, 인간 GluN2A 단백질의 아미노산 861-878)의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하고, GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:7(즉, 인간 GluN2B 단백질의 아미노산 862-879)의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 포함한다. 상기 수단은 예를 들어 GRIN2A 유전자 및/또는 GRIN2B 유전자의 각각의 부분 서열의 증폭, 시퀀싱 및/또는 검출을 가능하게 하는 핵산 프라이머 또는 프로브일 수 있다. 바람직하게는, 상기 수단은 GRIN2A 유전자 및/또는 GRIN2B 유전자의 부분 서열을 결정할 수 있게 하며, 여기서 부분 서열은 인코딩된 GluN2A 및 GluN2B 단백질의 100개 이하, 더 바람직하게는 75개 이하, 더 바람직하게는 50개 이하 아미노산을 커버한다. 적절한 수단은 예를 들어 전술한 프라이머, 즉 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, 및 SEQ ID NO:40의 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 키트는 본 발명의 제11 양태에 따른 방법을 수행하기 위한 키트일 수 있다. 상기 키트는 - 시퀀싱된 게놈 핵산 샘플에 기초하여 - 대상체가 하기의 하나 이상을 나타내는지 여부를 결정하도록 할 수 있다(모든 위치 표시는 UniProtKB - Q12879 또는 UniProtKB - Q13224의 서열과 관련하여 제공됨):
- 표준 GluN2A (SEQ ID NO:1 참조),
- GluN2A (I867M) (SEQ ID NO:4 참조),
- GluN2A (S869R) (SEQ ID NO:5 참조),
- GluN2A (I876N) (SEQ ID NO:6 참조),
- 표준 GluN2B (SEQ ID NO:7 참조),
- GluN2B (I872M) (SEQ ID NO:8 참조),
- GluN2B (H873R) (SEQ ID NO:22 참조).
바람직하게는, 키트는 표준 GluN2A(SEQ ID NO:1) 및 표준 GluN2B(SEQ ID NO:7)를 인코딩하는 본 발명의 서열 모티프를 식별하기 위한 수단을 적어도 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키트는 표준 GluN2A(SEQ ID NO:1)를 인코딩하는 본 발명의 서열 모티프, 및 예를 들어 GluN2A (I867M), GluN2A (S869R) 및 GluN2A (I876N)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 표준 GluN2A의 본 발명의 서열 모티프의 하나의 추가 변이체를 검출하기 위한 수단을 적어도 포함할 수 있다. 추가 구현예에서, 키트는 표준 GluN2B(SEQ ID NO:7)를 인코딩하는 본 발명의 서열 모티프, 및 예를 들어 GluN2B (I872M) 및 GluN2B (H873R)로 이루어진 군으로부터 선택된, 표준 GluN2B를 인코딩하는 본 발명의 서열 모티프의 하나의 추가 변이체를 검출하기 위한 수단을 적어도 포함할 수 있다. 샘플을 제공하는 대상체는 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 원숭이, 말, 햄스터, 기니피그, 돼지, 양, 염소, 토끼 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "포함하는(comprising)"은 "이루어지는(consisting of)" (즉 부가적인 다른 물질의 존재를 배제하는)의 의미로 제한되는 것으로 간주되어서는 안 된다. 오히려, "포함하는"은 선택적으로 부가적인 물질이 존재할 수 있다는 것을 의미한다. 용어 "포함하는"은 "이루어지는"(즉, 부가적인 다른 물질의 존재를 배제하는)과 "포함하지만 이루어지지 않는"(즉, 부가적인 다른 물질의 존재를 요구하는)의 범주 내에 속하는 특히 구상된 구현예들을 포함하며, 전자가 더 선호된다.
하기에는 첨부된 도면의 간략한 설명이 제공될 것이다. 도면은 본 발명의 양태를 보다 상세히 설명하기 위한 것이다.
도 1은 본 발명자에 의해 확인된 본 발명의 서열 모티프 및 이의 변이체의 배열을 예시한다. 본 발명의 서열 코어 모티프는 GluN2A 및 GluN2B 단백질의 세포질 도메인에 위치하며, 4개의 규칙적인 간격의 이소류신 잔기를 포함하는, 18개 아미노산 길이를 갖는다. 표시된 플랭킹 서열은 인간 서열이지만, 이는 래트 및 마우스 GluN2A/GluN2B에서 동일하게 발견될 수 있다.
"-": 결실된 아미노산 잔기; 굵은 문자: 표준 코어 서열과의 편차. 본 발명의 코어 서열 모티프는 코어의 위치 15에서 GluN2A의 히스티딘 잔기를 제외하고는 동일한 반면, GluN2B는 이 위치에서 알라닌 잔기를 나타낸다는 점에 주목해야 된다. 따라서, 상기 GluN2B 알라닌 잔기의 히스티딘 잔기로의 돌연변이는 GluN2B 프레임워크에서 GluN2A 서열을 생산할 것이며, 그 반대도 마찬가지이다.
도 1a) GluN2A 단백질 및 이의 변이체; 여기서 SEQ ID NO:1은 GluN2A 단백질에서 본 발명의 표준 서열 모티프를 나타냄;
도 1b) GluN2B 단백질 및 이의 변이체: 여기서 SEQ ID NO:7은 GluN2B 단백질에서 본 발명의 표준 서열 모티프를 나타냄.
도 2는 HEK293 세포의 세포 사멸에 대한 본 발명의 서열 모티프(각각 GluN2A 또는 GluN2B에서)의 결실 또는 점 돌연변이의 영향을 나타낸다. 도 2a) 대조군: 형질감염되지 않은 세포나 GFP 또는 GluN1만으로 형질감염된 세포는 모두 세포 사멸 유도를 나타내지 않음. 도 2b) GluN2A: GluN1+GluN2A (야생형 수용체 복합체); GluN1+GluN2A△SEQ ID NO:1 (결실 변이체; SEQ ID NO:41); GluN1+GluN2A△9 (본 발명의 서열 모티프와 관련되지 않은, GluN2A의 마지막 9개 C-말단 아미노산이 결여된 컨트롤); GluN1+GluN2A+MK-801 (비경쟁적인 일반 NMDA 수용체 억제제 MK-801의 존재하의 야생형 수용체 복합체). 도 2c) GluN2B: GluN1+GluN2B (야생형 수용체 복합체); GluN1+GluN2B△SEQ ID NO:7 (결실 변이체; SEQ ID NO:42); GluN1+GluN2B△9 (본 발명의 서열 모티프와 관련되지 않은, GluN2B의 마지막 9개 C-말단 아미노산이 결여된 컨트롤); GluN1+GluN2B+MK-801 (비경쟁적인 일반 NMDA 수용체 억제제 MK-801의 존재하의 야생형 수용체 복합체; n.s.: 유의적이지 않음(not significant); *: p < 0.05 ; **: p < 0.01.
도 3은 형질감염 48시간 후 HEK293 세포에서 - GluN1의 존재하에 - 세포 사멸을 유도하는 GluN2A 및 GluN2B 변이체의 역량을 나타낸다: 좌측부터 우측으로: 래트 야생형 GluN2A (UniProt: Q00959); GluN2A△SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:41; 즉, SEQ ID NO:1이 결여된 결실 변이체); GluN2A-I2A2 (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 I867A 및 I871A를 나타냄) (SEQ ID NO:2 참조); GluN2A-I3A3 (치환 I863A, I867A 및 I871A를 나타냄) (SEQ ID NO:3 참조); GluN2A-IAHA (치환 I867A, I871A 및 H875A를 나타냄) (SEQ ID NO:21 참조); 래트 야생형 GluN2B (UniProt: Q00960); GluN2B△SEQ ID NO:7 (GluN2B에서 본 발명의 18개 아미노산 서열 모티프가 결여됨) (SEQ ID NO:42 참조; 즉, 결실 돌연변이), GluN2B-I2A2 (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 I868A 및 I872A를 나타냄) (SEQ ID NO:21 참조); 및 GluN2B-I2A2AH (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 I868A, I872A 및 A876H를 나타냄); *: p < 0.05 ; **: p < 0.01.
도 4는 형질감염 48시간 후 HEK293 세포에서 GluN1의 존재하에 세포 사멸을 유도하는 (인간 유전자 풀에서 발생하는) GluN2A 및 GluN2B 변이 서열의 역량을 나타낸다: 좌측부터 우측으로: 래트 야생형 GluN2A (UniProt: Q00959); GluN2A-I867M (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 I867M을 나타냄; SEQ ID NO:4 참조); GluN2A-S869R (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 S869R을 나타냄; SEQ ID NO:5 참조); GluN2A-I876N (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 I876N을 나타냄; SEQ ID NO:6 참조); 래트 야생형 GluN2B (UniProt: Q00960); GluN2B-I872M (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 I872N을 나타냄; SEQ ID NO:8 참조); GluN2B-H873R (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 H873R을 나타냄; SEQ ID NO:8 참조). *: p < 0.05.
도 5는 SEQ ID NO:1의 서열을 포함하는 GluN2A 유래 폴리펩타이드 (SEQ ID NO:9) 또는 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 GluN2B 유래 폴리펩타이드 (SEQ ID NO:15)가 마우스 해마 및 피질 뉴런에서 세포 사멸을 유도하는데 충분한 반면, 변이체 버전(SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:2의 서열을 포함; 및 SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:21의 서열을 포함)은 세포 사멸을 유도할 수 없다는 것을 나타낸다. ****: p <0.0001.
