WO2023026881A1 - 抗ｐｄ－１シグナルペプチド抗体とその利用 - Google Patents

抗ｐｄ－１シグナルペプチド抗体とその利用 Download PDF

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WO2023026881A1
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conjugate
amino acid
antigen
cells
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菜穂子 ベイリー小林
徹彦 吉田
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東亞合成株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to an antibody against the signal peptide of PD-1 (Programmed cell death-1) and its use. It also relates to methods for producing such antibodies.
  • PD-1 Programmed cell death-1
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-136983 filed on August 25, 2021, and the entire contents of that application are incorporated herein by reference. there is
  • Immune checkpoint inhibition therapy is known as one of the cancer immunotherapies.
  • This therapy uses so-called "immune checkpoint proteins” such as CTLA-4 (Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4) and PD-1, which are known as proteins involved in the function of suppressing excessive immune reactions in vivo.
  • CTLA-4 Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4
  • PD-1 proteins involved in the function of suppressing excessive immune reactions in vivo.
  • an inhibitor that inhibits the immune response suppression mechanism involving immune checkpoint proteins is used to prevent cancer cells from attacking the immune system (also known as immune escape mechanism). )” and promote the immune system's attack on cancer cells.
  • an antibody against PD-1 which is a membrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily (anti-PD-1 antibody), or PD-L1 (Programmed cell death-1 ligand- 1: Also called B7-H1.)
  • anti-PD-1 antibody a membrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily
  • PD-L1 Programmed cell death-1 ligand- 1: Also called B7-H1.
  • antibodies such as anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody that can be used for immune checkpoint inhibition therapy usually use a partial protein (peptide) of the extracellular region as an antigen. and This could allow the antibody to bind to PD-1 or PD-L1 and inhibit the interaction between PD-1 and PD-L1.
  • anti-PD-1 antibodies and anti-PD-L1 antibodies have substantially no or extremely low effect on improving antitumor immune activity. Therefore, there is a demand for the development of a tumor treatment method from a new approach.
  • an object of the present invention is to provide an antibody that suppresses the growth of tumor cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing such an antibody.
  • anti-PD-1sp antibody a new antibody whose antigen is the signal peptide of PD-1 (hereinafter "anti-PD-1sp antibody” ) was manufactured.
  • signal peptides are removed before membrane proteins are transported to the cell membrane, so it is speculated that PD-1 present in the cell membrane does not have a signal peptide.
  • PD-1 is a protein that is highly expressed in immune cells (eg, T cells), and it is presumed that the expression level of PD-1 in tumor cells is relatively low.
  • T cells immune cells
  • the anti-PD-1sp antibody is expected to be used as a new approach to suppress the growth of tumor cells.
  • the antibody disclosed here is an antibody whose antigen is the PD-1 signal peptide consisting of the amino acid sequence: MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGW (SEQ ID NO: 1). Antibodies of such a configuration can inhibit cell proliferation of tumor cells.
  • the manufacturing method disclosed herein uses the following amino acid sequence: MQIPQAPWPVVWAVLQLGWRPGW (SEQ ID NO: 1)
  • a method for producing an antibody using a PD-1 signal peptide as an antigen comprising: a synthetic peptide containing all or part of the above amino acid sequence; It involves providing a conjugate having an attached conjugate-forming polymer and a carrier protein as an antigen, and obtaining an antibody from a non-human mammal immunized with the antigen.
  • an anti-PD-1sp antibody capable of suppressing cell proliferation of tumor cells can be produced.
  • At least one Cys residue is added to one end of the conjugate-forming polymer that is not bound to the synthetic peptide. and the carrier protein is linked to the Cys residue via a cross-linking agent having a homobifunctional group or a heterobifunctional group.
  • the conjugate-forming polymer is polyethylene glycol. Since polyethylene glycol is highly hydrophilic, it can improve the water solubility of the conjugate.
  • FIG. 1 is a graph showing antibody titers of sera obtained from rabbits immunized with the conjugate of Example 1 as an antigen.
  • FIG. 2 is a graph showing antibody titers of sera obtained from rabbits immunized with the conjugate of Example 2 as an antigen.
