KR102074590B1 - 자가포식체 탐침용 프로브 및 이를 이용한 탐침 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가포식체의 형성 및 분포 양상을 확인하기 위하여, PI3P와 결합을 형성하는 RavZ 단백질의 Membrane targeting(MT) 서열, LIR 서열 및 리포터 형광 단백질의 유전자를 포함하는 자가포식체 검출용 프로브 및 이를 이용하여 자가포식체의 형성 및 분포 양상을 확인하는 검출 방법에 대한 것이다.

Description

자가포식체 탐침용 프로브 및 이를 이용한 탐침 방법{Probe for autophagy and detecting method using the same}

본 발명은 자가포식체의 형성과 분포를 확인하기 위하여, PI3P와 결합을 형성하는 RavZ 단백질의 Membrane targeting(MT) 부위 및 리포터 형광 단백질과, LC3/GABARRP과 결합하는 LIR 서열을 포함하는 자가포식체 검출용 프로브 및 이를 이용한 자가포식체의 형성 및 분포의 검출 방법에 대한 것이다.

자가포식(autophagy) 현상은 기아상태 생존, 감염성 세균으로부터의 보호 및 신경붕괴조절과 같은 세포 기능을 하는데 중요한 역할을 하는데, 이는 진화적으로 보존된 과정으로, 이스트에서 포유류에 이르기까지 모든 진핵세포에서 나타난다.

지금까지 밝혀진 바에 의하면, 자가포식은 유도단계(induction/nucleation), 세포막 변형단계(membrane elongation/closure) 및 포식단계(vesicle trafficking/maturation/fusion/degradation)의 세 가지 단계로 크게 구분된다고 알려져 있다. 초기에는, 세포질 및 세포 내 기관들은 오토파고좀(autophagosome)이라는 이중막 결합 구조로 퇴화하고, 상기 퇴화된 오토파고좀은 리소좀(lysosome)과 융합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하며, 상기 오토리소좀에 의해 퇴화된 물질이 가수분해되어 재사용된다. 그러나, 이러한 과정에 내재한 분자적 작용기작은 아직 명확하게 밝혀지지 않았기 때문에 이를 규명하기 위한 연구가 활발히 진행중이다.

효모, 초파리 등을 대상으로 수행된 다양한 유전학/생화학적 연구를 통하여 세포 내에서 자가포식(autophagy) 현상을 일으키는데 필요한 단백질들이 발굴되었고, 이들의 상관관계를 분석하기 위한 연구가 수행되었다. 이러한 자가 포식에 대한 연구가 근래 다양한 동물모델 및 질병의 유전자 분석 연구를 통하여 자가포식과정이 당뇨, 고혈압등의 대사성 질환, 퇴행성 뇌질환, 감염성 질환, 그리고 암 등의 매우 다양한 질환에서 중요한 역할을 하고 있음이 보고됨으로써 그 중요성이 부각되고 있다. 따라서 자가포식(autophagy) 작용에 대한 정보를 수득하는 방법은 새로운 작용점을 타겟으로 하는 질병치료제 개발에 매우 중요한 역할을 할 수 있을 것이다.

RavZ 단백질은 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)로부터 유래된 단백질로서, 숙주세포의 자가포식작용을 방해하는 기능을 수행하는 것으로 알려져 있고, 자가포식체에 결합하는 부위(LIR, LC3-interacting region)를 포함하고 있어, 이를 이용하여 자가포식체를 타겟팅할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한 RavZ는 PI3P(phosphatidylinositol-3-phosphate)의 결합 서열을 포함하고 있는데, PI3P는 세포 내 초기 엔도좀(소낭)에 대한 마커로 알려져 있고, 초기의 자가소포체 형성에도 중요한 역할을 수행하며, 자가포식을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다(Levine, B, and Klionsky, DJ (2004) Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy Dev Cell 6, 463-477). 따라서, 본 발명자들은, 자가포식체 타겟팅 부위와 RavZ 유래의 초기 엔도좀 마커인 PI3P(phosphatidylinositol-3-phosphate)에 대한 결합 서열을 활용하여 기존의 탐침보다 기능이 향상된 자가포식체 탐침에 대한 본 발명을 완성하였다.

1. 특허 출원 제 10-2016-7032300 호 2. 특허 출원 제 10-2012-7004431 호

Kwon, et al. The 1:2 complex between RavZ and LC3 reveals a mechanism for deconjugation of LC3 on the phagophore membrane.