도 6은 호모 사피엔스 크로모좀 16에 대해 GRCh38.p13(Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13)에 기반하여 인간 GRIN2A 및 GRIN2B 유전자(즉, 각각 GluN2A 및 GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)에 대한 가능한 시퀀싱 전략을 나타낸다. 긴 화살표는 PCR 프라이머를 나타내고, 짧은 화살표는 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 검은 선은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:7에 따른 본 발명의 서열 영역을 나타낸다. 상기 영역은 인트론에 의해 차단된다는 것을 확인할 수 있다. 도 6a) GRIN2A: GRIN2A-1 영역: 9768629 내지 9769128은 SEQ ID NO:1의 처음 절반을 포함하며(TGVCSDRPGLLFSISR; SEQ ID NO:43), PCR (프라이머 GRIN2A-1-F, SEQ ID NO:29, 및 GRIN2A-1-R, SEQ ID NO:30)은 405 bp 단편을 생산한다. GRIN2A-2 영역: 9764689 내지 9765188은 SEQ ID NO:1의 두번째 절반을 포함하며 (GIYSCIHGVHIEEKKKS; SEQ ID NO:44), PCR (프라이머 GRIN2A-2-F, SEQ ID NO:31, 및 GRIN2A-2-R, SEQ ID NO:32)은 368 bp 단편을 생산한다. 도 6b) GRIN2B: GRIN2B-1 영역: 13566792 내지 13567291은 SEQ ID NO:7의 처음 절반을 포함하며 (MGVCSGKPGMVFSISR; SEQ ID NO:45), PCR (프라이머 GRIN2B-1-F, SEQ ID NO:35, 및 GRIN2B-1-R, SEQ ID NO:36)은 455 bp 단편을 생산한다; GRIN2B-2 영역: 13564382 내지 13564881은 SEQ ID NO:7의 두번째 절반을 포함하며 (GIYSCIHGVAIEERQSV; SEQ ID NO:46), PCR (프라이머 GRIN2B-2-F, SEQ ID NO:37, 및 GRIN2B-2-R, SEQ ID NO:38)은 395 bp 단편을 생산한다.
도 1은 본 발명자에 의해 확인된 본 발명의 서열 모티프 및 이의 변이체의 배열을 예시한다. 본 발명의 서열 코어 모티프는 GluN2A 및 GluN2B 단백질의 세포질 도메인에 위치하며, 4개의 규칙적인 간격의 이소류신 잔기를 포함하는, 18개 아미노산 길이를 갖는다. 표시된 플랭킹 서열은 인간 서열이지만, 이는 래트 및 마우스 GluN2A/GluN2B에서 동일하게 발견될 수 있다.
"-": 결실된 아미노산 잔기; 굵은 문자: 표준 코어 서열과의 편차. 본 발명의 코어 서열 모티프는 코어의 위치 15에서 GluN2A의 히스티딘 잔기를 제외하고는 동일한 반면, GluN2B는 이 위치에서 알라닌 잔기를 나타낸다는 점에 주목해야 된다. 따라서, 상기 GluN2B 알라닌 잔기의 히스티딘 잔기로의 돌연변이는 GluN2B 프레임워크에서 GluN2A 서열을 생산할 것이며, 그 반대도 마찬가지이다.
도 1a) GluN2A 단백질 및 이의 변이체; 여기서 SEQ ID NO:1은 GluN2A 단백질에서 본 발명의 표준 서열 모티프를 나타냄;
도 1b) GluN2B 단백질 및 이의 변이체: 여기서 SEQ ID NO:7은 GluN2B 단백질에서 본 발명의 표준 서열 모티프를 나타냄.
도 2는 HEK293 세포의 세포 사멸에 대한 본 발명의 서열 모티프(각각 GluN2A 또는 GluN2B에서)의 결실 또는 점 돌연변이의 영향을 나타낸다. 도 2a) 대조군: 형질감염되지 않은 세포나 GFP 또는 GluN1만으로 형질감염된 세포는 모두 세포 사멸 유도를 나타내지 않음. 도 2b) GluN2A: GluN1+GluN2A (야생형 수용체 복합체); GluN1+GluN2A△SEQ ID NO:1 (결실 변이체; SEQ ID NO:41); GluN1+GluN2A△9 (본 발명의 서열 모티프와 관련되지 않은, GluN2A의 마지막 9개 C-말단 아미노산이 결여된 컨트롤); GluN1+GluN2A+MK-801 (비경쟁적인 일반 NMDA 수용체 억제제 MK-801의 존재하의 야생형 수용체 복합체). 도 2c) GluN2B: GluN1+GluN2B (야생형 수용체 복합체); GluN1+GluN2B△SEQ ID NO:7 (결실 변이체; SEQ ID NO:42); GluN1+GluN2B△9 (본 발명의 서열 모티프와 관련되지 않은, GluN2B의 마지막 9개 C-말단 아미노산이 결여된 컨트롤); GluN1+GluN2B+MK-801 (비경쟁적인 일반 NMDA 수용체 억제제 MK-801의 존재하의 야생형 수용체 복합체; n.s.: 유의적이지 않음(not significant); *: p < 0.05 ; **: p < 0.01.
도 3은 형질감염 48시간 후 HEK293 세포에서 - GluN1의 존재하에 - 세포 사멸을 유도하는 GluN2A 및 GluN2B 변이체의 역량을 나타낸다: 좌측부터 우측으로: 래트 야생형 GluN2A (UniProt: Q00959); GluN2A△SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:41; 즉, SEQ ID NO:1이 결여된 결실 변이체); GluN2A-I2A2 (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 I867A 및 I871A를 나타냄) (SEQ ID NO:2 참조); GluN2A-I3A3 (치환 I863A, I867A 및 I871A를 나타냄) (SEQ ID NO:3 참조); GluN2A-IAHA (치환 I867A, I871A 및 H875A를 나타냄) (SEQ ID NO:21 참조); 래트 야생형 GluN2B (UniProt: Q00960); GluN2B△SEQ ID NO:7 (GluN2B에서 본 발명의 18개 아미노산 서열 모티프가 결여됨) (SEQ ID NO:42 참조; 즉, 결실 돌연변이), GluN2B-I2A2 (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 I868A 및 I872A를 나타냄) (SEQ ID NO:21 참조); 및 GluN2B-I2A2AH (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 I868A, I872A 및 A876H를 나타냄); *: p < 0.05 ; **: p < 0.01.
도 4는 형질감염 48시간 후 HEK293 세포에서 GluN1의 존재하에 세포 사멸을 유도하는 (인간 유전자 풀에서 발생하는) GluN2A 및 GluN2B 변이 서열의 역량을 나타낸다: 좌측부터 우측으로: 래트 야생형 GluN2A (UniProt: Q00959); GluN2A-I867M (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 I867M을 나타냄; SEQ ID NO:4 참조); GluN2A-S869R (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 S869R을 나타냄; SEQ ID NO:5 참조); GluN2A-I876N (야생형 GluN2A (UniProt: Q00959)와 유사하지만 치환 I876N을 나타냄; SEQ ID NO:6 참조); 래트 야생형 GluN2B (UniProt: Q00960); GluN2B-I872M (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 I872N을 나타냄; SEQ ID NO:8 참조); GluN2B-H873R (야생형 GluN2B (UniProt: Q00960)와 유사하지만 치환 H873R을 나타냄; SEQ ID NO:8 참조). *: p < 0.05.
도 5는 SEQ ID NO:1의 서열을 포함하는 GluN2A 유래 폴리펩타이드 (SEQ ID NO:9) 또는 SEQ ID NO:7의 서열을 포함하는 GluN2B 유래 폴리펩타이드 (SEQ ID NO:15)가 마우스 해마 및 피질 뉴런에서 세포 사멸을 유도하는데 충분한 반면, 변이체 버전(SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:2의 서열을 포함; 및 SEQ ID NO:26; SEQ ID NO:21의 서열을 포함)은 세포 사멸을 유도할 수 없다는 것을 나타낸다. ****: p <0.0001.
도 6은 호모 사피엔스 크로모좀 16에 대해 GRCh38.p13(Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 13)에 기반하여 인간 GRIN2A 및 GRIN2B 유전자(즉, 각각 GluN2A 및 GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)에 대한 가능한 시퀀싱 전략을 나타낸다. 긴 화살표는 PCR 프라이머를 나타내고, 짧은 화살표는 시퀀싱 프라이머를 나타낸다. 검은 선은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:7에 따른 본 발명의 서열 영역을 나타낸다. 상기 영역은 인트론에 의해 차단된다는 것을 확인할 수 있다. 도 6a) GRIN2A: GRIN2A-1 영역: 9768629 내지 9769128은 SEQ ID NO:1의 처음 절반을 포함하며(TGVCSDRPGLLFSISR; SEQ ID NO:43), PCR (프라이머 GRIN2A-1-F, SEQ ID NO:29, 및 GRIN2A-1-R, SEQ ID NO:30)은 405 bp 단편을 생산한다. GRIN2A-2 영역: 9764689 내지 9765188은 SEQ ID NO:1의 두번째 절반을 포함하며 (GIYSCIHGVHIEEKKKS; SEQ ID NO:44), PCR (프라이머 GRIN2A-2-F, SEQ ID NO:31, 및 GRIN2A-2-R, SEQ ID NO:32)은 368 bp 단편을 생산한다. 도 6b) GRIN2B: GRIN2B-1 영역: 13566792 내지 13567291은 SEQ ID NO:7의 처음 절반을 포함하며 (MGVCSGKPGMVFSISR; SEQ ID NO:45), PCR (프라이머 GRIN2B-1-F, SEQ ID NO:35, 및 GRIN2B-1-R, SEQ ID NO:36)은 455 bp 단편을 생산한다; GRIN2B-2 영역: 13564382 내지 13564881은 SEQ ID NO:7의 두번째 절반을 포함하며 (GIYSCIHGVAIEERQSV; SEQ ID NO:46), PCR (프라이머 GRIN2B-2-F, SEQ ID NO:37, 및 GRIN2B-2-R, SEQ ID NO:38)은 395 bp 단편을 생산한다.