  • FIG. 3 is a graph showing antibody titers of sera obtained from rabbits immunized with the conjugate of Example 3 as an antigen.
  • synthetic peptide means that the peptide chain does not exist independently and stably in nature, but is produced by artificial chemical synthesis or biosynthesis (that is, production based on genetic engineering). and can stably exist in a given system (eg, a composition containing an adjuvant).
  • peptide refers to an amino acid polymer having multiple peptide bonds, and is not limited by the number of amino acid residues contained in the peptide chain, but typically the total number of amino acid residues is about 100 or less. (preferably 80 or less, more preferably 70 or less, for example 60 or less).
  • amino acid residue as used herein is a term that includes the N-terminal amino acid and C-terminal amino acid of a peptide chain, unless otherwise specified.
  • conjugate refers to a product formed by binding two or more of various compounds (e.g., peptides, proteins, polymers, cross-linking agents, etc.) to the composition. It is a subsumed term. In the amino acid sequences described herein, the N-terminal side is always on the left side and the C-terminal side is on the right side.
  • tumor is used in a broad sense and refers to general tumors (typically malignant tumors) including carcinomas, sarcomas, and lesions of blood and hematopoietic tissue (leukemia, lymphoma, etc.).
  • tumor cells are synonymous with “cancer cells”, and are cells that form such tumors and typically grow abnormally independently of surrounding normal tissues. cells that have become cancerous (so-called cancerous cells). Therefore, unless otherwise specified, any cell classified as a tumor cell (cancer cell) rather than a normal cell is referred to as a tumor cell regardless of the origin or properties of the cell.
  • tumor cell refers to an animal to which an antigen is administered for the purpose of producing antibodies.
  • the antibody disclosed here is an antibody (anti-PD-1sp antibody) capable of using the signal peptide of human PD-1 as an antigen.
  • Human PD-1 is a membrane protein belonging to the immunoglobulin superfamily consisting of 288 amino acid residues.
  • PD-1 is an immune checkpoint protein that is abundantly expressed in the cell membrane of immune cells such as T cells, and is a protein involved in the negative control of immune reactions by binding to a ligand (eg, PD-L1). be.
  • the full-length sequence of the signal peptide of human PD-1 is a sequence consisting of a total of 23 amino acid residues shown in SEQ ID NO:1.
  • Such an amino acid sequence is the 1st to 23rd amino acid sequence of the amino acid sequence that constitutes human PD-1.
  • the genetic information and amino acid information of PD-1 can be obtained from databases of various public international organizations. Such databases include, for example, Universal Protein Resource (UniProt).
  • the anti-PD-1sp antibody disclosed here can suppress tumor cell proliferation by being added to tumor cells.
  • the tumor cell suppressing effect of conventional anti-PD-1 antibodies is typically due to the interaction between PD-1 expressed in immune cells and ligands (e.g. PD-L1) expressed in tumor cells, etc., resulting in immune reactions. It inhibits negative regulation and promotes suppression of tumor cell proliferation by activation of immune cells.
  • ligands e.g. PD-L1
  • the method for producing an anti-PD-1sp antibody disclosed herein comprises a conjugate comprising a synthetic peptide containing all or part of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a conjugate-forming polymer, and a carrier protein as an antigen. and obtaining the antibody from a non-human mammal immunized with the antigen.
  • a synthetic peptide contained in a conjugate used as an antigen typically consists of an amino acid sequence that constitutes the PD-1 signal peptide shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter also referred to as "PD-1sp sequence").
  • the synthetic peptide may partially contain the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and may be composed of a modified amino acid sequence obtained by modifying the PD-1sp sequence, for example.
  • modified amino acid sequences include, for example, amino acid sequences in which 1, 2 or 3 amino acid residues are substituted, deleted or inserted into the PD-1sp sequence.
  • the modified amino acid sequence may be an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are added to the N-terminal side and/or the C-terminal side of the PD-1sp sequence. Since polyclonal antibodies obtained from immunized animals have various parts of the synthetic peptide as epitopes, antibodies against the PD-1 signal peptide as an antigen can be obtained even with such a modified amino acid sequence.
  • the synthetic peptide preferably has a high degree of identity with the PD-1sp sequence.
