JP2023537355A - Ｎｍｄａ受容体媒介毒性を予測および操作するための新規の方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、神経変性過程の分野に関する。特に、本発明は、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の配列モチーフを含むポリペプチドに関し、このモチーフは、配列番号１または配列番号７によるアミノ酸配列またはその変異体配列を有し、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の研究と調節に有用である。本発明はまた、前記ポリペプチドを含む融合タンパク質、それをコードする核酸、およびそれぞれの（宿主）細胞および組成物に関する。本発明はまた、前記ポリペプチドに結合する化合物、ならびにＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する個体の感受性を評価するための方法にも関する。【選択図】なし

Description

本発明は、神経変性プロセスの分野に関する。特に、本発明は、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質およびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の配列モチーフを含むポリペプチドに関し、そのモチーフは、配列番号１または配列番号７に記載のアミノ酸配列またはそれらの変異体配列を有し、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の研究と調節に有用である。本発明はまた、前記ポリペプチドを含む融合タンパク質、それをコードする核酸、およびそれぞれの（宿主）細胞および組成物に関する。本発明はまた、前記ポリペプチドに結合する化合物、ならびにＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する個体の感受性を評価するための方法にも関する。
神経変性疾患は、ニューロンの構造と機能の進行性の喪失を伴う壊滅的な疾患であり、最終的にニューロンの死を引き起こす。神経変性は急性またはゆっくり進行することがあるが、どちらのタイプの神経変性も、細胞外グルタミン酸濃度の上昇またはシナプス外部位へのＮＭＤＡ受容体の再局在化によって引き起こされる、シナプス外ＮＭＤＡ受容体による死のシグナル伝達の増加を伴うことがよくある。ＮＭＤＡ受容体は、カルシウムを透過するグルタミン酸依存性および電位依存性のイオンチャネルである。それらは、細胞内の位置によって、シナプスＮＭＤＡ受容体およびシナプス外ＮＭＤＡ受容体として分類することができる。シナプス接触の内外の受容体のサブユニット組成は類似しているが、一般的なグルタミン酸イオノトロピック受容体ＮＭＤＡタイプサブユニット１（ＧｌｕＮ１）サブユニットを運ぶことに加えて、シナプス外ＮＭＤＡ受容体は優先的にＧｌｕＮ２Ｂサブユニットを含むが、ＧｌｕＮ２ＡはシナプスＮＭＤＡ受容体の主要なサブユニットである。シナプスＮＭＤＡ受容体刺激とシナプス外ＮＭＤＡ受容体刺激の細胞への影響は劇的に異なる。シナプスＮＭＤＡ受容体は、シナプス伝達の有効性における生理学的変化を引き起こす。それらはまた、事実上すべての行動適応の長期的な実施に重要な遺伝子発現応答を活性化する細胞核へのカルシウムシグナル伝達経路をトリガーする。最も重要なことは、シナプスＮＭＤＡ受容体は、核カルシウムを介して作用し、神経構造を保護し生存を促進する遺伝子の強力な活性化因子である。対照的に、シナプス外ＮＭＤＡ受容体は細胞死経路をトリガーする。シナプス外ＮＭＤＡ受容体の活性化後数分以内に、ミトコンドリア膜電位が崩壊し、続いてミトコンドリア透過性遷移が起こる。シナプス外ＮＭＤＡ受容体はまた、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）応答性エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）遮断経路をトリガーし、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）－ＭＡＰＫシグナル伝達を不活性化し、クラスＩＩａヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）とアポトーシス促進性転写因子Ｆｏｘｏ３Ａの核内移行をもたらすため、興奮転写連関に強く拮抗し、核カルシウム駆動の適応ゲノミクスを崩壊させる。これは、脳由来神経栄養因子（Ｂｄｎｆ）や血管内皮成長因子Ｄ（Ｖｅｇｆｄ）などの、複雑な樹状突起構造とシナプス接続の維持ならびに神経保護シールドの構築に不可欠な、多くの遺伝子の活性調節に影響を及ぼす。さらに、活性化されたＥＲＫ１／２の到達距離が短いため、シナプス外ＮＭＤＡ受容体によるそれらの遮断は、樹状突起のｍＲＮＡ翻訳や、シナプス伝達の有効性を制御するＡＭＰＡ（α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソキサゾールプロピオン酸）受容体輸送などの、重要な局所シグナル伝達イベントを混乱させる。したがって、シナプス外ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達は、ミトコンドリア機能障害、転写の調節解除、およびニューロン構造と接続性の完全性の喪失、を伴う病理学的トライアドの開始を特徴としている。
しかし、これまでのところ、ＮＭＤＡ受容体の毒性シグナル伝達の分子基盤は不明のままであった。例えば、ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達に関連する神経変性プロセスを発症または患うリスクを決定するための診断ツールが当技術分野で必要とされているため、これは残念である。したがって、本発明によって解決される問題は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を研究、予測、および／または調節するための新しい手段を提供することであった。
この問題は、添付の特許請求の範囲および以下の説明に記載の主題によって解決される。
本発明の発明者らは驚くべきことに、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの細胞内の膜に近い部分内に位置する４つの等間隔のイソロイシンを有する１８アミノ酸からなる進化的に高度に保存されたストレッチが、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の原因であることを発見した。対応する配列を持つポリペプチドは、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を誘発するのに十分であり、神経細胞死をもたらす。本発明者らは、変異分析において、１８アミノ酸からなる高度に保存されたストレッチ内のイソロイシンならびにイソロイシンに隣接する特定のアミノ酸が、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞などの非神経細胞におけるＮＭＤＡ受容体チャネルの毒性を決定することを見出した。さらに、彼らは、毒性の低いまたは高い、ＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のこのポリペプチドモチーフの変異体を発見した。これらの変異体のいくつかは、ヒト集団の遺伝子プールに存在する一塩基多型（ＳＮＰ）に対応している。この変異体のために、ＮＭＤＡ受容体介在毒性、したがって神経変性プロセスを他のものよりも起こしやすいヒト対象が存在し、そのような疾患の診断および予後に影響を与えると考えられる。また、この変異体のために、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性、したがって神経変性プロセスを他のものよりも起こしにくく、したがって神経細胞に有害な状態で神経細胞死を経験しないか、または神経細胞死が少なくなるという「利点」を有するヒト対象が存在することも考えられる。これらの状態には、低酸素性虚血状態、外傷性脳損傷、緑内障、脳微小血管障害、糖尿病などの代謝性疾患による神経障害、およびアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの神経変性疾患に対する遺伝的または非遺伝的素因が含まれる。
したがって、本発明は、第１の態様において、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８、またはそれらの変異体配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関し、前記変異体配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を示す。ポリペプチドは、好ましくは最大６４３アミノ酸長、好ましくは最大６２５アミノ酸長である。配列番号１は、マウス、ラットおよびヒトのＧｌｕＮ２Ａタンパク質内に保存された配列モチーフであり、そのＣ末端細胞質ドメインの一部である。前記１８アミノ酸長の配列要素は、完全長ＧｌｕＮ２Ａタンパク質に対するＵｎｉＰｒｏｔデータベースのそれぞれのデータベースエントリ（UniProtKB - Q12879; NMDE1_HUMAN; sequence version 1 of 1 Nov 1996）に見出される「基準」アイソフォームであるため、本明細書では「基準」ＧｌｕＮ２Ａと呼ばれる。Ｇｒｉｎ２Ｂタンパク質の配列番号１に相当する配列は配列番号７である。前記１８アミノ酸長配列要素は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのそれぞれのデータベースエントリ（UniProtKB - Q13224; NMDE2_HUMAN; sequence version 3 of 20 Jun 2001）に見出される「基準」アイソフォームであるため、本明細書では「基準」ＧｌｕＮ２Ｂと呼ばれる。本発明の発明者らは、これらの配列を含むポリペプチドがＮＭＤＡ受容体媒介毒性を誘発するのに十分であることを示した。配列番号２および配列番号３は、人工的に作成され、配列番号１の変異バージョン（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａに由来する）であり、依然としていくつかの毒性特性を示す。配列番号４、配列番号５および配列番号６は、ヒトに存在する配列番号１の天然変異体（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａに由来する）である。この配列を含むポリペプチドも有毒であり、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を誘発する。
好ましい実施形態では、本発明による本発明のポリペプチドは、本発明の上述のコアモチーフの他に、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端フランキング領域も含む。例えば、ポリペプチドは、それぞれ、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個（またはそれ以上）の追加のアミノ酸を含む場合があり、これらは配列番号１または配列番号７の基準配列モチーフのＮ末端に直接隣接して見出される。本発明のポリペプチドは、例えば、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの最大１、２、３、または４個（またはそれ以上）の追加のアミノ酸をさらに、または追加で含む場合があり、これらはこれらのタンパク質の配列番号１または配列番号７の本発明の配列モチーフのＣ末端に直接隣接して見出される。したがって、本発明の第１の態様によるポリペプチドは、例えば、ＧｌｕＮ２Ａに関して、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む場合がある。ＧｌｕＮ２Ｂに関しては、本発明の第１の態様のポリペプチドは、例えば、配列番号１５による配列または配列番号１６による配列を含む場合がある。これらの配列とそれらの構造的関係の図解を図１に示す。本発明の第１の態様によるポリペプチドは、例えば、神経細胞におけるＮＭＤＡ受容体媒介毒性、特に前記プロセスに関与する調節および相互作用を研究および誘導するために使用することができるが、これに限定されるものではない。
以下の表１および２に示されるように、配列番号１および配列番号７に図解されるＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの基準アミノ酸配列モチーフは、ヒトに固有のものではないが、哺乳動物に高度に保存されており、脊椎動物全体でさえも保存されている。
Figure 2023537355000001
Figure 2023537355000002
