CN107531780A - 抗‑Rho GTPase的构象单域抗体及其用途 - Google Patents

抗‑Rho GTPase的构象单域抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及活性形式的特异性抗‑Rho GTPase的构象单域抗体及其用途，尤其是在治疗和诊断领域的用途。具体地，本发明涉及其中CDR1‑IMGT、CDR2‑IMGT和CDR3‑IMGT的氨基酸序列与表B定义的H12、B6、4P75、4SP1、4SNP36、4SNP61、5SP10、5SP11、5SP58、5SNP47、5SNP48、5SNP65、B20、B15、B5、B71、E3、A6、G12、NB61、212B、111B或404F(hs2dAb)单域抗体的CDR1‑IMGT、CDR2‑IMGT和CDR3‑IMGT的氨基酸序列具有至少90％一致性的单域抗体。

Description

抗-Rho GTPase的构象单域抗体及其用途
技术领域
本发明涉及抗-Rho GTPase的构象单域抗体及其用途，尤其是在治疗和诊断领域的用途。
背景技术
Rho GTPase属于与Ras同源的20个小GAPase家族，其大部分被认为是无成药性的蛋白。它们的生理活性更多地在于开关I和开关 II高度保守结构域的构象变化，而不是其鸟嘌呤核苷酸三磷酸水解酶非常缓慢的催化活性。因此，小G蛋白是在非活性GDP结合状态和活性GTP结合构象之间循环的分子开关。Rho亚家族包括具有超过 85％序列一致性的RhoA、RhoB和RhoC，其是参与广泛的主要细胞过程，包括控制肌动球蛋白细胞骨架、细胞粘附、细胞分裂、细胞迁移、应激反应以及细胞存活或细胞凋亡的多效蛋白。这些GTPase通过添加对其锚定至细胞膜所必需的羧基末端类异戊二烯基进行翻译后修饰，且在细胞膜上其可以通过鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)催化的核苷酸交换在各种刺激下被活化。然后，活化步骤通过由GTPase 激活蛋白(GAP)增强的GTP水解进行平衡。因此，活化的Rho细胞池在细胞膜保持为有限的池。主要部分从膜中排出，并通过鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂(GDI)隔离在细胞质中。这些大蛋白质通过其氨基末端部分与Rho的开关结构域相互作用，从而防止GDP的释放，并且它们的羧基末端部分也与异戊二烯基相互作用，屏蔽该疏水部分以便从细胞膜排出时保持Rho蛋白可溶。
这些调控因子一起将细胞中的绝大部分Rho蛋白(通常多达95％) 维持为非活性，以便快速活化将与效应子蛋白相互作用的非常小的群体以启动细胞转导通路。此外，研究3种GDI与所有相互作用的Rho 之间的串扰显示，单个Rho的过表达可人为诱导其他Rho的置换和降解，并削弱不直接受转基因控制的信号通路。这个关键点突显出以选择性的方式靶向单个Rho的复杂性。
独特的RhoB似乎涉及与其最近的同源物RhoA和RhoC不同的细胞功能和调控。RhoB可以被棕榈酰化和法呢基化或香叶基香叶基化、异戊烯基化，其分别定义质膜或内涵体的定位。使用常规的分子工具例如过表达野生型或突变体或通过RAN干扰遗传敲低已经表征了在胞内运输和粘附中发挥功能的一些主要的RhoB。其他功能与RhoB基因表达相关，作为对细胞因子或生长因子以及DNA损伤剂或辐射的即时早期应答。此外，RhoB在癌症进展中起似是而非的(paradoxal) 作用。RhoB可以改变肿瘤的形成，并常常在头颈癌或肺癌中下调。
然而，RhoB也促进肿瘤血管生成并保护具有基因组不稳定性的细胞使其不凋亡。现在有明确的证据表明，RhoB发挥细胞和环境依赖性的多效功能。之前的研究通过在小鼠中的过表达、RNAi或基因敲除在遗传水平上靶向RhoB。然而，这些方法以全面方式改变了RhoB 的功能，敲低了细胞中的所有RhoB活性，但是大部分改变了可能诱导GDI-Rho相互作用不平衡的GDP结合的主要部分和少量GTP结合活性池。为破译RhoB的功能而不干扰其他Rho的活性，需要在蛋白质水平靶向RhoB。尽管没有靶向Rho GTPase的小分子抑制剂，来自肉毒杆菌(Claustridium botulinum)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的C3外切酶是诱导Rho的ADP-核糖基化的天然抑制剂，阻止其通过GEF活化，并进一步增加游离Rho与GDI的结合。实际上，在真核细胞中表达C3基因或与细胞渗透性tat-C3一起孵育已经成功地用于全面改变所有3种Rho的功能，导致肌动蛋白纤维损失和细胞变圆的强烈表型。数种其他细菌毒素也靶向Rho蛋白。然而，所有这些毒素缺乏特异性，因为它们不能区分RhoA、RhoB或RhoC，且大多数不直接阻断Rho的活化形式。
在之前的一些研究中，已经建立了从噬菌体展示文库选择重组单链抗体以鉴定对活化的GTP结合状态的Rho蛋白有选择性的结合分子。实际上已经在很多生物技术或生物医疗应用中使用从大的展示文库选择的重组抗体。尽管大多数重组抗体需要VH或VL可变结构域之间典型的二硫键的稳定性，一些特异的细胞内抗体(称为胞内抗体) 在还原条件下保持稳定。因此，取决于抗体形式、支架性质和文库多样性，已经报道一些稀有的重组抗体当在真核细胞的细胞质中表达时仍然有功能(Tanaka，T.，Williams，R.L.&Rabbitts，T.H.Tumour prevention by a sinle antibody domain targeting the interaction ofsignal transduction proteins with RAS.EMBO J 26，3250-3259，doi：7601744[pii]10.1038/sj.emboj.7601744(2007)；Nizak，C.等Recombinant antibodies to the smallGTPase Rab6 as conformation sensors.Science 300，984-987， doi：10.1126/science.1083911(2003).；Meli，G.，Visintin，M.，Cannistraci，I. &Cattaneo，A.Directin vivo intracellular selection of conformation-sensitive antibody domainstargeting Alzheimer′s amyloid-beta oligomers.J Mol Biol 387，584-606， doi：10.1016/j.jmb.2009.01.061(2009))。第一个活性Rho构象单链可变片段(scFv)称为scFvC1，其在体外的生化试验中识别GTP结合状态的所有3种Rho(Goffinet，M.等Identification of a GTP-bound Rho specific scFv molecular sensor by phagedisplay selection.BMC Biotechnol 8，34， doi：1472-6750-8-34[pii]10.1186/1472-6750-8-34(2008))。scFvC1的分子进化导致鉴定了scFvF7(亲和力高于scFvC1的泛活性Rho结合剂) 和scFvE3(优选识别活性RhoB，但不作为胞内抗体发挥功能)。
发明简述
本发明涉及活性形式的特定的抗-Rho GTPase的构象单域抗体及其用途，尤其是在治疗和诊断领域的用途。具体地，本发明由权利要求所限定。
发明详述
发明人制备了人源化纳米抗体的完全合成文库，其通用名为来自骆驼科(camelidae)的单结构域VH。该新型噬菌体展示文库基于稳定性优化的独特支架，允许系统性选择高功能性的对应于人源化合成单域抗体(hs2dAb)的结合分子。因此，发明人特意选择几种功能性胞内抗体的不同靶标，其中一个是活性GTP结合状态的Rho蛋白的构象传感器，其称为H12hs2dAb克隆。他们表明，H12 hs2dAb是不区分Rho亚家族成员RhoA、RhoB和RhoC的泛Rho结合剂，也是近 Rac1家族的Ras同源小G蛋白的结合成员。通过使用更具竞争力的选择方案，本发明人进一步分离出对Rho亚家族具有更多特异性的几种活性Rho选择性hs2dAb分子，即不识别Rac1或其他小G蛋白。他们表明，这些hs2dAb中的一些对Rho的重组组成型活性L63突变体具有亚-纳摩尔的亲和力。这些分子的胞内表达导致肌动蛋白细胞骨架的明确重组，表明它们在培养细胞中作为Rho信号转导的强胞内抑制剂发挥作用。然后，发明人应用相同策略来选择对识别GTP结合状态的RhoB具有特异性的单域抗体。具体地，他们建立了可以诱导活性RhoB蛋白敲低的功能化胞内抗体的可视化细胞内筛选。蛋白敲低是基于使用与所选择的单域抗体遗传融合的Fbox结构域，其诱导结合靶标的泛素化和随后的蛋白酶体依赖性的降解。一个双重挑战是鉴定一种可以从生理上区分RhoB和它最近的同源物，同时对活性 GTP结合状态具有选择性的胞内抗体。使用表达各种Rho突变体的细胞系，发明人成功选择了一种对其活性状态有选择性的强大的遗传编码的RhoB抑制剂，并表明这种独特工具敲低内源性RhoB活性部分的效率，不仅耗尽其基础活性，而且在生长因子处理后阻断其细胞活化。此外，在原理研究的证明中，发明人表明，在人支气管上皮细胞迁移和侵袭方面，微小的RhoB活性敲低并没有取代RhoB的全部细胞部分，而是诱导与RNAi相似的表型。因此，本发明涉及抗-Rho GTPase的构象单域抗体及其用途，尤其是在治疗和诊断领域的用途。
如本文所用，术语“Rho-GTPase”具有本领域的普通含义，是指小分子量鸟苷三磷酸酶的Rho(ras同源)家族。Rho GTPAse是调控细胞骨架组织、基因表达、细胞周期进展、细胞运动和其他细胞过程的控制信号通路的分子开关(Cell Communication andSignaling，2010，8， 23)。Rho家族GTPAse是控制与癌症发展相关的多种细胞功能的重要信号蛋白，包括肌动蛋白细胞骨架组织、转录调控、细胞周期进展、细胞凋亡、囊泡运输、细胞至细胞和细胞至胞外的基质粘连(Cell Communication and Signaling，2010，8(23)，1-14；Genes Dev.，1997，11， 2295-2322)。具体地，Rho-GTPAse包括RhoA、RhoB和RhoC。
发明人制备的单域抗体对至少一种Rho-GTPAse，更具体仅对一种Rho-GTPAse具有特异性(例如“B6”hs2dAb对RhoB具有特异性)。然而，本发明的一些抗体能够与数种Rho-GTPAse相互作用(例如， H12hs2dAb对RhoA、RhoB和RhoC以及Rac1具有亲和性)。因此，本发明的单域抗体的特征在于一个或多个功能性质使得它们被人源化、它们对一种Rho-GTPAse或对几种Rho-GTPAse具有特定亲和性、它们对一种Rho-GTPAse的活化形式(即，构象的)具有特异性、它们能够抑制Rho-GTPAse的活化形式、它们是高度稳定的单域抗体、它们呈现高亲和性、以及它们在胞内环境中是活性的。