  • the identity is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more (for example, 100%).
  • the term “identity” as used herein has the same general interpretation in the technical field, and means the degree of sequence invariance when two or more sequences are aligned. Identity values can be calculated, for example, using various publicly available programs, such as ClustalW from the National Institute of Genetics and the National Institute of Biotechnology, USA. BLAST or the like provided by the National Information Center (NCBI) can be used. Although not particularly limited, when such a program is used, various conditions related to identity calculation can be used as default values.
  • NCBI National Information Center
  • the number of amino acid residues constituting the synthetic peptide is not particularly limited, but from the viewpoint of enhancing identity, it is preferably 25 or less, and may be 24 or less. From the same point of view, the number of amino acid residues constituting the synthetic peptide is preferably 21 or more, more preferably 22 or more, and can be, for example, 23.
  • Synthetic peptides can be easily produced according to general chemical synthesis methods. For example, either a conventionally known solid-phase synthesis method or liquid-phase synthesis method may be employed. A solid-phase synthesis method using Boc (t-butyloxycarbonyl) or Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) as an amino-protecting group is suitable.
  • synthetic peptides may be biosynthesized based on genetic engineering techniques. Briefly, a polynucleotide (typically DNA) of a nucleotide sequence (including the ATG initiation codon) encoding the amino acid sequence of the desired synthetic peptide is synthesized. It also includes various regulatory elements (promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis-elements that control expression levels) for expressing the synthesized polynucleotide (DNA) and the amino acid sequence in host cells. ) is constructed according to the host cell.
  • a polynucleotide typically DNA
  • a nucleotide sequence including the ATG initiation codon
  • various regulatory elements promoters, ribosome binding sites, terminators, enhancers, and various cis-elements that control expression levels
  • this recombinant vector is introduced into a given host cell (eg, yeast, insect cell, plant cell), and the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under given conditions.
  • a given host cell eg, yeast, insect cell, plant cell
  • the host cell or a tissue or individual containing the cell is cultured under given conditions.
  • the peptide of interest can be expressed and produced in cells.
  • the peptide of interest can be obtained by isolating the peptide from the host cell (or in the medium if secreted) and, if necessary, refolding, purification, and the like.
  • methods conventionally practiced in the relevant field may be adopted as they are, and such methods themselves are particularly disclosed herein. The detailed description is omitted because it does not characterize the technology to be used.
  • a template DNA for a cell-free protein synthesis system i.e., a synthetic gene fragment containing a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of a synthetic peptide
  • various compounds necessary for peptide synthesis ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • ATP ATP, RNA polymerase, amino acids, etc.
  • cell-free protein synthesis system for example, a paper by Shimizu et al. (Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755 (2001)), a paper by Madin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a single-stranded or double-stranded polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a synthetic peptide and/or a nucleotide sequence complementary thereto can be easily produced (synthesized) by a conventionally known method. That is, by selecting the codon corresponding to each amino acid residue that constitutes the designed amino acid sequence, the nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence of the synthetic peptide is readily determined and provided. Once the nucleotide sequence is determined, a polynucleotide (single-stranded) corresponding to the desired nucleotide sequence can be easily obtained using a DNA synthesizer or the like.
  • polynucleotides may be in the form of DNA or may be in the form of RNA (mRNA, etc.).
  • the DNA may be provided double-stranded or single-stranded. When provided as a single strand, it may be the coding strand (sense strand) or it may be the non-coding strand (antisense strand) of complementary sequence thereto.
  • the polynucleotides thus obtained can be used as materials for constructing recombinant genes (expression cassettes) for synthetic peptide production in various host cells or in cell-free protein synthesis systems, as described above. can be done.
  • a conjugate-forming polymer is added to the N-terminal side or C-terminal side of the synthetic peptide.
  • a conjugate-forming polymer a polymer that is generally added to an antigen to be administered to an immunized animal can be used without particular limitation. Examples include hydrophilic polymers, alkyl linkers, nonpeptidic linkers such as aminohexanoyl spacers, and the like. is mentioned. Among these, it is preferable to use a hydrophilic polymer. Synthetic peptides containing all or part of the PD-1sp sequence have a high proportion of hydrophobic amino acid residues and tend to aggregate in aqueous solution. Therefore, precipitation and aggregation of the conjugate can be suppressed by adding a hydrophilic polymer to the synthetic peptide.