上記の表１と表２から明らかなように、目的のモチーフはさまざまな脊椎動物全体および特に哺乳網の種によく保存されている。したがって、ある脊椎動物、特にマウスやラットなどの哺乳網の種で得られた結果は、他の脊椎動物の種、特に哺乳網の種にも適用できることが容易に推測される。これに関連して、本発明者らは、マウスＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂにもとより由来する配列を、ヒトＨＥＫ２９３細胞およびマウス初代培養ニューロンの両方で使用することができることを示しており、これは、脊椎動物および特に哺乳網の種の境界を越えて本発明のポリペプチドの保存された機能、したがって有用性を示している。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、好ましくはＴＲＰＭ４タンパク質が発現される有糸分裂後のニューロンおよび有糸分裂癌細胞の好ましくは両方に対して毒性である。本明細書で使用される場合、化合物がインビトロおよびインビボの両方で細胞死を誘発する場合、その化合物は「毒性」である。標準的なインビトロ試験では、一次ニューロンまたは神経芽腫細胞などの細胞株でこれらのポリペプチドを１０日間処理または発現させた後、細胞死を評価する（例えば、図２および図５を参照）。標準的なインビボ試験は、本発明のポリペプチドを３週間発現させた後、変性ニューロンを（例えば、ＦｌｕｏＪａｄｅ Ｃ染色を用いて）染色することによってニューロン死を評価することである。適切なコントロール（すなわち、生理食塩水、溶媒のみ、不活性な突然変異体）と比較して、インビボまたはインビトロで測定された細胞死率の統計的に関連する違いは、毒性を示す。
本発明の第１の態様によるポリペプチドの長さは、好ましくは長さが６２５アミノ酸を超えない。これに限定されないが、この長さは、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの本質的に全体の細胞質ドメインの使用を可能にする。しかしながら、ほとんどの場合、本発明のポリペプチドはより短い。ポリペプチドは、例えば、最大約６２５アミノ酸長、最大約６００アミノ酸長、最大約５００アミノ酸長、最大約４００アミノ酸長、最大約３００アミノ酸長、最大約２５０アミノ酸長、最大約２００アミノ酸長、最大約１５０アミノ酸長、最大約１２５アミノ酸長、最大約１００アミノ酸長、最大約９０アミノ酸長、最大約８５アミノ酸長、最大約８０アミノ酸長、最大約７５アミノ酸長、最大約７０アミノ酸長、最大約６５アミノ酸長、最大約６０アミノ酸長、最大約５５アミノ酸長、最大約５０アミノ酸長、最大約４５アミノ酸長、最大約４０アミノ酸長、最大約３５アミノ酸長、最大約３０アミノ酸長、最大約２５アミノ酸長、最大約２５アミノ酸長、最大約２０アミノ酸長である場合がある。好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは、１８アミノ酸長から約３０アミノ酸長である。本発明のポリペプチドは、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの断片に限定されるとは理解されないが、その一群は本発明の第１の態様によるポリペプチドの好ましい実施形態であることに留意されたい。
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様による本発明のポリペプチドと、本発明の第１の態様によるアミノ酸配列とは異種の少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質に関する。「異種」とは、結果として得られる融合タンパク質が自然界ではこの形で存在しないことを意味する。さらなるアミノ酸配列はＧｌｕＮ２Ａタンパク質またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質にまったく関連していないため、これは、例えば、融合タンパク質が、例えば異なる種のＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂ配列が新しく人工的に作成されたアイソフォーム（ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂ配列の混合形態を含む）において結合した、あるいは、より好ましい実施形態における、シャッフルされたＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの変異体を表す場合であるかも知れない。「融合タンパク質」という用語は、融合から生じるポリペプチドの特定の長さを意味するものではない。これらに限定されるものではないが、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列は、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも１５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５アミノ酸長、少なくとも３０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、または少なくとも５００アミノ酸長またはそれ以上のアミノ酸長を有する場合がある。必須ではないが、典型的には、さらなるアミノ酸配列は、ポリペプチド／得られる融合タンパク質に追加の機能性を提供する。例えば、さらなるアミノ酸配列は、膜固定部分、タンパク質伝達ドメインおよびタグからなる群から選択されてもよい。ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂは膜固定受容体であるため、膜固定部分は、融合タンパク質、したがって本発明のポリペプチドを細胞内で発現させる場合に特に有用である。特に好ましい膜固定部分は、ＣａａＸボックスモチーフ（プレニル化用）、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナルアンカー配列（配列番号１７）、およびＫ－Ｒａｓ４Ｂ（Ｒａｓ）タンパク質のＣ末端ターゲティングシグナル（配列番号１８）からなる群から選択される。ＣａａＸボックスモチーフに関して、Ｃはプレニル化されたシステイン、ａは任意の脂肪族アミノ酸であり、Ｘの同一性によってどの酵素がタンパク質に作用するかが決まる。ファルネシルトランスフェラーゼは、Ｘ＝Ｍ、Ｓ、Ｑ、Ａ、またはＣのＣａａＸボックスを認識するが、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼＩは、Ｘ＝ＬまたはＥのＣａａＸボックスを認識する。しかしながら、本発明のポリペプチドはまた、タンパク質導入ドメイン、すなわち、細胞膜を横切るポリペプチドの輸送を容易にし、したがってポリペプチドが細胞膜を通過して細胞の細胞質ゾルに入ることを可能にするペプチド配列にそれを融合させることによって、例えば外部から細胞に投与されてもよい。好ましいタンパク質導入ドメインは、配列番号１９によるＴＡＴタンパク質である。追加で、または代替で、本発明のポリペプチドをタグで標識して、例えばポリペプチド／融合タンパク質の検出または精製を可能にすることが有用であるかも知れない。好ましいタグは、本発明のポリペプチドの活性にまったく影響を及ぼさなかったＨＡタグ（配列番号２０）、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質タグである。本発明の第２の態様による融合タンパク質も好ましくは毒性である。
これらに限定されるものではないが、本発明の第２の態様による融合タンパク質は、好ましくは最大約６００アミノ酸長、最大約５００アミノ酸長、最大約４００アミノ酸長、最大約３００アミノ酸長、最大約２５０アミノ酸長、最大約２００アミノ酸長、最大約１５０アミノ酸長、最大約１２５アミノ酸長、最大約１００アミノ酸長、最大約９０アミノ酸長、最大約８５アミノ酸長、最大約８０アミノ酸長、最大約７５アミノ酸長、最大約７０アミノ酸長、最大約６５アミノ酸長、最大約６０アミノ酸長、最大約５５アミノ酸長、最大約５０アミノ酸長、最大約４５アミノ酸長、最大約４０アミノ酸長、最大約３５アミノ酸長、最大約３０アミノ酸長、最大約２５アミノ酸長、最大約２０アミノ酸長である。
第３の態様において、本発明は、第１の態様による本発明の１つまたは複数の発明のポリペプチドおよび／または本発明の第２の態様による１つまたは複数の融合タンパク質をコードする核酸に関する。本発明の核酸は、核酸について考えられるすべての形態をとり得る。特に、本発明による核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらのハイブリッドであってもよい。それらは、一本鎖または二本鎖であってもよい。それらは、小さな転写物のサイズまたはウイルスゲノムなどのゲノム全体のサイズを持つ場合がある。本明細書で使用される場合、本発明の１つまたは複数の発明のポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸は、センス鎖を反映する核酸であってもよい。同様に、アンチセンス鎖も「コードする」という用語の範囲に含まれる。核酸は、ウイルスプロモーターまたは細菌プロモーターなどの、本発明のポリペプチドの発現のための異種（すなわち、非ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂ）プロモーターを包含することがある。本発明による核酸は、全長ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂ遺伝子をコードできないことが理解される（本発明の第１の態様によるポリペプチドはより短く、融合タンパク質はＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂとは異種のアミノ酸配列を含む）。
第４の態様において、本発明は、本発明による核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、例えば、本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を可能にする発現ベクターであり得る。そのようなベクターは、例えば、ウイルス発現ベクターであってもよい。前記発現は、構成的または誘導的であってもよい。ベクターはまた、クローニング目的のための本発明の核酸の配列を含むクローニングベクターであってもよい。
第５の態様において、本発明は、対象の疾患を治療する方法で使用するための、特に対象の癌を治療する方法で使用するための、本発明によるポリペプチド、融合タンパク質、核酸、および／またはベクターに関する。好ましくは、癌は、神経芽細胞腫などの神経組織の癌である。癌を治療する方法は、ＮＭＤＡ受容体媒介性細胞死を誘導することによって癌を治療する方法であってもよい。「ＮＭＤＡ受容体媒介性細胞死を誘導する」という用語は、本発明のこの態様の文脈において、達成されるべき技術的効果、すなわち、（シナプス外）ＮＭＤＡ受容体シグナル伝達によって典型的に誘導され、それぞれの細胞の死をもたらす、それぞれの細胞死経路の誘導を定義するために使用されることに留意されたい。この方法は、治療を必要とする対象に有効量の本発明のポリペプチドまたは融合タンパク質、または治療を必要とする対象にそのようなポリペプチドまたは融合タンパク質の発現を与える核酸またはベクターを投与することを含む。対象は、典型的には脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト対象である。投与経路は、それぞれの癌に適していると当業者が考える任意の投与経路でよい。好ましくは、ポリペプチド、融合タンパク質、核酸、またはベクターは、腫瘍内に投与される。
第６の態様において、本発明は、本発明によるポリペプチド、融合タンパク質、核酸、および／またはベクターを含む（好ましくは単離された）細胞に関する。