본 발명의 목적은 탐침 능력이 향상된 RavZ 단백질 유래 서열 및 LIR 서열을 포함하는 자가포식체 탐침용 프로브를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 자가포식체의 형성 및 분포 양상을 검출하는 방법으로서, 상기 프로브를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 RavZ 유래의 LIR 서열, PI3P와 결합을 형성하는 RavZ 단백질의 막 결합(Membrane targeting, MT)) 서열 및 리포터 형광 단백질의 유전자 서열을 포함하는 자가포식체 검출용 프로브를 제공한다. 또한, 본 발명의 상기 프로브는 RavZ의 촉매 서열이 삭제되어 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 프로브는 도 1A의 모식도에 나타난 바와 같이 표현할 수 있으며, 도 1A와 같이 제작된 프로브를 RavZ(Δcat)-GFP로 표현할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명의 프로브는, N-말단에 RavZ 단백질 내에 존재하는 도메인 중, 자가포식체에서 기능하는 핵심 단백질인, LC3/GABARAP 단백질과 결합하는 LIR(LC3-intracting region)서열, 세포질에 존재하는 PI3P에 결합하는 막 결합 (MT) 서열(RavZ(MT)) 및 리포터 형광 단백질을 포함하며, RavZ 단백질 내에 효소로 작용하는 부위를 제거하여 자가포식체를 분해시키지 않고, 효과적으로 자가포식체를 타겟팅할 수 있다.

상기 프로브는 RavZ 단백질로부터 유래된 서열을 이용하였으며, LIR 서열을 포함하고, 상기 LIR 서열은 LC3/GABARAP 단백질과 결합할 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 RavZ 단백질 N-말단의 LIR1/2 또는 C-말단에 존재하는, LIR3를 이용하여 프로브를 제작하였다. 본 발명의 프로브는 상기 LIR 서열을 1이상 포함하며, LIR 서열이 없는 경우, 자가포식체에 대한 타겟팅이 이루어지지 않는다.

즉, 본 발명의 프로브는 LIR 서열을 1이상 포함하며, RavZ 단백질의 PI3P 서열, 그리고 리포터 형광 단백질의 서열을 포함하며, 상기 RavZ 단백질은 효소 기능 부위가 제거된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 리포터 단백질의 예로는 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein; mGFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP), 변형된 적색 형광 단백질(modified red fluorescent protein; mRFP) 등이 있으며, 바람직하게는 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP) 또는 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)이 사용될 수 있다. 본 발명의 프로브는 상기 리포터 단백질을 포함함으로 인하여 세포를 유지한 상태에서 직접 자가포식소체의 형성 및 분포 양상을 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자가포식소체의 형성 및 분포를 검출하는 방법으로서, 상기 프로브를 이용하는 방법을 제공한다.

보다 구체적으로, 본 발명의 자가포식소체의 검출 방법은, 본 발명의 프로브( RavZ(Δcat)-GFP)를 세포에서 발현하면 자가포식체에 타겟팅되는 특징을 이용한 것이다. 즉, 상기 프로브가 세포 내에서 표지하고 있는 부분을 확인하기 위하여, 제작된 프로브와 함께 라파마이신 및 염화암모늄(NH₄Cl)을 이용하여 자가포식체 형성을 유도 후 관찰한 결과, 자가포식체가 형성된 부분에 대한 타겟팅이 이루어진 것을 알 수 있었다. (도 1B 및 도 1D)

즉, LC3/GABARAP 패밀리 단백질과, 본 발명의 프로브를 각각 다른 형광으로 표지하고, 세포 내에서 자가포식체 형성을 유도하여 LC3/GABARAP 패밀리 단백질 및 본 발명의 프로브의 결합 양상 및 분포 등을 관찰하며, 형광 색상의 세기 및 위치의 변화로 인하여 자가포식체의 형성 및 분포 양상을 확인할 수 있다. 필요에 따라, 본 발명의 프로브를 구성하는 LIR 서열은 치환할 수있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 ULK2(unc-51-like kinase 2) 유래의 LIR 서열을 포함하도록 프로브를 제작함으로서 다른 LC3/GABARAP 패밀리 단백질과 결합할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과는, 자가포식체의 연구를 위하여 다양한 LIR 서열을 본 발명의 프로브에 도입하여 활용할 수 있다는 가능성을 보여주는 것이다.

본 발명은 RavZ 단백질 유래 서열을 이용한 자가포식체 검출용 프로브로서, RavZ 단백질의 LIR 서열 및 PI3P 결합 부위(MT)를 포함하며, 효소 작용 부위가 리포터 형광 단백질로 치환되어 자가포식체를 분해하지 않고 효과적으로 검출할 수 있는 기능을 가진다.