하기에서 본 발명의 구현예 및 양태를 예시하는 구체적인 예들이 제시된다. 그러나, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 하기 실시예로부터 통상의 기술자에게 쉽게 명백해질 것이다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위에 속한다.
실시예 1: 방법 및 재료
달리 나타내지 않는 한, 하기 방법 및 재료들은 후술하는 실시예에서 본 발명자들에 의해 사용되었다.
GluN2A 및 GluN2B를 인코딩하는 유전자인 GRIN1, GRIN2A 및 GRIN2B의 원래 플라스미드 구조는 Andres Barria & Robert Malinow(Addgene plasmid # 45446, 45445, 45447)로부터 획득하였다. 본원의 모든 돌연변이는 PCR에 의한 부위-지정 돌연변이 생성을 사용하여 제조된다. 플라스미드 제조에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
GrinN2A에 대해:
GrinN2B에 대해:
HEK293 세포 배양
HEK293 세포를 10% 소 태아 혈청 (FBS, Gibco™, 10270), 1% 피루브산 나트륨 (Gibco™, 11360070), 1% MEM NEAA (Gibco™, 11140035) 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신 (P-S; Sigma, P0781)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, Gibco™, 41965-039)에서 배양하고, 15-25 계대를 실험에 사용하였다.
발광 세포독성 어세이
본 발명에 따른 화합물의 세포독성을 테스트하기 위해, HEK293 세포(70-80% 밀집도(confluent))를 GluN1과 GluN2A 또는 GluN2B 둘 다를 위한 발현 벡터로 각각 플레이팅하고 (1:1; 6-cm 디쉬 당 총 2 μg 플라스미드) 24시간 후에 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000으로 형질감염시켰다. CytoTox-Glo™ 세포독성 어세이(Promega, G9290)로 제조사의 지시에 따르되 약간 변형하여, 형질감염 후 지정된 시점에서 집단 내 사멸 세포의 상대적인 수를 측정하였다. 요약하면, 전체 배지의 10%를 10 μL AAF-아미노 루시페린과 혼합하여 물과 함께 최종 부피 200 μL로 만들고, 사멸 세포 상대 발광 유닛(DRLU: dead cell relative luminescence units)을 96 웰 백색 바닥 폴리스티렌 마이크로플레이트 (Corning Costar®, 3912)에서 GloMax (Promega)로 측정하였다. 모든 측정 후, 용해 시약을 세포에 첨가하고 용해물의 10%를 전체 세포 상대 발광 유닛(TRLU: total cell relative luminescence units) 측정에 사용하였다. 세포 사멸은 하기 식으로 계산하였다:
일차 신경 배양(primary neuronal cultures)
일차 마우스 해마를 통상의 기술자에게 알려진 바에 따라 준비하고 유지하였다. 요약하면, P0 C57Bl/6N 마우스로부터 해마를 해리하고, Neurobasal A 배지(Gibco™ 10888022), 2% 무혈청 B27™ 보충제(Gibco™ 17504044), 1% 래트 혈청(Biowest, S2150), 0.5 mM L-글루타민(Sigma, G7513) 및 0.5% P-S로 이루어진 성장 배지(GM)에서 1.2*105/cm2 밀도로 플레이팅하였다. 신경교(glial) 세포의 증식을 막기 위해 사이토신 β-D-아라비노푸라노사이드(AraC; Sigma, C1768; 2.8 μM)를 DIV3에 첨가하였다. DIV8부터, 실험에 사용될 때까지 48 시간마다 배지의 절반을 래트 혈청이 없는 GM으로 교체하였다. 실험 24 시간 전에, GM을 형질감염 배지(10 mM HEPES, pH 7.4, 114 mM NaCl, 26.1 mM NaHCO3, 5.3 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 30 mM 글루코스, 1 mM 글리신, 0.5 mM C3H3NaO3, 및 0.001 % 페놀 레드 및 7.5 ㎍/ml 인슐린, 7.5 ㎍/ml 트랜스페린 및 7.5 ng/ml 소듐 셀레나이트(ITS 액체 배지 보충제, Sigma-Aldrich Cat # I3146)가 보충된, 10% 포스페이트-프리 이글 최소 필수 배지)로 교체하였다.
재조합 아데노-연관 바이러스(rAAVs) 및 컨스트럭트
당업계에 공지된 바와 같이 바이러스 입자를 생산하고 정제하였다. SEQ ID NO:9(즉, SEQ ID NO:1을 포함), SEQ ID NO: 10(즉, SEQ ID NO:2를 포함), SEQ ID NO:15(즉, SEQ ID NO:7을 포함), 및 SEQ ID NO:26(즉, SEQ ID NO:3을 포함)을 발현하는 핵산 컨스트럭트가, 자연적으로 멤브레인 근처 분포를 모사하기 위해, HA 태그(SEQ ID NO:20) 및 GPI 앵커(SEQ ID NO:17)에 융합된, 인간 시냅신 프로모터에 의해 구동되었다.
뉴런 사멸 평가(neuronal death assessment)
뉴런을 15분 동안 PBS 중 4% 수크로스와 함께 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 후 Hoechst 염색을 하였다. 뉴런 사멸 분석을 위해 10x 대물렌즈(NA 0.3)가 장착된 Leica DMIRBE 도립현미경과 VisiView 이미징 소프트웨어(Visitron Systems)가 있는 SPOT Insight 14비트 CCD 카메라를 사용하여 이미지를 획득한다. 사멸한 뉴런은 Hoechst 염색에서 압축되고 둥글고 수축된 핵으로 정의되었다. 세포 사멸은 Cell Profiler 및 Cell Analyzer 소프트웨어로 분석한다.
정량 및 통계
모든 통계 작업을 Prism (GraphPad)으로 수행하였다. 모든 플로팅된 데이터는 평균 ± s.d로 나타낸다. 달리 나타내지 않는 한, 통계적 분석을 위해 Two-Way ANOVA 분석을 사용하였다.
시약
MK-801 말레이트 (BN338, Biotrend). DL-APV (BN0858, Biotrend), NMDA (BN0385, Biotrend) 시약들이 이번 연구에서 사용되었다.
실시예 2: GluN2A 및 GluN2B의 결실 변이체의 생성 및 테스트
NMDA 수용체 매개 독성에서 GluN2A 및 GluN2B의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 컨스트럭트를 구축하고 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 발광 세포독성 어세이는 형질감염 48시간 후 수행하였으며, 세포 사멸(%)은 도 2에 나타내었다.
그 결과, GFP나 GluN1 단독(둘 다 대조군으로 제공)은 세포 사멸을 유도할 수 없었다. 래트 GluN2A의 마지막 9개 C-말단 아미노산이 결여된 GluN1 및 GluN2A 변이체의 조합된 발현이 했던 것처럼, 야생형 래트 GluN1 (UniProtKB - P35439; NMDZ1_RAT; 1994년 6월 1일자 서열 버전 1) 및 GluN2A (UniProtKB - Q00959; NMDE1_RAT, 1998년 12월 15일자 서열 버전 2)의 조합된 발현은 HEK293 세포에서 세포 사멸을 유도하였으며, 후자는 SEQ ID NO:1의 표준 서열 및 플랭킹 서열을 포함하는 SEQ ID NO:9에 따른 서열을 포함한다. 그러나, SEQ ID NO:1의 본 발명의 서열 모티프만 결여된 GluN1 및 래트 GluN2A 변이체의 조합된 발현 (SEQ ID NO:41)은 훨씬 더 낮은 수준의 세포 사멸을 야기한다. 비경쟁적인 일반 NMDA 수용체 억제제 MK-801의 존재하의 GluN1 및 GluN2A의 조합된 발현은 세포 사멸을 유도하지 않았다(대조 실험). 유사한 결과가 GluN2B에 대해 얻어졌다. 래트 GluN2B의 마지막 9개 C-말단 아미노산이 결여된 결실 변이체가 했던 것처럼, 야생형 래트 GluN1 및 GluN2B (UniProtKB - Q00960; NMDE2_RAT, 1994년 6월 1일자 서열 버전 1)의 조합된 발현ㅇ은 HEK293 세포에서 세포 사멸을 유도하였으며, 후자는 SEQ ID NO:7의 표준 서열 및 플랭킹 서열을 포함한다(SEQ ID NO:15 참조). SEQ ID NO:7의 본 발명의 서열 모티프가 결여된 GluN1 및 GluN2B 변이체의 조합된 발현 (SEQ ID NO:42)은 세포 사멸의 유도를 야기하지 않았다. 비경쟁적인 일반 NMDA 수용체 억제제 MK-801의 존재하의 GluN1 및 GluN2B의 조합된 발현도 또한 세포 사멸을 유도하지 않았다.
