CN101228187A - 针对突变p53的共同表位的人合成单链抗体及其用途 - Google Patents

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CN101228187A CNA2006800179299A CN200680017929A CN101228187A CN 101228187 A CN101228187 A CN 101228187A CN A2006800179299 A CNA2006800179299 A CN A2006800179299A CN 200680017929 A CN200680017929 A CN 200680017929A CN 101228187 A CN101228187 A CN 101228187A
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B·索洛蒙
S·奥加德
I·本哈
R·罗森菲尔德
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Abstract

提供了可以特异性结合由突变的而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位的分离的多肽、编码其的分离的多核苷酸或表达载体、病毒展示媒介物。还提供了使用通过本发明揭示的分离的多肽诱导凋亡和治疗癌症以及诊断p53相关癌症的方法。

Description

针对突变P53的共同表位的人合成单链抗体及其用途
发明领域和背景
本发明涉及使用针对p53突变蛋白的抗体治疗癌症的方法。
肿瘤抑制基因p53主要经由诱导凋亡来抑制肿瘤生长。p53肿瘤抑制基因中的突变是最普遍的遗传改变并且在超过一半的所有人肿瘤中发生。大约90％的这些改变是在负责野生型p53蛋白质与靶基因的序列特异性结合的DNA结合核心结构域中的错义突变。这些突变中的许多引起p53蛋白质中的共同构象变化，这导致原本隐藏在野生型p53分子内的表位暴露。
p53突变体在癌症进展中的涉及被提议与野生型p53的反式显性抑制、或野生型p53非依赖型致癌性“功能获得”相关。因为野生型p53形成四聚物以发挥其肿瘤抑制活性，所以一般公认的是突变p53与野生型p53的异聚作用驱动野生型蛋白质成为突变体或其他无活性构象，这导致反式显性抑制现象。突变p53的“功能获得”可能归因于2种互助的可能机制。一种是p53家族成员-p63和p73的肿瘤抑制活性的取消，发现所述p63和p73与突变p53而不是与野生型p53蛋白质物理地相互作用，并干扰其活性。第二种涉及突变p53反式激活或抑制调节这些突变体的各种致癌活性的特定基因的能力。发现核心结构域p53突变体反式激活一些基因，例如多重抗药性(MDR-1)、c-myc、增殖细胞核抗原(PCNA)、白介素-6(IL-6)和表皮生长因子受体(EGFR)和早期生长受体(EGR-1)，这些基因不同于由野生型p53激活的那些。
考虑到p53突变体在促进致肿瘤性中的活性作用，已付出努力灭活其功能或使其回复野生表型。这些包括导入第二种位点抑制突变(例如，N239Y、N268D和H168R)，其可以至少部分地恢复与突变p53的特异性DNA结合。另外发现来源于p53蛋白质C末端的合成肽、或CDB3，即一种p53结合蛋白(p53BP2)来源的化合物恢复DNA结合，随后为转录反式激活，以及诱导p53依赖性的肿瘤细胞凋亡。此外，低分子量化合物例如CP-31398和PRIMA-1显示恢复野生型构象，转录反式激活和诱导携带突变p53的细胞和人肿瘤异种移植物中的凋亡。然而，此类肽和化合物缺乏区别野生型和突变形式的p53的能力，即对于靶向治疗关键的特性。
因此，特异性靶向广泛范围的p53突变体而不是野生型p53蛋白质的新型抗癌治疗形式是希望的。
在p53蛋白质中发现的超过90％的突变引起p53蛋白质中的构象变化，这导致在原本隐藏在分子的疏水核心内的表位暴露。此类表位定位于人p53蛋白质(GenBank登记号NP_000537)的氨基酸212-217或小鼠p53蛋白质(GenBank登记号NP_035770)的氨基酸209-214，并具有FRHSVV(SEQ ID NO：1)的序列。先前研究描述了由用SEQ IDNO：1免疫的小鼠制备的单链scFv小鼠抗体的分离。发现这种抗体(称为ME1)表达于哺乳动物细胞的胞质溶胶中，并且以10-7M的亲和力结合突变p53蛋白质而不是野生型p53蛋白质(Govorko D，Cohen G和Solomon B.2001，J.Immunol.Methods.258：169-81)。然而，尽管这种抗体呈现了用于阐明突变p53在肿瘤转化中的作用的有用工具，但由于其小鼠起源及其对突变的p53的中等亲和力，其治疗应用是有限的。
因此普遍认识到需要能够以高亲和力特异性靶向突变p53蛋白质的人来源抗体，并且这将高度有利的。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了包括编码多肽的核酸序列的分离的多核苷酸，所述多肽能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位，其中所述特异性结合的亲和力小于25纳摩尔。
根据本发明的另一方面，提供了分离的多核苷酸，其包括编码包含CDR的多肽的核酸序列，所述多肽包括选自CDR SEQ ID NOs：8-112的至少一种CDR。
根据本发明的再一方面，提供了包括氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位，其中特异性结合的亲和力小于25纳摩尔。
根据本发明的另外一个方面，提供了分离的多肽，其包括选自CDRSEQ ID NOs：8-112的至少一种CDR的氨基酸序列。
根据本发明的再一方面，提供了药物组合物，其包括作为活性成分的分离的多核苷酸以及药学可接受载体。
根据本发明的再另外的方面，提供了核酸构建体，其包括分离的多核苷酸以及用于指导所述分离的多核苷酸在细胞中表达的启动子。
根据本发明的一个进一步的方面，提供了诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞的方法，其包括使分离的多肽与所述癌细胞接触或在其中表达，从而诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了治疗患有或易患p53相关癌症的受试者的方法，其包括给受试者施用、或在其细胞中表达治疗有效量的分离的多肽，从而治疗受试者中的p53相关癌症。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了诊断受试者中的p53相关癌症的方法，其包括：(a)在适合于免疫复合物形成的条件下使受试者的生物样品与分离的多肽接触，所述免疫复合物包括分离的多肽和p53突变蛋白；和(b)检测免疫复合物的形成，从而诊断受试者中的癌症。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了分离的多肽用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了分离的多核苷酸用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了核酸构建体用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了包括在表面上表达多肽的病毒展示媒介物(viral display vehicle)的组合物，所述多肽能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位，其中特异性结合的亲和力小于25纳摩尔。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了包括在表面上表达包含CDR的多肽的病毒展示媒介物的组合物，所述多肽包括选自CDR SEQID NOs 8-112的至少一种CDR。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了药物组合物，其包括作为活性成分的病毒展示媒介物以及药学可接受载体。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞的方法，其包括使病毒展示媒介物与癌细胞接触，从而诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了治疗患有或易患p53相关癌症的受试者的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的病毒展示媒介物，从而治疗受试者中的p53相关癌症。
根据本发明再一个进一步的方面，提供了病毒展示媒介物用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
根据本发明下述药物组合物的优选实施方案中进一步的特征，表位如SEQ ID NO 1所示。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多肽包括选自SEQ IDNOs 39-41、45-47和60-62的至少一种CDR。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多肽选自Fab片段、Fv片段、单链抗体、单结构域抗体和抗体。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，单链抗体选自SEQ IDNO：113、SEQ ID NO：114和SEQ ID NO：115。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，核酸构建体进一步包括编码与分离的多肽融合的核定位信号(NLS)的另外的核酸序列。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，NLS由SEQ ID。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多核苷酸进一步包括编码药物的另外的核酸序列。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多肽进一步包括药物的氨基酸序列。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多肽附着至药物。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，药物是毒素和/或化学治疗药物。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多核苷酸进一步包括编码可检测标记的另外的核酸序列。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，多肽进一步包括可检测标记。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，可检测标记是生物素和洋地黄毒苷。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，生物样品选自血液、淋巴结活检物、骨髓抽吸物和组织样品。
根据描述的优选实施方案中再进一步的特征，Fab片段、Fv片段、单链抗体、单结构域抗体和抗体中的每一种都是人源化的。
本发明通过提供抗体和经由使用针对突变p53蛋白质的抗体抑制细胞生长并诱导凋亡的方法成功地解决了目前已知构型的缺点。
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述那些相同或相似的方法和材料可以在本发明的实践或测试中使用，下文还是描述了合适的方法和材料。在冲突的情况下，以本专利说明书包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不希望是限制性的。
附图简述
本发明在本文中根据仅作为例子的附图进行描述。现在详细地具体参考附图，应强调的是显示的细节仅作为例子和用于本发明优选实施方案的说明性讨论的目的，并且为提供认为是本发明原理和概念方面最有用和容易理解的描述而呈现。在这点上，不试图显示比对于本发明基础理解所需更详细的本发明的结构细节，说明书连同附图使得本发明的几种形式如何能够在实践中实现对于本领域技术人员是显而易见的。
在附图中：
图1a-b描述了选择用于结合突变p53的共同表位(FRHSVV；SEQID NO 1)的20个人scFv克隆的氨基酸序列比对。scFvs由SEQ IDNOs 113-132列出。图1a描述了可变重链(VH)(1-119)的氨基酸，并且图1b描述了可变轻链(VL)(135-245)的氨基酸；针对突变p53共同表位的20种人scFvs。红色＝相同的氨基酸，蓝色＝具有低一致值(超过50％同一性)的氨基酸，和黑色＝小于50％同一性的氨基酸。CDRs由黑条指出。
图2a-b描述了F2scFv(在本文中也称为“TAR1”)(图2a)和E6scFv(图2b)克隆与FRHSVV(SEQ ID NO：1)表位的结合。结合使用BIACore以指定的抗体浓度进行测定。F2和E6scFv克隆的VH和VL链的序列在图1a-b中显示。RU＝共振单位。结合常数使用由BIAcore仪器(www.Biacore com)供应的软件进行测定。
图3的条形图描述了如使用ELISA测定的scFv F2与完整p53分子的结合。ELISA板用野生型p53或突变p53-R175H、p53-R248H和p53-R273W完整p53蛋白质包被，所述突变p53蛋白质由重组杆状病毒感染的sf9昆虫细胞(Hupp T.R和Line D.P，Curr Biol.1994，4：865-875)制备，并加入250ng scFv F2。与野生型p53的低结合比较，注意到scFv F2与R175H-突变p53分子的特异性结合。
图4a-j的FACS分析描述了scFv F2在p53无效人肺癌细胞(H1299p53-/-；图4f-j)或携带热点突变R175H的人肺癌细胞(H1299-R175H；图4a-e)中对凋亡的影响。细胞与下列浓度的scFv-F2一起温育24小时：0nM(未处理的细胞，图4a和f)，250nM(图4b和g)，500nM(图4c和h)，1μM(图4d和1)和2μM(图4e和j)。24小时后，细胞用乙醇固定，用碘化丙啶染色并测定细胞周期谱。数字指出在每种制剂中凋亡细胞的％[0.8％(图4a)，1.9％(图4c)，21.8％(图4d)，32 2％(图4e)，0-0.8％(图4f-j)]。注意到在scFv-F2抗体的存在下表达R175H p53突变的细胞中凋亡显著增加。
图5的条形图描述了表达scFv F2抗体的细胞对药物处理的敏感性增加。携带R175H突变(H1299-R175H)的人肺癌细胞稳定转染以表达scFv F2抗体(H1299-R175H-scFv-F2)，并且在药物处理后48小时测定依托泊苷和顺铂药物对细胞存活的影响(通过细胞计数)。注意到在表达scFv-F2抗体的细胞中肺癌细胞对低浓度顺铂(0 5μg/ml)或依托泊苷(1μM)的敏感性增加。
图6a-d描述了在表达scFv-F2抗体的肺癌细胞中集落形成的抑制。H1299-R175H细胞稳定转染以表达scFv F2抗体(H1299-R175H-scFv-F2)，并测定scFv F2的细胞内表达对集落形成的影响。500-1000细胞/板的H1299-R175H细胞或H1299-R175H-scFv-F2细胞种植在包含RPMI培养基的板上并允许生长2周。图6a-b是培养2周后呈现的姬姆萨染色集落的照片。图6a-H1299-R175H细胞；图6b-H1299-R175H-scFv-F2细胞。图6c-d的条形图描述了培养2周后H1299-R175H或H1299-R175H-scFv-F2细胞的集落数目(图6c)和集落面积(图6d)。注意到在表达scFv F2抗体的细胞中集落数目(图6c)和集落面积(图6d)都减少。
图7的图描述了scFv F2对小鼠中的人肿瘤细胞异种移植物的抗肿瘤效应。裸小鼠皮下注射5×106肺癌H1299-R175H细胞。3天后，小鼠接受200μg scFv F2或作为对照的PBS(50μl)的瘤内注射，这在2周的过程中每隔一天重复一次。在接种H1299-R175H细胞后6、15、21、25、28、32和36天测量肿瘤大小并计算肿瘤体积。结果表示为相对体积Vt/Vo，其中Vt是指定天数的体积，并且Vo是第一次scFv F2注射的体积。
图8a-f描述了scFv F2抗体对体内肿瘤生长的影响。小鼠皮下注射H1299-R175H细胞的人异种移植物，随后如对于图7所述，进行瘤内注射。显示的是注射PBS的小鼠(图8d-f)与注射scFv F2的小鼠(图8a-c)比较的代表性照片。箭头指向异种移植物和肿瘤形成的位置。注意到在PBS处理的小鼠(图8a-c)中存在大肿瘤并且在scFv F2处理的小鼠(图8d-f)中不存在此类肿瘤。
图9的条形图描述了scFvs的结合特异性。ELISA使用来自图1a-b中所述分离的scFv集合的F2、A4和B6scFvs进行。结合抗原是牛血清白蛋白(BSA；泳道5)、链霉亲和素(泳道6)和下列肽：FRHSVV(SEQ ID NO：1；突变p53的共同表位；泳道1)、β淀粉样蛋白肽的氨基酸1-16DAEFRHDSGYEVHHQK(SEQ ID NO 2；泳道2)、呈现人朊病毒蛋白质的多抗原肽的氨基酸144-153(MAP-PrPDYEDRYYRE；SEQ ID NO：3；泳道3)和对应前列腺癌抗原的肽(PaPILLWQPIPV；SEQ ID NO 4；泳道4)。注意到F2和A4抗体对于代表突变p53的共同表位(SEQ ID NO：1)的肽的高结合特异性。
图10a-d的条形图描述了使用TAR1抗体(图10a)或对野生型p53特异的mAB 1620(图10b-d)对重组p53野生型或突变核心结构域进行的ELISA测定法。图10a-TAR1与突变p53R175H核心结构域(黑色)和野生型p53核心结构域(灰色)的结合。注意到与p53野生型核心结构域(约0 05 O D )相比，TAR1抗体对p53突变体R175H核心结构域(约0 5 O D )的高特异性。图10b-mAb 1620与突变p53R175H核心结构域(黑色)和野生型p53核心结构域(灰色)的结合。注意到与突变p53 R175H核心结构域(约0.3 O.D.)相比，mAb 1620对p53野生型核心结构域(约1 2 O D )的高特异性。图10c和d-p53突变体(R175H)(图10c)或野生型(图10d)核心结构域在缺乏(灰色柱)或存在(黑色柱)0 4μM TAR1的条件下于37℃加热30或60分钟，并测试mAb 1620的结合。注意到在加热后和TAR1的存在下，突变p53与野生型特异性抗体(mAb 1620)的结合比缺乏TAR1的条件下高3倍(图10c)。还注意到在TAR1的存在下mAb 1620与野生型p53核心结构域的结合较高(图10d)。这些结果证实TAR1诱导突变p53中的构象变化并稳定野生型p53的构象。
图11a-b的免疫沉淀测定法描述了mAb DO-12mAb，即一种p53-特异性抗体与野生型或R175H突变p53的结合。图11a-在与80nMTAR1一起过夜温育前(泳道1和2)或后(泳道3和4)使用DO-12mAb对p53突变体(R175H；泳道1和3)或野生型(WT；泳道2和4)核心结构域实施免疫沉淀反应。注意到与野生型p53核心结构域(泳道2)的低结合特异性相比，mAb DO-12对R175H核心结构域(泳道1)的高结合特异性。还注意到与80nM TAR1一起过夜温育后，mAb DO-12与突变体R175H p53核心结构域的结合显著减少(泳道3)，而mAbDO-12与野生型p53核心结构域的结合不受影响(泳道4)。图11b-表达突变p53 R175H的H1299细胞用1μM TAR1处理过夜，并且提取物与mAb 1620(p53野生型-特异性抗体)一起免疫沉淀。注意到mAb 1620与表达突变p53的细胞的蛋白质提取物的结合以TAR1剂量依赖性方式显著增加，证实TAR1能够恢复体内p53R175H突变体中的野生型p53构象。
图12的圆二色性分析描述了在TAR1抗体的存在下野生型或R175H突变p53核心结构域的光谱。圆二色性测量结果同时对于野生型p53或突变p53 R175H核心结构域以及TAR1分开获取(TAR1/WT；TAR1/R175H)或作为免疫复合物(TAR1+WT复合物；TAR1+R175H复合物)获取。注意到TAR1的结合引起突变p53光谱中的位移，而在野生型核心结构域的光谱中几乎没有观察到差异，表明TAR1和突变p53的复合物中的构象变化。还注意到含野生型p53以及含突变p53的2种TAR1复合物的光谱是非常相似的，表明构象相似性。
图13a-h是用抗p21(图13a)、MDM2(图13b)、Egr1(图13c)、Bax(图13d)和微管蛋白(图13e-h)抗体探测表达R175H突变p53的H1299细胞提取物的蛋白质印迹分析，证实了TAR1处理对突变p53(R175H)的转录反式激活的影响。稳定表达突变p53的H1299细胞用终浓度为05μM(泳道2)或1μM(泳道3)的TAR1处理24小时，或保持未处理(泳道1)，其后制备蛋白质样品并使用下列抗体对其实施蛋白质印迹分析：抗p21(Santa Cruz Biotechnology，Inc.1∶1000稀释)、MDM2(由M Oren赠予，1 40稀释的杂交瘤上清液)、Egr1(SantaCruz Biotechnology，Inc，，1500稀释)、Bax(Abcam Laboratories，Ltd，UK，1 1000稀释)、微管蛋白(Sigma，1∶2500稀释)。微管蛋白的表达水平充当加样对照。注意到TAR1处理后p21、MDM2和Bax表达水平的浓度依赖性增加，证实TAR1能够恢复对突变p53的转录反式激活功能。相反，注意到TAR1处理导致Egr1表达水平减少，证实TAR1取消了p53突变蛋白的功能活性获得。
图14的条形图描述了图13a-h中显示的蛋白质印迹分析的定量。在处理或未处理细胞中每种蛋白质的表达水平通过微管蛋白的表达水平标准化。白色条-未处理的细胞；灰色条-用0.5μM TAR1处理24小时的细胞；黑色条-用1μM TAR1处理24小时的细胞。
图15a-h的荧光激活细胞分选术(FACS)分析描述了TAR1(scFv-F2)p53无效的H1299人肺癌细胞(图15c-d)、表达突变p53的H1299-R175H细胞(图15a-b)、或表达野生型p53(图15g-h)或突变体R175H p53(图15e-f)的HCT116结肠癌细胞中凋亡的影响(图15c-d)。细胞与1μM TAR1(图15b、d、f和h)一起温育24小时或保持未处理(图15a、c、e和g)，其后细胞用乙醇固定，用碘化丙啶染色并测定其细胞周期特征。注意到在TAR1抗体的存在下与具有无效p53的癌细胞或表达野生型p53蛋白质的细胞(图15d和h)比较，在表达R175H p53突变(图15b和f)的细胞中凋亡(Ap级分)显著增加。
图16a-d是在缺乏(图16a和c)或存在(图16b和d)1μM TAR1的条件下对p53无效的H1299细胞(图16c-d)或表达突变p53R175H的H1299细胞(图16a-b)的TdT-介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)。稳定转染以表达突变p53(R175H；图16a-b)或未转染(图16c-d)的H1299细胞用TAR1(终浓度为1μM)处理24小时(图16b和d)或保持未处理(图16a和c)，并使用TUNEL测定法(R&DSystems，Inc)测定处理的效应。
图17a-r的FACS分析描述了TAR1(scFv-F2)对内源性表达不同p53突变的9种细胞株中凋亡的影响。LAN1(图17a-b)、T47D(图17c-d)、SKBR3(图17e-f)、MCF7(图17g-h)、KM12-C(图17i-j)、SW480(图17k-1)、PANC1(图17m-n)、结肠320(图17o-p)和MDA231(图17q-r)癌细胞株用1μM TAR1处理24小时(图17b、d、f、h、j、l、n、p和r)或保持未处理(图17a、c、e、g、i、l、m、o和q)，其后对细胞实施如图15a-h中描述的碘化丙啶FACS分析。指出在亚-G1级分中的细胞百分比。注意到用TAR1抗体处理后凋亡显著增加。
图18a-b的示意性图解描述了包括PEP内化肽的噬菌体的构建。图18a-克隆到fd-Tet f88-4载体(Modified from Chen，L ，等人，2004，Chem.&Biol 11，1081-1091)内的噬菌体PEP的示意图。还显示了PEP肽(EFGACRGDCLGA；SEQ ID NO：136)的序列；图18b-展示PEP肽的fd-Tet噬菌体f88-4载体在tac启动子的调节下通过克隆到pVIII基因重组拷贝的HindIII和PstI位点内融合至约150个拷贝的pVIII。注意到为了指导噬菌体将本发明的抗-p53抗体(例如TAR1)递送到核内，核定位信号(NLS)肽(SEQ ID NO：134)可以融合至抗体，并且这种融合蛋白可以克隆到噬菌体蛋白质III(图18b)的下游，以产生在其蛋白质III上展示TAR1-NLS的噬菌体。