도 1은 본 발명의 RavZ(Δcat)-GFP의 제작을 위한 모식도 및 본 발명의 프로브가 자가포식체를 탐침할 수 있음을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 RavZ(Δcat)-GFP 프로브의 다양한 제작 예를 나타낸 것이며, 본 발명의 프로브가 기능하기 위한 서열을 확인하기 위한 것으로서, LIR 및 RavZ(MT)를 포함하는 다양한 프로브 및 이의 탐침 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 ULK2 유래의 LIR 서열로 치환된 프로브 및 이를 통하여 확인한 LC3/GABARAP 탐침 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 RavZ 단백질 유래의 서열을 이용한 자가포식체 프로브로서, 상기 단백질의 PI3P 서열 및 LIR 서열을 포함하면서, 효소 작용 부위가 리포터 형광 단백질로 치환된 것을 특징으로 하는 프로브에 대한 것이다.

"자가포식(Autophagy)은 라이소좀-의존 방식으로 세포내 구성물질을 변동, 조정하는 과정으로, 결함이 있는 거대 단백질 복합체 및 세포내 소기관을 제거하여, 세포 성장, 생존 및 항상성에 중요한 역할을 한다. 자가포식은 손상된 단백질 및 세포 소기관의 세포내 변동을 통한 세포 항상성의 유지를 위한 중요한데, 그 결과, 자가포식현상이 저하될 경우, 변성단백질(misfolded protein)의 축적이 초래되어 이로 인해 신경변성질환이 발생한다(Komatsu et al., (2006), Nature, 441, 880-884). 본 발명의 “자가포식체”는 상기 자가포식 작용에 의하여 생성되는 것으로, 본 발명의 프로브는 상기 자가포식체를 탐침하는 기능을 포함하고 있다.

본 발명에서 "프로브(탐침)(probe)"란 세포 내 소낭을 다른 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 세포 내 소낭(엔도좀)의 형성 및 분포에 의하여 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 다당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

"프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수개 염기 내지 길게는 수백 개 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단일가닥 DNA 프로브, 이중가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해분야에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

"단백질"은 또한 기준 단백질과 본질적으로 동일한 생물 활성 또는 기능을 보유하는, 단백질의 단편, 유사체 및 유도체를 포함하는 것이다.

"형질전환, 형질감염 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다. 그리고 외부 DNA 등이 도입된 세포 등을 '형질전환체'라고 한다.

" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.

"표지" 또는 "라벨"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 프로브는 RavZ 단백질 내에 존재하는 도메인 중, LC3/GABARAP 단백질 결합부위(LIR), 세포질에 존재하는 PI3P에 결합하는 막 결합 (MT) 부위(RavZ(MT)) 및 리포터 형광 단백질을 포함한다. 상기 형광 단백질은 RavZ의 효소 작용 부위에 치환되어 포함되는 것으로서, 본 발명의 프로브는 RavZ 단백질의 효소 작용부위가 제거된(Δcat) 특징을 가진다. 상기 제거된 효소 작용부위는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

상기 LIR 부위는 LC3/GABARAP에 결합하는 서열로서, 본 발명의 일 실시예에서 확인한 RavZ 단백질의 N-말단에 존재하는 LIR1/2 또는 C-말단에 존재하는 LIR3 을 포함할 수 있다.

아울러, 상기 LIR 서열은 타겟하는 LC3/GABARAP의 종류에 따라 다른 것으로 치환하여 적용될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 ULK2 유래의 LIR 서열로 치환하여 프로브를 제작할 경우, 이는 GABARAP 패밀리에 속하는 GABARAP/GABARAP-L1/GABARAP-L2와 결합하는 탐침이 될 수 있다는 점을 확인하였다. (도 3)

즉, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 LIR서열은 ATG13, FYCO1, NBR1, Nix/Bnip3L, p62, TP53INP1, TP53INP2/DOR, ULK1, ULK2, Optineurin, FUNDC1, TBC1D5 LIR1, TBC1D5 LIR2, c-Cbl, β-catenin, Dvl2, MAP15K, Bnip3, ATG4B, Tax1bp1/T6BP, Stbd1, NDP52, Calreticulin, Clathrin HC, FIP200 및 TBC1D25로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 서열번호 2 내지 5의 LIR 서열을 포함하는 프로브를 제작하였다. 서열번호 2 및 3은 RavZ 단백질의 N-말단 부위에 존재하는 LIR 서열이며, 서열번호 4는 RavZ 단백질의 C-말단에 존재하는 LIR 서열이다. 또한, 서열번호 5의 LIR 서열은 ULK2로부터 유래된 LIR 서열로서, 본 발명의 프로브는 목적하는 LC3/GABARAP 의 종류에 따라 LIR 부위를 선택하여 포함할 수 있다.