실시예 3: GluN2A 및 GluN2B에서 본 발명의 서열 모티프의 변이체의 생성 및 테스트
다음 단계로, 본 발명자들은 본 발명의 서열 모티프에서 이소류신 및 다른 아미노산 잔기의 중요성을 평가하고자 하였다. 본 발명자들은 전술한 변이체를 함유하는 컨스트럭트를 구축하고 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 발광 세포독성 어세이는 형질감염 48시간 후 수행하였으며, 세포 사멸(%)은 도 3에 나타내었다.
그 결과, 결실 변이체(GluN2A: SEQ ID NO:1 결여; GluN2B: SEQ ID NO:7 결여)는 HEK293 세포에서 세포 사멸을 유도하는 그들의 능력을 실질적으로 상실하였다. 본 발명의 서열 모티프에서 돌연변이를 가진 GluN2A의 변이체 (SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:21 참조)는 적어도 감소된 수준의 독성을 나타내었다. GluN2B에 대해, 유사한 돌연변이는 임의의 독성 효과를 본질적으로 없앴다(SEQ ID NO:21, 및 SEQ ID NO:2 참조).
실시예 4: NMDA 수용체 매개 독성의 민감도에 대한 추가 GluN2A 및 GluN2B 변이체의 영향 평가
실시예 3에서 본 발명의 서열 모티프의 GluN2A 및 GluN2B 변이체에 대해 얻은 결과를 고려하여, 본 발명자들은 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 민감도에 대한 인간 유전자 풀에서의 상기 서열 모티프의 자연 발생 변이의 영향을 추가로 테스트하였다. 본 발명자들은 NCBI의 SNP 데이터베이스로부터 선택된 전술한 변이를 함유하는 컨스트럭트를 구축하였으며(GRIN2A에 대해서는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?showRare=on&chooseRs=coding&go=Go&locusId=2903, 그리고 GRIN2B에 대해서는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?showRare=on&chooseRs=coding&go=Go&locusId=2904), 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켰다. 발광 세포독성 어세이는 형질감염 48시간 후 수행하였으며, 세포 사멸(%)은 도 4에 나타내었다.
그 결과, 상기 변이 서열을 나타내는 자연 발생 변이 서열은 GluN2A 및 GluN2B 단백질로부터 세포 사멸에 대한 민감도에 유의적인 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, GluN2A 단백질에서 SEQ ID NO:1 대신 SEQ ID NO:6에 따른 서열을 나타내는 대상체는 NMDA 매개 세포 사멸에 대해 유의적으로 증가된 민감도를 가질 수 있다. 반면, SEQ ID NO:7 대신 GluN2B 단백질에서 SEQ ID NO:8을 나타내는 대상체는 NMDA 매개 세포 사멸에 대해 유의적으로 감소된 민감도를 가질 수 있다.
실시예 5: SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 NMDA 수용체 매개 독성을 유도하기에 충분함
다음 단계로, 본 발명자들은 본 발명의 서열 모티프 자체가 NMDA 수용체 매개 독성을 유도하기에 충분한지 여부를 평가하였다. 이를 위해, GluN2A(SEQ ID NO:1) 및 GluN2B(SEQ ID NO:7)의 본 발명의 코어 영역과 플랭킹 영역을 재조합 아데노-연관 바이러스로 감염시켜 마우스 해마 뉴런에서 발현시켰다. 이를 위해, 일차 마우스 해마 뉴런을 rAAV-SEQ ID NO:9(즉, SEQ ID NO:1 포함), rAAV-SEQ ID NO:10(즉, SEQ ID NO:2 포함), rAAV-SEQ ID NO:15(즉, SEQ ID NO:7 포함) 및 rAAV-SEQ ID NO:26(즉, SEQ ID NO:3 포함)으로 DIV3에 감염시켰다. 뉴런을 DIV17에 고정하고 Hoechst로 염색하고 세포 사멸을 정량화하였다. 그 결과는, SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:7을 포함하는 펩타이드가 세포 사멸을 유도하기에 충분하고, GluN2A 및 GluN2B의 코어 모티프에서 두 개의 알라닌 잔기의 변이가 세포 사멸 수준을 대략 형질감염되지 않은 대조군 수준까지 크게 감소시킨다는 것을 보여준다(도 5 참조). 따라서 본 실험에 따르면, 전장 길이의 GluN2A 및 GluN2B 수용체로 얻은 결과가 중요한 코어 모티프만 사용하여 재현할 수 있음을 보여주며, 이에 따라 그 자체로 NMDA 수용체 매개 독성을 유도하기에 충분한 것으로 고려된다.
실시예 6: 본 발명에 따른 진단 키트의 예
본 발명에 따른 키트는 본질적으로 DNA 친자 확인을 위한 표준 키트와 유사한 방식으로 구성될 수 있다. 상기 키트에는 게놈 DNA 추출 키트 및 PCR/시퀀싱 키트가 포함될 수 있다. 상기 게놈 DNA 추출 키트는 하기를 포함한다: 용해/결합 버퍼, 소화 버퍼, 워시 버퍼 1, 워시 버퍼 2, 용출 버퍼, RN아제 A, 프로테이나제 K, 수집 튜브 및 추가 수집 튜브와 게놈 DNA 결합을 위한 스핀 컬럼. 상기 PCR/시퀀싱 키트는 표준 PCR을 위한 2 x Mastermix, 및 PCR 및 시퀀싱을 위한 프라이머를 포함한다. 인간 GRIN2A에 대한 타겟 영역은 하기 프라이머에 의해 두 영역에서 증폭된다:
영역 1 (정방향: GGGATCTGCCACAACGAGAA; SEQ ID NO:29; 역방향: CTCCCGTTTCCTTTCTGCCT; SEQ ID NO:30)
영역 1은 프라이머(SEQ primer1: GCGTATTCTACATGCTGG; SEQ ID NO:33)로 시퀀싱될 수 있다.
영역 2 (정방향: CCTATGCTTTGCAACTTGTCTCA; SEQ ID NO:31; 역방향: TTGGATGAAGTCAGCAGCTCTT; SEQ ID NO:32)
영역 2는 프라이머(SEQ primer2: CAGGGCTCCTGCAAGAAG; SEQ ID NO:34)로 시퀀싱될 수 있다.
인간 GRIN2B에 대한 SNP 검출을 위한 타겟 영역은 하기 프라이머에 의해 두 영역에서 증폭된다:
영역 1 (정방향: GAAGCTCTCTGGCTCACTGG; SEQ ID NO:35; 역방향: AACTGCCCAAATCCCACACA; SEQ ID NO:36)
영역 1은 프라이머(SEQ primer3: CACAATGAGAAGAATGAGG; SEQ ID NO:39)로 시퀀싱될 수 있다.
영역 2 (정방향: ACCTCAGCTCACCACATGAC; SEQ ID NO:37; 역방향: GATGACTCCCGTCGGATGAA; SEQ ID NO:38)
영역 2는 프라이머(SEQ primer2: GGTATAAATTAGGCAAACT; SEQ ID NO:40)로 시퀀싱될 수 있다.
DNA 추출 키트가 사용되는 샘플은 인간 대상체로부터 채취되며, 혈액 샘플 또는 마우스 스왑일 수 있다. 시퀀싱 개념은 도 6에 예시한다.