如本文所用，术语“单域抗体”具有本领域的普通含义，是指可以在骆驼科哺乳动物中发现的天然不含轻链的抗体类型的单个重链可变结构域。这种单域抗体也称为对于(单)域抗体的一般描述，可以提及以上引用的现有技术，以及EP 0368 684、 Ward等(Nature 1989 Oct 12；341(6242)：544-6)，Holt et al.，TrendsBiotechnol.，2003，21(11)：484-490；和WO 06/030220、WO 06/003388。可以认为单域抗体的氨基酸序列和结构由四个框架区或“FR”组成，其在现有技术和本文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；“框架区4”或“FR4”，所述框架区被三个互补决定区或“CDR”间隔，其在现有技术中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，单域抗体可以定义为具有以下一般结构的氨基酸序列：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1-4，CDR1至CDR3分别指互补决定区1-3。在本发明上下文中，单域抗体的氨基酸残基根据由IMGT编号系统给出的VH结构域的一般编码来进行编号(Lefranc M.-P.，″Unique database numberingsystem for immunogenetic analysis″ Immunology Today，18，509(1997))。无论抗原受体、链型还是物种，已经定义了IMGT的独特编号来比较可变结构域(Lefranc M.-P.，″Unique database humbering system for immunogenetic analysis″Immunology Today，18，509(1997)；Lefranc M.-P.，″The IMGT unique numbering for Immunoglobulins，Tcell receptors and Ig-like domains″The Immunologist， 7，132-136(1999).；Lefranc，M.-P.，Pommié，C.，Ruiz，M.，Giudicelli，V.， Foulquier，E.，Truong，L.，Thouvenin-Contet，V.and Lefranc，G.，″IMGT unique numbering for immunoglobulinand T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains″Dev.Comp.Immunol.，27，55-77 (2003))。在IMGT独特编号中，保守氨基酸总是具有相同的位置，例如半胱氨酸23、色氨酸41、疏水性氨基酸89、半胱氨酸104、苯丙氨酸或色氨酸118。IMGT独特编号为框架区(FR1-IMGT：位置1-26， FR2-IMGT：39-55，FR3-IMGT：66-104和FR4-IMGT：118-128)和互补决定区(CDR1-IMGT：27-38，CDR2-IMGT：56-65和CDR3-IMGT：105-117)提供了标准划分。由于空格表示未占据位置，CDR-IMGT的长度成为关键信息。CDR1-IMGT和CDR2-IMGT中的空格(分别小于 12个和10个氨基酸长)位于CDR-IMGT环的顶部。例如，当 CDR1-IMGT的长度为7个氨基酸时，它包括27、28、29、30、36、 37和38位。当CDR2-IMGT的长度为7个氨基酸时，它包括56、57、 58、59、63、64和65位。重排的CDR3-IMGT的基本长度为13个氨基酸(105-117位)，其对应于15个氨基酸的连接(第2个CYS 104 至J-TRP或J-PHE118)。选择这种长度及其对应的编号是因为它们方便使用。实际上，80％的IMGT/LIGM-DB中的IG和TR重排序列的CDR3-IMGT长度小于或等于13个氨基酸。如果CDR3-IMGT长度小于13个氨基酸，按以下顺序：111、112、110、113、109、114等从环的顶部开始产生空格。因此，当CDR3-IMGT的长度为9个氨基酸时，它包括105；106；107；108；109；114；115；116和117位。当CDR3-IMGT的长度为9个氨基酸时，它包括105；106；107；108；109； 110；112；113；114；115；116和117位。如果CDR3-IMGT的长度超过13 个氨基酸，按照以下顺序112.1、111.1、112.2、111.2、112.3、111.3 等从CDR3-IMGT环的顶部的111和112位之间产生额外的位置。因此，当CDR3-IMGT的长度为15个氨基酸时，它包括额外的111.1和 112.1位。
发明人制备的所有单域抗体(hs2dAb)的特征在于如表A所示的相同的框架区FR1-FR4，且包括表B所示的CDR1-IMGT和7个氨基酸长的CDR2-IMGT，以及9/12或15个氨基酸长的CDR3-IMGT。
表A：发明人制备的单域抗体(hs2dAb)的框架区FR1-FR4 (IMGT)。
框架区 序列
FR1 VQLQASGGGFVQPGGSLRLSCAASG(SEQ ID NO：1)
FR2 MGWFRQAPGKEREFVSAISS(SEQ ID NO：2)
FR3 YYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCA(SEQ ID NO：3)
FR4 YWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：4)
表B：发明人制备的单域抗体(hs2dAb)的CDR-IMGT区。
抗体(hs2dAb)的特征在于表C的序列。
表C：发明人制备的单域抗体(hs2dAb)的序列。
本发明的第一个目的涉及其中CDR1-IMGT、CDR2-IMGT和 CDR3-IMGT的氨基酸序列与H12、4P75、4SP1、4SNP36、4SNP61、 5SP10、5SP11、5SP58、5SNP47、5SNP48、5SNP65、B6、B20、B15、 B5、B71、E3、A6、G12、NB61、212B、111B或404F(hs2dAb)单域抗体的CDR1-IMGT、CDR2-IMGT和CDR3-IMGT的氨基酸序列具有至少90％一致性的单域抗体。
根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少90％一致性是指第一序列与第二氨基酸序列具有90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％一致性。一般使用合适的序列比对算法和默认参数，例如BLAST P确定氨基酸序列一致性(Karlin and Altschul，1990)。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含H12、4P75、4SP1、 4SNP36、4SNP61、5SP10、5SP11、5SP58、5SNP47、5SNP48、5SNP65、 B6、B20、B15、B5、B71、E3、A6、G12、NB61、212B、111B或404F (hs2dAb)单域抗体的CDR1-IMGT、CDR2-IMGT和CDR3-IMGT。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含与SEQ ID NO：1具有至少90％一致性的框架区FR1。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含与SEQ ID NO：2具有至少90％一致性的框架区FR2。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含与SEQ ID NO：3具有至少90％一致性的框架区FR3。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含与SEQ ID NO：4具有至少90％一致性的框架区FR4。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含分别与SEQ ID NO： 1-4具有至少90％一致性的框架区FR1-FR4。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含与SEQ ID NO：62-80 和SEQ ID NO：93-96所示的氨基酸序列具有至少70％一致性的氨基酸序列。
根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少70％一致性是指第一序列与第二氨基酸序列具有70；71；72；73；74；75；76；77； 78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97； 98或99％一致性。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含与SEQ ID NO：62-80 和SEQ ID NO：93-96所示的氨基酸序列具有至少90％一致性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体包含选自SEQ ID NO： 62-80和SEQ ID NO：93-96所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体与异源多肽融合以形成融合蛋白。如本文所用，“融合蛋白”包含与异源多肽(即除了同一单域抗体之外的多肽)可操作连接的本发明的单域抗体的全部或一部分 (一般为生物活性的)。在融合蛋白中，术语“可操作连接”意欲是指本发明的多肽和异源多肽互相框内融合。异源多肽可以融合至本发明的单域抗体的N末端或C末端。在一些实施方案中，异源多肽融合至本发明的单域抗体的C末端。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体和异源多肽互相直接融合 (即不使用接头)或通过接头融合。根据本发明，接头通常是接头肽且一般选择以允许单域抗体结合异源多肽。合适的接头对于本领域技术人员而言基于本文公开是清楚的，任选经过有限程度的常规实验。本文描述了合适的接头，其可以包括-例如但非限制性-氨基酸序列，所述氨基酸序列优选长度为2个或更多个氨基酸。通常，接头具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸。然而，上限不重要，但由于在例如这种融合蛋白的生物制药生产方面的方便而选择。接头序列可以是天然存在的序列或非天然存在的序列。如果用于治疗目的，接头优选在施用本发明的融合蛋白的受试者中无免疫原性。一组有用的接头序列是衍生自如WO 96/34103和WO 94/04678 所述的重链抗体的铰链区的接头。其他实例是聚丙氨酸接头序列，如 Ala-Ala-Ala。接头序列的进一步优选的实例是不同长度的Gly/Ser接头，包括(gly4ser)3、(gly4ser)4、(gly4ser)、(gly3ser)、gly3和(gly3ser2)3。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体与免疫球蛋白结构域融合。例如，本发明的融合蛋白可以包含与Fc部分(例如人Fc)融合的本发明的单域抗体。所述Fc部分可以用于增加本发明的单域抗体的半衰期，甚至是产量。例如，Fc部分可以与血清蛋白结合，从而增加单域抗体的半衰期。在一些实施方案中，至少一种单域抗体可以与一个或多个(通常是人)CH1、和/或CH2和/或CH3结构域，任选经由接头序列融合。例如，与合适的CH1结构域融合的单域抗体例如可以用于-与合适的轻链一起-制备与常规Fab片段或F(ab′)2片段类似的抗体片段/结构，但其中一个(在F(ab′)2片段的情况下)或一个或两个常规VH结构域被本发明的单域抗体替换。在一些实施方案中，一个或多个本发明的单域抗体可以与以下融合：一个或多个恒定结构域(例如，可以用作Fc部分的一部分或可以用于形成Fc部分的 2个或3个恒定结构域)、Fc部分和/或一个或多个赋予一个或多个效应子功能和/或赋予结合一个或多个Fc受体的能力的抗体部分、片段或结构域。例如，为此目的且不限于此，一个或多个进一步的氨基酸序列可以包含一个或多个抗体的CH2和/或CH3结构域，例如来自重链抗体，更通常来自常规人链抗体；和/或来自Fc区，例如来自IgG (如来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)，来自IgE或来自另一种人Ig诸如IgA、IgD或IgM。例如，WO 94/04678描述了包含骆驼VHH结构域的重链抗体或其人源化衍生物(即单域抗体)，其中骆驼科CH2 和/或CH3结构域被人CH2和CH3结构域替换，从而提供由2条重链组成的免疫球蛋白，各重链包含单域抗体和人CH2和CH3结构域 (但没有CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由CH2和CH3结构域提供的效应子功能，且所述免疫球蛋白可以在不存在任何轻链的情况下发挥功能。