第７の態様において、本発明は、ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質を組換え発現する（好ましくは単離された）細胞に関し、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のそれぞれは、配列番号１（ＧｌｕＮ２Ａ）および配列番号７の基準配列モチーフのそれぞれの代わりにそれらの変異体を含み、あるいは、前記配列モチーフが欠失している。変異体配列は、典型的には、配列番号１（ＧｌｕＮ２Ａ）および配列番号７とほぼ同じ配列長、例えば、約１６から約２０アミノ酸、好ましくは約１７から１９アミノ酸、最も好ましくは１８アミノ酸を示す。本発明のこの態様の細胞のＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質は、基準のＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂのそれぞれと比較して、好ましくは低下したレベルの毒性活性を示す。例えば、変異体配列は、配列番号１の配列において、Ｉ３Ａ、Ｉ７Ａ、Ｉ１１Ａ、Ｈ１５Ａの変異体アミノ酸残基の１つまたは複数を示すことがある。配列番号７に関して、変異体配列は、例えば、Ｉ７Ａ、Ｉ１１Ａ、Ｈ１２Ｒ、Ａ１５Ｈの変異体アミノ酸残基の１つまたは複数を示すことがある。本発明の第７の態様の文脈で使用することができるＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のそれぞれの例は、配列番号２、配列番号３、配列番号２１、および配列番号２２の変異体配列の１つを示すＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質である。変異体配列は、もちろん、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂのそれぞれのフランキング配列によって再び取り囲まれてもよい。したがって、本発明のこの態様のＧｌｕＮ２Ａタンパク質は、例えば、配列番号２３（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａ欠失突然変異体）、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号２４の配列のうちの１つを含むことがある。本発明のこの態様のＧｌｕＮ２Ｂタンパク質は、例えば、配列番号２５（すなわち、ＧｌｕＮ２Ｂ欠失突然変異体）、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８の配列のうちの１つを含むことがある。本明細書で使用される「ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質を組換え発現する」は、一過性または恒常的な、ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂ発現の人工的に誘導された発現のすべての形態を包含することを意図する。例えば、ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂ配列は、遺伝子工学によって細胞に人工的に与えられたものでもよい。ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質は、任意の種に由来し得るが、好ましくは哺乳動物種、好ましくはマウスまたはヒトＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂ、最も好ましくはヒトＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂに由来する。これは配列番号１（ＧｌｕＮ２Ａ）および配列番号７の変異体配列、またはそれらの欠失突然変異体ではなく、ＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂ配列の残りに関係することが理解される。「ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質」という用語は、所与の種におけるＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のすべての変異体も包含し、すなわち、前記種の基準配列に限定されない。本発明のこの態様のＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質は、好ましくは、グルタミン酸依存性および電位依存性イオンチャネルを形成し、シナプス伝達の有効性における生理学的変化を開始し、細胞核へのカルシウムシグナル伝達経路を誘発し、および／またはニューロン構造保護および生存促進遺伝子を活性化する能力を保持ことに留意されたい。
本発明の第６および第７の態様の細胞は、特に、細菌細胞および酵母細胞（例えば、生産目的のため）、ならびに哺乳動物細胞（例えば、研究目的のためであるが、場合によっては生産目的およびその他の目的のためでもある）からなる群から選択され得る。哺乳動物細胞は、神経細胞である場合もあるが、非神経細胞の哺乳動物細胞である場合もある。特に好ましい実施形態では、細胞は、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である。このＨＥＫ２９３細胞は、例えば、上記のＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質を含み得る。
第８の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクター、または細胞（第６または第７の態様による）を含む組成物に関する。組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでもよい。好ましい実施形態では、組成物は、本発明による前記ポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクターおよび／または細胞を含むナノ粒子を含み得る。ナノ粒子は、前記ポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクターおよび／または細胞を経時的に放出するように設計され得る。
第９の態様において、本発明は、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のＣ末端細胞質ドメインにそれぞれ結合するが、アミノ酸配列番号１および配列番号７にそれぞれ対応する領域（すなわち、UniProtKB entry - Q12879のアミノ酸８６１～８７８; NMDE1_HUMAN; sequence version 1 of 1 Nov 1996; およびＧｌｕＮ２Ｂのアミノ酸８６２～８７９; UniProtKB - Q13224; NMDE2_HUMAN; sequence version 3 of 20 Jun 2001）を欠くＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂ欠失突然変異体には結合しない、抗体、ナノボディまたはアンチカリン、特に、抗体またはナノボディに関する。そのような抗体、ナノボディまたはアンチカリンは、本発明者らによってＮＭＤＡ受容体媒介毒性の誘導に関連することが確認されたＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のそれぞれの本発明の領域に特異的である。抗体は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるポリペプチド配列に結合することができる。好ましくは、抗体、ナノボディまたはアンチカリンは、例えば、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの前記サブ領域と、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の誘発に関与する他のタンパク質または相互作用パートナー、特にＴＲＰＭ４タンパク質との相互作用を防止することによって、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性（例えば、ＮＭＤＡまたはグルタミン酸誘発神経細胞死、酸素グルコース欠乏誘発神経細胞死、脳卒中の動物モデル）を防御、誘発または改善する。そのような抗体、ナノボディまたはアンチカリンは、それぞれ、アンタゴニストまたは遮断抗体、ナノボディまたはアンチカリンと見なすことができる。本明細書で使用されるナノボディは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、すなわち、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。
第１０の態様において、本発明は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の研究のための、本発明のポリペプチド、融合タンパク質、核酸、ベクター、細胞、組成物および／または抗体、ナノボディまたはアンチカリンの使用に関する。本願の実施例で示されるように、本発明の発明者らは、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の誘導に十分なＧｌｕＮ２Ａタンパク質およびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質内の重要な領域を同定した。これにより、科学者や研究者は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を引き起こす事象の分子基盤をより詳細に研究することができる。
第１１の態様において、本発明は、対象のゲノム核酸サンプルにおいて、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする遺伝子）および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２ｂタンパク質をコードする遺伝子）を配列決定する方法に関し、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の配列決定された部分配列は、配列番号１の基準配列（すなわち、ヒトＧｌｕＮ２Ａタンパク質のアミノ酸８６１～８７８）を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、そして、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された部分配列は、配列番号７の基準配列（すなわち、ヒトＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のアミノ酸８６２～８７９）を通常コードする遺伝子領域を含む。本発明の発明者らは、遺伝子プール（例えば、ヒトの）におけるＧｌｕＮ２Ａタンパク質およびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の変異体（すなわち、タイプ）も基準配列の他に存在し、ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂの遺伝的変異体（すなわち、タイプ）に応じてＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性が異なることを示した。したがって、ＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２Ｂのタイプを決定することは、臨床的関連性を有する可能性があり、したがって、本発明のこの第１１の態様の方法は、対象のＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタイプに関する配列情報を（それぞれＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの細胞質ドメインにおける本発明の配列に関して）提供することを意図している。好ましくは、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された部分配列は、コードされたＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の最大１００アミノ酸、さらにより好ましくは最大７５アミノ酸、さらにより好ましくは最大５０アミノ酸をカバーする。好ましくは、配列決定は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく増幅および配列決定を利用する。ヒトゲノムにおいて、本発明のアミノ酸配列モチーフは、２つのエクソンにわたって分布しており、すなわち、イントロンによって中断されていることに留意されたい。したがって、前記領域を配列決定する手段は、この事実を考慮する必要がある。本発明の第１１の態様の方法は、例えば、エクソン－イントロン境界で２つの適切な領域を配列決定することによって実施することができる。標準プライマーを使用するＰＣＲの場合、ヒトゲノム中のＧＲＩＮ２Ａ標的配列の増幅に適したプライマーは、例えば、配列番号２９および配列番号３０（ＧＲＩＮ２Ａ、第１領域のフォワードおよびリバースプライマー）および配列番号３１および配列番号３２（ＧＲＩＮ２Ａ、第２領域のフォワードおよびリバースプライマー）で提供される。つぎに、前記増幅された核酸は、配列番号３３および配列番号３４によって表される配列決定プライマーを用いて配列決定することができる。ヒトゲノムのＧＲＩＮ２Ｂ標的配列については、配列番号３５および配列番号３６が第１領域の適切なフォワードおよびリバースプライマーであり、配列番号３７および配列番号３８が第２領域の適切なフォワードおよびリバースプライマーである。つぎに、前記増幅された核酸は、例えば、配列番号３９および配列番号４０によって表される配列決定プライマーを用いて配列決定することができる。本発明の第１１の態様の方法は、好ましくは、配列決定されたゲノム核酸サンプルに基づいて、対象が以下のうちの１つまたは複数を示すかどうかを決定するのに適している（すべての位置表示は、UniProtKB - Q12879またはUniProtKB - Q13224の配列に対して提供される）。
・基準ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１も参照）
・ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）（配列番号４も参照）
・ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）（配列番号５も参照）
・ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）（配列番号６も参照）
・基準ＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７も参照）
・ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）（配列番号８も参照）
・ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）（配列番号２２も参照）
本発明の発明者らは、上記のＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂ変異体（それぞれの遺伝子における異なるＳＮＰによって引き起こされる）が、実施例で実証されるように、ＨＥＫ２９３細胞株におけるＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する異なるレベルの感受性をもたらすことを見出した。したがって、本発明の第１１の態様の上記の方法は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する対象の感受性を評価するための方法であってもよく、この方法は、対象のゲノム核酸サンプルにおいてＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする遺伝子）および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をコードする遺伝子）を配列決定することを含み、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の配列決定された部分配列は、配列番号１の基準配列（すなわち、ヒトＧｌｕＮ２Ａタンパク質のアミノ酸８６１～８７８）を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、そして、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された部分配列は、配列番号７の基準配列（すなわち、ヒトＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のアミノ酸８６２～８７９）を通常コードする遺伝子領域を含み、
ａ）基準ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１）および／または基準ＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７）配列を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対して通常の感受性を示し、
ｂ）ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）変異（配列番号４も参照）を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性の増加を示し、
ｃ）ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）変異（配列番号５も参照）を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対して通常の感受性を示し、
ｄ）ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）変異（配列番号６も参照）を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性の増加を示し、
ｅ）ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）変異（配列番号８も参照）を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対して通常の感受性を示し、
ｆ）ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）変異（配列番号２２も参照）を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性の低下を示す。
好ましくは、本発明の第１１の態様の方法は、エクスビボ法であり、すなわち、ヒトまたは動物の体に対して実施されない。サンプルを提供する対象は、好ましくは哺乳動物であり、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ウマ、ハムスター、モルモット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどからなる群から選択される。最も好ましくは、対象はヒトである。
さらなる第１２の態様において、本発明は、タンパク質間相互作用アッセイにおけるポリペプチド、本発明による融合タンパク質または本発明による細胞の使用に関する。本発明者らは、本明細書において、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性について、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質における本発明の領域の重要性を開示するが、他のどのタンパク質因子がＮＭＤＡ受容体媒介毒性の促進または制限に関与し得るかは明らかではない。本発明の第１および第２の態様によるポリペプチド／融合タンパク質（または第６または第７の態様による細胞）は、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のさらなる結合および相互作用パートナーを同定するために特に有用になると考えられる。このようなアッセイで精査されるタンパク質間相互作用は、好ましくは、配列番号１および／または配列番号７によるアミノ酸配列、または本明細書で定義されるそれらの変異体配列によって特定される領域内の相互作用である。このような結合パートナーは、神経毒性、神経保護、またはそのいずれでもないことが判明する可能性がある。この文脈において、ポリペプチド／融合タンパク質／細胞は、直接的な相互作用パートナーに関する洞察を提供するだけでなく、例えば、特定の複合体が（例えば、競合）阻害により形成できなくなった場合において、ＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂシグナル伝達に関与する他の化合物の相互作用にも光を当てることになる。当業者は、生化学的、生物物理学的および遺伝的方法を含む、タンパク質間相互作用を決定するための多数の可能なアッセイに精通している。非限定的な例は、免疫沈降、二分子蛍光補完（例えば、スプリットＴＥＶ、スプリットＧＦＰ）、アフィニティー電気泳動、免疫電気泳動、ファージディスプレイ、タンデムアフィニティー精製、化学的架橋とそれに続く質量分析、表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動、核磁気共鳴イメージング、配列番号１および／または配列番号７への結合が上記のアッセイにおけるシグナルを無効にするリバースアッセイ、非レスポンダ細胞に化合物ライブラリーを加えてレスポンダにする補完アッセイ、またはＲＮＡｉスクリーニングアッセイ（レスポンダ細胞をオンレスポンダにする）などである。タンパク質間相互作用アッセイは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボアッセイであってもよい。最も好ましくは、タンパク質間相互作用アッセイはインビトロアッセイである。しかしながら、ライブイメージングの文脈では、そのようなアッセイはインビボアッセイでもあってもよい。アッセイがインビボアッセイである場合、ヒトにおけるアッセイではないことが好ましい。
本発明の領域との潜在的な相互作用は、従来の湿式化学手段だけでなく、新規のインシリコアプローチによっても決定することができる。したがって、本発明はまた、第１３の態様において、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のＣ末端細胞質ドメインと潜在的に相互作用する化合物を同定するための方法に関し、この方法は、
ｉ）配列番号１または配列番号７によるアミノ酸配列またはそれらの変異体への候補化合物のコンピュータ支援仮想ドッキングであって、変異体は、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）（配列番号４も参照）、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）（配列番号５も参照）、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）（配列番号６も参照）、ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）（配列番号８も参照）、およびＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）（配列番号２２も参照）から選択され、前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列を含むポリペプチドの仮想三次元構造で提供される、および、
ｉｉ）候補化合物を配列番号１または配列番号７によるアミノ酸配列またはそれらの変異体に仮想的にドッキングするためのドッキングスコアおよび／または内部歪みを決定すること、および任意で、
ｉｉｉ）ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂサブユニットをそれぞれ含むＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体をインビトロまたはインビボで候補化合物と接触させて、候補化合物が前記ＮＭＤＡ受容体の活性を調節するかどうかを決定すること、
を含む。
すでに上で述べたように、ＮＭＤＡ受容体活性を決定する方法は当技術分野で知られている（例えば、Zhang et al., 2011, J. Neurosci. 31, 4978-4990を参照、参照により本明細書に組み込まれる）。
候補化合物をタンパク質構造にインシリコでドッキングする方法は、当技術分野で周知である。候補化合物は、任意の化合物であり得る。典型的には、化合物は小分子であるが、化合物がタンパク質（例えば、抗体など）のような大きな生体分子であることも可能である。化合物のコレクションは、例えば、シュレディンガーエルエルシー（アメリカ合衆国、ニューヨーク州、ニューヨーク）から入手できる。三次元構造は、配列番号１または配列番号７またはそれらの変異体（配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７および配列番号２８）によるアミノ酸配列を含む任意の構造であり得る。三次元構造は、任意の脊椎動物ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質、または本発明の配列モチーフを含むこれらの任意の部分の任意の三次元構造であり得る。好ましくは、三次元構造は、哺乳動物起源のものであり、さらにより好ましくは、ヒト起源のものである。三次元構造はまた、ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質を含む複合体の構造、例えば、ＧｌｕＮ１およびＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの複合体であってもよい。この場合、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の様々な構造が、例えば、蛋白質構造データバンクにおいて当業者に入手可能であり、本発明の第１３の態様の方法に使用することができる。三次元構造は、例えば、Ｘ線結晶学分析、ＮＭＲ分光法分析、クライオＥＭによって得られた構造に基づくか、またはホモロジーモデリングに由来し得る。本発明の第１３の態様による方法は、配列番号１または配列番号７によるアミノ酸配列またはそれらの変異体（特に上記のもの）に対応するＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂ構造中の領域への候補化合物のドッキングを包含し、これらのアミノ酸配列に関連しない構造の領域へのドッキングを含まないことが理解される。しかし、配列番号１または配列番号７またはそれらの変異体を有する領域へのドッキングが、前記領域外の他のアミノ酸残基との並行相互作用を必要とする場合、そのようなドッキングも、本発明の第１３の態様による方法に包含される。ドッキング自体は、当業者に知られているさまざまな方法によって行うことができ、それぞれのソフトウェアは公的に入手可能である（例えば、シュレディンガーエルエルシー、アメリカ合衆国、ニューヨーク州、ニューヨークを参照）。それぞれの分析は、プロテロスバイオストラクチャーズゲーエムベーハー（ドイツ、プラネック）などの商用プロバイダーに注文することもできる。本発明の第１３の態様の方法はまた、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性の阻害剤を同定するために使用され得る。