  • hydrophilic polymer for example, various polyethylene glycol derivatives can be used, and among these, polyethylene glycol (PEG) can be preferably used.
  • PEG has low antigenicity and is difficult to be degraded in vivo, and thus has excellent biocompatibility.
  • PEG for example, PEG units ( --CH.sub.2 -- CH.sub.2 --O--) repeated from 2 to 24, preferably from 5 to 15, more preferably from 8 to 12, can be used. can be used.
  • PEG8 in which 8 PEG units are repeated, can be used.
  • a conjugate-forming polymer can be added to a synthetic peptide by a conventionally known method. For example, by preparing a derivative having an amino group at one end and a carboxyl group at the other end of the conjugate-forming polymer, the conjugate-forming polymer can be treated like an amino acid residue. Amide bonds can be made to synthetic peptides by methods (eg, the Fmoc method).
  • the ⁇ -amino group on the N-terminal side of the synthetic peptide is preferably acetylated. This makes the synthetic peptide difficult to degrade in vivo.
  • the carboxyl group on the C-terminal side of the synthetic peptide is preferably amidated. Thereby, water solubility can be improved.
  • the conjugate preferably further comprises a carrier protein. Since the carrier protein can enhance the antigenicity of the conjugate, it can induce an immune response in the immunized animal and promote antibody production.
  • the type of carrier protein is not particularly limited. OVA) and the like can be suitably used.
  • a carrier protein can be linked to a synthetic peptide or conjugating polymer via a cross-linking agent.
  • a cross-linking agent one having a homobifunctional group or a heterobifunctional group that is commonly used for peptide cross-linking can be preferably used.
  • Common functional groups possessed by crosslinkers include N-hydroxysuccinimide activated esters (NHS esters), maleimides, azides and iodoacetamides.
  • NHS esters can efficiently react with amines at neutral or higher pH to form very stable amide bonds.
  • maleimide reacts selectively with SH groups, and is superior to amines in reactivity with SH groups in neutral conditions.
  • Suitable cross-linking agents with homobifunctional groups include N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis(sulfosuccinimidyl) suberate ( BS3 ), dithiobis(succinic imidyl propionate) (DSP), dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis(succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST) and the like.
  • bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) can be preferably used.
  • Suitable crosslinkers with heterobifunctional groups also include N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide (EMCS), m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), succinimidyl 4-[maleimide phenyl]butyrate (SMPB), succinimidyl 4-(maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-( ⁇ -maleimidobutyroxy)succinimide ester (GMBS), m-maleimidopropionic acid-N-hydroxy Succinimide ester (MPS), N-succinimidyl (4-iodoacetyl) aminobenzoate (SIAB) and the like can be preferably used.
  • EMCS and MBS having NHS ester and maleimide as reactive functional groups can be preferably used.
  • a conjugate-forming polymer is added to the N-terminal side or the C-terminal side of the synthetic peptide, and one end of the conjugate-forming polymer binds to the synthetic peptide.
  • a Cys residue is added to one end of the free side, and a carrier protein is bound to the Cys residue via a cross-linking agent. Since the PD-1sp sequence does not contain a Cys residue, according to such a configuration, the carrier protein and the added Cys residue are linked by a cross-linking agent having an SH group-selective functional group (e.g., maleimide). can be easily combined.
  • a non-human mammal is immunized with the conjugate prepared above as an antigen to obtain an anti-PD-1sp antibody from the immunized non-human mammal.
  • mammals to be immunized experimental animals such as guinea pigs, rats, mice, rabbits and sheep are used, and rats, mice and rabbits are suitable for obtaining monoclonal or polyclonal antibodies.
  • any administration route such as subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, etc. may be used, but subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, and intravenous injections are preferred. .
  • various methods can be used without any particular restrictions on the immunization interval, immunization dose, etc.
  • immunization is performed about 2 to 10 times at intervals of 1 to 2 weeks, and about 2 to 7 days after the final immunization.