在一些实施方案中，异源多肽是单域抗体。因此，在一些实施方案中，本发明的融合蛋白是双互补位多肽。如本文所用，术语“双互补位”多肽是指包含如本文所定义的第一单域抗体和第二单域抗体的多肽，其中这两个单域抗体能够结合一个抗原(即Rho GTPase)的两个不同表位。根据本发明的双互补位多肽由具有不同表位特异性的单域抗体组成，且不包含结合相同表位的互相互补的可变结构域对。因此，它们互相不竞争结合Rho GTPase。
在一些实施方案中，异源多肽是载体多肽。合适的载体是本领域已知的，包括例如甲状腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破伤风类毒素；白喉类毒素；聚氨基酸如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素、流感病毒核蛋白；乙型肝炎病毒核心蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原；来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)；灭活铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(毒素A)；匙孔血蓝蛋白(KLH)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)的丝状血凝素(FHA)；破伤风类毒素(TT)和卡介苗(BCG)细胞壁的T辅助细胞(Th)表位；来自麻风树(M.leprae)或来自结核分枝杆菌的重组10kDa、19kDa和 30-32kDa蛋白质，或这些蛋白质的任何组合等。
在一些实施方案中，异源多肽是荧光多肽。合适的荧光多肽包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，包括但不限于GFP的“人源化”版本，例如把其中天然存在的核苷酸序列密码子换为更密切匹配的人类密码子偏好；来自维多利亚多管发光水母(Aequoria victoria)的GFP 或其衍生物，例如“人源化”衍生物如可从CLontech Inc.商购的增强 GFP；如WO 99/49019和Peelle等(2001)J.Protein Chem.20：507-519所述的来自另一个物种例如动物海肾(Renilla reniformis)、Renilla mulleri 或Ptilosarcus guernyi的GFP；“人源化”重组GFP(hrGFP)(Stratagene)；如Matz等(1999)Nature Biotechnol.17：969-973所述的来自珊瑚虫 (Anthozoan)种的任何种类的荧光和有色蛋白质；等等。
在一些实施方案中，异源多肽是酶。通常，所述酶可以选自以下：β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和辣根过氧化物酶。当异源多肽是产生可检测产物的酶时，该产物可以使用适当的方式检测，例如取决于底物，β-半乳糖苷酶可以产生分光光度计检测的有色产物或荧光产物；荧光素酶可以产生用照度仪可检测的发光产物；等等。
在一些实施方案中，异源肽是促进融合蛋白的纯化或分离的多肽，例如金属离子结合多肽诸如6H标签(例如乙酰化的Tat/6His) 或谷胱甘肽-S-转移酶。
在一些实施方案中，异源多肽是细胞穿透肽。术语“细胞穿透肽”是本领域熟知的，是指细胞可渗透的序列或膜穿透序列，例如穿膜肽、 TAT线粒体穿透肽和Bechara和Sagan，2013；Jones和Sayers，2012； Khafagy el和Morishita，2012和Malhi和Murthy，2012中所述的化合物。在一个具体的实施方案中，异源多肽是最初来源于细胞穿透性HIV tat 肽的转录物的转录激活因子(TAT)细胞穿透序列。
在一些实施方案中，异源多肽是泛素连接酶，例如E3泛素连接酶的结构域。各种E3泛素连接酶结构域的实例包括RING、HECT， U-box、RIBRR、F-box结构域、DCAF结构域、DDS2、HIF-模拟肽、 IkB-模拟序列、BTB结构域或其组合。这些E3连接酶结构域促进泛素化，且当与本发明的单域抗体融合时允许抗原-抗体复合物的降解。可以使用已知的或后期发现或开发的任何E3连接酶结构域，包括E2 结合结构域。可以使用重组E3连接酶结构域。在一些实施方案中，异源多肽是F-box结构域。F-box结构域通常是约50个氨基酸的蛋白质基序。F-box结构域通过结合核心SCF组分Skp1将F-box蛋白质连接到SCF复合物的其他组分。
在一些实施方案中，异源多肽是可切换结构域，其可以通过小分子或通过光活化来激活。小分子可切换系统的实例包括激素配体结合结构域，例如Ralpha LBD、Auxin AID系统、HaloTag2衍生系统HyT 或HALTS、FKB-FRB雷帕霉素或屏蔽1系统。光活化系统的实例包括Lov2结构域、PhyB-PIF、Cry2、UVR8或Dronpa。这些可切换系统通常用于通过构象变化或再定位来在空间或时间上精确控制蛋白质功能。
本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)通过本领域已知的任何技术来制备，例如但不限于单独的或组合的任何化学、生物、遗传或酶技术。例如，已知所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员通过制备多肽的标准技术容易制备所述单域抗体(与异源多肽融合或不融合)。例如，它们可以使用已知的固相方法，优选使用可商购的肽合成装置(例如由Applied Biosystems，Foster City，California 制造的那些)，按照制造商的说明来合成。或者，本发明的单域抗体 (与异源多肽融合或不融合)可以通过本领域熟知的重组DNA技术来合成。例如，本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)可以通过以下作为DNA表达产物获得：将编码单域抗体(与异源多肽融合或不融合)的DNA序列整合入表达载体，并将该载体引入将表达目标单域抗体的合适的原核或真核宿主，然后用已知技术从其中分离。可以使用各种表达载体/宿主系统来包含并表达本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)。这些包括但不限于：微生物，例如用重组细菌噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母(Giga-Hama等，1999)；用病毒表达载体感染的昆虫细胞系统(例如，杆状病毒，参见Ghosh等，2002)；用病毒表达载体转染(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟苹花叶病毒TMV)或用细菌表达载体转化(例如Ti或pBR322质粒；参见例如Babe等，2000)的植物细胞系统；或动物细胞系统。本领域技术人员已知用于优化哺乳动物的蛋白质表达的各种技术，参见例如Kaufman，2000；Colosimo等，2000。用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa 细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、W138、 BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。在细菌、酵母和其他无脊椎动物中重组表达肽底物或融合多肽的实验方案是本领域技术人员已知的，且简要描述如下。表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统也是本领域技术人员已知的。可以选择具有特定能力的宿主细胞菌株以加工所表达的蛋白或产生可用于提供蛋白活性的一些翻译后修饰。多肽的这种修饰包括但不限于乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和酰化。切割蛋白质的“预制”形式的翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能也可能是重要的。不同的宿主细胞例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等具有针对这种翻译后活性的特殊的细胞机器和特征机制，且可以选择以确保引入的外源蛋白的正确修饰和加工。在本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合) 的重组生产中，需要使用包含编码所述单域抗体的多核苷酸分子的载体。制备这种载体以及产生用这种载体转化的宿主细胞的方法是本领域技术人员已知的。用于这种努力的多核苷酸分子可以连接到载体，其通常包括可选择标记和用于在宿主中繁殖的复制起点。这些表达构建体的元件是本领域技术人员已知的。通常，表达载体包括编码给定蛋白的DNA，其与合适的转录或翻译调控序列(例如衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的那些)可操作连接。调控序列的实例包括转录启动子、操纵子或增强子，mRNA核糖体结合位点和控制转录和翻译的适当序列。术语“表达载体”、“表达构建体”或“表达盒”在本说明书中可交替使用，且包括任何类型的含有编码基因产物的核酸的遗传构建体，其中核酸编码序列的一部分或全部能够被转录。用于表达本发明的单域抗体的合适表达载体的选择当然取决于待使用的特定宿主细胞，且在本领域技术人员能力范围内。表达需要在载体中提供适当的信号，例如可以用于在宿主细胞中驱动目标核酸表达的来自病毒和哺乳动物来源两者的增强子/启动子。通常，被表达的核酸是在启动子的转录控制下。通常，当调控序列与编码目标蛋白 (例如单域抗体)的DNA功能相关时，核苷酸序列可操作连接。因此，如果启动子核苷酸序列指导序列转录，则启动子核苷酸序列与给定DNA序列可操作连接。然后如果需要，可以通过本领域技术人员已知的常规程序纯化它们，例如通过分级沉淀，特别是硫酸铵沉淀、电泳、凝胶过滤、亲和层析等。具体地，用于制备和纯化重组蛋白的常规方法可用于制备根据本发明的蛋白质。