상기 RavZ 단백질은 레지오넬라 뉴모필라(legionella pneumophila)로부터 유래된 단백질로서, 자가포식소체 막 단백질에 직접 결합하여 이를 제거함으로써, 자가포식작용을 억제하는 역할을 한다고 알려져 있다. RavZ 단백질로부터 유래된 PI3P 막 결합(MT) 부위는 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 아울러, RavZ 단백질로부터 유래된 본 발명의 LIR 부위는 이에 제한되는 것은 아니나, 서열번호 2 및 3의 서열을 포함하는 N 말단의 LIR1/2 또는 서열번호 4의 서열을 포함하는 아미노산 서열인, C 말단의 LIR3일 수 있으며, 상기 아미노산 서열을 코디하는 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 LIR 부위는 목적에 따라 다른 서열로 치환되어 적용될 수 있으며, 본 발명의 프로브에서 사용될 수 있는 LIR 부위가 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 프로브에서, 제거되어야 하는 효소 작용 부위는 RavZ 단백질의 49 내지 325번째 아미노산 서열(서열번호 1)을 포함하는 부위를 말한다. 상기 효소 작용 부위를 삭제한 자리에 리포터 형광 단백질을 포함할 수 있으며, 효소 작용 부위를 제거함으로 인하여 본 발명의 프로브가 자가포식체를 분해하는 RavZ 단백질 본래의 기능을 하지 않게 됨으로서, 효과적인 탐침으로서 이용될 수 있는 것이다.

또한 본 발명의 프로브에 포함되는 상기 유전자 또는 단백질들은 야생형(wild type) 뿐만 아니라 이의 결실, 삽입, 비보전적 는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의한 변이체를 포함한다.

상기 단백질 등을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 염기서열을 참조하여 이의 말단 부분에 상보적인 올리고뉴클레오타이를 삭제한 후 이를 프라이머로 하고 특정한 세포의 지노믹 DNA나 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 단백질과 기능적 동등물인 경우를 모두 포함한다. '기능적 동등물'이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 원래 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90%이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성'이란 자식작용 메커니즘에 관여하는 각 단백질들의 활성을 의미한다.

본 발명의 프로브는 자가포식체의 세포 내 수준을 검출하기 위해서 리포터 유전자로서 형광 단백질을 융합시켜 발현시킬 수 있다. 상기 리포터 형광 단백질 유전자는 그 업스트림(upstream)의 프로모터 활성에 따라 유전자가 발현되어 세포 내에서 그 발현 여부를 확인할 수 있다. 리포터 형광 단백질의 예로는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP) 및 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase), 적색 형광 단백질(DsRed) 등을 포함하나 상기 예에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)을, 가장 바람직하게는 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP) 및 변형된 적색 형광 단백질(mRFP)을 리포터 단백질로서 사용한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 리포터 형광 단백질은 서열번호 7의 EGFP를 포함하여 프로브를 제작하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 자가 포식체 검출용 프로브 서열을 포함하는, 세포 내 소낭 검출용 재조합 벡터에 관한 것이다.

상기 벡터는 예를 들어, 상기 프로브에 함유되어 있는 유전자 각각을 포함할 수도 있고 이들이 융합된 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수도 있다.

상기 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c)외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커 (linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션 (ligation)할 수 있다.

상기 "작동 가능하게 연결된"이란, 본 발명의 프로모터 서열의 다운스트림에 유전자가 연결될 때, 해당 유전자의 발현이 가능한 형태로 연결되는 것을 의미하며, 상기 목적을 달성하기 위하여 임의의 서열이 추가로 포함될 수 있다. 상기 임의의 서열을 예로 들면, 오퍼레이터(operator) 서열, 인프레임(in frame)을 위한 서열 등이 있으며, 또한 본 발명의 유전자 이외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 유전자, 암피실린 저항 유전자, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 유전자 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되기 위한 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아니다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 프로브 또는 상기 벡터를 포함하는, 자가포식체 형성 및 분포 양상을 파악하기 위한 자가포식체 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일시시예에 있어서, 상기 검출은 리포터 형광 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법으로 수행될 수 있다. 상기 '발현 수준 측정'이란, mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 모두 포함한다. mRNA 발현수준 측정을 위한 분석 방법으로는 역전사중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으며, 형광단백질을 직접 관찰하기 위한 이미징 방식으로서, 형광 이미지를 수득하기 위한 레이져 스캐닝 현미경 등을 이용할 수 있으며 방식에 제한되는 것은 아니다.