SEQUENCE LISTING
<110> FundaMental Pharma GmbH
<120> Novel means to predict and manipulate NMDA receptor-mediated
toxicity
<130> FMP-002 PCT
<150> EP20190722.7
<151> 2020-08-12
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A motif mutated with 2 Ile residues mutated to Ala residues
<400> 2
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val His Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A core motif mutated with 3 Ile residues mutated to Ala
residues
<400> 3
Phe Ser Ala Ser Arg Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val His Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Met Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Ile His Gly Val His Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Homo sapiens
<400> 6
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Asn
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val Ala Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 8
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Met His Gly Val Ala Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 9
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 10
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A core motif mutated with 2 Ile residues mutated to Ala
residues plus flanking regions
<400> 10
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 11
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A core motif mutated with 3 Ile residues mutated to Ala
residues plus flanking regions
<400> 11
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ala Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 12
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Met Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 13
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Arg Cys Ile His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 14
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Asn Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 15
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
<210> 16
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Ser Cys Met His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
<210> 17
<211> 29
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> Glycosylphosphatidylinositol (GPI) signal anchor sequence
<400> 17
Leu Glu Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Val Thr Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro
20 25
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> C-terminal targeting signal of K-Ras4B
<400> 18
Ser Lys Asp Gly Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ser Arg Thr Arg Cys Thr
1 5 10 15
Val Met
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus
<400> 19
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> HA tag
<400> 20
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A motif mutated with 2 Ile residues and one His residue
mutated to Ala residues
<400> 21
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val Ala Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Phe Ser Ile Ser Arg Gly Ile Tyr Ser Cys Ile Arg Gly Val Ala Ile
1 5 10 15
Glu Glu
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A deletion mutant fragment exhibiting only flanking regions
<400> 23
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Lys Lys Lys Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A motif mutated with 2 Ile residues and one His residue
mutated to Ala residues plus flanking regions
<400> 24
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val Ala Ile Glu Glu Lys Lys Lys
20 25 30
Ser
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B deletion mutant fragment exhibiting only flanking regions
<400> 25
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Arg Gln Ser Val
1 5 10 15
<210> 26
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B motif mutated with 2 Ile residues mutated to Ala residues
plus flanking regions
<400> 26
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
<210> 27
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B motif mutated with 2 Ile residues mutated to Ala residues
and one Ala residue mutated to His plus flanking regions
<400> 27
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Ser Cys Ala His Gly Val His Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
<210> 28
<211> 33
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile Arg Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
20 25 30
Val
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
gggatctgcc acaacgagaa 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
ctcccgtttc ctttctgcct 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
cctatgcttt gcaacttgtc tca 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
ttggatgaag tcagcagctc tt 22
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
gcgtattcta catgctgg 18
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 34
cagggctcct gcaagaag 18
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 35
gaagctctct ggctcactgg 20
<210> 36
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ala Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Ala Ala Thr Cys Cys Cys Ala
1 5 10 15
Cys Ala Cys Ala
20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
acctcagctc accacatgac 20
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys Gly Thr Cys Gly Gly Ala
1 5 10 15
Thr Gly Ala Ala
20
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 39
cacaatgaga agaatgagg 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 40
ggtataaatt aggcaaact 19
<210> 41
<211> 1446
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2A LACK SEQ ID 1, Q00959, NMDE1_RAT
<400> 41
Met Gly Arg Leu Gly Tyr Trp Thr Leu Leu Val Leu Pro Ala Leu Leu
1 5 10 15
Val Trp Arg Asp Pro Ala Gln Asn Ala Ala Ala Glu Lys Gly Pro Pro
20 25 30
Ala Leu Asn Ile Ala Val Leu Leu Gly His Ser His Asp Val Thr Glu
35 40 45
Arg Glu Leu Arg Asn Leu Trp Gly Pro Glu Gln Ala Thr Gly Leu Pro
50 55 60
Leu Asp Val Asn Val Val Ala Leu Leu Met Asn Arg Thr Asp Pro Lys
65 70 75 80
Ser Leu Ile Thr His Val Cys Asp Leu Met Ser Gly Ala Arg Ile His
85 90 95
Gly Leu Val Phe Gly Asp Asp Thr Asp Gln Glu Ala Val Ala Gln Met
100 105 110
Leu Asp Phe Ile Ser Ser Gln Thr Phe Ile Pro Ile Leu Gly Ile His
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Met Ile Met Ala Asp Lys Asp Pro Thr Ser Thr Phe
130 135 140
Phe Gln Phe Gly Ala Ser Ile Gln Gln Gln Ala Thr Val Met Leu Lys
145 150 155 160
Ile Met Gln Asp Tyr Asp Trp His Val Phe Ser Leu Val Thr Thr Ile
165 170 175
Phe Pro Gly Tyr Arg Asp Phe Ile Ser Phe Ile Lys Thr Thr Val Asp
180 185 190
Asn Ser Phe Val Gly Trp Asp Met Gln Asn Val Ile Thr Leu Asp Thr
195 200 205
Ser Phe Glu Asp Ala Lys Thr Gln Val Gln Leu Lys Lys Ile His Ser
210 215 220
Ser Val Ile Leu Leu Tyr Cys Ser Lys Asp Glu Ala Val Leu Ile Leu
225 230 235 240
Ser Glu Ala Arg Ser Leu Gly Leu Thr Gly Tyr Asp Phe Phe Trp Ile
245 250 255
Val Pro Ser Leu Val Ser Gly Asn Thr Glu Leu Ile Pro Lys Glu Phe
260 265 270
Pro Ser Gly Leu Ile Ser Val Ser Tyr Asp Asp Trp Asp Tyr Ser Leu
275 280 285
Glu Ala Arg Val Arg Asp Gly Leu Gly Ile Leu Thr Thr Ala Ala Ser
290 295 300
Ser Met Leu Glu Lys Phe Ser Tyr Ile Pro Glu Ala Lys Ala Ser Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Gln Ala Glu Lys Pro Glu Thr Pro Leu His Thr Leu His Gln
325 330 335
Phe Met Val Asn Val Thr Trp Asp Gly Lys Asp Leu Ser Phe Thr Glu
340 345 350
Glu Gly Tyr Gln Val His Pro Arg Leu Val Val Ile Val Leu Asn Lys
355 360 365
Asp Arg Glu Trp Glu Lys Val Gly Lys Trp Glu Asn Gln Thr Leu Ser
370 375 380
Leu Arg His Ala Val Trp Pro Arg Tyr Lys Ser Phe Ser Asp Cys Glu
385 390 395 400
Pro Asp Asp Asn His Leu Ser Ile Val Thr Leu Glu Glu Ala Pro Phe
405 410 415
Val Ile Val Glu Asp Ile Asp Pro Leu Thr Glu Thr Cys Val Arg Asn
420 425 430
Thr Val Pro Cys Arg Lys Phe Val Lys Ile Asn Asn Ser Thr Asn Glu
435 440 445
Gly Met Asn Val Lys Lys Cys Cys Lys Gly Phe Cys Ile Asp Ile Leu
450 455 460
Lys Lys Leu Ser Arg Thr Val Lys Phe Thr Tyr Asp Leu Tyr Leu Val
465 470 475 480
Thr Asn Gly Lys His Gly Lys Lys Val Asn Asn Val Trp Asn Gly Met
485 490 495
Ile Gly Glu Val Val Tyr Gln Arg Ala Val Met Ala Val Gly Ser Leu
500 505 510
Thr Ile Asn Glu Glu Arg Ser Glu Val Val Asp Phe Ser Val Pro Phe
515 520 525
Val Glu Thr Gly Ile Ser Val Met Val Ser Arg Ser Asn Gly Thr Val
530 535 540
Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Pro Phe Ser Ala Ser Val Trp Val Met
545 550 555 560