本发明的进一步目的涉及编码本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)的核酸分子。
如本文所用，术语“核酸分子”具有本领域的普通含义，是指 DNA或RNA分子。然而，术语涵盖包含任何已知的DNA和RNA 的碱基类似物的序列，例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、 5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基- 氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N61-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含于合适的载体中，例如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。因此，本发明的进一步的目的涉及包含编码本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)的核酸的载体。通常，载体是病毒载体，其是腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒载体、慢病毒载体、痘苗病毒、多瘤病毒或感染病毒。在一些实施方案中，载体是 AAV载体。如本文所用，术语“AAV载体”是指衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和它们的突变形式。AAV载体可以具有整体或部分缺失的一个或多个AAV野生型基因，优选rep和/或cap 基因，但保留功能性的侧翼ITR序列。逆转录病毒可以选作基因递送载体，因为它们能够将其基因整合至宿主基因组、转移大量异源遗传物质、感染广谱的物种和细胞类型，且在特定细胞系中装配。为构建逆转录病毒载体，将编码目标基因的核酸插入病毒基因组中一些病毒序列的位置以产生复制缺陷的病毒。为产生病毒粒子，构建含有gag、pol和/或env基因但不合LTR和/或装配组分的装配细胞系。当将含有cDNA、逆转录病毒LTR和装配序列的重组质粒引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀法)，装配序列允许将重组质粒的RNA转录物装配成病毒颗粒，其然后被分泌至培养基。然后将含有重组逆转录病毒的培养基收集、任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染各种各样的细胞类型。慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了普通的逆转录基因gag、pol和env，还包括具有调控或结构功能的其他基因。高度复杂性使得病毒能够在潜在性感染过程中调控其生命周期。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(HIV1、HIV2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒载体已经通过多次减弱HIV毒力基因产生，例如缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef，使得载体在生物学上是安全的。慢病毒载体是本领域已知的，参见例如通过引用并入本文的美国专利号6,013,516和5,994,136。总之，载体是基于质粒或基于病毒的，且设置为携带用于整合外源核酸、用于选择和用于将核酸转移至宿主细胞的必要序列。目标载体的gag、pol和env基因也是本领域已知的。因此，将相关基因克隆入所选择的载体，然后用来转化目标靶细胞。通过引用并入本文的美国专利号5,994,136描述了能够感染非分裂细胞的重组慢病毒，其中合适的宿主细胞被两个或多个携带装配功能，即gag、pol和env，以及rev和tat的载体转染。这描述了能够提供编码病毒gag和pol基因的核酸的第一载体和能够提供编码病毒env的核酸以产生装配细胞的另一个载体。将提供异源基因的载体引入该装配细胞产生生产细胞，其释放携带目标外源基因的感染性病毒颗粒。 Env优选是允许转导人和其他物种的细胞的双嗜性包膜蛋白。通常，本发明的核酸分子或载体包括“控制序列”，其整体上是指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子等，其整体上提供受体细胞中编码序列的复制、转录和翻译。只要所选择的编码序列能够在合适的宿主细胞中复制、转录和翻译，不是所有这些控制序列需要一直存在。另一种核酸序列是“启动子”序列，其在本文中以其普通含义使用，是指含有DNA调控序列的核苷酸区域，其中调控序列衍生自能够结合RNA聚合酶并启动下游(3’方向)编码序列的转录的基因。转录启动子可以包括“诱导型启动子”(其中与启动子可操作连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)、“抑制性启动子”(其中与启动子可操作连接的多核苷酸序列的表达由分析物、辅因子、调节蛋白等诱导)和“组成型启动子”。
本发明的进一步目的涉及用本发明的核酸分子转化的宿主细胞。术语“转化”是指将“外源”(即外部的或细胞外的)基因、DNA 或RAN序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生期望物质，通常是由引入基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已经被“转化”。例如，如上所述，为表达并产生本发明的单域抗体，将选择原核细胞，尤其是大肠杆菌(E.coli)细胞。实际上，根据本发明，并不强制在有利于翻译后修饰(例如糖基化)的真核细胞环境中产生本发明的单域抗体。通常，宿主细胞可以适于产生如上所述的本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)。在一些情况下，宿主细胞用作研究工具以研究例如目标细胞中的Rho GTPAse活化或失活(例如功能敲低)的影响，如在实施例中所述。在一些实施方案中，宿主细胞分离自选自以下的哺乳动物受试者：人、马、狗、猫、小鼠、大鼠、牛和绵羊。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是培养物中的细胞。细胞可以直接从哺乳动物(优选人)直接获得，或从商业来源、或从组织、或以例如现场制备或从商业细胞来源购买的培养细胞的形式获得，等等。细胞可以来自任何器官，包括但不限于：血液或淋巴系统，来自肌肉、任何器官、腺体、皮肤、大脑、肺……在一些实施方案中，细胞选自：上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、肝细胞、B细胞、T 细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、肌细胞、血管平滑肌细胞、肝细胞、脾细胞、胰腺β细胞……在一些实施方案中，宿主细胞是癌细胞。通常，癌细胞分离自选自以下的癌症：乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮肤癌、胰腺癌、结肠癌、黑素瘤、恶性黑素瘤、卵巢癌、脑癌、原发性脑癌、头颈癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、肝癌、膀胱癌、非小细胞细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小细胞肺癌、Wilms肿瘤、宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、泌尿生殖道癌、甲状腺癌、食管癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、肾上腺癌、肾细胞癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、恶性胰腺癌、恶性类癌、绒毛膜癌、恶性高钙血症、宫颈增生、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、毛细胞白血病、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、卡波西氏肉瘤、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、成骨肉瘤、原发性巨球蛋白血症和视网膜母细胞瘤。在一些实施方案中，宿主细胞是干细胞。如本文所用，术语“干细胞”是指能够被诱导而增殖的未分化细胞。干细胞能够自我维持或自我更新，这意味着每次细胞分裂，子细胞也将是干细胞。干细胞可以获得自胚胎、产后、幼年或成人组织。干细胞可以是多能的或专能的。如本文所用，术语“祖细胞”是指衍生自干细胞的未分化细胞，其本身不是干细胞。一些祖细胞能够产生能分化成超过一种细胞类型的后代。干细胞包括多能干细胞，其能够形成身体组织谱系的任何细胞：外胚层、中胚层和内胚层。因此，例如，干细胞可以选自人胚胎干细胞(ES)；人内细胞团(ICM)/上皮细胞；人原始外胚层细胞，人原始内胚层细胞；人原始中胚层细胞；和人原始胚芽(EG)细胞。干细胞还包括专能干细胞，其能够形成组成整个组织的多个细胞谱系，例如但不限于造血干细胞或神经前体细胞。干细胞还包括全能干细胞，其能够形成整个生物。在一些实施方案中，干细胞是间充质干细胞。术语“间充质干细胞”或“MSC”对于成人体细胞交替使用，所述成人体细胞没有终止分化，其可以分裂成是干细胞的生产细胞，或不可逆地分化以产生间充质细胞谱系的细胞(例如脂肪组织、骨组织、软骨、弹性和纤维结缔组织、成肌细胞)以及来自胚胎中胚层的组织以外的组织(例如神经细胞)，这取决于来自生物活性因子如细胞因子的各种影响。在一些实施方案中，干细胞是部分分化或正在分化的细胞。在一些实施方案中，干细胞是诱导型多能干细胞(iPSC)，其已经被重编程或去分化。干细胞可以获得自胚胎、胎儿或成人组织。
本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)可以用于研究和诊断领域。例如，本发明的单域抗体尤其适用于检测Rho GTPase的活化形式的存在，所述检测可能在研究或诊断目的中有用处。
因此，本发明的进一步方面提供用于检测至少一种Rho GTPase(例如RhoA、RhoB和/或RhoC)的活化形式的存在的方法，包括步骤：i)a)从受试者获得样品；ii)在体外将所述样品与本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)接触；iii)检测所述单域抗体与所述样品的结合；和iv)将步骤(iii)中检测的结合与标准比较，其中相对于所述样品的结合差异表明存在Rho GTPase的活化形式。通常，检测用任何合适的方法进行，例如显微镜或自动分析系统。
如本文所用，术语“样品”涵盖从受试者获得的且可用于诊断或研究试验的各种样品类型。生物样品包括但不限于血液和其他生物来源的液体样品、固体组织样品例如活检样本或组织培养物或从其衍生的细胞，以及其后代。在一些实施方案中，样品是肿瘤组织样品。术语“肿瘤样品”是指来源自受试者的肿瘤的任何组织样品。获得组织样品是为了体外评估，且通常来自在受试者肿瘤中进行的活检。样品可以是新鲜的、冷冻的或包埋的(例如FFPE活检)。