  • a method of collecting a sample from within a living body is often used.
  • the amount of antigen to be administered at one time is not limited, it is preferable to use about 25 to 300 ⁇ g per rabbit, for example.
  • the conjugate is mixed well with an adjuvant (for example, FCA (Freund's complete adjuvant)) and administered to the immunized animal to proliferate immune cells.
  • FCA Fully Freund's complete adjuvant
  • the antibody thus obtained is an anti-PD-1sp antibody that can use the PD-1 signal peptide composed of the amino acids shown in SEQ ID NO:1 as an antigen.
  • the antibody titer of the obtained antibody to the PD-1 signal peptide can be evaluated, for example, by an ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method using a microplate on which the PD-1 signal peptide is immobilized.
  • a monoclonal antibody whose antigen is the PD-1 signal peptide can be obtained by a known method.
  • B cells are harvested from the spleens of mammals immunized with the above conjugates and fused with myeloma cells to produce hybridomas. By screening the prepared hybridomas and selecting hybridomas that produce anti-PD-1sp antibodies, it is possible to obtain monoclonal antibodies with the PD-1 signal peptide as an antigen.
  • An anti-PD-1sp antibody can be suitably used as an active ingredient of a composition for suppressing (or inhibiting) the growth of tumor cells (ie, a pharmaceutical antitumor composition such as an antitumor agent).
  • the anti-PD-1sp antibody may contain various pharmaceutically (pharmaceutical) acceptable carriers depending on the mode of use, as long as the anti-tumor activity is not lost.
  • carriers commonly used in peptide medicines as diluents, excipients and the like can be applied. Water, physiological buffers, and various organic solvents are typical examples, although they may vary depending on the application and form of the antitumor composition.
  • secondary ingredients that can be included in the anti-tumor composition include various fillers, extenders, binders, wetting agents, surfactants, dyes, perfumes, and the like.
  • Typical forms of antitumor compositions include liquids, suspensions, emulsions, aerosols, foams, granules, powders, tablets, capsules, ointments, aqueous gels and the like.
  • compositions (drugs) using the anti-PD-1sp antibody (main component) and various carriers (subcomponents) as materials may follow conventionally known methods. Detailed description will be omitted because it itself does not characterize the technology disclosed herein. Sources of detailed information on prescription include, for example, Comprehensive Medicinal Chemistry, edited by Corwin Hansch, published by Pergamon Press (1990). The entire contents of this book are incorporated herein by reference.
  • Cells to which the antitumor composition (antitumor peptide) disclosed herein is applied are not particularly limited as long as they are tumor cells (cancer cells), and can be applied to various types of tumor cells that occur in humans. is. Examples include many types of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma.
  • cancer cells such as breast cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, lung cancer (non-small cell lung cancer and small cell lung cancer), or skin cancer such as melanoma, basal cell carcinoma, neuroblastoma (neuroblastoma) blastoma), retinoblastoma, pheochromocytoma, and other cell tumors.
  • the antitumor composition can be used in a manner and dosage according to its form and purpose, like conventional peptide preparations. For example, it can be administered in a desired amount to an affected area (typically malignant tumor tissue) of a patient (ie, living body) by intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection as a liquid preparation.
  • an affected area typically malignant tumor tissue
  • a solid form such as a tablet, or a gel or aqueous jelly form such as an ointment can be directly administered to a predetermined tissue (that is, an affected area such as a tissue or organ containing tumor cells).
  • solid forms such as tablets can be administered orally.
  • an appropriate amount of the anti-tumor composition disclosed herein may be supplied to the culture medium of the target cultured cells (tissues, etc.) at least once.
  • the amount of supply per time and the number of times of supply are not particularly limited because they may vary depending on conditions such as the type of tumor cells to be cultured, cell density (cell density at the start of culture), number of passages, culture conditions, type of medium, and the like.
  • the conjugates of Examples 1-3 were synthesized as antigens for immunizing rabbits.
  • the structures of the conjugates of Examples 1-3 are shown in Table 1.
  • a synthetic peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, PEG8 added to the C-terminal side of the synthetic peptide, and A Cys residue added to the end of the PEG8 was synthesized.