Met Phe Val Met Leu Leu Ile Val Ser Ala Ile Ala Val Phe Val Phe
565 570 575
Glu Tyr Phe Ser Pro Val Gly Tyr Asn Arg Asn Leu Ala Lys Gly Lys
580 585 590
Ala Pro His Gly Pro Ser Phe Thr Ile Gly Lys Ala Ile Trp Leu Leu
595 600 605
Trp Gly Leu Val Phe Asn Asn Ser Val Pro Val Gln Asn Pro Lys Gly
610 615 620
Thr Thr Ser Lys Ile Met Val Ser Val Trp Ala Phe Phe Ala Val Ile
625 630 635 640
Phe Leu Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Met Ile Gln Glu
645 650 655
Glu Phe Val Asp Gln Val Thr Gly Leu Ser Asp Lys Lys Phe Gln Arg
660 665 670
Pro His Asp Tyr Ser Pro Pro Phe Arg Phe Gly Thr Val Pro Asn Gly
675 680 685
Ser Thr Glu Arg Asn Ile Arg Asn Asn Tyr Pro Tyr Met His Gln Tyr
690 695 700
Met Thr Arg Phe Asn Gln Arg Gly Val Glu Asp Ala Leu Val Ser Leu
705 710 715 720
Lys Thr Gly Lys Leu Asp Ala Phe Ile Tyr Asp Ala Ala Val Leu Asn
725 730 735
Tyr Lys Ala Gly Arg Asp Glu Gly Cys Lys Leu Val Thr Ile Gly Ser
740 745 750
Gly Tyr Ile Phe Ala Ser Thr Gly Tyr Gly Ile Ala Leu Gln Lys Gly
755 760 765
Ser Pro Trp Lys Arg Gln Ile Asp Leu Ala Leu Leu Gln Phe Val Gly
770 775 780
Asp Gly Glu Met Glu Glu Leu Glu Thr Leu Trp Leu Thr Gly Ile Cys
785 790 795 800
His Asn Glu Lys Asn Glu Val Met Ser Ser Gln Leu Asp Ile Asp Asn
805 810 815
Met Ala Gly Val Phe Tyr Met Leu Ala Ala Ala Met Ala Leu Ser Leu
820 825 830
Ile Thr Phe Ile Trp Glu His Leu Phe Tyr Trp Lys Leu Arg Phe Cys
835 840 845
Phe Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Lys Lys Lys Ser
850 855 860
Pro Asp Phe Asn Leu Thr Gly Ser Gln Ser Asn Met Leu Lys Leu Leu
865 870 875 880
Arg Ser Ala Lys Asn Ile Ser Asn Met Ser Asn Met Asn Ser Ser Arg
885 890 895
Met Asp Ser Pro Lys Arg Ala Thr Asp Phe Ile Gln Arg Gly Ser Leu
900 905 910
Ile Val Asp Met Val Ser Asp Lys Gly Asn Leu Ile Tyr Ser Asp Asn
915 920 925
Arg Ser Phe Gln Gly Lys Asp Ser Ile Phe Gly Asp Asn Met Asn Glu
930 935 940
Leu Gln Thr Phe Val Ala Asn Arg His Lys Asp Asn Leu Ser Asn Tyr
945 950 955 960
Val Phe Gln Gly Gln His Pro Leu Thr Leu Asn Glu Ser Asn Pro Asn
965 970 975
Thr Val Glu Val Ala Val Ser Thr Glu Ser Lys Gly Asn Ser Arg Pro
980 985 990
Arg Gln Leu Trp Lys Lys Ser Met Glu Ser Leu Arg Gln Asp Ser Leu
995 1000 1005
Asn Gln Asn Pro Val Ser Gln Arg Asp Glu Lys Thr Ala Glu Asn
1010 1015 1020
Arg Thr His Ser Leu Lys Ser Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Glu Val
1025 1030 1035
Ala His Ser Asp Ile Ser Glu Thr Ser Ser Arg Ala Thr Cys His
1040 1045 1050
Arg Glu Pro Asp Asn Asn Lys Asn His Lys Thr Lys Asp Asn Phe
1055 1060 1065
Lys Arg Ser Met Ala Ser Lys Tyr Pro Lys Asp Cys Ser Asp Val
1070 1075 1080
Asp Arg Thr Tyr Met Lys Thr Lys Ala Ser Ser Pro Arg Asp Lys
1085 1090 1095
Ile Tyr Thr Ile Asp Gly Glu Lys Glu Pro Ser Phe His Leu Asp
1100 1105 1110
Pro Pro Gln Phe Val Glu Asn Ile Thr Leu Pro Glu Asn Val Gly
1115 1120 1125
Phe Pro Asp Thr Tyr Gln Asp His Asn Glu Asn Phe Arg Lys Gly
1130 1135 1140
Asp Ser Thr Leu Pro Met Asn Arg Asn Pro Leu His Asn Glu Asp
1145 1150 1155
Gly Leu Pro Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Leu Tyr Ala Lys His Phe
1160 1165 1170
Thr Leu Lys Asp Lys Gly Ser Pro His Ser Glu Gly Ser Asp Arg
1175 1180 1185
Tyr Arg Gln Asn Ser Thr His Cys Arg Ser Cys Leu Ser Asn Leu
1190 1195 1200
Pro Thr Tyr Ser Gly His Phe Thr Met Arg Ser Pro Phe Lys Cys
1205 1210 1215
Asp Ala Cys Leu Arg Met Gly Asn Leu Tyr Asp Ile Asp Glu Asp
1220 1225 1230
Gln Met Leu Gln Glu Thr Gly Asn Pro Ala Thr Arg Glu Glu Val
1235 1240 1245
Tyr Gln Gln Asp Trp Ser Gln Asn Asn Ala Leu Gln Phe Gln Lys
1250 1255 1260
Asn Lys Leu Arg Ile Asn Arg Gln His Ser Tyr Asp Asn Ile Leu
1265 1270 1275
Asp Lys Pro Arg Glu Ile Asp Leu Ser Arg Pro Ser Arg Ser Ile
1280 1285 1290
Ser Leu Lys Asp Arg Glu Arg Leu Leu Glu Gly Asn Leu Tyr Gly
1295 1300 1305
Ser Leu Phe Ser Val Pro Ser Ser Lys Leu Leu Gly Asn Lys Ser
1310 1315 1320
Ser Leu Phe Pro Gln Gly Leu Glu Asp Ser Lys Arg Ser Lys Ser
1325 1330 1335
Leu Leu Pro Asp His Ala Ser Asp Asn Pro Phe Leu His Thr Tyr
1340 1345 1350
Gly Asp Asp Gln Arg Leu Val Ile Gly Arg Cys Pro Ser Asp Pro
1355 1360 1365
Tyr Lys His Ser Leu Pro Ser Gln Ala Val Asn Asp Ser Tyr Leu
1370 1375 1380
Arg Ser Ser Leu Arg Ser Thr Ala Ser Tyr Cys Ser Arg Asp Ser
1385 1390 1395
Arg Gly His Ser Asp Val Tyr Ile Ser Glu His Val Met Pro Tyr
1400 1405 1410
Ala Ala Asn Lys Asn Thr Met Tyr Ser Thr Pro Arg Val Leu Asn
1415 1420 1425
Ser Cys Ser Asn Arg Arg Val Tyr Lys Lys Met Pro Ser Ile Glu
1430 1435 1440
Ser Asp Val
1445
<210> 42
<211> 1464
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GluN2B LACK SEQ ID 7, Q00960, NMDE2_RAT
<400> 42
Met Lys Pro Ser Ala Glu Cys Cys Ser Pro Lys Phe Trp Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Val Leu Ala Val Ser Gly Ser Lys Ala Arg Ser Gln Lys Ser Pro
20 25 30
Pro Ser Ile Gly Ile Ala Val Ile Leu Val Gly Thr Ser Asp Glu Val
35 40 45
Ala Ile Lys Asp Ala His Glu Lys Asp Asp Phe His His Leu Ser Val
50 55 60
Val Pro Arg Val Glu Leu Val Ala Met Asn Glu Thr Asp Pro Lys Ser
65 70 75 80
Ile Ile Thr Arg Ile Cys Asp Leu Met Ser Asp Arg Lys Ile Gln Gly
85 90 95
Val Val Phe Ala Asp Asp Thr Asp Gln Glu Ala Ile Ala Gln Ile Leu
100 105 110
Asp Phe Ile Ser Ala Gln Thr Leu Thr Pro Ile Leu Gly Ile His Gly
115 120 125
Gly Ser Ser Met Ile Met Ala Asp Lys Asp Glu Ser Ser Met Phe Phe
130 135 140
Gln Phe Gly Pro Ser Ile Glu Gln Gln Ala Ser Val Met Leu Asn Ile
145 150 155 160
Met Glu Glu Tyr Asp Trp Tyr Ile Phe Ser Ile Val Thr Thr Tyr Phe
165 170 175
Pro Gly Tyr Gln Asp Phe Val Asn Lys Ile Arg Ser Thr Ile Glu Asn
180 185 190
Ser Phe Val Gly Trp Glu Leu Glu Glu Val Leu Leu Leu Asp Met Ser
195 200 205
Leu Asp Asp Gly Asp Ser Lys Ile Gln Asn Gln Leu Lys Lys Leu Gln
210 215 220
Ser Pro Ile Ile Leu Leu Tyr Cys Thr Lys Glu Glu Ala Thr Tyr Ile
225 230 235 240
Phe Glu Val Ala Asn Ser Val Gly Leu Thr Gly Tyr Gly Tyr Thr Trp
245 250 255
Ile Val Pro Ser Leu Val Ala Gly Asp Thr Asp Thr Val Pro Ser Glu
260 265 270
Phe Pro Thr Gly Leu Ile Ser Val Ser Tyr Asp Glu Trp Asp Tyr Gly
275 280 285
Leu Pro Ala Arg Val Arg Asp Gly Ile Ala Ile Ile Thr Thr Ala Ala
290 295 300
Ser Asp Met Leu Ser Glu His Ser Phe Ile Pro Glu Pro Lys Ser Ser
305 310 315 320
Cys Tyr Asn Thr His Glu Lys Arg Ile Tyr Gln Ser Asn Met Leu Asn
325 330 335
Arg Tyr Leu Ile Asn Val Thr Phe Glu Gly Arg Asn Leu Ser Phe Ser
340 345 350
Glu Asp Gly Tyr Gln Met His Pro Lys Leu Val Ile Ile Leu Leu Asn
355 360 365
Lys Glu Arg Lys Trp Glu Arg Val Gly Lys Trp Lys Asp Lys Ser Leu
370 375 380
Gln Met Lys Tyr Tyr Val Trp Pro Arg Met Cys Pro Glu Thr Glu Glu
385 390 395 400
Gln Glu Asp Asp His Leu Ser Ile Val Thr Leu Glu Glu Ala Pro Phe
405 410 415
Val Ile Val Glu Ser Val Asp Pro Leu Ser Gly Thr Cys Met Arg Asn
420 425 430
Thr Val Pro Cys Gln Lys Arg Ile Ile Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu
435 440 445
Glu Pro Gly Tyr Ile Lys Lys Cys Cys Lys Gly Phe Cys Ile Asp Ile
450 455 460
Leu Lys Lys Ile Ser Lys Ser Val Lys Phe Thr Tyr Asp Leu Tyr Leu
465 470 475 480
Val Thr Asn Gly Lys His Gly Lys Lys Ile Asn Gly Thr Trp Asn Gly
485 490 495
Met Ile Gly Glu Val Val Met Lys Arg Ala Tyr Met Ala Val Gly Ser
500 505 510
Leu Thr Ile Asn Glu Glu Arg Ser Glu Val Val Asp Phe Ser Val Pro
515 520 525
Phe Ile Glu Thr Gly Ile Ser Val Met Val Ser Arg Ser Asn Gly Thr
530 535 540
Val Ser Pro Ser Ala Phe Leu Glu Pro Phe Ser Ala Asp Val Trp Val
545 550 555 560
Met Met Phe Val Met Leu Leu Ile Val Ser Ala Val Ala Val Phe Val
565 570 575
Phe Glu Tyr Phe Ser Pro Val Gly Tyr Asn Arg Cys Leu Ala Asp Gly
580 585 590
Arg Glu Pro Gly Gly Pro Ser Phe Thr Ile Gly Lys Ala Ile Trp Leu
595 600 605
Leu Trp Gly Leu Val Phe Asn Asn Ser Val Pro Val Gln Asn Pro Lys
610 615 620
Gly Thr Thr Ser Lys Ile Met Val Ser Val Trp Ala Phe Phe Ala Val
625 630 635 640
Ile Phe Leu Ala Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Met Ile Gln
645 650 655
Glu Glu Tyr Val Asp Gln Val Ser Gly Leu Ser Asp Lys Lys Phe Gln
660 665 670
Arg Pro Asn Asp Phe Ser Pro Pro Phe Arg Phe Gly Thr Val Pro Asn
675 680 685
Gly Ser Thr Glu Arg Asn Ile Arg Asn Asn Tyr Ala Glu Met His Ala
690 695 700
Tyr Met Gly Lys Phe Asn Gln Arg Gly Val Asp Asp Ala Leu Leu Ser
705 710 715 720
Leu Lys Thr Gly Lys Leu Asp Ala Phe Ile Tyr Asp Ala Ala Val Leu
725 730 735
Asn Tyr Met Ala Gly Arg Asp Glu Gly Cys Lys Leu Val Thr Ile Gly
740 745 750
Ser Gly Lys Val Phe Ala Ser Thr Gly Tyr Gly Ile Ala Ile Gln Lys
755 760 765
Asp Ser Gly Trp Lys Arg Gln Val Asp Leu Ala Ile Leu Gln Leu Phe