图19a-c的共焦显微镜图像描述了噬菌体PEP在CHO细胞中的免疫荧光分析并证实噬菌体的内化依赖于噬菌体浓度。CHO细胞在指定浓度的噬菌体PEP(1011-图19a；109-图19b；106-图19c；噬菌体/孔)的存在下与膜红色分子染料(CM-DiI分子探针)一起温w育48小时。内化的噬菌体颗粒(绿色)用小鼠抗M13抗体随后为山羊抗小鼠cy2缀合抗体检测。细胞使用共焦显微镜显现。注意到噬菌体PEP的内化是浓度依赖性的；如通过细胞内较高强度的绿色标记判断的，在细胞内检测到的噬菌体数目与培养基中的噬菌体浓度正相关。
图20a-w的共焦显微镜图像描述了噬菌体PEP在CHO细胞中的免疫荧光分析并证实噬菌体穿透到哺乳动物CHO细胞内。显示的是在CHO细胞的细胞切片深度上的共焦系列，所述CHO细胞与膜分子染料和终浓度为1011个噬菌体/孔的噬菌体PEP一起温育48小时。内化的噬菌体颗粒用小鼠抗M13抗体随后为山羊抗小鼠cy2缀合抗体(绿色)检测。膜用CM-DiI分子探针显现(红色)。
图21的条形图描述了与噬菌体PEP一起温育后的CHO细胞的MTT分析。CHO细胞与109pfu噬菌体PEP、野生型(W.T.)噬菌体、硫柳汞(细胞杀伤的对照)和PBS(只有细胞)一起温育48小时，并通过MTT分析测量细胞存活力。误差条表示由各自重复4次的3次独立实验计算的标准差值。注意到噬菌体PEP对CHO细胞无毒。
优选实施方案的描述
本发明是关于可以特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位的分离的多肽、编码其的分离的多核苷酸或表达载体。具体地，本发明可以用于诱导凋亡并治疗p53相关癌症。另外，本发明可以用于诊断受试者中的p53相关癌症。
根据本发明能够结合由突变p53蛋白质共有的暴露表位的分离多肽的原理和操作通过参考附图和伴随的描述可以更好地理解。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应当理解本发明的应用不限于下列描述中阐述或通过实施例例示的细节。本发明可以是其他实施方案或以各种方式实践或执行。同样地，应当理解本文采用的措词和术语是用于描述性目的并且不应被视为限制性的。
肿瘤抑制基因p53主要经由诱导凋亡来抑制肿瘤生长。癌症进展中p53突变体的参与被提议与野生型p53的反式显性抑制、或野生型p53非依赖型致癌性“功能获得”相关。考虑到p53突变体在促进致肿瘤性中的活性作用，已付出努力灭活其功能或使其回复野生表型。这些包括导入第二种位点抑制突变、来源于p53蛋白质C末端的合成肽、或CDB3来源的化合物和低分子量化合物，其显示恢复野生型构象，转录反式激活和诱导携带突变p53的细胞和人肿瘤异种移植物中的凋亡。然而，此类肽和化合物缺乏区别野生型和突变体形式的p53的能力，即对于靶向治疗关键的特性。
先前研究针对开发新型抗癌治疗/诊断形式，其特异性靶向/识别广泛范围的p53突变体而不是野生型p53蛋白质。例如，Gannon JV和同事产生了针对p53突变蛋白的共同表位的小鼠单克隆抗体[PAb-240，EMBO J 1990 9(5) 1595-602]。然而，由这种杂交瘤克隆生产单链抗体的努力失败了，从而限制了此类抗体的治疗应用。这种抗体的真正用途被提议只用于诊断应用。近来，分离了单链Fv(scFv)小鼠抗体(ME1)并发现能够以10-7M的亲和力专有地结合突变p53蛋白质而不是野生型p53蛋白质(Govorko D，Cohen G和Solomon B，2001，J ImmunolMethods 258：169-81)。然而，尽管这种抗体呈现了用于阐明突变p53在肿瘤转化中的作用的有用工具，但由于其小鼠起源及其对突变的p53的中等亲和力，其治疗应用是有限的。
在将本发明变为实践的同时，本发明人已从人合成组合文库中分离了scFvs[Azriel-Rosenfeld R，等人，2004，J.Mol.Biol 335(1)：177-92]，其能够以小于25纳摩尔(nM)的结合亲和力特异性结合由突变p53蛋白而不是野生型p53共有的表位。
如图2a-b、3和9中所示以及随后实施例部分的实施例1和2中所述，F2(TAR1)和E6 scFvs分别显示了对于由突变体而不是野生型p53蛋白共有的共同表位(SEQ ID NO：1)具有1.1×10-8和4.6×10-14M的亲和力。另外，A6 scFv的BIAcore分析显示对于共同表位(SEQ IDNO：1)(数据未显示)具有2 3×10-8M的结合常数。类似地，F2 scFv(TAR1)显示出对于表达重度(R175H)或中等(R248W)构象突变的完整p53蛋白质而不是对于野生型p53蛋白质的高亲和力。另外，TAR1抗体显示能够恢复突变p53核心结构域的野生型构象(图10a-d、11a-b和12，随后实施例部分的实施例5)和野生型p53的转录反式激活功能(例如激活野生型特异性靶基因例如p21、MDM2和Bax)，同时阻止突变p53的转录激活(例如下调Egr1)(图13a-h、14以及随后实施例部分的实施例6)。作为多肽施用、在噬菌体上展示或表达为细胞内抗体的此类抗体因此可以用于p53相关癌症的有效治疗。
因此，根据本发明的一个方面，提供了包括氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位，其中特异性结合的亲和力小于25nM。
如本文使用的短语“p53蛋白质”指TP53肿瘤蛋白p53，即在细胞周期调节特别是从G0到G1的转变中起关键作用的核蛋白。p53是包含DNA结合、寡聚化和转录激活结构域的DNA结合蛋白。p53已从各种来源中克隆，包括但不限于，人[GenBank登记号NP_000537(蛋白质)和NM_000546(mRNA)]、小鼠[GenBank登记号NP_035770(蛋白质)和NM_011640(mRNA)]、大鼠[GenBank登记号NP_112251(蛋白质)和NM_030989(mRNA)]和斑马鱼(Zebrafish)[GenBank登记号NP_571402(蛋白质)和NM_131327(mRNA)]，并且p53蛋白质的编码序列可经由例如NCBI网站(http.//www.ncbi nlm.nih.gov)获得。
短语“暴露表位”指在野生型p53蛋白质中隐藏在疏水核心内，但在p53突变体中经历中等或重度构象变化而暴露于蛋白质外表面的任何抗原决定簇。例如，此类暴露表位可以是FRHSVV(SEQ ID NO 1)，其在携带中等和重度突变的R248W和R175H的p53蛋白质中是暴露的，但在野生型p53蛋白质中是隐藏的。
短语“特异性结合的亲和力”指本发明的分离的多肽与由p53突变蛋白共有的暴露表位的结合亲和力。此类亲和力可以使用本领域已知的可以计算解离(Kd)或结合常数(Ka)的方法测量[例如BIAcore系统(Biacore AB，Uppsala，Sweden)，斯卡恰特作图分析]。根据本发明的这个方面，表征的本发明多肽的亲和力具有小于25nM的解离常数，优选小于12nM，优选小于1nM，优选小于0.1nM，并再更优选小于0.01nM。
本发明的这个方面的抗体能够中和突变p53的活性，例如阻止其转录激活活性(如图13-14和随后实施例部分的实施例6中证实的)。
本发明的分离的多肽可以是任何合成、天然存在或重组表达的多肽，其能够结合由p53突变蛋白而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位。此类多肽优选是抗体或抗体片段。
如本发明中使用的，术语“抗体”包括针对至少部分由重组DNA技术产生的抗原表位的完整分子及其功能性片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv或单结构域分子例如VH和VL。这些功能性抗体片段定义如下：(1)Fab，这是包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体产生，以得到完整的轻链和1条重链的一部分；(2)Fab′，这是可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体随后还原获得的抗体分子片段，以得到完整的轻链和重链的一部分；每个抗体分子获得2个Fab′片段；(3)(Fab′)2，这是可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体而不含后续还原获得的抗体片段；F(ab′)2是通过2个二硫键结合的2个Fab′片段的二聚物；(4)Fv，定义为表达为2条链、包含轻链可变区和重链可变区的基因改造片段；(5)单链抗体(“SCA”)，包含轻链可变区和重链可变区的基因改造分子，通过合适的多肽连接体连接为基因融合的单链分子(scFv)；和(6)单结构域抗体由显示对抗原足够的亲和力的单VH或VL结构域组成。
如本文使用的，术语“抗体”不仅包括通过免疫接种和重组噬菌体展示技术产生的抗体，还包括被产生以包括至少一种互补决定区(CDR)的任何多肽，其能够特异性结合由突变p53而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位。因此，本发明的抗体可以由包括抗体的至少一种CDR的编码序列的多核苷酸序列表达(如下文进一步描述的)。
为了增加抗体对于由突变体而不是野生型p53共有的暴露表位的亲合力，本发明的抗体优选至少是二价的。此类抗体可以克隆到IgG亚型(这是二价的)、IgM(这是五价的)或使用本领域已知的方法选择的此类亚型内。可替代地，单链可变片段(scFvs)的亲和力可以基本上如Cloutier SM，等人，2000，Mol.Immunol.37(17)：1067-77中所述，通过在链霉亲和素上四聚体化随后通过酶BirA的位点特异性生物素化来增加。
生产多克隆和单克隆抗体及其片段的方法是本领域众所周知的(参见例如引入本文作为参考的Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1988)。
根据本发明的抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌或哺乳动物(例如中国仓鼠卵巢细胞培养或其他蛋白质表达系统)中表达编码片段的DNA来制备。抗体片段可以通过常规方法经由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体以提供称为F(ab′)2的5S片段来获得。这种片段可以使用硫醇还原剂进一步切割，和任选地使用二硫键切割产生的巯基的阻断基，以产生3.5S Fab′单价片段。可替代地，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生2个单价Fab′片段和Fc片段。这些方法由例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647以及其中包含的参考文献描述，所述专利在此整体引入作为参考。还参见Porter，R R.[Biochem.J.73：119-126(1959)]。可以使用切割抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，片段的进一步切割，或其他酶促、化学或遗传技术，只要片段结合由完整抗体识别的抗原。
Fv片段包括VH和VL链的缔合。如Inbar等人[Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 69：2659-62(19720]中描述的，这种缔合可以是非共价的。可替代地，可变链可以通过分子间二硫键连接或通过化学试剂例如戊二醛交联。优选地，Fv片段包括通过肽连接体连接的VH和VL链。这些单链抗原结合蛋白(scFv)通过构建包括DNA序列的结构基因来制备，所述DNA序列编码由寡核苷酸连接的VH和VL结构域。结构基因插入表达载体中，其随后引入宿主细胞例如大肠杆菌中。重组宿主细胞合成含有桥接2个V结构域的连接体肽的单多肽链。生产scFvs的方法由例如Whitlow和Filpula，Methods 2：97-105(1991)；Bird等人，Science242 423-426(1988)；Pack等人，Bio/Technology 11：1271-77(1993)；以及在此整体引入作为参考的美国专利号4,946,778描述。
另一种形式的抗体片段是编码单互补决定区(CDR)的肽。CDR肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码目的抗体的CDR的基因获得。此类基因通过例如使用聚合酶链式反应合成来自抗体生产细胞的RNA的可变区来制备。参见，例如Larrick和Fry[Methods，2：106-10(1991)]。
人源化形式的非人(例如鼠类)抗体是免疫球蛋白的嵌合分子、免疫球蛋白链或其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列的片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合序列)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基由具有所需特异性、亲和力和能力、来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基代替。在某些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基由相应的非人残基代替。人源化抗体还可以包括在受体抗体或引入的CDR或构架序列中不存在的残基。一般而言，人源化抗体将基本上包括至少一个并且一般是2个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的构架区(FR)是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最理想地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的那种[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；and Presta，Curr.Op.Struct Biol.2593-596(1992)]。
对非人抗体进行人源化的方法是本领域众所周知的。一般地，人源化抗体含有由非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为引入残基，其一般取自引入的可变结构域。人源化可以基本上根据Winter和同事[Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)]的方法进行，通过用啮齿动物的CDRs或CDR序列取代人抗体的相应序列。相应地，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中显著上少于完整的人可变结构域的序列已由来自非人种类的相应序列取代。在实践中，人源化抗体一般是某些CDR残基和可能的某些FR残基由来自啮齿动物抗体中类似位点的残基取代的人抗体。
人抗体还可以使用本领域已知的各种技术包括噬菌体展示文库[Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581(1991)]来生产。Cole等人和Boerner等人的技术同样可用于制备人单克隆抗体(Cole等人，Monoclonal Antibodies和Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerner等人，J.Immunol，147(1)：86-95(1991)。体内形成的CDRs在种系来源的人可变区构架上组合改组的大型人合成单链Fv抗体文库的构建也是可利用的[Azriel-Rosenfeld R，等人，2004.A human synthetic combinatoriallibrary of arrayable single-chain antibodies based on shuffling in vivoformed CDRs into general framework regions J.Mol Biol.335(1)：177-92]。类似地，人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因已部分或完全灭活的小鼠中来制备。攻击后观察到人抗体生产，其在包括基因重排、装配和抗体文库的所有方面非常类似人抗体。这种方法在例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及下列科学出版物：Marks等人，Bio/Technology 10，：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368 812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14，845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；and Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol 13，65-93(1995)中描述。
应当理解使用细胞内抗体(也称为“胞内抗体”)可以达到细胞内特定隔室的靶向作用。这些基本是已添加细胞内定位信号(例如，ER、线粒体、核、细胞质)的SCA。这种技术已成功地应用于本领域中(关于综述，参见Richardson和Marasco，1995，TIBTECH第13卷)。细胞内抗体已显示基本上消除在原本丰富的细胞表面受体的表达并抑制细胞内的蛋白质功能(参见，例如，Richardson等人，1995，Proc Natl.Acad Sci USA 92：3137-3141；Deshane等人，1994，Gene Ther.1：332-337；Marasco等人，1998 Human Gene Ther 9：1627-42；Shaheen等人，1996J Virol 70：3392-400；Werge，T M 等人，1990，FEBSLetters 274：193-198；Carlson，J R.1993 Proc Natl Acad Sci USA90：7427-7428；Biocca，S.等人，1994，Bio/Technology 12：396-399；Chen，S-Y.等人，1994，Human Gene Therapy 5595-601；Duan，L等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91.5075-5079；Chen，S-Y等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5932-5936；Beerli，R R等人，1994，J.Biol Chem.269：23931-23936；Mhashilkar，A.M.等人，1995，EMBO J 14：1542-1551；Marasco等人的PCT公开号WO 94/02610；和Duan等人的PCT公开号WO 95/03832)。
为了制备细胞内抗体表达载体，一般从分泌对于标记特异的单克隆抗体的杂交瘤中分离编码对于目的靶蛋白特异的抗体轻和重链的cDNA。分泌抗标记单克隆抗体或重组单克隆抗体的杂交瘤可以使用本领域已知的方法制备。一旦鉴别了对于标记蛋白特异的单克隆抗体(例如杂交瘤来源的单克隆抗体或来自组合文库的重组抗体)，就可以通过标准分子生物学技术分离编码单克隆抗体的轻和重链的DNAs。对于杂交瘤来源的抗体，通过例如PCR扩增或cDNA文库筛选可以获得轻和重链cDNAs。对于重组抗体，例如来自噬菌体展示文库，可以从文库筛选过程中分离的展示包装(例如噬菌体)中回收编码轻和重链的cDNA，并测定抗体轻和重链基因的核苷酸序列。例如，许多此类序列在Kabat，E A，等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEditon，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242以及“Vbase”人种系序列数据文库中公开。一旦获得，就使用标准方法将抗体轻和重链序列克隆到重组表达载体内。
对于轻和重链的细胞质表达，去除编码轻和重链的疏水性前导序列的核苷酸序列。为了将抗体的表达导向细胞核，优选将核定位信号编码序列(例如，DPKKKRKV；SEQ ID NO：134)连接至编码抗体的核酸构建体，优选抗体编码序列的下游。此类构型的非限制性例子在随后实施例部分的材料和实验方法中提供。细胞内抗体的表达载体可以编码几种不同形式之一的细胞内抗体。例如，在一个实施方案中，载体编码全长抗体的轻和重链，从而使得全长抗体在细胞内表达。在另一实施方案中，载体编码全长轻链但只有重链的VH/CH1区，从而使得Fab片段在细胞内表达。在另一实施方案中，载体编码单链抗体(scFv)，其中轻和重链的可变区通过柔性肽连接体[例如，(Gly4Set)3]连接，并表达为单链分子。为了抑制细胞中的标记活性，编码细胞内抗体的表达载体通过如下文讨论的标准转染方法引入细胞内。
根据本发明的这个方面的优选实施方案，本发明的多肽是包括由IDNOs：8-112所示的至少一种CDR序列的重组多肽。例子包括但不限于F2 scFv(SEQ ID NO：113)、E6scFv(SEQ ID NO：114)和A6scFv(SEQ ID NO：115和/或包括至少一种CDR或scFv序列的任何IgG克隆。优选地，本发明的多肽包括如SEQ ID NOs：39-41、45-47和60-62所示的至少一种CDR。
根据本发明的这个方面的优选实施方案，本发明的多肽可以是Fab片段、Fv片段、单链抗体和单结构域抗体。可以连同本发明一起使用的单链抗体的非限制性例子包括F2 scFv(SEQ ID NO：113)和E6 scFv(SEQ ID NO：114)以及A6 scFv(SEQ ID NO：115)，所有这些显示出对于由p53突变体而不是野生型p53共有的暴露表位的高亲和力(解离常数小于25nM)。
如随后实施例部分表3-5中所示，本发明人已分离了特异性结合突变p53共同表位(SEQ ID NO：1)的20种不同scFvs。这些scFvs共有相同的重链可变区(表3)并且在其轻链可变区方面不同(表4)。表5呈现了可变轻链的独特CDRs，其可以特异性结合由p53蛋白质的各种突变体而不是由野生型p53蛋白质共有的p53表位。
因此，根据本发明的另一方面，提供了分离的多肽，其包括选自CDR SEQ ID NOs：8-112的至少一种CDR。
如随后实施例部分和下文说明书中进一步描述的，本发明的分离的多肽可以在各种体外、离体和体内应用中使用。为了增加对靶表位(即，由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位)的稳定性、生物利用度、亲和力和抗体亲抗原性，本发明还可以采用来源于本发明CDRs(例如SEQ ID NOs：8-112)的肽、肽类似物或其模拟物。
此类肽、肽类似物或其模拟物优选是来源于如SEQ ID NOs：8-112所示CDRs中的至少一种CDRs的至少4-5个氨基酸的短氨基酸序列，优选至少6个，更优选至少7个，更优选8-20个，更优选8-15个，再更优选11-15个氨基酸。
如本文使用的，术语“肽”包括天然肽(降解产物、合成肽或重组肽)和如上所述的肽模拟物(peptidomimetics)(一般是合成肽)，以及肽类似物的类肽和半类肽(semipeptoids)，其可以具有例如使肽在体内时更稳定或更能够渗透到细胞内的修饰。此类修饰包括但不限于，N末端修饰，C未端修饰，肽键修饰，包括但不限于，CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH，主链修饰和残基修饰。用于制备肽模拟化合物的方法是本领域众所周知的，并且例如在Quantitative Drug Design，C.A.RamsdenGd.Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press(1992)中详细说明，其引入作为参考如充分在本文中阐述一样。这个方面的更多细节在下文提供。
肽内的肽键(-CO-NH-)可以由下列键取代：例如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基键(-CO-CH2-)、R是任何烷基例如甲基的α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)、carba键(-CH2-NH-)、羟亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH＝CH-)、逆(retro)酰胺键(-NH-CO-)、其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链的肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)。
这些修饰可以在肽链的任何键上并且甚至同时在几个(2-3)键上发生。