さらなる第１４の態様において、本発明は、細胞に核酸、特に遺伝子を提供し、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する耐性を高める方法に関し、この方法は、前記細胞において、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより高い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２Ｂゲノム配列を、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより低い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２Ｂ配列で置換することを含む。例えば、ＮＭＤＡ受容体媒介性毒性に対する（例えば、基準ＧＲＩＮ２Ａ／ＧＲＩＮ２Ｂと比較して）高い感受性（例えば、Ｉ８７６ＮサブタイプをコードするＧＲＩＮ２Ａ遺伝子変異体を参照、配列番号６も参照）と関連するＧＲＩＮ２Ａゲノム配列は、ＧＲＩＮ２Ａ基準ゲノム配列で置換され、または基準配列よりもＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するさらに低い感受性を提供する配列（例えば、欠失突然変異体をコードするＧＲＩＮ２Ａ遺伝子変異体、配列番号２３も参照、または配列番号２、配列番号３または配列番号２１による配列）で置換されてもよい。同様に、基準ＧＲＩＮ２Ｂゲノム配列は、基準配列よりもＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより低い感受性を提供する配列（例えば、欠失突然変異体をコードするＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子変異体、配列番号２５も参照、または配列番号２、配列番号３または配列番号２２による配列）で置換されてもよい。この方法は、好ましくはインビトロ法である。細胞は、例えば、神経細胞、幹細胞、特に胚性幹細胞、卵母細胞または精母細胞であり得る。細胞は、好ましくは哺乳動物由来であり、さらにより好ましくはヒト由来である。しかしながら、ヒト以外の哺乳動物細胞もまた、本発明によって特に熟慮される。好ましい実施形態では、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対してより耐性を与える核酸（または遺伝子）は、本発明の配列モチーフ領域を完全に欠く核酸（または遺伝子）（すなわち、欠失突然変異体）であってもよい。好ましい実施形態では、遺伝子置換は、ＣＲＩＳＰＲまたは遺伝子編集を介した他の技術によって達成される。この置換は、ＮＭＤＡ毒性に対するニューロンの耐性を高め、その結果、神経変性の多くの形態（脳卒中、ＡＬＳ、アルツハイマー病、ハンチントン病、網膜変性（緑内障、糖尿病性網膜症）などを含む）に対する耐性を高める。
第１５の態様において、および上記の第１４の態様と同様に、本発明は、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの両方の発明の領域内の細胞、器官、齧歯類、哺乳動物、またはヒトの部位特異的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）編集の方法に関し、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより高い感受性に関連するｍＲＮＡを、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより低い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２ＢのｍＲＮＡ配列に変更することによって、宿主にＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより高い耐性を提供する。部位特異的ｍＲＮＡ編集は、ヌクレオチドアデノシンのイノシンへの脱アミノ化を触媒するＲＮＡに作用する酵素アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって達成される。イノシンは構造的にグアニンに似ており、翻訳中にグアノシンを模倣し、タンパク質コード配列に変化をもたらす可能性がある。部位特異的ｍＲＮＡ編集のためのいくつかの技術が利用可能である（Aquino-Jarquin, 2020, Mol Ther Nucleic Acids 19, 1065-1072、参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、ＳＮＡＰタグと短い（約２０ｎｔ）ガイドＲＮＡに融合されたヒトＡＤＡＲのデアミナーゼドメインが、トランスフェクションまたは感染法によって細胞に導入されている。ガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ－ＳＮＡＰタグ融合タンパク質に結合し、それを目的のｍＲＮＡへの標的にする。ガイドＲＮＡは、部位特異的な脱アミノ化を誘導するために、標的部位にＡ：Ｃミスマッチを含むように設計されている（Vogel et al., 2018, Nat Meth 15, 535-538、参照により本明細書に組み込まれる）。簡略化された方法では、２つのセグメントとして、標的ｍＲＮＡ結合を決定するガイド配列と、転写産物を編集するために内在性ヒトＡＤＡＲをＡＳＯ：ｍＲＮＡハイブリッドにガイドするＡＤＡＲリクルートドメイン、を含むように設計された、化学的に修飾され安定化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の細胞へのトランスフェクションを必要とする（Merkle et al., 2019, Nat Biotech 37, 133-138、参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の標的配列における所望の変更には、Ｉ８６３Ｖ、Ｉ８６７Ｖ、Ｉ８７１Ｖ、Ｉ８７６Ｖ、Ｈ８７５Ｒおよびそれらの組み合わせ（すべてＧｌｕＮ２Ａ内）、Ｉ８６４Ｖ、Ｉ８６８Ｖ、Ｉ８７２Ｖ、Ｉ８７７Ｖ、Ｈ８７３Ｒ、およびそれらの組み合わせ（すべてＧｌｕＮ２ｂ内）のアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない（編集後：ＩはＶになり、ＨはＲになる）。好ましくは、本発明のこの態様の方法は、前記細胞において、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより高い感受性に関連するＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２ＢのｍＲＮＡ配列を、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより低い感受性に関連するＧｌｕＮ２Ａおよび／またはＧｌｕＮ２ＢのｍＲＮＡ配列で編集または置換することを含む（上記も参照）。この方法は、インビトロまたはインビボの方法である。細胞は、例えば、神経細胞、幹細胞、特に胚性幹細胞、卵母細胞または精母細胞であり得る。細胞または器官は、好ましくは齧歯類または哺乳動物由来であり、さらにより好ましくはヒト由来である。しかしながら、ヒト以外の哺乳動物の細胞および器官もまた、本発明によって特に熟慮される。ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２ＢのｍＲＮＡ配列の置換または編集は、上記のパターンに従う。例えば、細胞が、配列番号７による配列モチーフを有するＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む場合、それは、配列番号２２によるｍＲＮＡモチーフを有するＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をコードするｍＲＮＡによって置換されてもよい。さらなる例において、細胞が、配列番号６による配列モチーフを有するＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする配列を含む場合、それは、例えば、配列番号１または配列番号２、配列番号３または配列番号２１による配列モチーフを有するＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする配列によって置換されてもよく、それらはすべて、配列番号６よりも低いＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性を提供する。いくつかの実施形態において、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対してより高い耐性を提供するメッセンジャーＲＮＡ（または遺伝子）は、本発明の配列モチーフを完全に欠くメッセンジャーＲＮＡ（または遺伝子）（すなわち、配列番号１または配列番号７に対応する配列が欠失している欠失突然変異体）であってもよい。好ましい実施形態において、ｍＲＮＡ置換は、ＣＲＩＳＰＲまたはｍＲＮＡ編集を介した他の方法によって達成される。前と同じように、このｍＲＮＡ置換は、ＮＭＤＡ毒性に対するニューロンの耐性を高め、その結果、神経変性の多くの形態（脳卒中、ＡＬＳ、アルツハイマー病、ハンチントン病、網膜変性（緑内障、糖尿病性網膜症）などを含む）に対する耐性を高める。
最後の第１６の態様において、本発明は、対象のゲノム核酸サンプルにおいて、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする遺伝子）および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２ｂタンパク質をコードする遺伝子）を決定するための手段を含むキットに関し、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の配列決定された部分配列は、配列番号１の基準配列（すなわち、ヒトＧｌｕＮ２Ａタンパク質のアミノ酸８６１～８７８）を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、そして、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された部分配列は、配列番号７の基準配列（すなわち、ヒトＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のアミノ酸８６２～８７９）を通常コードする遺伝子領域を含む。この手段は、例えば、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子のそれぞれの部分配列の増幅、配列決定および／または検出を可能にする核酸プライマーまたはプローブであってもよい。好ましくは、この手段は、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列を決定することを可能にし、部分配列は、コードされたＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の最大１００アミノ酸、さらにより好ましくは最大７５アミノ酸、さらにより好ましくは最大５０アミノ酸をカバーする。適切な手段は、例えば、上述のプライマー、すなわち、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０の群から選択されてもよい。このキットは、本発明の第１１の態様による方法を実施するためのキットであってもよい。このキットは、配列決定されたゲノム核酸サンプルに基づいて、対象が以下のうちの１つまたは複数を示すかどうかを決定することを可能にすることができる（すべての位置表示は、UniProtKB - Q12879またはUniProtKB - Q13224の配列に対して提供される）。
・基準ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１も参照）
・ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）（配列番号４も参照）
・ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）（配列番号５も参照）
・ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）（配列番号６も参照）
・基準ＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７も参照）
・ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）（配列番号８も参照）
・ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）（配列番号２２も参照）