이 때, 사용되는 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 상기 프라이머는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있고, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다.

또한 상기 단백질 발현수준 측정은 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 다른 측면에서 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다. 상기 형질 전환 방법은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 열 충격 방법(heat shock method), 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun), 실리콘 탄화물 위스터(silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 및 PEG(polyethylenglycol)를 이용한 침전법, 자연 도입 방법 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 벡터를 도입하는 방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 형질감염(형질전환)에 이용되는 세포주는 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포주인 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N.et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.

1. 세포 배양, 형질감염, 약물 처리 및 세포 이미징

HEK293T 세포 또는 HeLa 세포 또는 MEFs를 세포배양 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium [DMEM]: 10% [v/v] FBS 및 페니실린/스트렙토마이신 보충)에서 5% (v/v) CO₂ 를 함유하는 습한 대기 및 37℃에서 성장시켰다. 일차 신경세포 배양을 수행하였다.

혈청 기아(serum starvation)를 위해, HeLa 세포 또는 MEFs를 FBS 없이 세포 배양 배지에서 24 h 동안 배양시켰다. 상기 세포들을, 칼슘 포스페이트 방법 또는 리포펙타민 2000(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 중 어느 하나를 이용하여 DNA 구조물로 형질 감염시키고 24시간 동안 배양하였다.

형광 이미지들을 공초점 레이저-스캐닝 현미경(Radiance 2000, Zeiss)으로 수득하고 NIH Image J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 분석하였다.

자식작용(autophagy)을 유도하기 위해, WT HeLa 세포, atg5-/- HeLa 세포, atg7-/- HeLa 세포 및 WT MEFs를, 10 nM 라파마이신으로 세포 유형 및 실험에 따라 10 mM NH₄Cl 존재 하에서 4시간 동안 배양하였다.

2. RavZ(Δcat) 프로브 제작

RavZ 의 효소 작용 부위를 제거하고(Δcat) 이를 형광 단백질로 치환한 탐침을 제작하였다. 먼저, PI3P와 결합을 형성하는 RavZ 단백질의 막 결합(Membrane targeting, MT)) 서열인 서열번호 6의 아미노산 서열, N 말단 방향에 포함되는 서열번호 2 및 3을 포함하는 LIR1/2 서열 및 C 말단 방향에 포함되는 서열번호 4의 LIR3 서열을 포함하도록 프로브를 제작한 후, 효소 작용 부위인 서열변호 1의 아미노산 서열을(RavZ 단백질 중 49 내지 325번째 아미노산 서열) EGFP 서열(서열번호 7)로 치환하여, 자가포식체에 대한 효소의 작용을 제거하고 형광 표지가 가능한 프로브를 제작하였다. 도 1에 상기 제작에 대한 모식도를 표시하였다.

3. LC3/GABARAP 패밀리와 결합성 확인

RavZ 단백질 서열을 이용한 본 발명의 프로브가 LC3/GABARAP 패밀리 단백질과 결합하여 이들을 탐침할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 다양한 LC3/GABARAP 패밀리 단백질에 mRFP를 융합시켜 실험예 1에서 배양한 mouse embryonic fibroblast (MEF) 세포 내에서 본 발명의 프로브와 함께 발현하여 이의 결합 여부를 확인하였다. LC3/GABARAP 패밀리 단백질들이 자가포식체로 가는 것을 방지하기 위해 C-말단의 인지질인 PE가 결합해 막에 위치하는 것을 차단하는 기능을 포함하도록, 글리신을 알라닌으로 치환한 돌연변이체 LC3/GABARAP 패밀리 단백질을 사용하였다.