天然的芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以取代合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物或o-甲基-Tyr。
除了上述之外，本发明的肽还可以包括一种或多种修饰的氨基酸或一种或多种非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合糖等)。
如本文说明书中使用的，术语“氨基酸”应当理解为包括20种天然存在的氨基酸；通常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；以及其他罕见氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正缬氨酸、正亮氨酸和乌氨酸。此外，术语“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
下表1和2列出了天然存在的氨基酸(表1)和可以以本发明方式使用的非常规或修饰的氨基酸(表2)。
表1
    氨基酸     3字母缩写     单字母符号
    丙氨酸     Ala     A
    精氨酸     Arg     R
    天冬酰胺     Asn     N
    天冬氨酸     Asp     D
    半胱氨酸     Cys     C
    谷氨酰胺     Gln     Q
    谷氨酸     Glu     E
    甘氨酸     Gly     G
    组氨酸     His     H
    异亮氨酸     Iie     I
    亮氨酸     Leu     L
    赖氨酸     Lys     K
    甲硫氨酸     Met     M
    苯丙氨酸     Phe     F
    脯氨酸     Pro     P
    丝氨酸     Ser     S
    苏氨酸     Thr     T
    色氨酸     Trp     W
    酪氨酸     Tyr     Y
    缬氨酸     Val     V
  如上的任何氨基酸     Xaa     X
表2
非常规氨基酸 编码  非常规氨基酸 编码
α-氨基丁酸 Abu  L-N-甲基丙氨酸 Nmala
α-氨基-α-甲基丁酸 Mgabu  L-N-甲基精氨酸 Nmarg
氨基环丙烷- Cpro  L-N-甲基天冬酰胺 Nmasn
羧酸  L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp
氨基异丁酸 Aib  L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys
  氨基降冰片基-   Norb   L-N-甲基谷氨酰胺   Nmgin
  羧酸   L-N-甲基谷氨酸   Nmglu
  环己基丙氨酸   Chexa   L-N-甲基组氨酸   Nmhis
  环戊基丙氨酸   Cpen   L-N-甲基异亮氨酸   Nmile
  D-丙氨酸   Dal   L-N-甲基亮氨酸   Nmleu
  D-精氨酸   Darg   L-N-甲基赖氨酸   Nmlys
  D-天冬氨酸   Dasp   L-N-甲基甲硫氨酸   Nmmet
  D-半胱氨酸   Dcys   L-N-甲基正亮氨酸   Nmnle
  D-谷氨酰胺   Dgln   L-N-甲基正缬氨酸   Nmnva
  D-谷氨酸   Dglu   L-N-甲基乌氨酸   Nmorn
  D-组氨酸   Dhis   L-N-甲基苯丙氨酸   Nmphe
  D-异亮氨酸   Dile   L-N-甲基脯氨酸   Nmpro
  D-亮氨酸   Dleu   L-N-甲基丝氨酸   Nmser
  D-赖氨酸   Dlys   L-N-甲基苏氨酸   Nmthr
  D-甲硫氨酸   Dmet   L-N-甲基色氨酸   Nmtrp
  D-乌氨酸   Dorn   L-N-甲基酪氨酸   Nmtyr
  D-苯丙氨酸   Dphe   L-N-甲基缬氨酸   Nmval
  D-脯氨酸   Dpro   L-N-甲基乙基甘氨酸   Nmetg
  D-丝氨酸   Dser   L-N-甲基-叔丁基甘氨酸   Nmtbug
  D-苏氨酸   Dthr   L-正亮氨酸   Nle
  D-色氨酸   Dtrp   L-正缬氨酸   Nva
  D-酪氨酸   Dtyr   α-甲基-氨基异丁酸   Maib
  D-缬氨酸   Dval   α-甲基-γ-氨基丁酸   Mgabu
  D-α-甲基丙氨酸   Dmala   α-甲基环己基丙氨酸   Mchexa
  D-α-甲基精氨酸   Dmarg   α-甲基环戊基丙氨酸   Mcpen
  D-α-甲基天冬酰胺   Dmasn   α-甲基-α-萘基丙氨酸   Manap
  D-α-甲基天冬氨酸   Dmasp   α-甲基青霉胺   Mpen
  D-α-甲基半胱氨酸   Dmcys   N-(4-氨基丁基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基谷氨酰胺  Dmgln   N-(2-氨基乙基)甘氨酸   Naeg
  D-α-甲基组氨酸  Dmhis   N-(3-氨基丙基)甘氨酸   Norn
  D-α-甲基异亮氨酸  Dmile   N-氨基-α-甲基丁酸   Nmaabu
  D-α-甲基亮氨酸  Dmleu   α-萘基丙氨酸   Anap
  D-α-甲基赖氨酸  Dmlys   N-苄基甘氨酸   Nphe
  D-α-甲基甲硫氨酸  Dmmet   N-(2-氨甲酰基乙基)甘氨酸   Ngln
  D-α-甲基鸟氨酸  Dmorn   N-(氨甲酰基甲基)甘氨酸   Nasn
  D-α-甲基苯丙氨酸  Dmphe   N-(2-羧乙基)甘氨酸   Nglu
  D-α-甲基脯氨酸  Dmpro   N-(羧甲基)甘氨酸   Nasp
  D-α-甲基丝氨酸  Dmser   N-环丁基甘氨酸   Ncbut
  D-α-甲基苏氨酸  Dmthr   N-环庚基甘氨酸   Nchep
  D-α-甲基色氨酸  Dmtrp   N-环己基甘氨酸   Nchex
  D-α-甲基酪氨酸  Dmty   N-环癸基甘氨酸   Ncdec
  D-α-甲基缬氨酸  Dmval   N-环十二烷基甘氨酸   Ncdod
  D-α-甲基丙氨酸  Dnmala   N-环辛基甘氨酸   Ncoct
  D-α-甲基精氨酸  Dnmarg   N-环丙基甘氨酸   Ncpro
  D-α-甲基天冬酰胺  Dnmasn   N-环十一烷基甘氨酸   Ncund
  D-α-甲基天冬氨酸  Dnmasp   N-(2，2-二苯基乙基)甘氨酸   Nbhm
  D-α-甲基半胱氨酸  Dnmcys   N-(3，3-二苯基丙基)甘氨酸   Nbhe
  D-N-甲基亮氨酸  Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸  Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸  Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基乌氨酸  Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸  Nala   D-N-甲基苯丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸   Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸   Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸   Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nva
  D-N-甲基酪氨酸   Dnmtyr   N-甲基a-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸   Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸   Gabu   N-(p-羟苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸   Tbug   N-(硫甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸   Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯基丙氨酸   Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸   Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸   Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸   Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺   Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸   Mhis   L-α-甲基高苯基丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸   Mile   N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸   Nmet
  D-N-甲基谷氨酰胺   Dnmgln   N-(3-胍基丙基)甘氨酸   Narg
  D-N-甲基谷氨酸   Dnmglu   N-(1-羟乙基)甘氨酸   Nthr
  D-N-甲基组氨酸   Dnmhis   N-(羟乙基)甘氨酸   Nser
  D-N-甲基异亮氨酸   Dnmile   N-(咪唑基乙基)甘氨酸   Nhis
  D-N-甲基亮氨酸  Dnmleu   N-(3-吲哚基乙基)甘氨酸   Nhtrp
  D-N-甲基赖氨酸  Dnmlys   N-甲基-γ-氨基丁酸   Nmgabu
  N-甲基环己基丙氨酸  Nmchexa   D-N-甲基甲硫氨酸   Dnmmet
  D-N-甲基乌氨酸  Dnmorn   N-甲基环戊基丙氨酸   Nmcpen
  N-甲基甘氨酸  Nala   D-N-甲基苯基丙氨酸   Dnmphe
  N-甲基氨基异丁酸  Nmaib   D-N-甲基脯氨酸   Dnmpro
  N-(1-甲基丙基)甘氨酸  Nile   D-N-甲基丝氨酸   Dnmser
  N-(2-甲基丙基)甘氨酸  Nleu   D-N-甲基苏氨酸   Dnmthr
  D-N-甲基色氨酸  Dnmtrp   N-(1-甲基乙基)甘氨酸   Nval
  D-N-甲基赖氨酸  Dnmtyr   N-甲基a-萘基丙氨酸   Nmanap
  D-N-甲基缬氨酸  Dnmval   N-甲基青霉胺   Nmpen
  γ-氨基丁酸  Gabu   N-(p-羟苯基)甘氨酸   Nhtyr
  L-叔丁基甘氨酸  Tbug   N-(硫甲基)甘氨酸   Ncys
  L-乙基甘氨酸  Etg   青霉胺   Pen
  L-高苯基丙氨酸  Hphe   L-α-甲基丙氨酸   Mala
  L-α-甲基精氨酸  Marg   L-α-甲基天冬酰胺   Masn
  L-α-甲基天冬氨酸  Masp   L-α-甲基-叔丁基甘氨酸   Mtbug
  L-α-甲基半胱氨酸  Mcys   L-甲基乙基甘氨酸   Metg
  L-α-甲基谷氨酰胺  Mgln   L-α-甲基谷氨酸   Mglu
  L-α-甲基组氨酸  Mhis   L-α-甲基高苯基丙氨酸   Mhphe
  L-α-甲基异亮氨酸  Mile   N-(2-甲基硫乙基)甘氨酸   Nmet
  L-α-甲基亮氨酸  Mleu   L-α-甲基赖氨酸   Mlys
  L-α-甲基甲硫氨酸  Mmet   L-α-甲基正亮氨酸   Mnle
  L-α-甲基正缬氨酸  Mnva   L-α-甲基乌氨酸   Morn
  L-α-甲基苯丙氨酸   Mphe   L-α-甲基脯氨酸   Mpro
  L-α-甲基丝氨酸   mser   L-α-甲基苏氨酸   Mthr
  L-α-甲基缬氨酸   Mtrp   L-α-甲基酪氨酸   Mtyr
  L-α-甲基亮氨酸   MvalNnbhm   L-N-甲基高苯基丙氨酸   Nmhphe
  N-(N-(2，2-二苯基乙基)   N-(N-(3，3-二苯基苯基)
  氨甲酰基甲基-甘氨酸   Nnbhm   氨甲酰基甲基(1)甘氨酸   Nnbhe
  1-羧基-1-(2，2-二苯基乙氨基)环丙烷   Nmbc
本发明的肽优选以线性形式使用，尽管应当理解在其中环化不严重干扰肽特征的情况下，也可以使用环状形式的肽。
本发明的分离的多肽(例如，包括由SEQ ID NOs：8-112列出的CDRs中的至少一种的肽)可以使用标准固相技术生物化学地合成。这些方法包括全部固相合成、部分固相合成方法、片段浓缩和经典溶液合成。这些方法优选在肽相对短(即，10kDa)时和/或当其不能通过重组技术(即，不能由核酸序列编码)生产时使用，并因此涉及不同的化学作用。
固相肽合成操作是本领域众所周知的并由John Morrow Stewart和Janis Dillaha Young，Solid Phase Peptide Syntheses(2nd Ed.PierceChemical Company，1984)进一步描述。
合成肽可以通过制备型高效液相色谱法[Creighton T.(1983)Proteins，structures and molecular principles.WH Freeman和Co.N.Y.]进行纯化，并且其组成可以经由氨基酸测序进行确认。
在需要大量本发明的肽的情况下，本发明的肽可以使用重组技术产生，例如由Bitter等人，(1987)Methods in Enzymol 153516-544，Studier等人(1990)Methods in Enzymol 185：60-89，Brisson等人(1984)Nature 310 511-514，Takamatsu等人(1987)EMBO J 6307-311，Coruzzi等人(1984)EMBO J.3 1671-1680；Brogli等人，(1984)Science224：838-843；Gurley等人(1986)Mol.Cell Biol 6 559-565和Weissbach&Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，第421-463页描述的。
如本文使用的，术语“模拟物”指充当本发明肽的代替物特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的p53暴露表位的分子结构(关于肽模拟物的综述参见Morgan等人(1989)Ann.Reports Med.Chem.24：243-252)。
如本文使用的，肽模拟物包括合成结构(已知和仍未知的)，其可以包含或不包含氨基酸和/或肽键，但保留特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的p53暴露表位的结构和功能特征。可以用于产生模拟物的氨基酸类型在下文进一步描述。术语“肽模拟物”还包括类肽和寡类肽(oligopeptoids)，其是N-取代的氨基酸的肽或寡聚物[Simon等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89：9367-9371]。作为肽模拟物进一步包括的是肽文库，其是设计为具有给定氨基酸长度并代表与其对应的所有可能氨基酸序列的肽集合。
如上所述的肽模拟物的产生使用各种方法完成，包括例如使用各自展示如上所述的短肽序列的多种展示媒介物(例如噬菌体、病毒或细菌)的展示技术。构建和筛选肽展示文库的方法是本领域众所周知的。此类方法在例如引入本文作为参考的Young AC，等人，“The three-dimensional structures of a polysaccharide binding antibody toCryptococcus neoformans and its complex with a peptide from a phagedisplay library：implications for the identification of peptide mimotopes”JMol Biol 1997 Dec 12；274(4)622-34；Giebel LB等人“Screening ofcyclic peptide phage libraries identifies ligands that bind streptavidin withhigh affinities”Biochemistry 1995Nov 28；34(47)：15430-5；Davies EL等人，“Selection of specific phage-display antibodies using librariesderived from chicken immunoglobulin genes”J Immunol Methods 1995Oct 12；186(1)：125-35；Jones C RT al.(？et al等人)“Current trendsin molecular recognition and bioseparation”J Chromatogr A 1995 Jul 14；707(1)：3-22；Deng SJ等人“Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chain antibodies from synthetic gene libraries”Proc NatlAcad Sci U S A 1995 May 23；92(11)：4992-6；以及Deng SJ等人“Selection of antibody single-chain variable fragments with improvedcarbohydrate binding by phage display”J Biol Chem 1994 Apr l；269(13)：9533-8中描述。
肽模拟物还可以使用计算生物学揭示。例如，各种化合物可以使用各种三维计算工具计算分析特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的p53暴露表位的能力。对于显示三维结构模型有用的软件程序例如RIBBONS(Carson，M.1997.Methods in Enzymology 277，25)、O(Jones，TA.等人，1991.Acta Crystallogr.A47，110)、DINO(DINO：Visualizing Structural Biology(2001)http://www.dino3d org)；以及QUANTA、INSIGHT、SYBYL、MACROMODE、ICM、MOLMOL、RASMOL和GRASP(在Kraulis，J，1991.Appl Crystallogr 24，946中综述)可以用于模拟p53暴露表位(例如SEQ ID NO：1)和预期的肽模拟物之间的相互作用，从而鉴别显示特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位的最高可能性的肽。蛋白质-肽相互作用的计算模型已成功地在合理药物设计中使用，关于更多的细节，参见Lam等人，1994.Science 263，380；Wlodawer等人，1993 Ann Rev Biochem62，543；Appelt，1993.Perspectives in Drug Discovery and Design 1，23；Erickson，1993.Perspectives in Drug Discovery and Design 1，109，andMauro MJ.等人，2002.J Clin Oncol.20，325-34。
不管使用的方法如何，使用上述技术产生的肽模拟物都可以使用随后实施例部分中描述的测定法(例如，结合亲和力测定法)进行定性。
如前文所述，本发明的分离的多肽还可以作为包含多核苷酸的核酸构建体的一部分在细胞(例如哺乳动物细胞、细菌细胞、植物细胞、酵母细胞)中重组表达，所述多核苷酸编码例如Fab片段、scFv、完整的IgG抗体或本发明分离的多肽的任何一种CDRs。
为了在哺乳动物细胞中表达本发明的重组分离多肽，编码如SEQ IDNOs 8-112列出的至少一种CDR序列的多核苷酸序列优选连接到适合于哺乳动物细胞表达的核酸构建体内。此类多核苷酸可以是例如由SEQID NO 113(关于F2 scFv)、SEQ ID NO 114(关于E6 scFv)、SEQ IDNO：115(关于A6 scFv)列出的多核苷酸。核酸构建体包括用于指导多核苷酸序列在细胞中以组成型或诱导型方式转录的启动子序列。
适合于以本发明的方式使用的组成型启动子是在大多数环境条件下和大多数细胞类型中有活性的启动子序列，例如巨细胞病毒(CMV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。适合于以本发明的方式使用的诱导型启动子包括例如四环素诱导型启动子(Zabala M，等人，Cancer Res.2004，64(8)：2799-804)。
本发明的核酸构建体(在本文中也称为“表达载体”)包括使得这种载体适合于在原核生物、真核生物或优选两者(例如改组载体)中复制和整合的另外序列。另外，一般的克隆载体还可以包含转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子以及聚腺苷酸化信号。例如，此类构建体一般将包括5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点、以及3′LTR或其部分。
真核启动子一般包含2种类型的识别序列、TATA盒和下游启动子元件。位于转录起始位点25-30碱基对上游区的TATA盒被认为涉及指导RNA聚合酶开始RNA合成。其他上游启动子元件决定转录起始的速率。
优选地，本发明的核酸构建体使用的启动子在转化的特定细胞群体中是有活性的。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的例子包括启动子例如肝特异性的白蛋白[Pinkert等人，(1987)Genes Dev.1：268-277]、淋巴特异性启动子[Calame等人，(1988)Adv.Immunol.43：235-275]；特别是T细胞受体[Winoto等人，(1989)EMBO J.8：729-733]和免疫球蛋白的启动子；[Banerji等人(1983)Cell 33729-740]，神经元特异性启动子例如神经丝启动子[Byrne等人(1989)Proc.Natl.Acad Sci.USA 86：5473-5477]，胰腺特异性启动子[Edlunch等人(1985)Science 230：912-916]或乳腺特异性启动子例如乳清启动子(美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。
增强子元件可以刺激来自连接的同源或异源启动子的转录高达1,000倍。增强子当置于转录起始位点的下游或上游时是有活性的。来源于病毒的许多增强子元件具有广泛的宿主范围并且在各种组织中是有活性的。例如，SV40早期基因增强子适合于许多细胞类型。适合于本发明的其他增强子/启动子组合包括来源于多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(CMV)的那些，来自各种逆转录病毒例如鼠白血病病毒、鼠或劳斯肉瘤病毒和HIV的长末端重复。参见，引入本文作为参考的Enhancersand Eukaryotic Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，N Y 1983。
在表达载体的构建中，启动子优选置于离异源转录起始位点与其在其天然背景中离转录起始位点大约相同的距离。然而，如本领域已知的，可以调节这种距离中的某些变化而不丧失启动子功能。
聚腺苷酸化序列同样可以添加至表达载体以便增加重组分离抗体mRNA翻译的效率。2种不同的序列元件是精确且有效的聚腺苷酸化所必需的：位于聚腺苷酸化位点下游的富含GU或U的序列和位于上游11-30个核苷酸的6个核苷酸AAUAAA的高度保守序列。适合于本发明的终止和聚腺苷酸化信号包括来源于SV40的那些。