  • Such synthesis was carried out according to the manual of the peptide synthesizer.
  • PEG8 was bound to an adjacent amino acid via an amide bond.
  • the carrier protein keyhole limpet hemocyanin (KLH), and the Cys residue synthesized above are coupled via a cross-linking agent, N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide (EMCS). bottom.
  • EMCS N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide
  • the conjugate of Example 3 was obtained by changing the amino acid sequence constituting the synthetic peptide to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the method for producing the conjugate of Example 1, and changing the amino group on the N-terminal side of the synthetic peptide to It was produced in the same manner except that it was acetylated. Since the mode of use of the peptide synthesizer itself does not characterize the present disclosure, detailed description thereof will be omitted.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the full-length sequence of the full-length signal peptide of human PD-L1.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a partial sequence of the signal peptide of human CTLA-4, and is the amino acid sequence from 4th to 18th of the full-length signal peptide of human CTLA-4 shown in SEQ ID NO: 4. corresponds to
  • Antibodies were prepared by administering (immunizing) the obtained conjugate to a Japanese white rabbit as an antigen.
  • rabbit blood was collected before and after immunization for evaluation of antibody titer. Specifically, on day 1 (hereinafter, the number of days based on this day will be described), 5 ml of blood was sampled before administration of the conjugate, and pre-immune serum was prepared.
  • a composition obtained by mixing 0.2 mg of the above conjugate and an equal volume of FCA was intradermally administered to the above rabbits.
  • Antibody titers of pre-immune and post-immune sera were evaluated by ELISA.
  • the synthetic peptide portion contained in the conjugate was dissolved in pH 7.2 PBS (Phosphate-Buffered Saline) at 5 ⁇ g/ml, and placed in a microplate (manufactured by NalgeNunc, cat#442404, flat-bottom 96-well). 100 ⁇ l was added to each well and incubated for 2 hours at room temperature.
  • pH 7.2 PBS Phosphate-Buffered Saline
  • FIG. 1 is a graph showing antibody titers of rabbit sera against the conjugate of Example 1 as an antigen.
  • FIG. 1 is a graph showing antibody titers of rabbit sera against the conjugate of Example 1 as an antigen.
  • FIG. 2 is a graph showing antibody titers of rabbit sera against the conjugate of Example 2 as an antigen.
  • FIG. 3 is a graph showing antibody titers of rabbit sera against the conjugate of Example 3 as an antigen.
  • the absorbance exceeds the measurement upper limit of the Immno Reader (when the absorbance exceeds 3.0), the absorbance is indicated as 3.0.
  • HeLa cells were suspended in a culture medium so as to be 1 ⁇ 10 4 cells/100 ⁇ L, and 100 ⁇ L of such a suspension was added to each well of a 96-well (well) plate (i.e., 1 ⁇ 10 4 cells /well). After that, it was incubated at 37° C. under 5% CO 2 conditions for about 24 hours. Then, after removing the medium in each well, 90 ⁇ L of 20% antiserum-containing medium or 90 ⁇ L of normal culture medium was added instead, and further incubated at 37° C. under 5% CO 2 conditions for about 24 hours. At this time, in each case, 3 wells were added with the medium containing 20% antiserum, and 3 wells were added with the normal culture medium.
  • the system incubated with 20% antiserum-containing medium is called “antiserum (+)", and the system incubated with normal culture medium instead of 20% antiserum-containing medium is called “antiserum (-)”.
  • the average absorbance at 450 nm in each system was determined. At this time, the average value was obtained by subtracting the absorbance value at 450 nm in the blank. In each case, the cell viability (%) was obtained by calculating "100 x (average absorbance at 450 nm for antiserum (+))/(average absorbance at 450 nm for antiserum (-))". rice field. Table 2 shows the results.
  • the survival rate is much lower than in Examples 2 and 3 when the antiserum of Example 1 is added. That is, it can be seen that the addition of the anti-PD-1sp antibody to tumor cells (HeLa cells) suppresses the growth of tumor cells.
  • the anti-PD-1 antibody can be said to have anti-tumor activity (tumor cell growth inhibitory activity).