실시예 2에서 제작된 RavZ(Δcat) 탐침에는 형광단백질인 GFP를 융합하여 EGFP-RavZ(Δcat)(서열번호 8)를 제작하였으며, 상기 LC3/GABARAP 패밀리 단백질인 LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAP-L1, GABARAP-L2 각각에 mRFP를 결합하여 세포 내 발현 시킨 후, 10 mM 라파마이신 및 10 mM NH₄Cl을 처리하여 자가포식체 형성을 유도한 후, 세포 내 co-localization을 형광 이미지 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2B에서 보듯이, 자가포식체 형성을 유도하기 전에는 각각의 형광이 세포질에서 고르게 분포하고 있으나(좌), 자가포식체 형성을 유도한 후에는 탐침이 자가포식체에 타겟팅 되어 있음을 확인하였다.(우)

또한, 상기 탐침을 HeLa 세포 또는 MEF 세포에서 발현하고 10 mM 라파마이신 및 10 mM NH₄Cl을 처리하여 자가포식체 형성을 유도한 후, 리소솜 마커인 LysoTracker를 이용하여 염색한 결과, co-localization 됨을 확인하였다.(도 2C) 이와 같은 결과는 본 발명의 탐침이 효소 작용 부위가 제거되어 자가포식체와 리소좀이 결합하여 오토리소좀(autolysosome)을 형성하는 과정을 방해하지 않음을 확인한 것이다.

본 발명의 프로브가 자가포식체를 탐침하는지 여부를 확인하기 위한 실험으로서, 자가포식체가 형성되지 않는 ATG5(-/-), ATG7(-/-) 결핍 HeLa세포에 본 발명의 탐침을 발현시킨 후, 자가포식체 형성을 유도하여 탐침이 발현되는 위치를 확인하였다. 도 2D에서 보듯이, WT Hela 세포에서는 자가포식체로 보이는 소포에 타겟팅하여 발현되나, ATG5(-/-), ATG7(-/-) 결핍 HeLa세포에서는 세포질에 위치하고 있음을 확인하였다. 즉, 이는 본 발명의 프로브가 자가포식체를 검출하는 탐침으로 작용하는 것을 확인한 결과이다.

4. 프로브의 기능을 위한 부위 확인

본 탐침내에 존재하는 N-말단의 LC3-intracting region (LIR)1/2 부위와 C-말단에 존재하는 LIR3부위와 인지질 중에 하나인 PI3P에 결합하는 membrane targeting (MT) 부위를 각각 없앤 프로브 돌연변이를 이용해 자가포식체 타기팅을 수행하였다. MEF 세포에 다양한 프로브 돌연변이체를 mRFP-LC3B와 함께 발현시킨 후, 라파마이신 및 NH4Cl을 처리하여 자가포식체 형성을 유도하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.

먼저 RavZ(Δcat)GFP는 N 말단 및 C 말단의 LIR1/2 및 LIR3을 모두 포함하는 탐침이며, 효과적으로 자가포식체를 타겟팅하는 결과를 확인하였다.

상기 프로브로부터 C 말단의 LIR(LIR3)을 삭제한 RavZ(Δcat, ΔC)GFP, N 말단의 LIR(LIR1/2)를 삭제한 RavZ(Δcat, ΔN)GFP는 RavZ(Δcat)GFP보다 약하지만 모두 자가포식체에 대한 타겟팅이 이루어짐을 확인할 수 있었다. 그러나, LIR 서열을 모두 포함하지 않는 탐침 (RavZ(MT)-GFP)과, MT 서열을 포함하지 않은 탐침의 경우, 자가포식체에 대한 타겟팅이 이루어지지 않았다. 이와 같은 결과로부터, 본 발명의 프로브는 PI3P 결합하는 MT 부위 및 최소한 1 이상의 LIR 서열을 포함하여야 자가포식체에 대한 타겟팅 기능을 가질 수 있음을 확인하였다.

5. LIR서열에 따른 자가포식체 검출 효과 확인

본 발명의 프로브의 N 말단 및 C 말단의 LIR 부위를 새로운 LIR부위로 치환하여 새로운 탐침을 제작하였다. LIR 부위는 LC3/GABARAP 패밀리에 속하는 패밀리단백질의 종류에 따라 결합하는 서열이 다르기 때문에, 목적에 따라 치환하여 사용할 경우, 다양한 LC3/GABARAP 패밀리 단백질에 대한 탐침으로 활용할 수 있다.