除了已描述的元件之外，本发明的表达载体一般可以包含预期增加克隆的核酸的表达水平或促进携带重组DNA的细胞鉴别的其他专门元件。例如，许多动物病毒包含促进病毒基因组在允许的细胞类型中的染色体外复制的DNA序列。只要由质粒上携带或宿主细胞基因组内的基因提供合适的因素，具有这些病毒复制子的质粒就游离地复制。
载体可以包括或不包括真核复制子。如果存在真核复制子，那么载体使用合适的可选标记可在真核细胞中扩增。如果载体不包括真核复制子，那么游离型扩增是不可能的。相反，重组DNA整合到改造细胞的基因组内，在其中启动子指导所需核酸的表达。
本发明的表达载体可以进一步包括允许例如来自单个mRNA的几种蛋白质翻译的另外多核苷酸序列，例如内部核糖体进入位点(IRES)，和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列。
关于哺乳动物表达载体的例子包括但不限于，从Invitrogen可获得的pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3 1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，从Promega可获得的pCI，从Strategene可获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，从Clontech可获得的pTRES，及其衍生物。
还可以使用包含来自真核病毒例如逆转录病毒的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。来源于牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且来源于EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许蛋白质在下列启动子的指导下表达的任何其他载体：SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子、或显示对于在真核细胞中表达有效的其他启动子。
如上所述，病毒是非常特化的传染剂，其在许多情况下已进化以躲避宿主的防御机制。一般地，病毒在特定细胞类型中感染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用其对特异性靶向预定的细胞类型的天然特异性并从而将重组基因引入受感染细胞内。因此，本发明使用的载体类型将取决于转化的细胞类型。根据转化的细胞类型选择合适载体的能力完全在普通技术人员的能力内，因此本文不提供选择考虑的一般描述。例如，如Liang CY等人，2004(Arch Virol.149：51-60)中描述的，骨髓细胞可以使用人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)靶向，并且肾细胞可以使用杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中存在的异源启动子靶向。
重组病毒载体对于本发明分离的多肽的体内表达有用，因为它们提供例如横向感染和靶向特异性的优点。横向感染是例如逆转录病毒的生活周期中固有的，并且是由此单个受感染细胞产生许多子代病毒颗粒的过程，所述子代病毒颗粒出芽并感染邻近细胞。结果是大范围变得迅速感染，大部分所述范围最初没有被原始病毒颗粒感染。这与其中传染剂只通过子代后裔传播的纵向类型的感染相反。还可以生产不能横向传播的病毒载体。如果所需目的是只将特定基因引入有限数目的靶细胞内，那么这种特征可以是有用的。
各种方法可以用于将本发明的表达载体引入细胞内。此类方法一般在下列文献中描述：Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，Md(1989)，Chang等人，Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)，Vega等人，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor Mich.(1995)，Vectors：A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston Mass(1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4(6)：504-512，1986]，并且包括例如稳定或瞬时转染，脂质转染、电穿孔和使用重组病毒载体的感染。此外，关于正-负选择方法参见美国专利号5,464,764和5,487,992。
除了包含对于插入的编码序列转录和翻译必需的元件外，本发明的表达构建体还可以包括改造的序列以增强所表达肽的稳定性、生产、纯化、分泌、产量或毒性。
对于本发明分离的多肽的分泌，本发明的核酸构建体一般包括用于使肽从它置于其中的宿主细胞中分泌的信号序列。此外，可以改造包括本发明的Met变体和异源蛋白的融合蛋白或可切割的融合蛋白的表达。此类融合蛋白可以如此设计使得融合蛋白可以通过亲和色谱法容易分离，例如通过固定在对异源蛋白特异的柱上。当可切割位点在Met部分和异源蛋白之间改造时，Met部分可以通过用断裂切割位点的合适的酶或试剂处理从色谱柱中释放[例如，参见Booth等人(1988)Immunol Lett19：65-70；和Gardella等人，(1990)J.Biol.Chem 265：15854-15859]。
应当理解各种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统以表达本发明的分离的多肽。这些包括但不限于，微生物例如用包含编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用包含编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用包含编码序列的重组质粒表达载体例如Ti质粒转化的植物细胞系统。哺乳动物表达系统同样可以用于表达本发明的多肽。
细菌构建体的例子包括大肠杆菌表达载体的pET系列[Studier等人(1990)Methods in Enzymol 185：60-89)。
在酵母中，如美国专利申请号：5,932,447中公开的，可以使用包含组成型或诱导型启动子的许多载体。可替代地，可以使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体内的载体。
其他表达系统例如昆虫、植物和哺乳动物宿主细胞系统是本领域众所周知的并且同样可以被本发明使用。
本发明的重组多肽的回收在培养合适的时间后完成。短语“回收重组多肽”指收集包含多肽的全部生长(例如发酵)培养基并且不一定意味着另外的分离或纯化步骤。虽然如上所述，本发明的多肽也可以使用各种标准蛋白质纯化技术进行纯化，例如但不限于，亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、色谱聚焦和差异溶解。
应当理解本发明分离的多肽(其充当抗p53抗体)还可以在表达突变p53蛋白质的靶细胞(例如具有重度p53突变例如R175H的癌细胞)中表达，从而形成如上所述的细胞内抗体。这尤其在p53是核蛋白并从而对常规抗体冶疗相对更有“抗性”的情况下特别重要。如图4a-j、15a-h和16a-d中所示以及随后实施例部分的实施例3中所述，F2 scFv抗体(TAR1)能够诱导特异性表达突变体R175H p53蛋白质(具有如SEQ ID NO：1所示的暴露表位)的人肺癌或人结肠癌细胞的凋亡。另外，用TAR1处理表达各种内源性p53突变蛋白的癌细胞株导致凋亡显著增加(图17a-r，实施例3)。此外，稳定转染具有突变p53蛋白质(R175H)的细胞以表达本发明的F2 scFv(TAR1)抗体，显示集落形成能力减少，这是由所形成集落的数目减少以及所形成集落的尺寸减小证实(图5、6a-d，随后实施例部分的实施例3和4)。
因此，根据本发明的再另外的方面，提供了诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞的方法。该方法通过使本发明的分离的多肽(其在上文详尽描述)与癌细胞接触或在其中表达，从而诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞来完成。
如本文使用的，术语“凋亡”指程序性细胞死亡，由此细胞执行“细胞自杀”程序。凋亡在许多生理学事件中起重要作用，包括胚胎发生、免疫系统调节和动态平衡。因此，凋亡可以响应不同信号例如四肢和神经发育、神经变性疾病、放射疗法和化学疗法。凋亡过程通常的特征在于线粒体氧化解偶联、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]水平下降、细胞色素c释放、胱天蛋白酶激活、DNA断裂和磷脂酰丝氨酸(通常局限于脂质双层的内部小叶的膜磷脂)外化至质膜的外部小叶。
如本文使用的，短语“生长停滞”指体外、离体(即，当细胞来源于个体并在组织培养中培养时)和/或体内(在个体的肿瘤中)细胞生长的抑制。在使用体外或离体条件的情况下，生长停滞可以使用本领域已知的各种方法根据集落形成(通过计数集落数目)、细胞面积、集落中的细胞数目等进行检测。在使用体内条件的情况下，生长停滞同样可以使用病理学领域任何技术人员已知的各种组织学和免疫学染色法根据肿瘤的尺寸和形状和/或肿瘤转移灶的存在进行监控。
根据本发明这个方面的方法，癌细胞(其中凋亡根据本发明这个方面的方法诱导)特异性表达由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位(例如，SEQ ID NO：1)。此类癌细胞可以具有如上所述的重度或中等p53突变。此类癌细胞可以来源于任何种类的肿瘤，包括实体瘤(例如乳癌、结肠癌、肺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、结肠直肠癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、鳞状上皮细胞癌)和非实体瘤(例如白血病和淋巴瘤)。另外，此类细胞可以通过使用本领域已知的方法诱变或转染含有致癌基因的正常细胞获得。
根据本发明这个方面的方法，本发明的分离的多肽与本发明的癌细胞接触或在其中表达。应当理解因为p53在细胞核中表达，所以本发明的分离的多肽优选是小多肽[例如，包含CDR的多肽或scFv例如F2 scFv(SEQ ID NO：113)]而不是大分子(例如IgG分子)，其因此可以更容易地穿透细胞和核膜。
为了促进分离的多肽穿透到细胞核，分离的多肽可以共价附着至疏水部分或作为含疏水部分的融合基因表达(例如在随后实施例部分的“一般材料和实验方法”中描述的TAT-scFv F2/His表达质粒的情况下)。疏水部分可以是非极性且一般与水不混溶的任何物质，例如疏水性物质的疏水性残基(部分)。疏水性部分的非限制性例子包括但不限于，取代和未取代的、饱和和不饱和的烃，其中烃可以是脂肪族、脂环族或芳香族的。优选地，烃具有使其能够附着至氨基酸残基的官能团。此类官能团的代表性例子包括但不限于，游离羧酸(C(＝O)OH)、游离氨基(NH2)、酯基(C(＝O)OR，其中R是烷基、环烷基或芳基)、酰卤基团(C(＝O)A，其中A是氟化物、氯化物、溴化物或碘化物)、卤化物(氟化物、氯化物、溴化物或碘化物)、羟基(OH)、硫醇基(SH)、腈基(C≡N)、游离C-氨基甲酸基团(NR″-C(＝O)-OR′，其中每个R′和R″独立地是氢、烷基、环烷基或芳基)、游离N-氨基甲酸基团(OC(＝O)-NR′-，其中R′如上文限定)、亚硫酰基(S(＝O)2A，其中A是如上文限定的卤化物)等。例如，此类疏水部分可以是脂肪酸例如肉豆蔻酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸(C18)、油酸、亚麻酸和花生四烯酸。
本发明的分离的多肽可以使用本领域已知的方法施用于细胞，例如将分离的多肽添加到细胞环境例如血液、血浆、缓冲液、组织培养基等。
可替代地，本发明的分离的多肽可以使用核酸构建体在细胞中表达以形成如上所述的胞内抗体。
另外或可替代地，本发明的抗-p53抗体(例如TAR1抗体)可以呈现在病毒展示媒介物例如丝状噬菌体上并且可以以治疗有效量使用以诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞。本发明人先前已证实此类病毒展示媒介物(即，噬菌体)是惰性媒介物且适合于携带活性抗体片段至CNS(Solomon，Beka等人的美国专利申请号20040013647)。
应当理解本发明的病毒展示媒介物可以设计为使得本发明的p53抗体(例如TAR1)能够在细胞内呈现。如图18-21中所示以及随后实施例部分的实施例7中所述，包含PTD(蛋白质转导结构域)[例如，PEP肽(SEQ ID NO：136)，其使得能够内化到哺乳动物细胞内；图18a-b中显示]的病毒展示媒介物能够穿透到哺乳动物CHO细胞内。对于穿透到核内，病毒载体可以进一步包括与展示的抗体缀合的NLS肽(SEQ IDNO：134)。构建的噬菌体将在其外壳蛋白VIII上呈现PTD，并且在其蛋白质III上呈现与NLS肽融合的抗体(参见图18a-b)。
因此，呈现本发明的抗-p53抗体的病毒展示媒介物可以施用于有此需要的个体并靶向目的细胞的核。例如，对于脑肿瘤，病毒展示媒介物可以通过鼻内应用施用于个体并从而到达各个脑区域例如皮质和海马。
由本发明的分离的多肽、核酸构建体和/或病毒展示媒介物诱导的凋亡可以使用本领域已知的各种方法进行检测。
乙啡啶同型二聚体-1染色-凋亡可以通过特异性结合具有受损膜的细胞即死细胞的染料进行检测。简言之，未固定的细胞例如悬浮液、组织培养物、组织切片等中的细胞用荧光染料乙啡啶同型二聚体-1(激发，495nm；发射，635nm)染色。在这种测定法中，活细胞具有绿色荧光的细胞质但没有EthD-1信号，而死细胞缺乏绿色荧光并且由EthD-1染色。
Tunnel测定法(Roche，Basel，Switzerland)-用荧光素标记DNA断裂，这是细胞经历凋亡的特征(激发450-500nm，发射515-565nm)。
活/死存活力/细胞毒性二色荧光测定法(Molecular Probes，Inc.L-3224，Eugene，OR，USA)-这种测定法用细胞可渗透底物(钙黄绿素-AM)测量细胞内的酯酶活性，所述底物由活细胞转换成荧光衍生物(聚阴离子钙黄绿素，激发，495nm；发射，515nm)，所述荧光衍生物其后通过活细胞的完整质膜保留。
FACS分析-使用能够特异性结合经历凋亡的细胞的分子，例如碘化丙啶和膜联蛋白V。膜联蛋白V是人蛋白质，其特征在于钙介导的与磷脂酰丝氨酸的高亲和力结合，所述磷脂酰丝氨酸在早期凋亡过程中经历外化至质膜外侧。
经由凝胶电泳的DNA断裂-简言之，从未固定的细胞中提取DNA并对其实施凝胶电泳(例如1.5-2％的琼脂糖凝胶)，并使用任何DNA染料例如溴化乙锭、Syber Green等评估DNA断裂的程度。
如图8a-f中进一步所示以及随后实施例部分的实施例4中所述，F2 scFv(TAR1)抗体能够抑制体内肿瘤生长。这些结果强烈提示本发明的分离多肽、编码其的多核苷酸和/或表达载体在p53相关癌症治疗中的用途。
因此，根据本发明的再另外的方面，提供了治疗患有或易患p53相关癌症的受试者的方法。该方法通过给受试者施用、或在其细胞中表达治疗有效量的本发明分离的多肽，从而治疗受试者中的p53相关癌症来完成。
术语“治疗”指抑制或阻止疾病、病症或状况(例如p53相关癌症)发展和/或引起疾病、病症或状况减少、缓和或消退。本领域技术人员应当理解各种方法和测定法可以用于评估疾病、病症或状况的发展，并且类似地，各种方法和测定法可以用于评估疾病、病症或状况的减少、缓和或消退。
如本文使用的，术语“受试者”(或“个体”，这在本文中可互换使用)指患有p53相关癌症的任何年龄的哺乳动物，优选人类。优选地，这个术语包括处于发展p53相关癌症的危险中的个体，即易患p53相关癌症的个体。此类个体可以是p53基因(GenBank登记号NM_000546)中种系突变的携带者，例如在李-弗劳明综合征的情况下。
如本文使用的，“p53相关癌症”指其中p53与其发作或进展有关的任何癌症。此类癌症可以由p53基因[GenBank登记号NC_000017：7512464-7531642(基因组区域)；NM_000546(mRNA)；NP_000537(蛋白质)]中的突变引起，导致p53蛋白质的异常结构和/或功能。此类突变可以是错义、无义、剪接突变、启动子突变、缺失、插入、重复等。如上所述，p53蛋白质中的各种突变引起中等或重度构象变化，导致p53蛋白质的异常功能。p53相关癌症的非限制性例子包括由p53基因中的种系突变(例如在李-弗劳明综合征1的情况下，OMIM#151623)引起的那些以及由p53基因中的体细胞突变引起的那些，例如肝细胞癌、骨肉瘤、结肠直肠癌、肺癌、成胶质细胞瘤、食道癌、膀胱癌、鳞状上皮细胞癌、白血病和淋巴瘤。
如本文使用的，短语“受试者的细胞”包括来源于受试者且从受试者中取出的任何细胞(即，离体基因治疗)或是受试者一部分的细胞(即，如上所述的体内基因治疗)。
如本文使用的，短语“治疗有效量”指本发明分离的多肽、多核苷酸、编码其的表达载体和/或展示本发明抗-p53抗体的病毒展示媒介物的量，其足以发挥生物学活性，即结合p53的暴露表位(如上所述)、诱导凋亡和治疗或预防p53相关癌症。
如图5中所示以及随后实施例部分的实施例3中所述，A4 scFv能够增加癌细胞对化学治疗药物的敏感性。这些结果提示分离的多肽、分离的多核苷酸、编码其的表达载体和/或包括其的药物组合物(如下文进一步描述的)连同使用例如化学治疗药物的常规癌症治疗方案(即，组合治疗)的用途。
应当理解此类药物(例如，化学治疗剂例如氮芥、氟尿嘧啶、氮烯咪胺、多西他奇、卡氮芥、长春酰胺)还可以缀合至本发明的分离的多肽或形成编码其的表达载体的一部分。
此外，为了增加由本发明分离的多肽发挥的特定生物学活性，此类多肽可以进一步包括细胞毒性剂(即药物)例如假单胞菌外毒素PE35、PE38、PE40，产气假单胞菌外毒素A(ETA′)，和白喉毒素(DT390)，从而形成特定的免疫毒素。此类细胞毒性剂可以附着至分离的多肽或是由本发明的表达载体表达的多核苷酸的一部分。
因此，根据本发明的一个优选实施方案，本发明的分离的多肽融合或缀合至药物。
根据本发明的另一优选实施方案，本发明的分离的多核苷酸和/或表达载体进一步包括编码药物的另外的核酸序列。
应当理解此类免疫毒素和/或化学治疗剂可以通过本领域已知的方法使用重组DNA技术(例如，通过将试剂分子的编码序列连接至本发明分离的多肽的编码序列，通常是分离的多肽的编码序列下游)，或通过将毒素或化学治疗剂共价缀合至分离的多肽序列(例如，由SEQ IDNO：113、114或115列出的多肽)产生。例如，通过使用各种双功能蛋白质偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫羟)丙酸酯(SPDP)、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如己二亚胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate)HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二叠氮基化合物(例如二-(对叠氮基苯甲酰)己二胺、二重氮基衍生物(例如二-(对重氮基苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲代亚苯基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。
本发明的分离的多肽、编码其的多核苷酸和/或核酸构建体可以本身，或在它与合适载体或赋形剂混合的药物组合物中施用于生物。
如本文使用的，“药物组合物”指本文描述的一种或多种活性成分与其他化学组分例如生理学合适的载体和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物对生物的施用。
在本文中术语“活性成分”指负责生物效应(即特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位、诱导凋亡和/或治疗p53相关癌症)的本发明的重组分离多肽、多核苷酸和/或病毒展示媒介物。
在下文中短语“生理学可接受的载体”和“药学可接受的载体”可以互换地用于指对生物不引起明显刺激并且不取消所施用化合物的生物活性和特性的载体或赋形剂。佐剂包括在这些短语下。
在本文中术语“赋形剂”指加入药物组合物以进一步促进活性成分施用的惰性物质。赋形剂的非限制性例子包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和淀粉类型、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
关于配制和施用药物的技术可以在引入本文作为参考的“Remington’s Pharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co，Easton，PA，最新版中找到。
合适的施用途径可以包括例如口服，直肠，经粘膜特别是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内、静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射。
可替代地，可以以局部而不是全身形式施用药物组合物，例如经由将药物组合物直接注射到患者的组织区域内。
本发明的药物组合物可以通过本领域众所周知的过程制备，例如通过常规混合、溶解、粒化、糖衣丸制备、磨碎、乳化、装入胶囊、卷入或冻干过程。
用于依照本发明使用的药物组合物因此可以使用一种或多种生理学可接受的载体包括赋形剂和助剂以常规方式配制，所述载体促进活性成分加工为可以药学使用的制剂。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，药物组合物的活性成分可以在水溶液中进行配制，优选生理学相容缓冲液例如Hank氏溶液、林格氏溶液、或生理盐缓冲液。对于经粘膜施用，在制剂中使用适合于被穿透屏障的穿透剂。此类穿透剂是本领域普遍知道的。
对于口服施用，药物组合物可以通过将活性化合物与本领域众所周知的药学可接受的载体组合容易地配制。此类载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、糊剂、悬浮液等，用于由患者口服摄取。用于口服使用的药理学制剂可以使用固体赋形剂制备，任选将所得到的混合物研磨、并在必要时添加合适的助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核。合适的赋形剂特别是充填剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨糖醇；纤维素制剂例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素；羧甲基纤维素钠和/或生理学可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要时可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐，例如藻酸钠。
糖衣丸核与合适的涂层一起提供。为了这个目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚羧乙烯凝胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以加入片剂或糖衣丸涂层用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推合胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推合胶囊可以包含与充填剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉、润滑剂例如滑石粉或硬脂酸镁和任选稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解于或悬浮于合适液体例如脂肪油、液体石蜡或液态聚乙二醇中。另外可以添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂应当是适合于所选施用途径的剂量。
对于含服施用，组合物可以采取以常规方式配制的片剂或糖锭的形式。