因此，在一些实施方案中，本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)与可检测标记偶联。合适的可检测标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、酶标记、生物发光标记或胶体金。制备和检测这种可检测标记的免疫偶联物的方法是本领域技术人员已知的，且将在以下更详细的描述。例如，可检测标记可以是通过放射自显影检测的放射性同位素。尤其适用于本发明目的的同位素是 3H、125I、131I、35S和14C。本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)也可以用荧光化合物标记。荧光标记的本发明的单域抗体的存在通过将免疫偶联物暴露至合适波长的光并检测所得荧光来测定。荧光标记化合物包括异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋、邻苯二甲醛和荧光胺以及AlexaFluor染料。或者，本发明的单域抗体可以通过将所述单域抗体与化学发光化合物偶联来可检测地标记。化学发光标记的免疫偶联物的存在通过检测在化学反应过程中产生的发光的存在来测定。化学发光标记化合物的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、芳香族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。类似地，生物发光化合物可以用来标记本发明的单域抗体。生物发光是在生物系统中发现的一类化学发光，其中催化蛋白质增加化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在通过检测发光的存在来测定。适用于标记的生物发光化合物包括荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。通常，当单域抗体与如上所述的荧光多肽融合时，可以用本领域已知的任何方法例如显微镜或显微镜或自动分析系统来检测融合蛋白的存在。通常，当单域抗体与酶融合时，然后将融合蛋白在合适底物的存在下孵育，酶部分与底物反应，产生可以例如通过分光光度法、荧光法或视觉法检测的化学部分。可以用来可检测标记多特异性免疫偶联物的酶的实例包括β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和碱性磷酸酶。本领域技术人员已知可以在本发明中使用的其他合适的标记。用本领域已知的标准技术来完成标志物部分与本发明的单域抗体的结合。这方面的典型方法描述于Kennedy等，Clin.Chim.Acta 70：1，1976； Schurs等，Clin.Chim.Acta 81：1，1977；Shih等，Int′U.Cancer 46：1101， 1990；Stein等，Cancer Res.50：1330，1990；和Coligan，supra。此外，可以使用已经与抗生物素蛋白、链霉亲和素和生物素偶联的本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)来增强免疫化学检测的便利性和多功能性。参见，例如Wilchek等(eds.)，″Avidin-BiotinTechnology″， Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press 1990)；Bayer等，″Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology，″in Methods InMolecular Biology(Vol.10)149-162(Manson，ed.，The Humana Press，Inc.1992)。在一些实施方案中，单域抗体(与异源多肽融合或不融合) 的存在用对本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)具有特异性的第二抗体来检测。通常，所述第二抗体用如上所述的相同方法标记。例如，当本发明的单域抗体与标签(例如组氨酸标签)融合时，第二抗体对所述标签具有特异性。进行免疫分析的方法是完善的。参见，例如Cook and Self，″MonoclonalAntibodies in Diagnostic Immunoassays″，in Monoclonal Antibodies：Production，Engineering，and Clinical Application 180-208(Ritter and Ladyman，eds.，Cambridge University Press 1995)；Perry，″The Role of Monoclonal Antibodies inthe Advancement of Immunoassay Technology″，in Monoclonal Antibodies：Principles and Applications 107-120(Birch and Lennox，eds.，Wiley-Liss，Inc.1995)；Diamandis，Immunoassay(Academic Press，Inc.1996)。
本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)和编码其的核酸分子可以用作药物。特别是，本发明的核酸分子(插入或不插入载体) 尤其适用于基因疗法。
在一些实施方案中，本发明的单域抗体和核酸分子(插入或不插入载体)尤其适用于治疗癌症。如本文所用，术语“癌症”具有本领域的普遍含义，且包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语癌症包括皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步涵盖原发性和转移性癌症。可以用本发明的方法和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于来自以下的癌细胞：膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头、肾、肝、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫。此外，癌症特别可以是以下组织学类型，但不限于这些：肿瘤；恶性肿瘤；癌；未分化癌；巨细胞梭状细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；联合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤息肉腺瘤；腺癌，家族性息肉病；实体癌；恶性类癌肿瘤；分支肺泡腺癌；乳头状腺癌；发色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包囊硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附属器癌；顶分泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍；腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌与鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性肉瘤；恶性颗粒细胞瘤；和恶性骨髓瘤；支原体细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无色素黑素瘤；浅表性扩散黑色素瘤；巨型色素痣中的黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合肿瘤；穆勒混合肿瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间质瘤；恶性膀胱肿瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性结肠畸形；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞癌；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞肿瘤；尤文氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；肿瘤室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；大细胞弥漫性恶性淋巴瘤；滤泡恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特殊的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤和多毛细胞白血病。
因此，本发明的进一步目的涉及用于治疗需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)或如上所述插入或不插入载体的本发明的核酸分子。
如本文所用，术语“治疗”是指治疗性或预防性治疗以及治愈性或疾病改变性治疗，包括治疗有患病风险或怀疑患有疾病的患者以及患病或被诊断患有疾病或医学病症的患者，并包括抑制临床复发。治疗可以施用于具有医学病症或最终可能患该病症的受试者，以便预防、治愈、延缓发作、降低严重性或改善病症或复发性疾病的一种或多种症状，或者为了在不存在这种治疗的情况下将受试者的生存期延长超出预期的范围。“治疗有效量”是指适用于任何医学治疗的以合理收益/风险比治疗疾病的本发明的单域抗体或核酸分子的足够的量。将理解，活性剂的总日用量将由主治医师在合理的医疗判断范围内决定。对于任何具体的受试者，特定的治疗有效剂量水平将取决于各种因素，包括受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；所用的特定化合物的施用时间、施用途径和排泄率；治疗持续时间；与所用的特定多肽组合或同时使用的药物；以及医疗领域熟知的因素。例如，本领域技术人员已知以比实现期望治疗效果所需的水平低的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直到达到期望效果。然而，产品的每日剂量可在每成人每天0.01-1000mg的宽范围内变化。通常，组合物包括0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、 100、250和500mg活性成分，用于对待治疗受试者的剂量进行症状调整。药物通常包括约0.01mg至约500mg活性成分，优选1mg至约 100mg活性成分。药物的有效量一般以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg 体重，尤其是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供。