서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 ULK2 유래의 LIR서열을 이용하여 RavZ(Δcat)GFP를 제작하여, 상기 실험에 3과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 새롭게 제작된 프로브는 LC3A, LC3B, LC3C와는 결합하지 않고, GABARAP, GABARAP-L1 및 GABARAP-L2과 결합을 하여, 이를 탐침하는 프로브로서 활용 가능한 점을 확인하였다. (도 4)

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Kyungpook National University Industry- Academic Cooperation Foundation Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation <120> Probe for autophagy and detecting method using the same <130> PN1807-232 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 277 <212> PRT <213> legionella pneumophila <400> 1 Ser Ile Tyr Pro Pro Glu Thr Ser Trp Glu Val Asn Lys Gly Met Asn 1 5 10 15 Ser Ser Arg Leu His Lys Leu Tyr Ser Leu Phe Phe Asp Lys Ser Ser 20 25 30 Ala Phe Tyr Leu Gly Asp Asp Val Ser Val Leu Glu Asp Lys Pro Leu 35 40 45 Thr Gly Ala Tyr Gly Phe Gln Ser Lys Lys Asn Asp Gln Gln Ile Phe 50 55 60 Leu Phe Arg Pro Asp Ser Asp Tyr Val Ala Gly Tyr His Val Asp Ala 65 70 75 80 Lys Ser Asp Ala Gly Trp Val Asn Asp Lys Leu Asp Arg Arg Leu Ser 85 90 95 Glu Ile Ser Glu Phe Cys Ser Lys Ala Thr Gln Pro Ala Thr Phe Ile 100 105 110 Leu Pro Phe Val Glu Met Pro Thr Asp Ile Thr Lys Gly Val Gln His 115 120 125 Gln Val Leu Leu Thr Ile Ser Tyr Asp Pro Lys Ser Lys Gln Leu Thr 130 135 140 Pro Thr Val Tyr Asp Ser Ile Gly Arg Asp Thr Tyr Ser Glu Ser Leu 145 150 155 160 Ser Ser Tyr Phe Lys Gly Lys Tyr Arg Thr Thr Cys Asp Glu Ile Leu 165 170 175 Thr Gln Ser Ile Glu Lys Ala Ile Lys Ser Thr Asp Phe Thr Leu Gly 180 185 190 Lys Phe Thr Arg Ala Ala Tyr Asn His Gln Asn Arg Leu Thr Glu Gly 195 200 205 Asn Cys Gly Ser Tyr Thr Phe Arg Thr Ile Lys Glu Val Ile Ser Ser 210 215 220 Ser Ala Gln Gly Thr Glu Val Lys Ile Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Thr 225 230 235 240 Ser Asn Ser Tyr Leu Thr Ser Gln His Val Gln Asp Ile Glu Ser Cys 245 250 255 Ile Lys Tyr Arg Asn Leu Gly Val Val Asp Ile Glu Ser Ala Leu Thr 260 265 270 Glu Gly Lys Thr Leu 275 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Legionella pneumophila <400> 2 Phe Glu Glu Leu 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Legionella pneumophila <400> 3 Phe Asp Leu Leu 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Legionella pneumophila <400> 4 Phe Val Thr Ile 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Human ULK2 <400> 5 Phe Val Leu Val 1 <210> 6 <211> 105 <212> PRT <213> Legionella pneumophila <400> 6 Pro Val Gln Leu Ser Glu Phe Ile Val Ala Leu Glu Asp Tyr Gly Lys 1 5 10 15 Leu Arg Ser Gln Gln Ser Glu Lys Ser Met Leu Asn Phe Ile Gly Tyr 20 25 30 Ser Lys Thr Ala Lys Leu Thr Ala Val Glu Leu Leu Ile Gly Ile Leu 35 40 45 Asn Asp Ile Lys Gly Lys Asn Glu Ile Ser Glu Ser Gln Tyr Asp Lys 50 55 60 Leu Val Lys Glu Val Asp Cys Leu Met Asp Ser Ser Leu Gly Lys Leu 65 70 75 80 Val Gln Phe His Leu Lys Asn Leu Gly Ala Glu Ser Leu Gln Lys Leu 85 90 95 Val Leu Pro Cys Val Lys Phe Asp Asp 100 105 <210> 7 <211> 239 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> EGFP sequence <400> 7 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 8 <211> 476 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RavZ deleted CATALASE-EGFP probe <400> 8 Met Lys Gly Lys Leu Thr Gly Lys Asp Lys Leu Ile Val Asp Glu Phe 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gly Glu Gln Glu Ser Asp Ile Asp Glu Phe Asp Leu Leu 20 25 30 Glu Gly Asp Glu Lys Leu Pro Gly Asp Ser Glu Leu Asp Lys Thr Thr 35 40 45 Gly Thr Ala Gly Pro Gly Ser Ile Ala Thr Met Val Ser Lys Gly Glu 50 55 60 Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp 65 70 75 80 Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala 85 90 95 Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu 100 105 110 Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln 115 120 125 Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys 130 135 140 Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys 145 150 155 160 Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp 165 170 175 Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp 180 185 190 Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn 195 200 205 Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe 210 215 220 Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His 225 230 235 240 Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp 245 250 255 Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu 260 265 270 Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile 275 280 285 Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Leu Glu Pro Val Gln Leu Ser 290 295 300 Glu Phe Ile Val Ala Leu Glu Asp Tyr Gly Lys Leu Arg Ser Gln Gln 305 310 315 320 Ser Glu Lys Ser Met Leu Asn Phe Ile Gly Tyr Ser Lys Thr Ala Lys 325 330 335 Leu Thr Ala Val Glu Leu Leu Ile Gly Ile Leu Asn Asp Ile Lys Gly 340 345 350 Lys Asn Glu Ile Ser Glu Ser Gln Tyr Asp Lys Leu Val Lys Glu Val 355 360 365 Asp Cys Leu Met Asp Ser Ser Leu Gly Lys Leu Val Gln Phe His Leu 370 375 380 Lys Asn Leu Gly Ala Glu Ser Leu Gln Lys Leu Val Leu Pro Cys Val 385 390 395 400 Lys Phe Asp Asp Thr Ile Asp Asp Phe Val Thr Ile Glu Lys Asp Glu 405 410 415 Leu Phe Asp Val Pro Asp Ile Thr Gly Glu Glu Leu Ala Ser Lys Lys 420 425 430 Gly Ile Glu Gln Gly Ala Leu Asp Lys Glu Ala Leu Leu Lys Gln Lys 435 440 445 Gln Ile Lys Thr Asp Leu Leu Asp Leu Arg Glu Glu Asp Lys Thr Gly 450 455 460 Leu Lys Lys Pro Leu His Gly Gly Ile Lys Val Lys 465 470 475