对于通过鼻吸入的施用，用于根据本发明使用的活性成分以气溶胶喷雾剂的形式常规递送，所述气溶胶喷雾剂由加压包装或借助于合适推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳的喷雾器送递。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀递送计量的量来确定。用于在分配器中使用的例如明胶胶囊和药筒可以配制为包含化合物和合适的粉状基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本文描述的药物组合物可以配制用于肠胃外施用，例如通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以与任选加入的防腐剂一起以单位剂型例如在安瓿或多剂容器中呈现。组合物可以是溶于油或水媒介物的悬浮液、溶液或乳状液，并且可以包含配制剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性制剂的水溶液。另外，活性成分的悬浮液可以制备为合适的基于油或水的注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮液粘性的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含增加活性成分溶解度的合适稳定剂或试剂，以允许制备高度浓缩的溶液。
可替代地，活性成分可以是粉末形式，在使用前用合适媒介物例如基于无菌无热原水的溶液构建。
本发明的药物组合物还可以使用例如常规的栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯配制为直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂。
适合于在本发明内容中使用的药物组合物包括其中包含有效量活性成分以达到预期目的的组合物。更具体而言，治疗有效量意指活性成分(本发明的分离的多肽、或编码其的多核苷酸或表达载体)的量足以阻止、缓和或改善病症(p53相关癌症)的症状或延长被治疗受试者的存活。
治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，特别是根据本文提供的详细公开内容。
对于在本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量可以最初由体外和细胞培养测定法估计。例如，剂量可以在动物模型中配制以达到所需浓度或滴度。此类信息可以用于更精确地确定在人中使用的剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗效果可以通过标准药学程序在体外、细胞培养或实验动物中测定。从这些体外和细胞培养测定法以及动物研究中获得的数据可以在配制用于在人中使用的剂量范围中使用。剂量可以依采用的剂型和使用的施用途径而变。确切制剂、施用途径和剂量可以通过个别医师考虑患者的情况来选择。(参见，例如Fingl，等人，1975，“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第1章，第1页)。
剂量的量和间隔可以个别调整以足以发挥生物活性(例如，结合上文描述的突变p53的暴露表位、诱导凋亡和/或治疗p53相关癌症)的活性成分水平提供给表达突变p53蛋白质[这导致上文所述的共同表位(例如SEQ ID NO：1)暴露]的癌细胞。MEC将对于每种制剂而改变，但可以由体外数据估计。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和施用途径。检测测定法可以用于确定血浆浓度。
取决于待治疗状况的严重度和反应性，剂量可以是单次或多次施用，而疗程从数天持续至数周或直至实现治愈或达到疾病状况减轻。
当然施用的组合物的量将取决于待治疗的受试者、病痛的严重度、施用方式、开处方的医师的判断等。
本发明的组合物必要时可以以包装或分配装置例如FDA批准的试剂盒的形式呈现，其可以包含一种或多种包含活性成分的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，例如气泡包装。包装或分配器装置可以伴随施用说明书。包装或分配器装置还可以提供附于容器的由管理药物制造、使用或销售的政府机构规定形式的说明，所述说明表示由机构批准用于人或兽医施用的组合物形式。此类说明可以是例如由美国食品与药品管理局批准用于处方药的标签，或批准的产品插页。如上文进一步详述的，还可以制备包括在相容性药学载体中配制的本发明制剂的组合物，置于合适容器中，并标记用于治疗标明状况。
应当理解将本发明的核酸引入受试者可以使用本领域使用的任何基因治疗方法实现。例如，通过提供超过其他方法例如脂质转染的几个优点的病毒感染，因为由于病毒的传染性质可以获得较高的转染率。
目前优选的体内核酸转移技术(体内基因治疗)包括用病毒或非病毒构建体，例如腺病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒I、或腺伴随病毒(AAV)和基于脂质的系统转染。用于脂质介导的基因转移的有用脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol[Tonkinson等人，Cancer Investigation，14(1)：54-65(1996)]。在基因治疗中使用的最优选构建体是病毒，最优选腺病毒、AAV、慢病毒或逆转录病毒。病毒构建体例如逆转录病毒构建体包括至少一种转录启动子/增强子或基因座限定元件，或通过其他手段例如可变剪接、核RNA输出、或信使的翻译后修饰来控制基因表达的其他元件。此类载体构建体还包括包装信号，长末端重复(LTRs)或其部分，以及适合于所使用病毒的正和负链引物结合位点，除非它已存在于病毒构建体中。此外，此类构建体一般包括用于使肽从它所处的宿主细胞中分泌的信号序列。优选地，用于这个目的的信号序列是哺乳动物信号序列或本发明的多肽变体的信号序列。任选地，构建体还可以包括指导聚腺苷酸化的信号，以及一个或多个限制性位点和翻译终止序列。例如，此类构建体一般将包括5′LTR、tRNA结合位点、包装信号、第二链DNA合成的起点、以及3′LTR或其部分。可以使用非病毒的其他载体，例如阳离子脂质、聚赖氨酸和树枝状聚合物。
应当理解因为本发明的分离的多肽能够特异性结合由突变体而不是野生型p53蛋白质共有的暴露表位，所以此类多肽可以用于诊断此类表位被暴露的p53相关癌症。
因此，根据本发明再另外的方面，提供了诊断受试者中的p53相关癌症的方法。该方法通过：(a)在适合于分离的多肽和由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位之间形成免疫复合物的条件下，使受试者的生物样品与本发明的分离的多肽接触；和(b)检测免疫复合物的形成，从而诊断受试者中的癌症。
如本文使用的，短语“诊断”指分类疾病(p53相关癌症)或症状、确定疾病严重度、监控疾病进展、预测疾病的结果和/或痊愈的前景。
如本文使用的，“生物样品”指从受试者中分离的组织或体液的样品，包括但不限于，例如血细胞、骨髓细胞，特别是巨噬细胞、淋巴液、各种肿瘤、神经元细胞、树突状细胞、器官、以及体内细胞培养组成成分的样品。应当注意“受试者的生物样品”还可以任选包括仍未从受试者中物理上移出的样品。优选地，通过本发明这个方面的方法使用的生物样品是血液、淋巴结活检物、骨髓抽吸物和组织样品。
使用根据本发明这个方面的方法诊断的癌症可以是上文描述的任何p53相关癌症。优选地，从受试者中获得的生物样品是血液样品、骨髓抽吸物或组织样品。
根据本发明的癌症诊断通过在适合于免疫复合物形成的条件下使受试者的生物样品与本发明的分离的多肽接触来完成。
如本文使用的，术语“免疫复合物”指抗体(例如，本发明的分离的多肽)和其特异性抗原(其中共同表位由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的p53突变蛋白)之间形成的复合物。
本发明的免疫复合物可以在依使用的分离的多肽和癌细胞而变的各种温度、盐浓度和pH值下形成，并且本领域技术人员能够调整适合于每种免疫复合物形成的条件。
根据本发明这个方面的方法，免疫复合物形成的检测是p53相关癌症的诊断指示。各种方法可用于检测本发明的免疫复合物，并且本领域技术人员能够决定哪种方法适合于每种免疫复合物和/或用于诊断的细胞类型。
例如，免疫复合物可以通过常规免疫组织化学或免疫荧光、FACS、ELISA、蛋白质印迹和RIA分析，或通过基于分子量的方法进行检测。
免疫组织化学或免疫荧光分析-这种方法涉及通过抗原特异性抗体(即，本发明的分离的多肽)在固定细胞中原位检测抗原(例如具有重度或中等突变、其中共同表位由突变体而不是野生型p53共有的p53突变蛋白是暴露的)。抗原特异性抗体可以是酶连接的或连接至荧光团。检测经由显微镜检查法以及主观或自动评估。如果使用酶连接的抗体，那么可能需要比色反应。应当理解免疫组织化学通常随后为使用例如苏木精或姬姆萨染料复染细胞核。
荧光激活细胞分选术(FACS)-这种方法涉及通过抗原特异性抗体在细胞中原位检测抗原。抗原特异性抗体连接至荧光团。检测借助于细胞分选机器，其阅读当细胞通过光束时，由每个细胞发出的光的波长。这种方法可以同时采用2种或更多种抗体。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)-这种方法涉及包含抗原(例如，如上所述的p53突变蛋白)的样品(例如固定细胞或蛋白质性质的溶液)固定至表面例如微量滴定板的孔。施加与酶偶联的抗原特异性抗体(即，本发明的分离的多肽)并允许与抗原结合。随后检测抗体的存在并通过采用与抗体偶联的酶的比色反应进行定量。这种方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。如果适当校准并且在线性反应范围内，那么样品中存在的底物量与产生的颜色量成比例。一般采用底物标准以改善定量的精确度。
蛋白质印迹-这种方法涉及借助于丙烯酰胺凝胶随后通过将底物转移至膜(例如尼龙或PVDF)来分离底物(例如，如上所述的p53突变蛋白)与其他蛋白质。随后通过对底物特异的抗体(即，本发明的分离的多肽)来检测底物的存在，其依次由抗体结合试剂物来检测。抗体结合试剂可以是例如A蛋白，或其他抗体例如ECL试剂盒(AmershamBiosciences Inc，Piscataway，NJ，USA)中的那些。抗体结合试剂可以是放射标记的或如上所述酶连接的。检测可以经由放射自显影法、比色反应或化学发光。这种方法允许定量底物量并通过在膜上的相对位置确定其特性，所述相对位置是电泳过程中在丙烯酰胺凝胶中迁移距离的指示。应当理解在MHC-肽复合物的情况下，优选采用非变性凝胶电泳。
放射免疫测定法(RIA)：在一个版本中，这种方法涉及用特异性抗体(即，本发明的分离的多肽)和放射标记的抗体结合蛋白(例如，用I125标记的A蛋白)沉淀所需抗原(例如，如上所述的p53突变蛋白)，所述抗体固定在可沉淀的载体例如琼脂糖珠上。沉淀团块的计数数目与抗原量成比例。
在可替代版本的RIA中，采用标记的抗原和未标记的抗体结合蛋白。包含未知量抗原的样品以各种量加入。来自标记抗原的沉淀计数的减少与加入样品中的抗原量成比例。
基于分子量的方法-应当理解如上所述的p53突变蛋白与本发明的分离的多肽之间形成的免疫复合物显示出比其组分，即本发明的分离的多肽或p53突变蛋白更高的分子量。因此，还可以采用能够检测分子量中的此类变化的方法。例如，免疫复合物可以通过凝胶阻滞测定法进行检测。简言之，在免疫复合物形成之前或之后，非变性丙烯酰胺凝胶装载了包含本发明的分离的多肽和p53突变蛋白的样品。与其组分相比，蛋白质产物大小(分子量)的转变是存在免疫复合物的指示。向较高分子量的此类转变可以使用非特异性蛋白质染色法例如银染色或考马斯蓝染色观察。可替代地，p53突变蛋白或本发明的分离的多肽可以在凝胶电泳之前进行标记(例如，用放射性标记)。另外或可替代地，表达p53突变蛋白的细胞可以在蛋白质提取之前进行放射性标记。
为了促进免疫复合物形成的检测，本发明分离的多肽的多肽序列进一步包括可检测标记(即，表位标记)的氨基酸序列。此类氨基酸序列可以由包括在本发明的表达载体中的核酸序列编码。
根据本发明这个方面的另外的优选实施方案，本发明的分离的多肽附着至可检测标记，例如生物素、洋地黄毒苷等。此类可检测标记可以使用本领域众所周知的方法共价附着至本发明的分离的多肽。
上文描述的用于检测免疫复合物形成的试剂可以包括在制造的诊断试剂盒/物品中，优选连同合适的使用说明书和标明FDA批准用于在诊断和/或评估p53相关癌症的严重度中使用的标签。
此类试剂盒可以包括例如包括至少一种上述诊断剂(例如，F2、E6或A4 scFv抗体)的至少一种容器以及包装在另一容器中的成像试剂(例如，酶、二抗、缓冲液、显色底物、荧光材料)。试剂盒还可以包括合适的缓冲液和用于改善试剂盒的保存期限的防腐剂。
本发明的另外目的、优点和新特征在检查下列实施例后对于本领域普通技术人员将是显而易见的，所述实施例不希望是限制性的。另外，如上文所描述的以及如下文权利要求部分中所要求的本发明各种实施方案和方面中的每一个都可以在下列实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考连同上文说明书的下列实施例以非限制性方式举例说明本发明。
一般而言，本文使用的术语和本发明中使用的实验操作包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中充分说明。参见，例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook等人，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”第I-III卷Ausubel，R.M.Ed(1994)；Ausubel等人，“Current Protocols in MolecularBiology”，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley & Sons，New York(1988)；Watson等人，“Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，New York；Birren等人(Eds)“Genome Analysis：A LaboratoryManual Series”，第1-4卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐述的方法；“Cell Biology：A Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，J.E，Ed(1994)；“Culture of Animal Cells-AManual of Basic Technique”by Freshney，Wiley-Liss，N Y.(1994)，Third Edition；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan JE.Ed(1994)；Stites等人(Eds.)，“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(Eds.)，“Selected Methods in Cellular Immunology”，W.H.Freeman和Co.New York(1980)；可用的免疫测定法在专利和科学文献中广泛描述，参见，例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M J，Ed(1984)；“NucleicAcid Hybridization”Hames，B.D.and Higgins S J.Eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D，and Higgins S.J.Eds(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.Ed(1986)；″ImmobilizedCells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to MolecularCloning”Perbal，B.(1984)and“Methods in Enzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods AndApplications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“Strategies  for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有这些引入作为参考如完全在本文中阐述一样。
其他一般参考文献在本文件各处提供。其中的操作被认为是本领域众所周知的并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息引入本文作为参考。
一般材料和实验方法
细胞，质粒和试剂-H1299细胞从美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)获得，并且维持在补充10％胎牛血清(Sigma)的RPMI(Sigma，St.Louis，MO)中。稳定表达热斑点突变R175H的H1299-R175H细胞从V Rotter(Weizmann Institute of Science)获得。质粒pCMV/myc和pCMV/myc/nuc由I.Benhar(Tel Aviv University)提供。pCMV-scFv F2和pCMV/nuc-scFv F2通过从相应的pCC16克隆中去除scFv F2序列并亚克隆到pCMV和pCMV/nuc的NcoI和NotI位点中来构建，所述克隆从pCC16人合成文库(Azriel-Rosenfeld等人2004JMB 335，177)中分离。TAT-scFv F2/His表达质粒通过将TAT肽(RKKRRQRRRG；SEQ ID NO 133)克隆到载体pCANTAB6-Fv(表达无关scFv)中scFv上游的NcoI位点内或载体pMalC-TNN-EGFP中MBP上游的NcoI位点内来构建。2种载体都由I.Benhar(Tel AvivUniversity)提供。Fv和EGFP由克隆到2种质粒的NcoI和NotI位点内的scFv F2代替。TAT-scFv F2-NLS/His表达质粒通过将NLS肽(DPKKKRKV；SEQ ID NO：134)克隆到scFv下游的NotI位点内来构建。
文库的筛选-为了鉴别特异性结合突变p53共同表位的scFvs，筛选可排列的单链抗体的人合成组合文库。文库的构建和特性在Azriel-Rosenfeld等人2004 JMB 335，177-192中描述。文库的生物淘选使用生物素化的FRHSVV(SEQ ID NO 1)和Dynabeads M280-链霉亲和素(Dynal)进行。
文库的援救-等分试样的细菌文库甘油贮存物(约1×1010个克隆)接种到包含100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖(YTAG)的2 x YT中，并于37℃生长直至OD600nm为0.5。细胞用M13KO7辅助噬菌体以120的比率感染，于37℃不伴随振荡温育30分钟并随后转移至振荡温育器37℃另外30分钟。受感染细胞在3,300g下10分钟形成团块，重悬浮于包含100μg/ml氨苄青霉素和50mg/ml卡那霉素(YTAK)的2 xYT中，且于30℃温育过夜。细胞在4℃和8000g下离心10分钟。向上清液中加入PEG/NaCl(PEG/NaCl与上清液的比率为1∶5)并在冰上温育1小时。通过在4℃和10,800g下离心30分钟收集噬菌体并重悬浮于PBS中。
生物淘选-链霉亲和素-dynabeads在旋转器上于室温用MPBS(包含2％的脱脂奶粉PBS)平衡1小时。珠用磁体收集并重悬浮于包含0 1％吐温-20的MPBS中。噬菌体于室温与链霉亲和素-dynabeads单独预温育1小时。这2个步骤耗尽并避免了抗-链霉亲和素结合物。将噬菌体转移至新管并加入5nmol生物素化的FRHSVV(SEQ ID NO 1)肽并于室温在旋转器上温育1小时。将平衡的dynabeads加入噬菌体-抗原混合物中并于室温在旋转器上温育15分钟。将试管置于磁性架中1分钟并随后小心抽吸。珠用包含0 1％吐温-20的1ml MPBS洗涤6次。随后使用1ml 100mM TEA(三乙胺)从珠中洗脱噬菌体。噬菌体溶液通过转移至包含0.5ml 1.0M Tris(HCl)pH7的试管中立即中和。淘选输出通过铺板系列稀释的TG-1受感染细胞来测定。
单克隆噬菌体制剂-挑选来自输出板的单个克隆并接种到无菌96孔板中的100μl YTAG内。噬菌体于30℃伴随150rpm振荡生长过夜。将10μl接种物转移至每孔包含200μl YTAG的第二个96孔板并于37℃伴随振荡生长1小时。向每孔中加入包含109个噬斑形成单位(PFU)的辅助噬菌体的25μl YTAG，于37℃不伴随振荡温育30分钟，并于37℃伴随振荡(150rpm)再温育1小时。板在1,800g下经过10分钟，抽吸培养基并将细胞重悬浮于200μl YTAK中并于30℃振荡(150rpm)的同时生长过夜。板随后在1,800g下经过10分钟并在噬菌体ELISA中使用100ml上清液。
ELISA-板用1μg/孔的BSA-生物素包被并于4℃温育过夜。每种抗体温育后，板用PBST(PBS+0.05％吐温-20)洗涤3次，随后用PBS洗涤1次。加入1μg/孔的链霉亲和素，于37℃温育1小时并如上所述洗涤。板分成两半，一半加入FRHSVV-生物素(1μg/孔)，并且另一半加入BSA-生物素(1μg/孔)(作为对照)。板于37℃温育1小时，洗涤，于4℃用3％的脱脂奶粉封闭过夜并于37℃加入scFv(对于于37℃的1小时温育scFvs的量在100ng和500ng之间变动)。与scFv一起温育后，洗涤板，并取决于scFvs的来源加入单克隆抗M13(Amersham)、单克隆抗His-标记(Sigma)或单克隆抗MBP(Sigma)(根据制造商的说明各1∶1000稀释)于37℃温育1小时，随后洗涤。施加与HRP缀合的抗小鼠IgG，于37℃温育1小时，洗涤并根据制造商的说明使用底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma)显色。板随后在EasyReader 400 FW ELISA读数器(SLT，Austria)中在450nm处扫描。
使用mAb 1620或TAR1抗体的突变体和野生型核心结构域的ELISA研究-板于4℃与重组野生型或突变体核心结构域或与作为对照的PBS一起包被过夜。洗涤板并于37℃用3％的脱脂奶粉封闭2小时。加入mAb 1620或TAR1抗体并于37℃温育1小时，随后洗涤。施加与HRP缀合(1∶1000稀释)的单克隆抗MBP，于37℃温育1小时，洗涤并使用底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Sigma)显色。
scFvs的表达和纯化-scFv表达载体通过将TAT序列(RKKRRQRRRG；SEQ ID NO：133)融合至scFv的N末端并将3个重复的NLS序列(DPKKKRKV；SEQ ID NO 134)融合至scFv的C末端来制备。用pMalC-NN-TAT-scFv、pMalC-NN-TAT-scFv-NLS、pCANTAB6-TAT-scFv或pCANTAB6-TAT-scFv-NLS(所有构建体都是组氨酸标记的)转化的大肠杆菌细胞在补充100μg/ml氨苄青霉素和1％(w/v)葡萄糖的LB培养基中生长。当培养物达到0 6-0.9的A600时，它于30℃用0.5mM IPTG诱导4小时。细胞提取物通过冷冻-融化随后短暂超声处理在20mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)、0.5M NaCl和20mM咪唑中制备。通过在20,000g下离心来澄清提取物，并根据制造商的说明使用AKTA prime(Amersham pharmacia biotech)在HisTrapHP柱(Amersham Biosciences)上纯化scFv。
BIAcore分析-scFv和FHRSVV-生物素之间相互作用的实时分析根据制造商的说明使用BIAcore技术(Biacore AB，Uppsala，Sweden)进行测定。肽FRHSVV-生物素固定在链霉亲和素包被的传感器芯片表面SA上。固定肽的量是200pg/mm2，结合在HBS缓冲液(10mM HepesPH74、150mM NaCl、0 005％吐温-20、3.4mM EDTA)中进行。几种浓度的纯化scFv(62nM、125nM、250nM、1μM和2μM)以20μl/分钟的流速注入。解离在电泳缓冲液(HBS)中观察180秒。传感器芯片的再生使用10μl 10mM HCl进行。结合反应的动力学参数通过BIAevaluation 40软件(Biacore AB)使用1∶1的兰格缪尔模型进行测定。解离速率(离开速率)常数Kd和缔合速率常数(依附速率)Ka根据制造商的说明同时测定。
FACS分析-每个孔种植3×105个细胞。24小时后向培养基中加入纯化的TAT-scFV F2-NLS(250nM、0 5μM、1μM或2μM)并再温育24小时。通过将上清液中的脱壁细胞与来自同一孔的已用胰蛋白酶消化去除的粘附细胞组合来收获细胞。离心沉淀细胞、用PBS洗涤，并随后通过缓慢加入1ml冷70％的乙醇来固定。细胞于4℃维持过夜，再一次形成团块，重悬浮于1ml PBS中，并通过加入50μl碘化丙啶(1mg/ml)染色。染色强度使用FACScalibur Flow Cytometry System(BectonDickinson)测定。