根据本发明，本发明的单域抗体(与异源多肽融合或不融合)或核酸分子(插入或不插入载体)以药物组合物的形式向受试者施用。通常，本发明的单域抗体或核酸分子(插入或不插入载体)可以与药学上可接受的赋形剂和任选的缓释基质例如生物可降解的聚合物组合以形成药物组合物。“药学上”或“药学上可接受的”是指当酌情向哺乳动物尤其是人施用时，不会产生有害的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂是指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的配制辅剂。在用于口服、舌下、皮下、肌内、静脉内、经皮、局部或直肠施用的本发明的药物组合物中，活性成分(单独或与另一种活性成分组合) 可作为与常规药物载体的混合物以单位施用形式向动物和人施用。合适的单位施用形式包括口服途径形式如片剂、凝胶胶囊、粉末、颗粒剂和口服悬浮液或溶液、舌下和口腔施用形式、喷雾剂、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜内、肌内、静脉内、真皮下、透皮、鞘内和鼻内施用形式和直肠施用形式。通常，药物组合物包含对于能够被注射的制剂而言药学上可接受的介质。这些特别可以是等渗、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥、特别是冷冻干燥的组合物，其根据情况，当加入无菌水或生理盐水时允许构成可注射溶液。适用于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散体；制剂包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式必须无菌，且必须具有易于注射的程度的流动性。它在制备和储存条件下必须稳定，且必须防止微生物，例如细菌和真菌的污染作用。含有本发明的化合物作为游离碱或药学上可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂，例如羟丙基纤维素适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和并在油中制备分散体。在储存和使用的一般条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。本发明的单域抗体或核酸分子(插入或不插入载体)可以中性或盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，其是用无机酸例如诸如盐酸或磷酸、或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用游离羧基形成的盐也可以来自无机碱，例如诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，或有机碱，例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。载体也可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散体介质。例如可以通过使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来获得，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶来获得可注射组合物的延迟吸收。通过以下来制备无菌可注射溶液：根据需要将所需量的活性化合物和数种以上列举的其他成分引入合适的溶液中，随后过滤灭菌。通常，通过以下制备分散体：将各种灭菌的活性成分引入无菌介质中，所述无菌介质包含基础的分散体介质和所需的来自以上列举的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，典型的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从之前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。也考虑制备用于直接注射的较浓缩或高度浓缩的溶液，其中考虑使用DMSO作为溶剂以产生极速渗透，将高浓度的活性剂递送至小的肿瘤区域。一旦配制，溶液将以与剂量配方相容的方式并以治疗有效的这种量施用。制剂容易以各种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型，但也可以使用药物释放胶囊等。例如，为了水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖等渗。这些特定的水溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹腔内施用。在这方面，可以使用的无菌水性介质是本领域技术人员基于本公开将知晓的。取决于被治疗的受试者的情况，剂量将必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定用于个体受试者的合适剂量。
本发明将通过以下附图和实施例进一步阐述。然而，这些实施例和附图不应当以任何方式被理解为限制本发明的范围。
附图说明
图1：H12 hs2dAb对处于其活性构象的Rho具有选择性。(A) H12是仅结合GTP结合的RhoA GTPAse活化状态的构象hs2dAb。 ELISA显示负载100μM GTPγS(黑色)或1mM GDP(白色)、或RhoA 组成型活性突变体Q63L的纯化GST融合体(格子)的重组GST-RhoA 野生型。(B)来自HeLa细胞提取物的CBD标签的H12拉下，用100μM GTPγS(GTP)或用1mM GDP上样作为输入。蛋白质印迹表明RhoA 在两种输入的5％相似水平，但仅存在于CBD-H12拉下的GTP负载的提取物上。D5抗微管蛋白用作阴性对照，标准GST-RBD(Rhotekin 的Rho结合结构域)用作活性Rho下拉的阳性对照。(C)过表达 GFP-RhoAT19N非活性突变体或GFPRhoAQ63L的HeLa细胞上的免疫荧光。用myc标签抗体检测的H12染色仅显示以与GFP荧光相似的模式过表达组成型活性突变体的细胞。
图2：当在细胞质中表达时，H12hs2dAb能够干扰内源Rho活性。用对照不相关hs2dAb或表达为GFP融合体的H12抗Rho-GFP 转染的HeLa细胞。转染后20小时固定细胞，并用DAPI和Alexa 594 鬼笔环肽染色以标记肌动蛋白应力纤维。
图3：表征选择的F-Ib。(A)Hm和HmB细胞系中通过流式细胞仪定量的mCherry荧光。在Hm和HmB细胞系中转染F-Ib 48h后，在转染的亚群和非转染的亚群中定量各F-Ib的mCherry荧光。各荧光中值的比例(转染vs非转染群体)给出一个F-Ib的mCherry荧光强度百分比。(B)Fbox结构域引起HmB细胞系中RhoB降解。在HmB 细胞系中转染F-hs2dAb和hs2dAb。如(A)一样用流式细胞仪测定 mCherry荧光的中值。仅用F-Ib观察到mCherry荧光的降低，而单独的hs2dAb不能诱导这种衰减。(C)HmB细胞系中的降解是蛋白酶体依赖性的。用F-Ib转染HmB细胞，并用1μM的MG132(一种蛋白酶体抑制剂)或DMSO处理36h。MG132处理将荧光水平几乎恢复到对照水平。荧光中值归一化至NR对照。(D)F-H12和F-B5降解Rac1 突变体。转染F-Ib 48h后，如(A)所述在Hm、HmB和 H2B-mCherry-Rac1L63细胞系中通过流式细胞仪定量mCherry荧光，并将各细胞系的荧光中值归一化至NR对照。与其他F-Ib相比，F-H12 和F-B5在Rac1L63细胞系中诱导mCherry荧光的显著降低。(E)所有RhoB阳性F-Ib均是构象敏感的，对活性突变体RhoBL63具有选择性。如上所述，在Hm、HmB和H2B-mCherry-RhoBN19细胞系中转染F-Ib后通过流式细胞仪定量mCherry荧光，并将各细胞系的荧光中值归一化至NR对照。对于各F-Ib，与对照细胞系Hm相比，在 RhoBN19细胞系中没有观察到mCherry荧光的显著降低。
图4：内源性RhoB细胞活化的敲低。(A)用F-Ib质粒转染Hela S3细胞48h。对各F-Ib进行GST-RBD拉下试验以控制Rho-GTP水平 (泳道RhoB-GTP、RhoA-GTP和RhoC-GTP)，通过上样2％输入显示Rho蛋白质的总水平(泳道总RhoB、总RhoA和总RhoC)。用 myc标签显示表明F-Ib的产量，微管蛋白是上样对照。(B)三个独立的GST-RBD拉下实验的定量。F-B6似乎选择性地降解比RhoA或 RhoC更多的RhoB-GTP。F-H12和F-B15是泛Rho结合剂。将相对活性计算为GTP水平与归一化至微管蛋白的输入水平之间的比例。显示归一化的平均值±SEM。(C)EGF处理后的RhoB活化动力学。用F-NR对照转染HeLa S3细胞48h，包括24h的血清饥饿。转染48h 后，用50ng.mL-1浓度的EGF处理细胞指定的次数。进行GST-RBD 拉下实验以监控该处理后的Rho-GTP诱导。RhoB在5分钟内活化直到30分钟，且在120分钟显示第二波的活化。RhoA和RhoC仅在5-30 分钟之间活化，最大值在5分钟。(C、D、E)用EGF处理15分钟并用F-Ib转染细胞48h后，检查RhoB-GTP(B)、RhoA-GTP(C)和 RhoC-GTP(D)的水平。与阴性对照相比，F-H12和F-B6能够在EGF 处理后抑制RhoB活化。F-H12抑制部分RhoA活化(50％)，并将 EGF处理下的RhoC-GTP水平降低至基础水平(没有处理)，而在 EGF处理后F-B6对这两种RhoGTPase活化没有抑制作用。定量用归一化的平均值±SEM显示。
具体实施方式
实施例1：选择构象敏感性抗体
使用展示技术的体外免疫的主要优势之一是控制抗原构象和浓度以驱动向期望结果的选择。例如，可以设计选择方案以改善具有低解离速率动力学的高亲和力结合剂的回收率、靶向特异性表位或鉴定构象敏感性结合剂。例如，重组抗体片段文库筛选已经提供了选择性靶向小GTPase活性构象的几种结合剂。我们假设，我们的合成文库 (描述于PCT/EP2014/073713)具有足够的多样性和功能性以允许鉴定选择性构象结合剂。我们进行了扣除性淘选以从Rho亚家族选择针对小GTPase的构象特异性抗体。当分别与GDP和GTP核苷酸结合时，小GTPase是在非活性和活性状态之间循环的分子开关。可以采用稳定的活性或非活性构象设计小GTPase的突变体。组成型活性突变体(例如RhoA Q63L、RhoB Q63L或RhoCQ63L)在HEK293中作为诱饵表达，然后新鲜地拉下来进行淘选以保持其天然构象。为了富集对GTP结合的RhoA具有特异性的噬菌体，使用GDP-结合的RhoA 蛋白从第二轮淘选引入耗竭步骤，以在选择活性突变体之前去除通用结合剂。四轮选择后，使用针对与GTPγS(GTP的不可水解类似物) 负载的Rho GTPase结合的Rho GTPase或GDP负载的Rho GTPase 的噬菌体ELISA分析克隆。所选择的单域抗体的基本特征如表1所述。
表1：所选择的单域抗体的基本特征：(ND＝未测定)
实施例2：H12抗体的功能性表征