Claims (11)

1. RavZ 유래의 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 LIR 1, 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 LIR 2 및 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 LIR3로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 LIR 서열;
   PI3P와 결합을 형성하는 RavZ 단백질의 서열번호 6의 아미노산으로 이루어진 Membrane targeting(MT) 서열; 및
   서열번호 7의 아미노산으로 이루어진 리포터 형광 단백질의 서열을 포함하는 자가포식체(Endosome) 검출용 프로브.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 프로브는 RavZ의 효소 작용 부위인 서열번호 1의 아미노산 서열을 제거한 것을 특징으로 하는 자가포식체 검출용 프로브.
5. 제4항에 있어서,
   상기 RavZ의 효소 작용 부위가 제거된 부위에, 형광 단백질 발현 유전자 서열을 포함하는, 자가포식체 검출용 프로브.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 리포터 형광 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(modified green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 변형된 적색 형광 단백질(mRFP), 청색 형광 단백질(BFP), 증강된 청색 형광 단백질(EBFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 형광 단백질(EYFP), 남색 형광 단백질(CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질(ECFP) 및 레닐라 루시퍼라제(Renila luciferase) 및 적색 형광 단백질(DsRed)을 포함하는 군으로부터 선택된 1이상의 것임을 특징으로 하는 자가포식체 검출용 프로브.
7. 제1항에 있어서,
   상기 프로브는 자가포식체의 형성 및 분포 양상을 파악하기 위한 것인, 자가포식체 검출용 프로브.
8. 제1항에 있어서,
   상기 프로브는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 자가포식체 검출용 프로브.
9. 제1항의 자가포식체 검출용 프로브 또는 이를 함유하는 벡터를 포함하는 자가포식체 검출용 조성물.
10. PI3P와 결합을 형성하는 RavZ 단백질의 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 Membrane targeting(MT) 서열;
    RavZ 유래의 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 LIR 1, 서열번호 3의 아미노산으로 이루어진 LIR 2 및 서열번호 4의 아미노산으로 이루어진 LIR3로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 LIR 서열이 결합된 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 프로브를 제작하는 단계;
    상기 프로브에 서열번호 7의 아미노산으로 이루어진 형광 단백질 서열을 추가로 결합하여 프로브를 제작하는 단계;
    상기 프로브를 세포 내에서 발현시키는 단계; 및
    상기 세포에 라파마이신 및 NH4Cl을 처리하는 단계를 포함하는, 자가포식체의 탐침 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 탐침 방법은 전자현미경을 통한 형광 이미지 분석을 이용하는 것을 특징으로 하는, 자가포식체의 탐침 방법.

Images