表达scFv的细胞的建立-根据制造商的说明使用Fugene(Roche)以2μg DNA：4μl Fugene的比率用pCMV/myc-scFv-F2质粒转染H1299-R175H细胞。转染48小时后以0 4mg/ml的浓度加入可选择的药物G418(Invitrogen)。细胞在G418的存在下生长3周以达到单细胞克隆的集落。使用每种集落并通过蛋白质印迹分析测试scFv F2表达。
蛋白质印迹分析-细胞在被动裂解缓冲液(Promega)中裂解。蛋白质浓度使用BCA Protein Assay试剂盒(Pierce)进行测定。裂解物等分试样通过SDS-PAGE在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离，转移至硝化纤维膜，并用抗MBP-HRP(Sigma)或抗His-HRP(Sigma)探测。膜随后使用ECL试剂盒(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)显色。
免疫沉淀反应-对于突变体或野生型核心结构域的免疫沉淀反应研究，蛋白质与80nM TAR1一起温育过夜。免疫沉淀反应使用与G蛋白磁珠一起于4℃温育过夜的mAb DO-12抗体(1∶33稀释)来进行。珠用PBS洗涤，加入样品缓冲液并煮沸5分钟。使用抗His-HRP(1∶3000稀释)对洗脱的蛋白质实施蛋白质印迹分析，并使用ECL试剂盒显色。
集落形成-稳定表达突变p53的H1299-R175H或稳定表达突变p53和scFv F2的H1299-R175H-scFv F2以低浓度(500-1000个细胞/板)种植。细胞生长2周，抽吸培养基并用姬姆萨染色集落。集落的数目和大小使用scion(NIH Image Beta 4.0.2)分析系统的分析颗粒工具进行测定。
动物研究-对于scFv F2的抗肿瘤活性评估，9只CD1裸小鼠(6周龄)用5×106个H1299-R175H细胞皮下和单侧接种到右胁腹。3天后，小鼠分为2组。一组5只小鼠接受200μg/小鼠剂量的scFv F2瘤内注射，并且第二组4只小鼠用PBS注射并充当对照。注射每隔一天给予一次，共2周。测量肿瘤大小并使用公式(a2×b)/2计算肿瘤体积，其中(a)是短轴并且(b)是长轴。每组的相对体积通过每个数据点的平均肿瘤体积除以平均起始肿瘤体积测定。
圆二色性测量-使用串联比色杯(Hellma)允许分开地或在复合物中同时测量p53核心结构域和TAR1。所有蛋白质在50mM Tris，150mMNaCl中稀释至1μM的浓度。圆二色性吸光度测量在AVIV仪器中获取。实验参数如下：190nm-250nm的光谱扫描；1nm步幅；在每步中平均测量5秒；对于每个样品获取3次扫描。测量在4℃进行。
TUNEL测定法-对p53无效的H1299细胞或表达R175H突变p53的H1299细胞在载玻片上生长。细胞在缺乏或存在1μM TAR1的条件下温育过夜。载玻片用PBS洗涤且于室温用37％的甲醛固定10分钟随后用PBS洗涤。样品用Cytonin于室温透化处理15分钟并随后用水洗涤。内源性过氧化物酶的淬火使用溶于甲醇的3％H2O2于室温进行5分钟。载玻片用PBS洗涤并于37℃用生物素化核苷酸TdT标记1小时随后用PBS洗涤。载玻片与链霉亲和素-HRP一起温育10分钟，用PBS洗涤2次，并用底物二氨基联苯胺显色。
实施例1
SCFVs以高亲和力结合突变p53的共同表位
为了鉴别特异性结合突变p53共同表位的scFvs，使用生物素化的FRHSVV(SEQ ID NO：1)肽和链霉亲和素Dynabeads(Dynal)筛选可排列的单链抗体的人合成组合文库(Azriel-Rosenfeld等人2004JMB335，177-192)。
使用突变p53的共同表位通过生物淘选选择20个scFv克隆-图1a-b描述了使用突变p53的共同表位的FRHSVV(SEQ ID NO：1)肽通过生物淘选选择的分离scFvs的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的氨基酸序列。下文的表3描述了分离并在图1a-b以及表4和5中描述的所有scFv克隆的可变重链的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
表3：可变重链
  CDR1   CDR2   CDR3
  FSGYWMHWV(SEQ ID NO：5)   EISGSGDSTHYGDSVKG(SEQ ID NO：6)   GRNGSLDYW(SEQ ID NO：7)
表3：本发明分离的所有scFv克隆的可变重(VH)链的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(关于scFv克隆IDs参见下文的表2)。
下文的表4和5呈现了针对FRHSVV(SEQ ID NO：1)肽选择的分离scFvs的可变轻链(表4)的CDRs以及分离scFvs的可变轻链(表5)的独特CDRs。
表4：可变轻链
CDR1 CDR2 CDR3   scFv CloneID No
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表4：呈现了各种scFv克隆的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列(SEQ ID NOs：8-65和111-112)。
表5：轻链的独特CDRS
  CDR1   CDR2   CDR3
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  CQSFDSTLSGPVFGGGTKV(SEQ ID NO 110)
表5：呈现了各种scFv克隆的可变轻链的CDR1、CDR2和CDR3的独特氨基酸序列(SEQ ID NOs 66-110)。
ScFvs F2、A4和B6对突变p53的共同表位是特异的-测试F2、A4和B6scFvs对牛血清白蛋白(BSA)和链霉亲和素蛋白以及FRHSVV(SEQ ID NO：1)、β淀粉样蛋白肽DAEFRHDSGYEVHHQK SEQ IDNO：2)、MAP-PrP(DYEDRYYRE；SEQ ID NO：3)和PaP(ILLWQPIPV；SEQ ID NO 4)肽的结合能力。如图9中所示，F2 scFv、A4 scFv显示出对于来源于突变p53共同表位的肽的高亲和力，而B6 scFv的程度较少。另一方面，这些抗体显示出对于测试的其他肽或蛋白质的低亲和力。
scFv F2和E6抗体显示结合突变体表位的高亲和力-为了测定分离的scFvs对于靶肽(SEQ ID NO 1)的结合亲和力，采用BIAcore技术。肽(FRHSVV；SEQ ID NO 1)的生物素缀合物固定在链霉亲和素包被的传感器芯片表面上并使用浓度递增的纯化F2和E6 scFvs测定结合特异性。如图2a-b中所示，F2(图2a)和E6(图2b)scFvs能够以分别为11×10-8和4.6×10-14M的亲和力结合突变p53的共同表位。这些结果首次证实针对p53的共同表位分离的人抗体具有适合于治疗应用的亲和力。
F2和A4抗体对突变p53的共同表位是特异的-如图9中所示，使用F2、A4和B6 scFvs进行的ELISA显示F2和A4抗体对来源于突变p53的共同表位的肽(SEQ ID NO：1)是高度特异的。
实施例2
分离的SCFVs结合具有重度构象变化的完整突变p53蛋白质
为了证实分离的scFvs对完整p53分子的结合能力，ELISA板用重组野生型p53或在sf9昆虫细胞中生产的突变p53-R175H、p53-R248H和p53-R273W完整蛋白包被，并加入100-500ng scFv F2。
如图3中所示，F2 scFv(在本文中也称为TAR1)纯化的抗体有区别地结合各种p53蛋白质。尽管F2 scFv与野生型p53蛋白质的结合相对较低(OD492nm约0.1)，与显示重度构象变化(例如R175H)或中等构象变化(例如R248W)的p53突变体的结合非常高(OD492nm＞0.25)。因此，导致共同突变体表位较高暴露的p53蛋白质中的重度构象变化对本发明的抗体更敏感。
这些结果提示本发明的抗体(例如F2 scFv)特异性和区别性靶向突变p53蛋白质而不影响野生型p53蛋白质的用途。
实施例3
F2 SCFV抗体(TAR1)在表达突变p53的细胞中
诱导凋亡并抑制集落形成
野生型p53的凋亡活性是其肿瘤抑制功能的主要贡献者。然而，当p53突变时这种活性丧失。为了确定F2 SCFV(TAR1)是否能够恢复突变p53的凋亡功能，稳定表达突变体R175H p53蛋白质的癌细胞株用TAR1处理并如下使用FACS和TUNEL分析测定对凋亡的影响。
F2 scFv(TAR1)能够诱导凋亡-测试纯化的分离F2 scFv抗体(TAR1)诱导表达突变体R175H p53蛋白质的H1299人肺癌细胞中的凋亡的能力。如图4a-j和15a-d中所示，尽管在表达突变体R175H p53蛋白质的细胞用F2 scFv抗体(TAR1)处理24小时导致剂量依赖性方式的凋亡(例如在0.5和2μM F2 scFv的存在下分别有约13％和约32％的细胞凋亡；图4a-e和图15a-b)，在不表达R175H p53蛋白质的肺癌细胞中，F2 scFv抗体不能诱导凋亡(图4f-j和图15c-d)。
当稳定表达突变p53 R175H的HCT116结肠癌细胞用1μM TAR1处理24小时时，获得类似结果。如图15e-h中所示，TAR1导致具有亚-G1 DNA含量的细胞比例明显增加，表明DNA断裂和细胞死亡(图15f)。凋亡的诱导在表达野生型p53的HCT116细胞中不明显(图15h)，表明经由TAR1诱导的凋亡是突变p53依赖性的。
这些结果由图16a-d中显示的TUNEL测定法确证。凋亡细胞的染色只在用TAR1处理的(图16b)表达突变p53 R175H的H1299细胞中明显，而在未处理的细胞中则不是(图16a)。在对p53无效的H1299细胞中没有观察到染色，不管细胞是(图16d)不是(图16c)用TAR1处理。
TAR1在表达内源性突变p53蛋白质的癌性细胞株中能够通过凋亡诱导细胞死亡-TAR1对细胞死亡的影响在一组9个人肿瘤细胞株中进一步测试，所述细胞株在其p53核心结构域中内源性表达不同的点突变，代表性的各种肿瘤类型包括结肠(KM12-C、SW480、Colon 320)，乳腺(T47D、SKBR3、MCF7、MDA231)，脑(例如成神经细胞瘤LAN1)和胰腺(PANC1)。细胞用1μM TAR1处理24小时(图17b、d、f、h、j、l、n、p、r)或保持未处理(图17a、c、e、g、i、k、m、o、q)并且使用FACS分析评估对凋亡的影响。如图17a-r中所示，如在亚-G1部分中积聚的细胞所证明的，不管其点突变性质或肿瘤类型如何，TAR1处理导致所有测试细胞株中有区别的凋亡诱导。
表达F2 scFv的细胞显示集落形成减少-为了进一步证实F2 scFv抗体对凋亡和细胞死亡的影响，含有突变p53蛋白质(R175H)的细胞用含有F2 scFv抗体的表达载体稳定转染，并在用500-1000个细胞/板种植的组织培养中测定对细胞生长的影响。如图6a-d中所示，在表达F2scFv抗体的细胞中集落数目和集落面积显著减少。
总而言之，这些结果证实本发明的F2 scFv抗体可以诱导凋亡并抑制集落形成。这些结果提示本发明的scFv抗体在治疗表达突变p53的细胞的癌症中的用途。
F2 scFv增加表达突变p53的细胞对化学治疗药物的敏感性-为了测试本发明的scFv抗体与常用的化学治疗药物组合的潜在用途，在F2scFv抗体的缺乏和存在下测试依托泊苷和顺铂药物对表达突变p53的细胞的影响。如图5中所示，尽管表达F2 scFv抗体的细胞在低至0.5μg/ml顺铂和1μM依托泊苷的浓度下对化学治疗药物高度敏感，不表达scFv抗体的人肺癌细胞对于此类药物是较不敏感的。
这些结果进一步提示本发明的scFv抗体与其他药物组合治疗癌症的用途。
实施例4
F2 SCFV抗体抑制体内肿瘤生长
为了测试本发明的F2 scFv抗体抑制体内肿瘤细胞生长的能力，对裸小鼠实施人肺癌细胞(H1299-R175H)的皮下注射。3天后，小鼠接受scFv F2(200μg)或PBS(50μl)的瘤内注射，这每隔一天重复一次，共2周。如图7中所示，尽管在PBS处理的小鼠中肿瘤大小在接种后28-36天内显著增加，在F2 scFv处理的小鼠中，即使在36天后肿瘤大小也保持不变。图8a-f描述了在F2 scFv处理的小鼠中肿瘤的抑制。总而言之，这些结果证实纯化的F2 scFv抗体在抑制体内肿瘤生长中的用途。
实施例5
突变p53恢复野生型P53构象
如下所述，本发明人采用生物化学和生物物理学方法确定TAR1(即，F2 scFv抗体)与突变p53结合是否能够恢复野生型蛋白质折叠。
实验结果
TAR1增加野生型p53特异性抗体mAb 1620与p53 R175H突变体的结合-使用构象特异性的单克隆抗体对野生型和R175H突变p53蛋白质的P53核心结构域的重组多肽(包括由SEQ ID NO 135列出的p53蛋白质的氨基酸94-312；GenBank登记号NP_000537)实施ELISA和免疫沉淀测定法。第一个步骤是确定纯化的重组核心结构域蛋白质显示野生型和突变p53蛋白质的特异性构象。使用对突变构象特异的TAR1抗体(其识别与mAb 240相同的表位)(图10a)和对野生型构象特异的mAb 1620(Abcam Laboratories，Ltd，UK)(图10b)的ELISA测定法证实情况的确就是这样。TAR1与突变p53 R175H和野生型核心结构域的结合于37℃加热30或60分钟后，导致突变体核心结构域的mAb 1620阳性部分增加3倍，并阻止野生型核心结构域的解折叠且稳定野生型p53的构象(图10c和d)。为了证实这些结果，在免疫沉淀测定法中使用mAb DO-12(Novocastra Laboratories，Ltd，UK)，其对突变p53构象特异，然而结合与TAR1不同的表位。TAR1与突变p53核心结构域结合导致DO-12阳性部分显著减少，但对野生型核心结构域没有影响(图11a)。
与TAR1的结合导致突变p53光谱中的转变-圆二色性是用于分析溶液中的蛋白质二级结构的方法并且可以确定蛋白质-蛋白质相互作用是否改变蛋白质的构象。蛋白质的构象变化导致与单个组分的总和不同的光谱。采用圆二色性方法，使用TAR1抗体和野生型p53或突变体R175H核心结构域。TAR1的结合导致突变p53光谱中的转变，同时在野生型核心结构域光谱中几乎没有观察到差异，表明TAR1和突变p53的复合物中的构象变化。含野生型p53以及含突变p53的2种TAR1复合物的光谱是非常相似的，表明构象相似性(图12)。
TAR1处理表达突变p53的细胞增加mAb 1620与此类细胞提取物的结合-如图11b中所示，在稳定表达突变p53 R175H的H1299细胞中可以检测到突变p53的构象变化。这些细胞用TAR1处理后，如通过使用野生型特异性的mAb 1620的免疫沉淀反应判断的，观察到采用野生型构象的细胞比例增加。
总而言之，这些结果证实TAR1能够恢复突变p53核心结构域的野生型构象。
实施例6
TAR1恢复突变p53的转录反式激活
野生型p53靶基因的反式激活转录的能力丧失是突变p53的特征性特征之一。如下所述，本发明人已测试了TAR1在表达突变p53的细胞中恢复P53转录反式激活功能的能力。稳定表达突变p53 R175H蛋白质的H1299细胞用TAR1处理24小时，并通过蛋白质印迹分析检查p21、MDM2和Bax的表达水平。用TAR1处理细胞导致3种内源性野生型p53靶基因p21(图13a)、MDM2(图13b)和Bax(图13d)的表达水平以浓度依赖性方式增加。微管蛋白的表达水平充当每次实验中使用的蛋白质水平的内部对照(图13e-h)。此外，某些突变p53蛋白质已显示反式激活不同于由野生型p53激活的基因的基因转录，其中之一是EGR1。如图13c中所示，如通过处理细胞中EGR1的表达较少所证实的，用TAR1处理细胞取消了突变p53蛋白质的功能活性获得。
因此，这些结果证实本发明的TAR1抗体能够恢复野生型特异的靶基因(例如p21、MDM2和Bax)的转录反式激活功能，并阻止突变p53的转录激活。
实施例7
病毒展示媒介物是有用的治疗剂
如下所述，本发明人已设计了能够穿透到哺乳动物细胞(例如CHO细胞)内的病毒展示媒介物，其可以用于将本发明的抗-p53抗体(例如TAR1)递送到目的细胞内。
丝状噬菌体融合物88在外被蛋白VIII上表达PTD(例如如图18a-b中所显示的肽PEP)。PEP肽(SEQ ID NO：136)使得噬菌体能够穿透到细胞内。该丝状噬菌体还包括在蛋白质III上与NLS(SEQ IDNO：134)融合的本发明的scFv(例如TAR1)。NLS肽使得噬菌体能够核定位。呈现于图18-21中的结果证实噬菌体PEP能够穿透哺乳动物细胞并且对这些细胞没有毒性作用。此类丝状噬菌体(即病毒展示媒介物)可以作为治疗剂鼻内施用用于治疗脑肿瘤。
因此，这些结果证实包括本发明的抗-p53抗体的病毒展示媒介物用于治疗p53相关疾病的用途。
应当理解为了清晰起见在分开的实施方案的背景中描述的本发明的某些特征同样可以以单个实施方案组合的形式提供。相反，为了简洁起见在单个实施方案的背景中描述的本发明的各种特征同样可以分开或以任何合适亚组合的形式提供。
尽管本发明已结合其具体实施方案进行描述，但很显然许多可替代方案、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，希望涵盖包括在所附权利要求的精神和广泛范围内的所有此类可替代方案、修改和变化。本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在此整体引入本说明书作为参考，其程度与每个单个出版物、专利或专利申请特别并个别指出引入本文作为参考相同。此外，本说明书中引用或鉴别的任何参考文献不应解释为承认此类参考文献可用作本发明的现有技术。
参考文献
(另外的参考文献在正文中引用)
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<170>PatentIn version 3 3
<210>1
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<223>对应β淀粉样蛋白的氨基酸1-16的肽
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<223>对应呈现人朊病毒蛋白质的多抗原肽的氨基酸144-153的肽
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<213>人工序列
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<223>对应前列腺癌抗原的肽
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<223>可变轻链
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<223>可变轻链
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<400>35
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Leu
<210>36
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>36
Thr Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>37
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>38
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>38
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Leu
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>39
Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>40
Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>41
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>41
Cys Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Leu
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>42
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>43
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>43
Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>44
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>44
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Leu
<210>45
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>45
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>46
Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>47
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>47
Cys Gln Ser Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Val
<210>48
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>48
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>49
Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>50
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>50
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Val
<210>51
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>51
Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Gln Trp
1               5                   10                  15
<210>52
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>52
Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>53
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>53
Cys Gly Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Pro Val
<210>54
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>54
Thr Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Asn His His Val Ser Trp
1               5                   10
<210>55
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>55
Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>56
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>56
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Val
<210>57
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>57
Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His Thr Val His Trp