  • the anti-PD-1sp antibodies disclosed herein can suppress (or inhibit) tumor cell proliferation. Therefore, by using an anti-PD-1sp antibody, it is possible to provide an anti-tumor composition (anti-tumor agent) that suppresses the growth of at least one kind of tumor cells.

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Abstract

本開示により、腫瘍細胞の増殖を抑制し得る抗体が提供される。ここで開示される抗体は、アミノ酸配列：ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷ（配列番号１）で構成されているＰＤ－１（Programmed cell death-1）のシグナルペプチドを抗原とする。

Description

抗ＰＤ－１シグナルペプチド抗体とその利用
　本発明は、ＰＤ－１（Programmed cell death-1）のシグナルペプチドに対する抗体とその利用に関する。また、かかる抗体の製造方法に関する。なお、本出願は、２０２１年８月２５日に出願された日本国特許出願２０２１－１３６９８３号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
　がんの免疫療法の一つとして、免疫チェックポイント阻害療法が知られている。この療法は、生体内において過剰な免疫反応を抑制する機能に関与するタンパク質として知られているＣＴＬＡ－４（Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4）、ＰＤ－１等のいわゆる「免疫チェックポイントタンパク質」をターゲットとした療法である。かかる療法では、免疫チェックポイントタンパク質が関与する免疫反応抑制メカニズムを阻害する阻害薬を使用することで、がん細胞が関与している「免疫系の攻撃を回避する機構（免疫逃避機構ともいう。）」を遮断し、がん細胞に対する免疫系の攻撃を促進することができ得る。
　例えば、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質であるＰＤ－１に対する抗体（抗ＰＤ－１抗体）、或いは、腫瘍細胞を含む種々の細胞に発現しているＰＤ－Ｌ１（Programmed cell death-1 ligand-1：Ｂ７－Ｈ１ともいう。）と呼ばれるＰＤ－１のリガンドに対する抗体（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）を、免疫チェックポイント阻害薬として患者に投与することにより、免疫逃避機構を遮断して免疫系細胞による抗腫瘍免疫活性を向上させ得ることが一部の腫瘍に対して確認されている（例えば特許文献１参照）。
国際公開第２００４／００４７７１号
　ところで、特許文献１に開示されるように、免疫チェックポイント阻害療法に用いられ得る抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体等の抗体は、通常、細胞外領域の部分タンパク質（ペプチド）を抗原としている。これにより、抗体がＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害することができ得る。しかしながら、抗ＰＤ－１抗体や抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、腫瘍のタイプによっては抗腫瘍免疫活性向上に及ぼす効果が実質無い場合、または、極めて低い場合がある。そのため、新たなアプローチからの腫瘍の治療法の開発が求められている。
　そこで、本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、腫瘍細胞の増殖を抑制する抗体を提供することを目的とする。また、かかる抗体の製造方法を提供することを別の目的とする。
　本発明者は、従来の抗ＰＤ－１抗体がＰＤ－１の細胞外領域を抗原とするのに対し、新たにＰＤ－１のシグナルペプチドを抗原とする抗体（以下「抗ＰＤ－１ｓｐ抗体」ともいう）を製造した。典型的には、シグナルペプチドは、膜タンパク質が細胞膜へ輸送される前に除去されるため、細胞膜に存在しているＰＤ－１はシグナルペプチドを有さないと推測される。また、ＰＤ－１は、免疫細胞（例えばＴ細胞）に多く発現するタンパク質であり、腫瘍細胞におけるＰＤ－１の発現量は比較的少ないと推測される。しかしながら、驚くべきことに、本発明者の検討により、腫瘍細胞に抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を添加することで、腫瘍細胞の細胞増殖を抑制できることが見出された。これは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用（例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合）を阻害することを目的とした従来の免疫チェックポイント阻害療法とは大きく異なっている。そのため、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体は、腫瘍細胞の増殖抑制効果をもたらす新たなアプローチとしての利用が期待できる。