在这个情况下用抗体的可溶形式，在几种在大肠杆菌中表达为 GST融合体的纯化Rho蛋白上通过ELISA进一步分析克隆H12。我们表明，H12 hs2dAb有效结合组成型活性突变体RhoAL63以及负载 GTPγS的野生型RhoA。相反，没有观察到与非活性RhoAN19突变体或GDP负载的野生型RhoA的结合(图1A)。然后，我们测试了H12 是否能够从哺乳动物细胞提取物特异性地把GTP负载的RhoA拉下来。将大肠杆菌中表达的CBD标签的H12构建体固定在几丁质珠上，并与预先用GTPγS或GDP处理的HeLa细胞提取物孵育。与GST 融合的Rhotekin的Rho结合结构域(GST-RBD)用作对照。已知该结构域结合Rho GTPase活性构象，并且是目前分析Rho活性的标准方法。发现H12 hs2dAb对负载GTPγS的Rho具有高度选择性，对 GDP负载的提取物没有信号(图1B)。接下来，我们测试了H12是否在免疫荧光中特异性检测RhoA活性构象。将表达GFP-RhoAL63活性突变体或非活性GFP-RhoAN19的HeLa细胞固定，并用H12hs2dAb 染色。过表达非活性突变体GFP-RhoAN19(其对RhoA通路或对细胞形状没有显性负效应)与未转染细胞的背景相比没有产生增加的信号。相反，在表达GFP-RhoAL63活性突变体的细胞上选择性获得强的染色。注意这些细胞显示成束的肌动蛋白应力纤维，这是与增强的RhoA活性相关的特征性表型(图1B)。总之，这些结果表明，H12 hs2dAb对活性构象的Rho具有选择性。
此外，我们的结果显示，当在细胞质中表达时，H12抗体能够干扰内源Rho活性。首先，我们在Hela细胞中共表达H12-GFP和 GFP-RhoAN19非活性突变体或GFP-RhoAL63组成型活性突变体，并用抗GFP单克隆抗体进行共免疫沉淀实验。活性RhoA与H12-GFP共免疫沉淀，但非活性RhoA没有。这表明，H12作为胞内抗体发挥作用，且在细胞质中保持其构象敏感性。由于Rho GTPase涉及促进肌动蛋白细胞骨架聚合的信号通路，我们观察了由H12过表达诱导的功能效果。与未转染细胞或用各种不相关的GFP融合的hs2dAb转染的细胞相反，我们观察到表达H12-GFP的细胞完全不含肌动蛋白应力纤维(图2)。这种肌动蛋白丝组织的变化与特征在于失去细胞间机械力和张力的细胞形状的显著变化有关(图2)。由于RhoA在激活肌球蛋白II和肌动蛋白细胞骨架重组中起重要作用，我们的结果显示，H12有效干扰了Rho依赖性信号转导，模拟由C3外酶Rho抑制剂诱导的作用。
实施例3：功能化构象胞内抗体以靶向RhoB活性
通过视觉筛选荧光蛋白敲低直接选择胞内抗体
为了用胞内抗体干扰细胞中的RhoB活性这一目标，我们建立了从噬菌体展示选择开始接着细胞内筛选的策略，其目的在于鉴定功能性的抑制性胞内抗体。在过去十年中，我们建立了复杂的噬菌体展示选择方案以分离区分Rho蛋白的GTP构象的结合剂。为在选择期间保留RhoB的天然构象，在哺乳动物细胞中表达诱饵抗原，并新鲜提取，在与NaLi-H1文库噬菌体孵育期间以纳摩尔范围使用。在预清除步骤之后，在存在过量的GDP负载的野生型RhoB的情况下，使用组成型活性突变体RhoBL63进行竞争性淘选选择，以富集对RhoB比对其最接近的同系物更有选择性的结合物。两轮富集后，我们添加了 5摩尔过量的RhoAL63和RhoCL63，以进一步与诱饵竞争。在噬菌体 ELISA中控制与细菌表达和纯化的GTS-RhoBL63结合的噬菌体的阳性富集后，我们希望开发RhoB胞内抗体的直接筛选。我们从我们之前在重组抗体技术中的经验学到，这种单克隆结合结构域的功效可能非常依赖试验，即在ELISA筛选中的阳性通常不能在免疫荧光中起作用，反之亦然。我们还用基于纳米抗体与靶标的荧光融合共定位的选择方案分离了胞内抗体。然后，当我们功能化一组这些跟踪胞内抗体时(用蛋白酶体靶向结构域替换GFP以降解抗原)，出乎意料地最好的追踪者和最好降解者之间没有明显相关。因此，我们推测，鉴定在特定试验中起作用的胞内抗体的最好方法是直接以最终形式筛选。
在此，我们选择通过诱导其蛋白酶体介导的降解来抑制RhoB。胞内抗体的几种功能化将诱导靶标的降解。其中之一在于将Fbox蛋白的Fbox结构域融合。Fbox蛋白包括两个调控结构域，一个用于靶标识别，Fbox结构域与Skip1(SCF E3泛素连接酶复合物的组分)相互作用，其诱导Fbox蛋白靶标的聚泛素化，随后诱导蛋白酶体降解。用胞内抗体替换靶标结合结构域能够指定靶标，从而诱导抗原的降解。敲低策略的一个优点在于，Fbox-胞内抗体(F-Ib)以催化方式起作用，而并不共降解。另一个优点在于以下事实：如果观察到降解，这间接表明抗原和纳米抗体之间的细胞内相互作用。主要的缺点是靶标抗原不显示泛素化位点，但对于小GTPase或能够通过蛋白酶体天然降解的任何蛋白却不是这样。我们之前已经在几种抗GFP hs2dAb 胞内抗体上测试了该策略，并构建了允许表达来自与hs2dAb融合的果蝇slmb基因的氨基末端Fbox结构域和位于线粒体荧光报告基因上游的羧基末端myc标签的质粒，所述报告基因表达为从IRES翻译的第二个顺反子。我们选择通过将RhoB与荧光蛋白融合来设置靶标降解的视觉筛选。为模拟活性RhoB，我们选择表达组成型活性突变体RhoBL63，其在催化GTO核苷酸水解方面严重受损，因此维持在GTP 负载的活性状态。为避免与内源性RhoB的结合串扰，我们使用了 RHOB-/-肺上皮细胞系H2882。由于RhoBL63表达毒性不允许我们制备稳定的细胞系，我们构建了一个由以下组成的嵌合体：编码氨基末端组氨酸H2B的序列，随后是mCherry荧光蛋白和缺失与棕榈酰化和异戊烯基化信号对应的5个末端氨基酸的羧基末端RhoBL63。该融合蛋白丧失膜锚定能力，并被人工整合至染色质核小体，在细胞核中产生荧光信号，同时在一个位置显示出似乎无毒的活性RhoBL63突变体以产生稳定的细胞系，称为HmB。为控制与RhoBL63的结合特异性，也制备仅表达H2B-mCherry的细胞系，称为Hm。我们假设，如果Fbox-hs2dAb是稳定的F-Ib且如果与RhoBL63特异性产生相互作用，则将在HMB细胞系而不是Hm细胞系中观察到细胞核mCherry 荧光的降低。因此，与RhoBL63降解相关的荧光衰减可以是视觉筛选 F-Ib RhoB抑制剂的基础。染色质数量和密度是细胞依赖性的，根据细胞周期波动，细胞核荧光可能有轻微的异质性。基于瞬时质粒转染的筛选中细胞依赖性的异质性的另一个来源是多变的质粒拷贝数、转染效率和F-Ib的相对表达水平。为更好地评估这些参数，我们使用了我们的作为报告基因靶向线粒体基质的具有单体GFP的F-Ib双顺反子表达载体，并在该筛选中使用两个阴性hs2dAb设置了试验，称为 F-NR(与RhoB噬菌体展示不相关)和F-20(之前为了RhoB选择的但不是降解的胞内抗体)。总之，视觉筛选在于在显示GFP荧光线粒体的细胞中观察mCherry细胞核荧光衰减。
4轮淘选后，在池中消化hs2dAb序列，并将其直接插入F-Ib双顺反子表达载体。尽管这种多克隆亚克隆可能导致与噬菌粒亚文库相比一定程度的多样性损失，但我们认为在传统的噬菌体展示策略中，仅筛选一组随机挑选的菌落，并且在噬菌体选择期间特异性结合剂的有效富集在亚克隆期间不被转移的概率较小。单个克隆步骤之后，我们通过在两个细胞系中(HmB和Hm)瞬时转染单独的质粒克隆并在倒置显微镜下观察mCherry荧光强度筛选了几百个F-hs2dAb。在将阳性点击测序后，我们鉴定了四个独特克隆，当与两个阴性内部对照 F-NR和F-B20相比时，其仅在HmB细胞转染的细胞中诱导mCherry 荧光的强衰减。一个选择的克隆是H12 hs2dAb，其是之前从NaLi-H1 文库鉴定的泛活性Rho。在一些选定视野的荧光衰减定量表明，这些 F-Ib根据RhoBL63的存在诱导H2B-mCherry-RhoBL63的降解。然后，进一步通过流式细胞仪定量这些结果，证实F-H12、F-B6、F-B15和 F-B5选择性降解H2B-mCherry-RhoBL63，并表明F-H12和F-B6是最有效的F-Ib(图3A)。
选择的F-Ib的表征
已经报道，Fbox结构域与肽或胞内抗体的融合在各种细胞环境中通过蛋白酶体介导靶向降解。为证实Fbox结构域的存在是否引起降解，我们在Hm和HmB细胞中单独表达hs2dAb，并观察到mCherry 荧光没有降低(图3B)。然后，使用MG132蛋白酶体抑制剂，我们发现了观察到的降解是蛋白酶体依赖性的。与通过流式细胞仪定量的4个F-Ib诱导的荧光衰减几乎没有降低的DMSO处理相比，在36小时内1BM的MG132处理将mCherry荧光几乎恢复到对照水平(图3C)。最后，在将转染中的质粒浓度从2μg降低至0后，我们通过定量荧光分析了荧光衰减是否是F-Ib表达的直接作用。对于有效的F-H12和 F-B6观察到剂量反应的直接作用，因为质粒浓度越低，荧光信号越高 (数据未显示)。总之，这些结果表明，通过直接视觉筛选的F-Ib 以蛋白酶体依赖性的方式特异性靶向并降解在染色质上集中的 RhoBL63delta CAAX蛋白。
选择的F-Ib的特异性和构象选择性
H12 hs2dAb是GTP负载的Rho蛋白质的构象传感器和阻断胞内抗体，其不区分RhoA、RhoB、RhoC同源物，甚至识别Rac1和CDC42 密切相关的GTPase。它在本研究中再次被富集和选择这一事实并不出乎意料，因为在之前的淘选中它在较早轮的选择中的富集非常高，且在对RhoAL63的第三轮淘选中其表示超过50％的克隆。尽管这里我们引入了与活性RhoA和RhoC的竞争，H12并没有完全从选择中消失，表明其他新选择的hs2dAb也可能是泛Rho。然而，H12富集低得多，表明新的扣除性选择至少是部分有效的。为测定选择的 F-hs2dAb的选择性，我们在与H2B-mCherry-RhoBL63相同的基础上制备了不同的稳定细胞系。转染H2B-mCherry-RhoAL63和 H2B-mCherry-RhoCL63未能制备稳定细胞系，且瞬时表达的异质性没有导致荧光衰减的总体定量(数据未显示)。然而，用 H2B-mCherry-Rac1L61制备相似的细胞系是可能的，Rac1主要在开关结构域上是Rho亚家族的最近的同源物。如预期的，F-H12在后来的细胞系中诱导了荧光衰减。在其他选择的F-Ib中，F-B5也影响 H2B-mCherry-Rac1L63的荧光水平，但F-B6和F-B15不能降解Rac1 的活性形式(图3D)。在这一点上，我们在没有hs2dAb 5或其F-5 功能化的情况下进行研究，但是我们保留hs2dAb H12作为泛活性的 Rho对照。然后，通过比较对RhoBN19突变体的作用，我们解决了剩余F-Ib的构象选择性，所述RhoBN19突变体应该是大部分无活性的，因为相同的突变导致核苷酸结合其他Ras同源物中的GTPase有缺陷。我们制备了H2B-mCherry-RhoBN19稳定细胞系以测定在我们的荧光衰减试验中作为F-Ib表达的hs2dAb的构象选择性。FACS分析后，所有有效的F-Ib仅降解RhoB的活性突变体，而不是非活性形式(图3E)。这些结果表明，F-B6和F-B15是优选识别其活性构象中的RhoB的构象hs2dAb。
内源RhoB活性敲低
然后，我们研究了这些胞内抗体是否能够降解内源的RhoB活性形式。为此，我们使用了HeLa S3细胞，一种表达显著量的RhoB蛋白且具有可检测的基础水平的活性RhoB的普通细胞系。测定Rho GTPase活性的标准方法基于使用GST-RBD的拉下试验(pull-down)。RBD是来自Rhotekin的Rho结合结构域，其是仅与GTP结合的Rho 相互作用的三种Rho的共同效应子。瞬时转染F-Ib 48h后，在用F-B6、 F-B15或F-H12转染的细胞中，RhoB基础活性部分的拉下低于对照 F-B20和F-NR。检测RhoA和RhoC允许评估它们的基础活性是否也受影响。如预期的，F-H12诱导了所有3种Rho活性部分水平的强烈降低。然而，F-B15和F-B6表达的3种活性Rho水平没有同样降低，说明它们与F-H12不具有相同的选择性。与诱导活性RhoB和RhoA 两者降解的F-B15 hs2dAb相反，F-B6没有诱导RhoA或RhoC拉下部分的明显调控(图4A)。定量表明，F-B6仅在这种细胞环境和试验条件下降解RhoB活性(图4B)。该结果是能够区分RhoB和RhoA 的GFP负载状态并能够允许他们细胞蛋白水解的分子的首个实例。