好ましくは、このキットは、基準ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１）および基準ＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７）をコードする本発明の配列モチーフを同定する手段を少なくとも含む。別の実施形態において、このキットは、基準ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１）をコードする本発明の配列モチーフ、および、例えば、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）、およびＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）からなる群から選択される基準ＧｌｕＮ２Ａの本発明の配列モチーフの１つのさらなる変異体を検出する手段を少なくとも含み得る。さらなる実施形態において、このキットは、基準ＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７）をコードする本発明の配列モチーフ、および、例えば、ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）およびＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）からなる群から選択される基準ＧｌｕＮ２Ｂをコードする本発明の配列モチーフの１つのさらなる変異体を検出する手段を少なくとも含み得る。サンプルを提供する対象は、好ましくは哺乳動物であり、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、サル、ウマ、ハムスター、モルモット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどからなる群から選択される。最も好ましくは、対象はヒトである。
本明細書で使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加の他の事項の存在を除外する）という意味に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、「含む」は、場合により追加の事項が存在し得ることを意味する。「含む」という用語は、その範囲内にある特に想定される実施形態として、「からなる」（すなわち、追加の他の事項の存在を除外する）および「含むが、からなるではない」（すなわち、追加の他の事項の存在を必要とする）を包含し、前者がより好ましい。
以下、添付の図面について簡単に説明する。図面は、本発明の態様をより詳細に説明することを意図している。
発明者によって同定された本発明の配列モチーフおよびその変異体のアライメントを示す。本発明の配列コアモチーフは、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の細胞質ドメインに位置し、１８アミノ酸の長さを有し、４つの等間隔のイソロイシン残基を含む。描写されたフランキング配列はヒト配列であるが、ラットおよびマウスのＧｌｕＮ２Ａ／ＧｌｕＮ２Ｂにおいて同一に見出され得る。「－」：除去されたアミノ酸残基、太字：基準コア配列からの逸脱本発明のコア配列モチーフは、コアの１５位のＧｌｕＮ２Ａのヒスチジン残基を除いて同一であるが、ＧｌｕＮ２Ｂはこの位置にアラニン残基を示すことに留意されたい。したがって、前記ＧｌｕＮ２Ｂアラニン残基のヒスチジン残基への突然変異は、ＧｌｕＮ２Ａ配列をもたらすが、ＧｌｕＮ２Ｂフレームワーク内にあり、逆もまた同様である。Ａ）ＧｌｕＮ２Ａタンパク質およびその変異体。配列番号１は、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質における基準の本発明の配列モチーフを表す。Ｂ）ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質およびその変異体。配列番号７は、ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質における基準の本発明の配列モチーフを表す。 ＨＥＫ２９３細胞の細胞死における本発明の配列モチーフ（それぞれＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂのいずれかにおける）の欠失または点突然変異の影響を示す。Ａ）コントロール：トランスフェクトされていない細胞も、ＧＦＰまたはＧｌｕＮ１のみでトランスフェクトされた細胞も、細胞死の誘導を示さない。Ｂ）ＧｌｕＮ２Ａ：ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２Ａ（野生型受容体複合体）、ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２ＡΔ配列番号１（欠失突然変異体、配列番号４１）、ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２ＡΔ９（ＧｌｕＮ２Ａの最後の９個のＣ末端アミノ酸を欠くコントロール、本発明の配列モチーフに関連しない）、ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２Ａ＋ＭＫ－８０１（非競合的で一般的なＮＭＤＡ受容体阻害剤、ＭＫ－８０１の存在下での野生型受容体複合体）Ｃ）ＧｌｕＮ２Ｂ：ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２Ｂ（野生型受容体複合体）、ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２ＢΔ配列番号７（欠失突然変異体、配列番号４２）、ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２ＢΔ９（ＧｌｕＮ２Ｂの最後の９個のＣ末端アミノ酸を欠くコントロール、本発明の配列モチーフに関連しない）、ＧｌｕＮ１＋ＧｌｕＮ２Ｂ＋ＭＫ－８０１（非競合的で一般的なＮＭＤＡ受容体阻害剤、ＭＫ－８０１の存在下での野生型受容体複合体）ｎ．ｓ．：有意ではない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１ ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂ突然変異体が、ＧｌｕＮ１の存在下で、トランスフェクションの４８時間後にＨＥＫ２９３細胞において細胞死を誘導する能力を示す。左から右へ：ラット野生型ＧｌｕＮ２Ａ（UniProt: Q00959）、ＧｌｕＮ２ＡΔ配列番号１（配列番号４１、すなわち、配列番号１を欠く欠失突然変異体）、ＧｌｕＮ２Ａ－Ｉ２Ａ２（野生型ＧｌｕＮ２Ａ（(UniProt: Q00959）と同様であるが、置換Ｉ８６７ＡおよびＩ８７１Ａを示す（配列番号２も参照））、置換Ｉ８６３Ａ、Ｉ８６７ＡおよびＩ８７１Ａを示すＧｌｕＮ２Ａ－Ｉ３Ａ３（配列番号３を参照）、置換Ｉ８６７Ａ、Ｉ８７１ＡおよびＨ８７５Ａを示すＧｌｕＮ２Ａ－ＩＡＨＡ（配列番号２１を参照）、ラット野生型ＧｌｕＮ２Ｂ（(UniProt: Q00960）、ＧｌｕＮ２Ｂにおける本発明の１８アミノ酸配列モチーフを欠くＧｌｕＮ２ＢΔ配列番号７（配列番号４２を参照、すなわち、欠失突然変異体）、ＧｌｕＮ２Ｂ－Ｉ２Ａ２（野生型ＧｌｕＮ２Ｂ（UniProt: Q00960）と同様であるが、置換Ｉ８６８ＡおよびＩ８７２Ａを示す（配列番号２１も参照）、およびＧｌｕＮ２Ｂ－Ｉ２Ａ２ＡＨ（野生型ＧｌｕＮ２Ｂ（UniProt: Q00960）と同様であるが、置換Ｉ８６８Ａ、Ｉ８７２Ａ、およびＡ８７６Ｈを示す）＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１ ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂ変異体配列（ヒト遺伝子プールにおいて発生）が、ＧｌｕＮ１の存在下で、トランスフェクションの４８時間後にＨＥＫ２９３細胞において細胞死を誘導する能力を示す。左から右へ：ラット野生型ＧｌｕＮ２Ａ（UniProt: Q00959）、ＧｌｕＮ２Ａ－Ｉ８６７Ｍ（野生型ＧｌｕＮ２Ａ（UniProt: Q00959）と同様であるが、置換Ｉ８６７Ｍを示す、配列番号４も参照）、ＧｌｕＮ２Ａ－Ｓ８６９Ｒ（野生型ＧｌｕＮ２Ａ（UniProt: Q00959）と同様であるが、置換Ｓ８６９Ｒを示す、配列番号５も参照）、ＧｌｕＮ２Ａ－Ｉ８７６Ｎ（野生型ＧｌｕＮ２Ａ（UniProt: Q00959）と同様であるが、置換Ｉ８７６Ｎを示す、配列番号６も参照）、ラット野生型ＧｌｕＮ２Ｂ（UniProt: Q00960）、ＧｌｕＮ２Ｂ－Ｉ８７２Ｍ（野生型ＧｌｕＮ２Ｂ（UniProt: Q00960）と同様であるが、置換Ｉ８７２Ｎを示す、配列番号８も参照）、ＧｌｕＮ２Ｂ－Ｈ８７３Ｒ（野生型ＧｌｕＮ２Ｂ（UniProt: Q00960）と同様であるが、置換Ｈ８７３Ｒを示す、配列番号８も参照）＊：ｐ＜０．０５ 配列番号１の配列を含むＧｌｕＮ２Ａ由来ポリペプチド（配列番号９）、または配列番号７の配列を含むＧｌｕＮ２Ｂ由来ポリペプチド（配列番号１５）が、マウスの海馬および皮質ニューロンにおいて細胞死を誘導するのに十分である一方、突然変異体バージョン（配列番号１０、配列番号２の配列を含む、および配列番号２６、配列番号２１の配列を含む）が、細胞死を誘導することができないことを示す。＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１ ホモ・サピエンス第１６染色体についてのゲノムリファレンスコンソーシアム・ヒューマンビルド３８パッチリリース１３（GRCh38.p13）に基づく、ヒトＧＲＩＮ２ＡおよびＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子（すなわち、それぞれＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をコードする遺伝子）の可能な配列決定戦略を示す。長い矢印はＰＣＲプライマー、短い矢印は配列決定プライマーを示す。黒線は、配列番号１および配列番号７による本発明の配列領域を表す。見られるように、前記領域はイントロンによって中断されている。Ａ）ＧＲＩＮ２Ａ：ＧＲＩＮ２Ａ－１領域：９７６８６２９～９７６９１２８は、配列番号１の前半（TGVCSDRPGLLFSISR、配列番号４３）を含み、ＰＣＲ（プライマーＧＲＩＮ２Ａ－１－Ｆ、配列番号２９、およびＧＲＩＮ２Ａ－１－Ｒ、配列番号３０を用いる）は、４０５ｂｐの断片をもたらす。ＧＲＩＮ２Ａ－２領域：９７６４６８９～９７６５１８８は、配列番号１の後半（GIYSCIHGVHIEEKKKS、配列番号４４)を含み、ＰＣＲ（プライマーＧＲＩＮ２Ａ－２－Ｆ、配列番号３１、およびＧＲＩＮ２Ａ－２－Ｒ、配列番号３２を用いる）は、３６８ｂｐの断片をもたらす。Ｂ）ＧＲＩＮ２Ｂ：ＧＲＩＮ２Ｂ－１領域：１３５６６７９２～１３５６７２９１は、配列番号７の前半（MGVCSGKPGMVFSISR、配列番号４５)を含み、ＰＣＲ（プライマーＧＲＩＮ２Ｂ－１－Ｆ、配列番号３５、およびＧＲＩＮ２Ｂ－１－Ｒ、配列番号３６を用いる）は、４５５ｂｐの断片をもたらす。ＧＲＩＮ２Ｂ－２領域：１３５６４３８２～１３５６４８８１は、配列番号７の後半（GIYSCIHGVAIEERQSV、配列番号４６）を含み、ＰＣＲ（プライマーＧＲＩＮ２Ｂ－２－Ｆ、配列番号３７、およびＧＲＩＮ２Ｂ－２－Ｒ、配列番号３８を用いる）は、３９５ｂｐの断片をもたらす。
以下の特定の実施例において、本発明の実施形態および態様を説明する。しかしながら、本発明は、本明細書に記載の特定の実施例によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な変形は、前述の説明および以下の実施例から当業者に容易に明らかになるであろう。そのような変形はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれる。
≪方法と材料≫
以下の方法および材料は、他に示されない限り、後続の実施例において発明者によって使用された。
ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂをコードする遺伝子であるＧＲＩＮ１、ＧＲＩＮ２Ａ、およびＧＲＩＮ２Ｂの元のプラスミドコンストラクトは、アンドレス・バリアおよびロベルト・マリノウから寄贈された（Addgene plasmid # 45446、45445、45447）。本出願におけるすべての突然変異体は、ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発を使用して生成される。プラスミドの生成に使用したプライマーは次のとおりであった。
Figure 2023537355000003
Figure 2023537355000004
［ＨＥＫ２９３細胞培養］
ＨＥＫ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、GibcoTM、10270）、１％ピルビン酸ナトリウム（GibcoTM、11360070）、１％ＭＥＭ ＮＥＡＡ（GibcoTM、11140035）および０．５％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ－Ｓ、Sigma、P0781）を追加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GibcoTM、41965-039）で培養し、継代数１５－２５を実験に使用した。
［発光細胞毒性アッセイ］