770 775 780
Gly Asp Gly Glu Met Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Leu Thr Gly Ile
785 790 795 800
Cys His Asn Glu Lys Asn Glu Val Met Ser Ser Gln Leu Asp Ile Asp
805 810 815
Asn Met Ala Gly Val Phe Tyr Met Leu Gly Ala Ala Met Ala Leu Ser
820 825 830
Leu Ile Thr Phe Ile Cys Glu His Leu Phe Tyr Trp Gln Phe Arg His
835 840 845
Cys Phe Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Arg Gln Ser
850 855 860
Val Met Asn Ser Pro Thr Ala Thr Met Asn Asn Thr His Ser Asn Ile
865 870 875 880
Leu Arg Leu Leu Arg Thr Ala Lys Asn Met Ala Asn Leu Ser Gly Val
885 890 895
Asn Gly Ser Pro Gln Ser Ala Leu Asp Phe Ile Arg Arg Glu Ser Ser
900 905 910
Val Tyr Asp Ile Ser Glu His Arg Arg Ser Phe Thr His Ser Asp Cys
915 920 925
Lys Ser Tyr Asn Asn Pro Pro Cys Glu Glu Asn Leu Phe Ser Asp Tyr
930 935 940
Ile Ser Glu Val Glu Arg Thr Phe Gly Asn Leu Gln Leu Lys Asp Ser
945 950 955 960
Asn Val Tyr Gln Asp His Tyr His His His His Arg Pro His Ser Ile
965 970 975
Gly Ser Thr Ser Ser Ile Asp Gly Leu Tyr Asp Cys Asp Asn Pro Pro
980 985 990
Phe Thr Thr Gln Pro Arg Ser Ile Ser Lys Lys Pro Leu Asp Ile Gly
995 1000 1005
Leu Pro Ser Ser Lys His Ser Gln Leu Ser Asp Leu Tyr Gly Lys
1010 1015 1020
Phe Ser Phe Lys Ser Asp Arg Tyr Ser Gly His Asp Asp Leu Ile
1025 1030 1035
Arg Ser Asp Val Ser Asp Ile Ser Thr His Thr Val Thr Tyr Gly
1040 1045 1050
Asn Ile Glu Gly Asn Ala Ala Lys Arg Arg Lys Gln Gln Tyr Lys
1055 1060 1065
Asp Ser Leu Lys Lys Arg Pro Ala Ser Ala Lys Ser Arg Arg Glu
1070 1075 1080
Phe Asp Glu Ile Glu Leu Ala Tyr Arg Arg Arg Pro Pro Arg Ser
1085 1090 1095
Pro Asp His Lys Arg Tyr Phe Arg Asp Lys Glu Gly Leu Arg Asp
1100 1105 1110
Phe Tyr Leu Asp Gln Phe Arg Thr Lys Glu Asn Ser Pro His Trp
1115 1120 1125
Glu His Val Asp Leu Thr Asp Ile Tyr Lys Glu Arg Ser Asp Asp
1130 1135 1140
Phe Lys Arg Asp Ser Val Ser Gly Gly Gly Pro Cys Thr Asn Arg
1145 1150 1155
Ser His Leu Lys His Gly Thr Gly Glu Lys His Gly Val Val Gly
1160 1165 1170
Gly Val Pro Ala Pro Trp Glu Lys Asn Leu Thr Asn Val Asp Trp
1175 1180 1185
Glu Asp Arg Ser Gly Gly Asn Phe Cys Arg Ser Cys Pro Ser Lys
1190 1195 1200
Leu His Asn Tyr Ser Ser Thr Val Ala Gly Gln Asn Ser Gly Arg
1205 1210 1215
Gln Ala Cys Ile Arg Cys Glu Ala Cys Lys Lys Ala Gly Asn Leu
1220 1225 1230
Tyr Asp Ile Ser Glu Asp Asn Ser Leu Gln Glu Leu Asp Gln Pro
1235 1240 1245
Ala Ala Pro Val Ala Val Thr Ser Asn Ala Ser Ser Thr Lys Tyr
1250 1255 1260
Pro Gln Ser Pro Thr Asn Ser Lys Ala Gln Lys Lys Asn Arg Asn
1265 1270 1275
Lys Leu Arg Arg Gln His Ser Tyr Asp Thr Phe Val Asp Leu Gln
1280 1285 1290
Lys Glu Glu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ser Val Ser Leu Lys Asp
1295 1300 1305
Lys Gly Arg Phe Met Asp Gly Ser Pro Tyr Ala His Met Phe Glu
1310 1315 1320
Met Pro Ala Gly Glu Ser Ser Phe Ala Asn Lys Ser Ser Val Pro
1325 1330 1335
Thr Ala Gly His His His Asn Asn Pro Gly Ser Gly Tyr Met Leu
1340 1345 1350
Ser Lys Ser Leu Tyr Pro Asp Arg Val Thr Gln Asn Pro Phe Ile
1355 1360 1365
Pro Thr Phe Gly Asp Asp Gln Cys Leu Leu His Gly Ser Lys Ser
1370 1375 1380
Tyr Phe Phe Arg Gln Pro Thr Val Ala Gly Ala Ser Lys Thr Arg
1385 1390 1395
Pro Asp Phe Arg Ala Leu Val Thr Asn Lys Pro Val Val Val Thr
1400 1405 1410
Leu His Gly Ala Val Pro Gly Arg Phe Gln Lys Asp Ile Cys Ile
1415 1420 1425
Gly Asn Gln Ser Asn Pro Cys Val Pro Asn Asn Lys Asn Pro Arg
1430 1435 1440
Ala Phe Asn Gly Ser Ser Asn Gly His Val Tyr Glu Lys Leu Ser
1445 1450 1455
Ser Ile Glu Ser Asp Val
1460
<210> 43
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Thr Gly Val Cys Ser Asp Arg Pro Gly Leu Leu Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 44
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val His Ile Glu Glu Lys Lys Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 45
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Met Gly Val Cys Ser Gly Lys Pro Gly Met Val Phe Ser Ile Ser Arg
1 5 10 15
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Gly Ile Tyr Ser Cys Ile His Gly Val Ala Ile Glu Glu Arg Gln Ser
1 5 10 15
Val
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaSEQ ID NO:1 forward primer
<400> 47
ccgggctgct ccacattgaa gaaaagaaga 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaSEQ ID NO:1 reverse primer
<400> 48
tcttcaatgt ggagcagccc gggccggtca 30
<210> 49
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaC9 forward primer
<400> 49
cgctaaagag tcctaggtat ct 22
<210> 50
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2AdeltaC9 reverse primer
<400> 50
gtctgctcga agcggccgct tacttgtaca ctcgtctatt g 41
<210> 51
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2 forward primer
<400> 51
ctccatcagc aggggcgcct atagttgcgc ccatgg 36
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2 reverse primer
<400> 52
ccatgggcgc aactataggc gcccctgctg atggag 36
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I3A3 forward primer
<400> 53
ggctgctctt ctccgccagc aggggcgcct at 32
<210> 54
<211> 32
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I3A3 reverse primer
<400> 54
ataggcgccc ctgctggcgg agaagagcag cc 32
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2HA forward primer
<400> 55
tgcgcccatg gggtagccat tgaagaaaag 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I2A2HA reverse primer
<400> 56
cttttcttca atggctaccc catgggcgca 30
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I867M forward primer
<400> 57
catcagcagg ggcatgtata gttgcatcca t 31
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I867M reverse primer
<400> 58
atggatgcaa ctatacatgc ccctgctgat g 31
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-S869R forward primer
<400> 59
ggcatctata gatgcatcca tgg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-S869R reverse primer
<400> 60
ccatggatgc atctatagat gcc 23
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I876N forward primer
<400> 61
catccatggg gtacacaatg aagaa 25
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2A-I876N reverse primer
<400> 62
ttcttcattg tgtaccccat ggatg 25
<210> 63
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2BdeltaSEQ ID NO:7 forward primer
<400> 63
tggcatggtc gccatagagg agcgcca 27
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2BdeltaSEQ ID NO:7 reverse primer
<400> 64
cctctatggc gaccatgcca ggcttgcca 29
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial seqeunce
<220>
<223> GRIN2BdeltaC9 forward primer
<400> 65
gtggattggg aggaccggtc tgg 23
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2BdeltaC9 reverse primer
<400> 66
ggcaagaatt ctcactcata aacatgtcca ttg 33
<210> 67
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2 forward primer
<400> 67
ctccatcagc agaggtgcct acagctgtgc ccatgg 36
<210> 68
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2 reverse primer
<400> 68
ccatgggcac agctgtaggc acctctgctg atggag 36
<210> 69
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2AH forward primer
<400> 69
tgtgcccatg gggtacacat agaggagcgc c 31
<210> 70
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I2A2AH reverse primer
<400> 70
ggcgctcctc tatgtgtacc ccatgggcac a 31
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I872M forward primer
<400> 71
atctacagct gtatgcatgg ggtagcc 27
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-I872M reverse primer
<400> 72
ggctacccca tgcatacagc tgtagat 27
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-H873R forward primer
<400> 73
ctacagctgt atccgtgggg tagccataga 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> GRIN2B-H873R reverse primer
<400> 74
tctatggcta ccccacggat acagctgtag 30
Claims (16)
- SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이의 변이 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서,
상기 변이 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 가지며, 상기 폴리펩타이드는 125개 이하의 아미노산 길이인, 폴리펩타이드. - 제1항에 있어서,
상기 폴리펩타이드는 SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 및 SEQ ID NO:16으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인, 폴리펩타이드. - 제1항 또는 제2항의 폴리펩타이드 및 제1항에 따른 아미노산 서열에 이종성인 하나 이상의 추가 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질로서,
특히 이종성 폴리펩타이드 서열은 멤브레인 앵커 폴리펩타이드의 서열, 단백질 형질도입 도메인의 서열 및 태그의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 융합 단백질. - 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드 또는 제3항에 따른 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
- 대상체의 암, 특히 신경아세포종의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드, 제3항에 따른 융합 단백질, 또는 제4항에 따른 핵산.