为研究用F-6转染后48h观察到的蛋白质敲低是否是直接和特异性的，我们靶向了Rho蛋白的细胞激活的快过程。实际上，已经报告在EGF处理后几分钟内RhoB和RhoA被活化，且RhoC的程度较低。血清饥饿24h后，在HeLaS3细胞中评估由EGF活化的各Rho的动力学。对于所有3种Rho，在刺激5分钟后立即观察到活化，并在15 分钟达到最大值，其被选为用于进一步实验的激活时间(图5C&D)。我们表征了F-H12和F-B6对于Rho活化的作用，证实了观察到的 RhoA/B活性的选择性降解。F-NR或F-B20对照没有防止EFG介导的Rho活化，实际上F-B6仅降解由EGF诱导的RhoB活性，而FH12 抑制所有Rho活性(图5C&D)。
总之，hs2dAb B6似乎是RhoB-GTP高度选择性胞内抗体，其能够阻断RhoB基础活性及其刺激活化，同时作为F-Ib发挥功能而不下调细胞RhoB的主要部分。
参考文献
贯穿本申请，各种参考文献描述本发明涉及的领域的现有水平。这些参考文献的公开内容在此通过引用引入本公开。
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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Gly Trp Arg Ala Glu Ala
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115 120
<210> 80
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> G12
<400> 80
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Gly Trp Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Ser Arg Ala Ser Ser Gln Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Val Trp Met Lys Met Gly Ile Glu Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR1-NB61
<400> 81
Thr Thr Trp Phe Asn Glu Val
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR2-NB61
<400> 82
Gly Ser Thr Ser Trp Ala Glu
1 5
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3-NB61
<400> 83
Arg Met Ser Phe Met Arg Ala Gly Arg Thr Pro Met Thr Pro Met
1 5 10 15
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR1-212B
<400> 84
Asp Thr Trp Trp Ser Ser Ala
1 5
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR2-212B
<400> 85
Phe Tyr Pro Thr Glu Tyr Thr
1 5
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3-212B
<400> 86
Trp Ile Ala Trp Gly Pro Trp Met Arg Thr Ser Trp
1 5 10
<210> 87
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR1-111B
<400> 87
Gly Thr Ser Lys Gln Tyr Gly
1 5
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR2-111B
<400> 88
Arg Gln Glu Gly Glu Thr Ile
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3-111B
<400> 89
Tyr Arg His Val Trp Pro Tyr Pro Glu
1 5
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR1-404F
<400> 90
Arg Thr Ser Lys Asn Tyr Ala
1 5
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR2-404F
<400> 91
Trp Thr Thr Asn Gln Asp Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDR3-404F
<400> 92
Ile Trp Asp Lys Arg Glu Ile Ser Ile
1 5
<210> 93
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> NB61
<400> 93
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Trp Phe Asn Glu Val
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Gly Ser Thr Ser Trp Ala Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Met Ser Phe Met Arg Ala Gly Arg Thr Pro Met Thr Pro Met
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 94
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 212B
<400> 94
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Trp Trp Ser Ser Ala
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Phe Tyr Pro Thr Glu Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Trp Ile Ala Trp Gly Pro Trp Met Arg Thr Ser Trp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 111B
<400> 95
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Ser Lys Gln Tyr Gly
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Arg Gln Glu Gly Glu Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Tyr Arg His Val Trp Pro Tyr Pro Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 96
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 404F
<400> 96
Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Ser Lys Asn Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ser
35 40 45
Ala Ile Ser Trp Thr Thr Asn Gln Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Trp Asp Lys Arg Glu Ile Ser Ile Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (17)

1.一种单域抗体，其中CDR1-IMGT、CDR2-IMGT和CDR3-IMGT的氨基酸序列与表B定义的H12、B6、4P75、4SP1、4SNP36、4SNP61、5SP10、5SP11、5SP58、5SNP47、5SNP48、5SNP65、B20、B15、B5、B71、E3、A6、G12、NB61、212B、111B或404F(hs2dAb)单域抗体的CDR1-IMGT、CDR2-IMGT和CDR3-IMGT的氨基酸序列具有至少90％一致性。
2.权利要求1所述的单域抗体，其包含H12、B6、4P75、4SP1、4SNP36、4SNP61、5SP10、5SP11、5SP58、5SNP47、5SNP48、5SNP65、B20、B15、B5、B71、E3、A6、G12、NB61、212B、111B或404F(hs2dAb)单域抗体的CDR1-IMGT、CDR2-IMGT和CDR3-IMGT。
3.权利要求1所述的单域抗体，其包含与SEQ ID NO：1具有至少90％一致性的框架区FR1。
4.权利要求1所述的单域抗体，其包含与SEQ ID NO：2具有至少90％一致性的框架区FR2。
5.权利要求1所述的单域抗体，其包含与SEQ ID NO：3具有至少90％一致性的框架区FR3。
6.权利要求1所述的单域抗体，其包含与SEQ ID NO：4具有至少90％一致性的框架区FR4。
7.权利要求1所述的单域抗体，其包含与SEQ ID NO：62-80和SEQ ID NO：93-96所示的氨基酸序列具有至少70％一致性的氨基酸序列。
8.权利要求1所述的单域抗体，其包含选自SEQ ID NO：62-80和SEQ ID NO：93-96所示的氨基酸序列的氨基酸序列。
9.权利要求1所述的单域抗体，其与异源多肽融合以形成融合蛋白。
10.权利要求1所述的单域抗体，其与免疫球蛋白结构域、单域抗体、载体多肽、荧光多肽、酶、促进融合蛋白的纯化或分离的多肽、细胞穿透肽或泛素连接酶结构域融合。
11.权利要求1所述的单域抗体，其与F-box结构域融合。
12.编码权利要求1所述的单域抗体的核酸分子。
13.包括权利要求12所述的核酸分子的载体。
14.用权利要求12所述的核酸分子转化的宿主细胞。
15.用于检测至少一种Rho GTPase活化形式的存在的方法，包括步骤：i)从受试者获得样品；ii)在体外将所述样品与权利要求1所述的单域抗体接触；iii)检测所述单域抗体与所述样品的结合；和iv)将步骤(iii)中检测的结合与标准比较，其中相对于所述样品的结合差异表明存在Rho GTPase活化形式。
16.权利要求1所述的单域抗体或权利要求12所述的核酸分子用作药物。
17.用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1所述的单域抗体或权利要求12所述的核酸分子。
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