1               5                   10
<210>58
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>58
Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>59
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>59
Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Val
<210>60
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>60
Thr Gly Gly Arg Phe Asn Ile Gly Asp Tyr Ala Val His Trp
1               5                   10
<210>61
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>61
Ile Tyr Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>62
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>62
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Leu
<210>63
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>63
Thr Gly Gly Arg Phe Asn Ile Gly Asp Tyr Ala Val His Trp
1               5                   10
<210>64
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>64
Ile Tyr Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>65
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>65
Cys Gln Ser Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Val
<210>66
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>66
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>67
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>67
Ile Tyr Asp Asn His Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>68
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>68
Ser Trp Asp Asn Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
1               5                   10                  15
<210>69
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>69
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>70
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>70
Ile Tyr Ser Asn His His Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>71
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>71
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu
<210>72
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>72
Thr Gly Thr Thr Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>73
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>73
Ile Tyr Asp Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>74
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>74
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu His Val Glu Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu
<210>75
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>75
Thr Gly Ser Ser Ala Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>76
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>76
Tyr Glu Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>77
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>77
Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Leu
<210>78
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>78
Thr Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>79
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>79
Tyr Gly Asn Tyr His Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>80
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>80
Ser Ser Trp Asp Asp Ser Gln Ser Gly His Val Ala Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Val
<210>81
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>81
Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>82
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>82
Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>83
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>83
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Val
<210>84
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>84
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>85
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>85
Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>86
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>86
Ala Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Lys Val
<210>87
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>87
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>88
Ala Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5
<210>89
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>89
Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Lys Val
<210>90
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>90
Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Gln Trp
1               5                   10                  15
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>91
Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>92
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>92
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Val
<210>93
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>93
Thr Gly Gly Ser Ser Asn Ile Gly Asn His His Val Ser Trp
1               5                   10
<210>94
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>94
Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5
<210>95
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>95
Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu
<210>96
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>96
Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser His Thr Val His Trp
1               5                   10
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>97
Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
1               5
<210>98
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>98
Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
1               5                   10                  15
Leu
<210>99
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>99
Thr Gly Gly Arg Phe Asn Ile Gly Asp Tyr Ala Val His Trp
1               5                   10
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>100
Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5
<210>101
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>101
Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu
<210>102
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>102
Ile Tyr Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>103
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>103
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
1               5                   10                  15
Lys Leu
<210>104
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>  104
Cys Gln Ser Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Val
<210>105
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>105
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Val
<210>106
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>106
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Pro Val
1               5                   10
<210>107
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>107
Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Val
<210>108
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>108
Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly G1y Thr Gln Val
1               5                   10
<210>109
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>109
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Gln Leu
<210>110
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>轻链的独特CDR
<400>110
Cys Gln Ser Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Lys Val
<210>111
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>111
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp
1               5                   10                  15
<210>112
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>可变轻链
<400>112
Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val
1               5                   10
<210>113
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>113
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Leu Thr Val
<210>114
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>114
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Ser Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Val Thr Val
<210>115
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>115
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Pro Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Arg
145                 150                 155                 160
Phe Asn Ile Gly Asp Tyr Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly
            180                 185                 190
Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
        195                 200                 205
Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala
    210                 215                 220
Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asp Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln
225                 230                 235                 240
Leu Thr Val
<210>116
<211>242
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>116
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn His Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Ser Trp Asp Asn Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
225                 230                 235                 240
Ser Val
<210>117
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>117
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Asp Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn His His Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Leu Thr Val
<210>118
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>118
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Ser His Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu His Val Glu Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Leu Thr Val
<210>119
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>119
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Thr
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Asn Asp Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gln Leu Thr Val
                245
<210>120
<211>245
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>120
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Tyr His Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ser Ser Trp Asp Asp Ser Gln Ser Gly His Val Ala Phe Gly Gly Gly
225                 230                 235                 240
Thr Gln Val Thr Val
                245
<210>121
<211>244
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>121
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1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Val Thr Val
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>122
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ala Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Arg Leu Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Val Thr Val
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<212>PRT
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<220>
<223>单链Fv
<400>123
Val Arg Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Val Thr
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<212>PRT
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<220>
<223>单链Fv
<400>124
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