本発明による化合物の細胞毒性を試験するために、ＨＥＫ２９３細胞（７０～８０％コンフルエント）を、それぞれ、ＧｌｕＮ１およびＧｌｕＮ２Ａ、またはＧｌｕＮ１およびＧｌｕＮ２Ｂの両方（１：１、６ｃｍディッシュあたり合計で２μｇのプラスミド）の発現ベクターでプレーティングしてから２４時間後に、製造元の指示に従ってリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした。トランスフェクション後の示された時点での集団内の死細胞の相対数を、わずかな変更を加えた製造元の指示に従って、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＧｌｏＴＭ細胞毒性アッセイ（Promega、G9290）で測定した。簡単に説明すると、全培地の１０％を１０μＬのＡＡＦ－アミノルシフェリンと混合して、水で２００μＬの最終容量に到達させ、死細胞の相対発光単位（ＤＲＬＵ）を９６ウェルの白い底のポリスチレンマイクロプレート（Corning Costar(R)、3912）中でＧｌｏＭａｘ（Promega）によって測定した。すべての測定後、溶解試薬を細胞に添加し、溶解物の１０％を全細胞相対発光単位（ＴＲＬＵ）測定に使用した。細胞死を次の方程式で計算した。
Figure 2023537355000005
［初代神経培養］
初代マウス海馬を、当業者に知られているように調製し維持した。簡単に説明すると、Ｐ０ Ｃ５７Ｂｌ／６Ｎマウスの海馬を分離し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ培地（GibcoTM、10888022）、２％無血清Ｂ２７ＴＭサプリメント（GibcoTM、17504044）、１％ラット血清（Biowest、S2150）、０．５ｍＭ Ｌ－グルタミン（Sigma、G7513）および０．５％Ｐ－Ｓからなる増殖培地（ＧＭ）に１．２＊１０５／ｃｍ２の密度でプレーティングした。グリア細胞の増殖を防ぐために、シトシンβ－Ｄ－アラビノフラノシド（AraC、Sigma、C1768、２．８μＭ）をＤＩＶ３に添加した。ＤＩＶ８から、実験に使用するまで４８時間ごとに、培地の半分を、ラット血清を含まないＧＭに交換した。実験の２４時間前に、ＧＭをトランスフェクション培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１１４ｍＭ ＮａＣｌ、２６．１ｍＭ ＮａＨＣＯ３、５．３ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、３０ｍＭグルコース、１ｍＭグリシン、０．５ｍＭ Ｃ３Ｈ３ＮａＯ３、および０．００１％フェノールレッド、および、７．５μｇ／ｍｌのインスリン、７．５μｇ／ｍｌのトランスフェリンおよび７．５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを添加したリン酸塩を含まない１０％のイーグル最小必須培地（ITS Liquid Media Supplement、Sigma-Aldrich カタログ番号I3146））に交換した。
［組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）およびコンストラクト］
ウイルス粒子を、この技術分野で知られているように生成し精製した。配列番号９（すなわち、配列番号１を含む）、配列番号１０（すなわち、配列番号２を含む）、配列番号：１５（すなわち、配列番号７を含む）、および配列番号２６（すなわち、配列番号３を含む）を発現する核酸コンストラクトを、ヒトシナプシンプロモーターによって駆動し、その自然な膜近くの分布を模倣するためにＨＡタグ（配列番号２０）およびＧＰＩアンカー（配列番号１７）に融合した。
［神経細胞死の評価］
ニューロンを、ＰＢＳ中に４％スクロースを含む４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、続いてヘキスト染色した。神経細胞死分析のために、１０倍の対物レンズ（ＮＡ０．３）と、ＶｉｓｉＶｉｅｗイメージングソフトウェア（Visitron Systems）を備えたＳＰＯＴ Ｉｎｓｉｇｈｔ １４ビットＣＣＤカメラを装備したライカＤＭＩＲＢＥ倒立顕微鏡を使用して画像が取得される。死んだニューロンを、ヘキスト染色から凝縮した丸く縮小している核として定義した。Ｃｅｌｌ ＰｒｏｆｉｌｅｒおよびＣｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアによって細胞死が分析される。
［定量化と統計］
すべての統計作業をＰｒｉｓｍ（GraphPad）によって実行した。プロットされたすべてのデータは、平均値±標準偏差を表す。特に明記しない限り、統計分析には二元配置分散分析を使用した。
［試薬］
この研究では、以下の試薬を使用した。ＭＫ－８０１マレイン酸（BN338、Biotrend）、ＤＬ－ＡＰＶ（BN0858、Biotrend）、ＮＭＤＡ（BN0385、Biotrend）。
≪ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの欠失突然変異体の生成および試験≫
ＮＭＤＡ受容体媒介毒性におけるＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂの役割を調査するために、発明者らはコンストラクトを構築し、プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に発光細胞毒性アッセイを実施した。細胞死（％）を図２に示す。
その結果、ＧＦＰもＧｌｕＮ１も単独では（どちらもコントロールとして供する）細胞死を誘導できなかった。野生型ラットＧｌｕＮ１（UniProtKB - P35439; NMDZ1_RAT; sequence version of 1 June 1994）およびＧｌｕＮ２Ａ（UniProtKB - Q00959; NMDE1_RAT; sequence version 2 of 15 Dec 1998）（後者は、配列番号１の基準配列、およびフランキング配列を含む配列番号９による配列も含む）の複合発現は、ＧｌｕＮ１およびラットＧｌｕＮ２Ａの最後の９つのＣ末端アミノ酸を欠くＧｌｕＮ２Ａ突然変異体の複合発現と同様に、ＨＥＫ２９３細胞において細胞死を誘導した。しかしながら、ＧｌｕＮ１および配列番号１の本発明の配列モチーフのみを欠くラットＧｌｕＮ２Ａ突然変異体（配列番号４１）の複合発現は、細胞死のレベルがはるかに低くなる。非競合的で一般的なＮＭＤＡ受容体阻害剤であるＭＫ－８０１の存在下におけるＧｌｕＮ１およびラットＧｌｕＮ２Ａの複合発現は、細胞死を誘発しなかった（対照実験）。同様の結果がＧｌｕＮ２Ｂについて得られた。野生型ラットＧｌｕＮ１およびＧｌｕＮ２Ｂ（UniProtKB - Q00960; NMDE2_RAT, sequence version 1 of Jun 1994）（後者は、配列番号７の基準配列、およびフランキング配列を含む、配列番号１５を参照）の複合発現は、ラットＧｌｕＮ２Ｂの最後の９つのＣ末端アミノ酸を欠く欠失突然変異体と同様に、ＨＥＫ２９３細胞において細胞死を誘導した。ＧｌｕＮ１および配列番号７の本発明の配列モチーフを欠くＧｌｕＮ２Ｂ突然変異体（配列番号４２）の複合発現は、細胞死の誘導をもたらさなかった。非競合的で一般的なＮＭＤＡ受容体阻害剤であるＭＫ－８０１の存在下におけるＧｌｕＮ１およびＧｌｕＮ２Ｂの複合発現も、細胞死を誘導しなかった。
≪ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂにおける本発明の配列モチーフの突然変異体の生成および試験≫
つぎの段階において、本発明者らは、本発明の配列モチーフにおけるイソロイシンおよび他のアミノ酸残基の重要性を評価しようとした。本発明者らは、上述の突然変異体を含むコンストラクトを構築し、プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に発光細胞毒性アッセイを実施した。細胞死（％）を図３に示す。
結果として、欠失突然変異体（ＧｌｕＮ２Ａ：配列番号１を欠く、ＧｌｕＮ２Ｂ：配列番号７を欠く）は、ＨＥＫ２９３細胞において細胞死を誘導する能力を実質的に失った。本発明の配列モチーフ（配列番号２、配列番号３および配列番号２１を参照）において変異を有するＧｌｕＮ２Ａの変異体は、少なくとも減少した毒性のレベルを示した。ＧｌｕＮ２Ｂについて、同様の突然変異は、本質的に毒性効果を排除した（配列番号２１および配列番号２を参照）。
≪ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性におけるさらなるＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂ変異体の影響の評価≫
実施例３における本発明の配列モチーフのＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂ突然変異体について得られた結果を考慮して、本発明者らはさらに、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性についてヒト遺伝子プール中の前記配列モチーフの天然に存在する変異の影響を試験した。本発明者らは、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース（ＧＲＩＮ２Ａについて、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?showRare=on&chooseRs=coding&go=Go&locusId =2903、およびＧＲＩＮ２Ｂについて、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?showRare=on&chooseRs=coding&go=Go&locusId=2904）から選択された上述の突然変異体を含むコンストラクトを構築し、プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に発光細胞毒性アッセイを実施した。細胞死（％）を図４に示す。
結果として、変異体配列を示す天然に存在する変異体配列は、ＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂタンパク質による細胞死に対する感受性に有意な影響を有する可能性がある。例えば、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質において配列番号１の代わりに配列番号６による配列を示す対象は、ＮＭＤＡ媒介細胞死に対する有意に増加した感受性を有する可能性がある。それどころか、ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質において配列番号７の代わりに配列番号８を示す対象は、ＮＭＤＡ媒介細胞死に対する有意に低下した感受性を有する可能性がある。
≪配列番号１または配列番号７によるペプチドを含む融合タンパク質はＮＭＤＡ受容体媒介毒性を誘発するのに十分である≫
つぎの段階において、本発明者らは、本発明の配列モチーフそれ自体がＮＭＤＡ受容体媒介毒性を誘発するのに十分であるかどうかを評価した。この目的のために、ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１）およびＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７）の本発明のコア領域にプラスしてフランキング領域を、組換えアデノ随伴ウイルスによる感染によってマウス海馬ニューロンにおいて発現させた。この目的のために、初代マウス海馬ニューロンを、ＤＩＶ３において、ｒＡＡＶ－配列番号９（すなわち、配列番号１を含む)、ｒＡＡＶ－配列番号１０（すなわち、配列番号２を含む)、ｒＡＡＶ－配列番号１５（すなわち、配列番号７を含む)、ｒＡＡＶ－配列番号２６（すなわち、配列番号３を含む）のいずれかに感染させた。ニューロンを、ＤＩＶ１７において固定し、ヘキスト染色し、細胞死を定量化した。結果は、配列番号１および配列番号７を含むペプチドが細胞死を誘導するのに十分であること、およびＧｌｕＮ２ＡおよびＧｌｕＮ２Ｂのコアモチーフにおけるアラニン残基の２つの突然変異が細胞死レベルをおおよそトランスフェクトされていないコントロールのレベルまで大幅に減少させることを示している（図５を参照)。したがって、この実験は、全長ＧｌｕＮ２AおよびＧｌｕＮ２Ｂ受容体で得られた結果が、重要なコアモチーフのみを使用して再現できることを示しており、したがって、コアモチーフそれ自体がＮＭＤＡ受容体媒介毒性を誘発するのに十分であると考えられる。
≪本発明による診断キットの例≫
本発明によるキットは、本質的に、ＤＮＡ父子鑑定用の標準キットと同様の様式で構成され得る。このキットは、ゲノムＤＮＡ抽出キットおよびＰＣＲ／配列決定キットを含むことができる。ゲノムＤＮＡ抽出キットは、以下のものを含む。溶解／結合バッファー、消化バッファー、洗浄バッファー１、洗浄バッファー２、溶出バッファー、リボヌクレアーゼＡ、プロテイナーゼＫ、コレクションチューブおよび追加のコレクションチューブを備えたゲノムＤＮＡ結合用のスピンカラム。ＰＣＲ／配列決定キットは、標準ＰＣＲ用の２ｘマスターミックス、および、ＰＣＲおよび配列決定用のプライマーを含む。ヒトＧＲＩＮ２Ａのターゲット領域は、以下のプライマーによって２つの領域において増幅される。
領域１（フォワード：GGGATCTGCCACAACGAGAA、配列番号２９、リバース：CTCCCGTTTCCTTTCTGCCT、配列番号３０）
領域１は、以下のプライマーにより配列決定できる（配列プライマー１：GCGTATTCTACATGCTGG、配列番号３３）。
領域２（フォワード：CCTATGCTTTGCAACTTGTCTCA、配列番号３１、リバース：TTGGATGAAGTCAGCAGCTCTT、配列番号３２）
領域２は、以下のプライマーにより配列決定できる（配列プライマー２：CAGGGCTCCTGCAAGAAG、配列番号３４）。