- 하기 중 하나 이상을 포함하는 세포:
a) 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드;
b) 제3항에 따른 융합 단백질;
c) 제4항에 따른 핵산;
d) 재조합적으로 발현된 GluN2A 단백질, 여기서 GluN2A 단백질은 SEQ ID NO:1의 표준(canonical) 서열 모티프 대신 이의 변이 서열을 포함하거나, 또는 상기 SEQ ID NO:1의 서열 모티프가 결실된 것이며, 상기 변이 서열은 GluN2A 단백질을 SEQ ID NO:1의 표준 서열 모티프를 포함하는 GluN2A 단백질에 비해 독성 활성이 감소되도록 함;
e) 재조합적으로 발현된 GluN2B 단백질, 여기서 GluN2B 단백질은 SEQ ID NO:7의 표준 서열 모티프 대신 이의 변이 서열을 포함하거나, 또는 상기 SEQ ID NO:7의 서열 모티프가 결실된 것이며, 상기 변이 서열은 GluN2B 단백질을 SEQ ID NO:7의 표준 서열 모티프를 포함하는 GluN2B 단백질에 비해 독성 활성이 감소되도록 함. - 제6항에 있어서,
SEQ ID NO:1의 변이 서열은 SEQ ID NO:1의 서열에서 I3A, I7A, I11A, H15A 아미노산 잔기 변이의 하나 이상을 나타내거나, 및/또는 SEQ ID NO:7의 변이 서열은 SEQ ID NO:7의 서열에서 I7A, I11A, H12R, A15H 아미노산 잔기 변이의 하나 이상을 나타내는 것인, 세포. - GluN2A 또는 GluN2B 단백질의 C-말단 세포질 도메인에 결합하지만, 아미노 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO:7에 상응하는 영역이 결여된 GluN2A 또는 GluN2B 결실 변이체에 결합하지 않는, 항체, 나노바디 또는 안티칼린으로서,
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, 및 SEQ ID NO:27로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 결합하는 것인, 항체, 나노바디 또는 안티칼린. - 제8항에 있어서,
상기 항체, 나노바디 또는 안티칼린은 NMDA 수용체 매개 독성으로부터 보호하거나 NMDA 수용체 매개 독성을 유도 또는 개선하는 것인, 항체, 나노바디 또는 안티칼린. - NMDA 수용체 매개 독성을 연구하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드, 제3항에 따른 융합 단백질, 제4항에 따른 핵산, 제6항에 따른 세포, 및/또는 제8항 또는 제9항에 따른 항체, 나노바디 또는 안티칼린의 용도.
- GRIN2A 유전자(즉, GluN2A 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열 및/또는 GRIN2B 유전자(즉, GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열을 대상체의 게놈 핵산 샘플에서 시퀀싱하는 생체외 방법으로서,
GRIN2A 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:1 단백질의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하고, GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 SEQ ID NO:7의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하는 것인, 방법. - NMDA 수용체 매개 독성에 대한 대상체의 민감도를 평가하기 위한 방법으로서,
상기 방법은 GRIN2A 유전자(즉, GluN2A 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열 및/또는 GRIN2B 유전자(즉, GluN2B 단백질을 인코딩하는 유전자)의 부분 서열을 대상체의 게놈 핵산 샘플에서 시퀀싱하는 단계를 포함하며, 여기서 GRIN2A 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 인간 GluN2A 단백질에서 SEQ ID NO:1의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하고, GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 인간 GluN2B 단백질에서 SEQ ID NO:7의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하며,
상기 대상체는
a) 표준 GluN2A (SEQ ID NO:1) 및/또는 표준 GluN2B (SEQ ID NO:7) 서열이 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 보통의 민감도를 나타내고,
b) GluN2A (I867M) 변이가 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 증가된 민감도를 나타내고,
c) GluN2A (S869R) 변이가 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 보통의 민감도를 나타내고,
d) GluN2A (I876N) 변이가 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 증가된 민감도를 나타내고,
e) GluN2B (I872M) 변이가 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 보통의 민감도를 나타내고,
f) GluN2B (H873R) 변이가 NMDA 수용체 매개 독성에 대해 감소된 민감도를 나타내는 것인, 방법. - 단백질-단백질 상호작용 어세이에서, 제1항 또는 제2항에 따른 폴리펩타이드, 또는 제3항에 따른 융합 단백질의 용도.
- GluN2A 또는 GluN2B 단백질의 C-말단 세포질 도메인과 상호작용할 수 있는 화합물을 동정하는 방법으로서,
상기 방법은
i) SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열 또는 이의 변이체에 후보 화합물을 컴퓨터-지원 가상 도킹하는 단계, 여기서 상기 변이체는 GluN2A (I867M) (SEQ ID NO:4 참조), GluN2A (S869R) (SEQ ID NO:5 참조), GluN2A (I876N) (SEQ ID NO:6 참조), GluN2B (I872M) (SEQ ID NO:8 참조), 및 GluN2B (H873R) (SEQ ID NO:22 참조) 중에서 선택되며, 상기 아미노산 서열은 상기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 가상 3D 구조에서 제공됨; 및
ii) 후보 화합물을 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:7에 따른 아미노산 서열 또는 이의 변이체에 가상으로 도킹하기 위한 도킹 스코어 및/또는 내부 스트레인을 결정하는 단계; 및 선택적으로
iii) 시험관내 또는 생체내에서 GluN2A 또는 GluN2B 서브유닛 각각을 포함하는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA:N-methyl-D-aspartate) 수용체를 후보 화합물과 접촉시켜, 상기 후보 화합물이 상기 NMDA 수용체의 활성을 조절하는지 또는 조절하지 않는지를 결정하는 단계;를 포함하는 것인, 방법. - GRIN2A 유전자의 부분 서열 및/또는 GRIN2B 유전자의 부분 서열의 서열을 대상체의 게놈 핵산 샘플에서 결정하는 수단을 포함하는 키트로서,
GRIN2A 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 GluN2A 단백질의 SEQ ID NO:1의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 적어도 포함하고, GRIN2B 유전자의 시퀀싱된 부분 서열은 GluN2B 단백질의 SEQ ID NO:7의 표준 서열을 일반적으로 인코딩하는 유전자 영역을 포함하며,
특히 상기 키트는 SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 및 SEQ ID NO:40으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머를 포함하는 것인, 키트. - NMDA 수용체 매개 독성에 대해 더 많은 저항성을 제공하는 핵산을 갖는 세포를 제공하는 방법으로서,
상기 방법은
i) 상기 세포에서 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 높은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B 게놈 서열을 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 낮은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B 서열로 대체하는 단계; 또는
ii) 상기 세포에서 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 높은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B mRNA 전사체를 NMDA 수용체 매개 독성에 대한 더 낮은 민감도로 연결된 GRIN2A 및/또는 GRIN2B mRNA 서열로 부위-지정 mRNA 편집하는 단계;를 포함하는 방법.
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