l               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Leu Thr Val
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<211>244
<212>PRT
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<220>
<223>单链Fv
<400>  125
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asn Asn Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Asn Leu Ash Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Leu Thr Val
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<212>PRT
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<220>
<223>单链Fv
<400>126
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr
225                 230                 235                 240
Lys Leu Thr Val
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<212>PRT
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<220>
<223>单链Fv
<400>127
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
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            180                 185                 190
Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Gln Val Thr Val
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<220>
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<400>128
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        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val Gln Trp Tyr Gln Gln Leu Pro
                165                 170                 175
Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser
        195                 200                 205
Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gly Val Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr
225                 230                 235                 240
Pro Val Thr Val
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<220>
<223>单链Fv
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1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Ser His Thr Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly
            180                 185                 190
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
        195                 200                 205
Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Ala Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln
225                 230                 235                 240
Val Thr Val
<210>130
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>130
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asn Ile Gly Asn His His Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly
            180                 185                 190
Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
        195                 200                 205
Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val
<210>131
<211>243
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>131
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
1                5                  10                  15
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
            20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
        35                  40                  45
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp Ser Val Lys
    50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala
    130                 135                 140
Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gly Arg
145                 150                 155                 160
Phe Asn Ile Gly Asp Tyr Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly
                165                 170                 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asp Arg Arg Pro Ser Gly
            180                 185                 190
Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu
        195                 200                 205
Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
    210                 215                 220
Ser Phe Asp Ser Thr Leu Ser Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Val Thr Val
<210>132
<211>151
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>单链Fv
<400>132
Ser Val Pro Ser Ser Leu Val Ile Glu Gly Arg Pro Glu Phe Ser Thr
l               5                   10                  15
Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
            20                  25                  30
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
        35                  40                  45
Gly Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys GIy Leu Glu
    50                  55                  60
Trp Val Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr His Tyr Gly Asp
65                  70                  75                  80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
                85                  90                  95
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Asn Gly Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
        115                 120                 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145                 150
<210>133
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>TAT肽
<400>133
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly
1               5                   10
<210>134
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>核定位信号
<400>134
Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1               5
<210>135
<211>393
<212>PRT
<213>人
<400>135
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1               5                   10                  15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
            20                  25                  30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
        35                  40                  45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
    50                  55                  60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Arg Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65                  70                  75                  80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
            100                 105                 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
        115                 120                 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
    130                 135                 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145                 150                 155                 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
                165                 170                 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
            180                 185                 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
        195                 200                 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
    210                 215                 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225                 230                 235                 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
                245                 250                 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
            260                 265                 270
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
        275                 280                 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
    290                 295                 300
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305                 310                 315                 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu
                325                 330                 335
Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp
            340                 345                 350
Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His
        355                 360                 365
Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met
    370                 375                 380
Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp
385                 390
<210>136
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>细胞内化肽
<400>136
Glu Phe Gly Ala Cys Arg Gly Asp Cys Leu Gly Ala
1               5                   10

Claims (34)

1.一种分离的多核苷酸，其包括编码多肽的核酸序列，所述多肽能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位，其中所述特异性结合的亲和力小于25纳摩尔。
2.一种分离的多核苷酸，其包括编码包含CDR的多肽的核酸序列，所述多肽包括选自CDR SEQ ID NOs.8-112的至少一种CDR。
3.一种药物组合物，其包括作为活性成分的权利要求1或2的分离的多核苷酸以及药学可接受载体。
4.一种分离的多肽，其包括能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位的氨基酸序列，其中所述特异性结合的亲和力小于25纳摩尔。
5.一种分离的多肽，其包括选自CDR SEQ ID NOs 8-112的至少一种CDR的氨基酸序列。
6.一种药物组合物，其包括作为活性成分的权利要求4或5的分离的多肽以及药学可接受载体。
7.一种组合物，其包括在表面上表达多肽的病毒展示媒介物，所述多肽能够特异性结合由p53突变蛋白而不是由野生型p53蛋白质共有的暴露表位，其中所述特异性结合的亲和力小于25纳摩尔。
8.一种组合物，其包括在表面上表达包含CDR的多肽的病毒展示媒介物，所述多肽包括选自CDR SEQ ID NOs：8-112的至少一种CDR。
9.一种药物组合物，其包括作为活性成分的权利要求7或8的病毒展示媒介物以及药学可接受载体。
10.一种核酸构建体，其包括权利要求1或2的分离的多核苷酸，以及用于指导所述分离的多核苷酸在细胞中表达的启动子。
11.一种诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞的方法，其包括使权利要求4或5的分离的多肽与所述癌细胞接触或在其中表达，从而诱导所述癌细胞凋亡和/或生长停滞。
12.一种治疗患有或易患p53相关癌症的受试者的方法，其包括给所述受试者施用、或在其细胞中表达治疗有效量的权利要求4或5的分离的多肽，从而治疗所述受试者中的所述p53相关癌症。
13.一种诱导癌细胞凋亡和/或生长停滞的方法，其包括使权利要求7或8的病毒展示媒介物与所述癌细胞接触，从而诱导所述癌细胞凋亡和/或生长停滞。
14.一种治疗患有或易患p53相关癌症的受试者的方法，其包括给所述受试者施用治疗有效量的权利要求7或8的病毒展示媒介物，从而治疗所述受试者中的所述p53相关癌症。
15.权利要求4或5的分离的多肽用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
16.权利要求1或2的分离的多核苷酸用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
17.权利要求10的核酸构建体用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
18.权利要求7或8的病毒展示媒介物用于制备被鉴别用于治疗p53相关癌症的药物的用途。
19.一种诊断受试者中的p53相关癌症的方法，其包括：
(a)在适合于免疫复合物形成的条件下使所述受试者的生物样品与权利要求4或5的分离的多肽接触，所述免疫复合物包括所述分离的多肽和p53突变蛋白；和
(b)检测所述免疫复合物的形成，从而诊断所述受试者中的所述癌症。
20.权利要求1、3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中任何一项的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、组合物、用途或方法，其中所述表位如SEQ ID NO 1所示。
21.权利要求1、3、4、6、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18中任何一项的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、组合物、用途或方法，其中所述多肽包括选自SEQ ID NOs：39-41、45-47和60-62的至少一种CDR。
22.权利要求1-19中任何一项的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、组合物、用途或方法，其中所述多肽选自Fab片段、Fv片段、单链抗体、单结构域抗体和抗体。
23.权利要求22的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、组合物、用途或方法，其中所述单链抗体选自SEQ IDNO.113、SEQ ID NO 114和SEQ ID NO 115。
24.权利要求10的核酸构建体，其进一步包括编码与所述多肽融合的核定位信号(NLS)的另外的核酸序列。
25.权利要求24的核酸构建体，其中所述NLS由SEQ ID NO.134所示。
26.权利要求1、2、3、10、16和17中任何一项的分离的多核苷酸、药物组合物、核酸构建体、用途或方法，其中所述多核苷酸进一步包括编码药物的另外的核酸序列。
27.权利要求1-18中任何一项的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、组合物、用途或方法，其中所述多肽进一步包括药物的氨基酸序列。
28.权利要求4、5、6、11、12和15中任何一项的分离的多肽、药物组合物、用途或方法，其中所述多肽附着至药物。
29.权利要求26、27和28中任何一项的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、组合物、用途或方法，其中所述药物是毒素和/或化学治疗药物。
30.权利要求1、2和10中任何一项的分离的多核苷酸或核酸构建体，其中所述多核苷酸进一步包括编码可检测标记的另外的核酸序列。
31.权利要求1、2、4、5、7、8、10和19中任何一项的分离的多核苷酸、分离的多肽、核酸构建体、组合物或方法，其中所述多肽进一步包括可检测标记。
32.权利要求31的分离的多核苷酸、分离的多肽、核酸构建体、组合物或方法，其中所述可检测标记是生物素和洋地黄毒苷。
33.权利要求19的方法，其中所述生物样品选自血液、淋巴结活检物、骨髓抽吸物和组织样品。
34.权利要求22的分离的多核苷酸、分离的多肽、药物组合物、核酸构建体、用途或方法，其中所述Fab片段、所述Fv片段、所述单链抗体、所述单结构域抗体和所述抗体中的每一种都是人源化的。
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