ヒトＧＲＩＮ２ＢのＳＮＰ検出のターゲット領域は、以下のプライマーによって２つの領域において増幅される。
領域１（フォワード：GAAGCTCTCTGGCTCACTGG、配列番号３５、リバース：AACTGCCCAAATCCCACACA、配列番号３６）
領域１は、以下のプライマーにより配列決定できる（配列プライマー３：CACAATGAGAAGAATGAGG、配列番号３９）。
領域２（フォワード：ACCTCAGCTCACCACATGAC、配列番号３７、リバース：GATGACTCCCGTCGGATGAA、配列番号３８）
領域２は、以下のプライマーにより配列決定できる（配列プライマー２：GGTATAAATTAGGCAAACT、配列番号４０）。
ＤＮＡ抽出キットが使用されるサンプルは、人間被験者から採取され、血液サンプルまたは口腔スワップであることがある。配列決定の概念を図６に示す。

Claims (16)

  1. 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらの変異体配列を含むポリペプチドであって、前記変異体配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を示し、前記ポリペプチドは、最大１２５アミノ酸長である、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６からなる群から選択される配列を含む、ポリペプチド。
  3. 請求項１または請求項２のポリペプチドと、請求項１に記載のアミノ酸配列とは異種の少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質であって、特に前記異種ポリペプチド配列は、膜固定ポリペプチドの配列、タンパク質導入ドメインの配列およびタグの配列からなる群から選択される１つまたは複数から選択される、融合タンパク質。
  4. 請求項１または２に記載のポリペプチドまたは請求項３に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
  5. 対象の癌を治療する方法に使用するための、特に神経芽細胞腫を治療するための請求項１または２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の融合タンパク質または請求項４に記載の核酸。
  6. 以下の１つまたは複数を含む細胞。
    ａ）請求項１または請求項２に記載のポリペプチド
    ｂ）請求項３に記載の融合タンパク質
    ｃ）請求項４に記載の核酸
    ｄ）組換え発現されたＧｌｕＮ２Ａタンパク質であって、前記ＧｌｕＮ２Ａタンパク質は、配列番号１の基準配列モチーフの代わりにその変異体配列を含み、または、配列番号１の前記配列モチーフが欠失しており、前記変異体配列は、配列番号１の前記基準配列モチーフを含むＧｌｕＮ２Ａタンパク質と比較して減少した毒性活性を示すＧｌｕＮ２Ａタンパク質をもたらす
    ｅ）組換え発現されたＧｌｕＮ２Ｂタンパク質であって、前記ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質は、配列番号７の基準配列モチーフの代わりにその変異体配列を含み、または、配列番号７の前記配列モチーフが欠失しており、前記変異体配列は、配列番号７の前記基準配列モチーフを含むＧｌｕＮ２Ｂタンパク質と比較して減少した毒性活性を示すＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をもたらす
  7. 請求項６に記載の細胞であって、配列番号１の前記変異体配列は、配列番号１の配列に関して変異体アミノ酸残基Ｉ３Ａ、Ｉ７Ａ、Ｉ１１Ａ、Ｈ１５Ａの１つまたは複数を示し、および／または、配列番号７の前記変異体配列は、配列番号７の配列において変異体アミノ酸残基Ｉ７Ａ、Ｉ１１Ａ、Ｈ１２Ｒ、Ａ１５Ｈの１つまたは複数を示す、細胞。
  8. ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のＣ末端細胞質ドメインに結合するが、アミノ酸の配列番号１および配列番号７に対応する領域を欠くＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂの欠失変異体には結合しない抗体、ナノボディまたはアンチカリンであって、特に前記抗体、ナノボディまたはアンチカリンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択される配列に結合する、抗体、ナノボディまたはアンチカリン。
  9. 請求項８に記載の抗体、ナノボディ、またはアンチカリンであって、前記抗体、ナノボディ、またはアンチカリンは、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を防御、誘導または改善する、抗体、ナノボディ、またはアンチカリン。
  10. ＮＭＤＡ受容体媒介毒性を研究するための、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の融合タンパク質、請求項４に記載の核酸、請求項６に記載の細胞および／または請求項８または９に記載の抗体、ナノボディまたはアンチカリンの使用。
  11. 対象のゲノム核酸試料においてＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする遺伝子）および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をコードする遺伝子）を配列決定するエクスビボ法であって、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の配列決定された前記部分配列は、配列番号１タンパク質の基準配列を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された前記部分配列は、配列番号７の基準配列を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含む、エクスビボ法。
  12. ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する対象の感受性を評価するための方法であって、前記方法は、対象のゲノム核酸サンプルにおいてＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質をコードする遺伝子）および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列（すなわち、ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質をコードする遺伝子）を配列決定することを含み、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の配列決定された前記部分配列は、ヒトＧｌｕＮ２Ａタンパク質における配列番号１の基準配列を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された前記部分配列は、ヒトＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の配列番号７の基準配列を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、
    ａ）基準ＧｌｕＮ２Ａ（配列番号１）および／または基準ＧｌｕＮ２Ｂ（配列番号７）配列を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対して通常の感受性を示し、
    ｂ）ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）変異を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性の増加を示し、
    ｃ）ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）変異を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対して通常の感受性を示し、
    ｄ）ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）変異を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性の増加を示し、
    ｅ）ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）変異を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対して通常の感受性を示し、
    ｆ）ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）変異を有する対象は、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する感受性の低下を示す、
    方法。
  13. タンパク質間相互作用アッセイにおける、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド、または請求項３に記載の融合タンパク質の使用。
  14. ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂタンパク質のＣ末端細胞質ドメインと潜在的に相互作用する化合物を同定するための方法であって、前記方法は、
    ｉ）配列番号１または配列番号７によるアミノ酸配列またはそれらの変異体への候補化合物のコンピュータ支援仮想ドッキングであって、前記変異体は、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８６７Ｍ）（配列番号４も参照）、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｓ８６９Ｒ）（配列番号５も参照）、ＧｌｕＮ２Ａ（Ｉ８７６Ｎ）（配列番号６も参照）、ＧｌｕＮ２Ｂ（Ｉ８７２Ｍ）（配列番号８も参照）、およびＧｌｕＮ２Ｂ（Ｈ８７３Ｒ）（配列番号２２も参照）から選択され、前記アミノ酸配列は、前記アミノ酸配列を含むポリペプチドの仮想三次元構造で提供される、および、
    ｉｉ）前記候補化合物を配列番号１または配列番号７による前記アミノ酸配列またはそれらの変異体に仮想的にドッキングするためのドッキングスコアおよび／または内部歪みを決定すること、および任意で、
    ｉｉｉ）ＧｌｕＮ２ＡまたはＧｌｕＮ２Ｂサブユニットをそれぞれ含むＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体をインビトロまたはインビボで前記候補化合物と接触させて、前記候補化合物が前記ＮＭＤＡ受容体の活性を調節するかどうかを決定すること、
    を含む、方法。
  15. 対象のゲノム核酸サンプルにおいてＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の部分配列および／またはＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の部分配列の配列を決定するための手段を含むキットであって、ＧＲＩＮ２Ａ遺伝子の配列決定された前記部分配列は、ＧｌｕＮ２Ａタンパク質の配列番号１の基準配列を通常コードする遺伝子領域を少なくとも含み、ＧＲＩＮ２Ｂ遺伝子の配列決定された前記部分配列は、ＧｌｕＮ２Ｂタンパク質の配列番号７の基準配列を通常コードする遺伝子領域を含み、特に前記キットは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、および配列番号４０からなる群から選択されるプライマーを含む、キット。
  16. 細胞にＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対する耐性を高める核酸を提供する方法であって、前記方法は、
    ｉ）前記細胞において、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより高い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２Ｂゲノム配列を、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより低い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２Ｂ配列で置換すること、または、
    ｉｉ）前記細胞におけるＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより高い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２ＢのｍＲＮＡ転写物の、ＮＭＤＡ受容体媒介毒性に対するより低い感受性に関連するＧＲＩＮ２Ａおよび／またはＧＲＩＮ２ＢのｍＲＮＡ配列への部位特異的ｍＲＮＡ編集、
    を含む、方法。
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