　ここで開示される抗体は、アミノ酸配列：ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷ（配列番号１）で構成されているＰＤ－１のシグナルペプチドを抗原とする抗体である。かかる構成の抗体は、腫瘍細胞の細胞増殖を抑制することができる。
　また、本開示により、ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体の製造方法が提供される。ここで開示される製造方法は、以下のアミノ酸配列：
　　ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷ（配列番号１）
で構成されているＰＤ－１のシグナルペプチドを抗原とする抗体の製造方法であって、上記アミノ酸配列の全体又はその一部を含む合成ペプチドと、該合成ペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に付加されたコンジュゲート形成用ポリマーと、キャリアタンパク質とを有するコンジュゲートを抗原として準備すること、および、上記抗原で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体を取得することを包含する。これにより、腫瘍細胞の細胞増殖を抑制し得る抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を製造することができる。
　また、ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体の製造方法の好適な一態様では、上記コンジュゲート形成用ポリマーの上記合成ペプチドと結合していない一端には、少なくとも１つのＣｙｓ残基が付加されており、該Ｃｙｓ残基にホモ二官能性基またはヘテロ二官能性基を有する架橋剤を介して上記キャリアタンパク質が連結されている。かかる構成によれば、キャリアタンパク質を有するコンジュゲートを容易に製造することができる。
　また、ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体の製造方法の好適な一態様では、上記コンジュゲート形成用ポリマーが、ポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは、親水性が高いため、コンジュゲートの水溶性を向上させることができる。
図１は、例１のコンジュゲートを抗原として免疫したウサギから得られた血清の抗体価を示すグラフである。 図２は、例２のコンジュゲートを抗原として免疫したウサギから得られた血清の抗体価を示すグラフである。 図３は、例３のコンジュゲートを抗原として免疫したウサギから得られた血清の抗体価を示すグラフである。
　以下、ここで開示される技術の好適な実施形態を説明する。本明細書において特に言及している事項（例えば合成ペプチドのアミノ酸配列）以外の事柄であって実施に必要な事柄（例えばペプチドの化学合成方法、コンジュゲートの化学合成方法、組成物の調製に関するような一般的事項等）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。ここで開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。なお、以下の説明では、場合に応じてアミノ酸をＩＵＰＡＣ－ＩＵＢガイドラインで示されたアミノ酸に関する命名法に準拠した１文字表記で表す。
　また、本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
　本明細書において「合成ペプチド」とは、そのペプチド鎖がそれのみで独立して自然界に安定的に存在するものではなく、人為的な化学合成あるいは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって製造され、所定の系（例えばアジュバントを含む組成物）の中で安定して存在し得るペプチド断片をいう。
　ここで「ペプチド」とは、複数のペプチド結合を有するアミノ酸ポリマーを指す用語であり、ペプチド鎖に含まれるアミノ酸残基の数によって限定されないが、典型的には全アミノ酸残基数が概ね１００以下（好ましくは８０以下、より好ましくは７０以下、例えば６０以下）のような比較的分子量の小さいものをいう。
　また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸およびＣ末端アミノ酸を包含する用語である。
　また、本明細書において「コンジュゲート」とは、種々の化合物（例えば、ペプチド、タンパク質、ポリマー、架橋剤等）が２種以上結合することで構成される生成物のことをいい、組成物に包含される用語である。
　なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がＮ末端側であり右側がＣ末端側である。
　本明細書において「腫瘍」とは、広義に解釈される用語であり、癌腫及び肉腫或いは血液や造血組織の病変（白血病、リンパ腫等）を含む腫瘍一般（典型的には悪性腫瘍）をいう。また、「腫瘍細胞」とは、「がん細胞」と同義であり、そのような腫瘍を形成する細胞であって、典型的には周辺の正常組織とは無関係に異常に増殖を行うに至った細胞（所謂がん化した細胞）をいう。従って、特別に規定しない限り、正常細胞ではなく腫瘍細胞（がん細胞）に区分される細胞であれば、該細胞の起源や性状に関わりなく腫瘍細胞と呼称される。
　また、本明細書において「免疫動物」とは、抗体を作成する目的で抗原が投与される動物のことをいう。
　ここで開示される抗体は、ヒトＰＤ－１のシグナルペプチドを抗原とすることができる抗体（抗ＰＤ－１ｓｐ抗体）である。ヒトＰＤ－１は、２８８アミノ酸残基からなる免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質である。ＰＤ－１は、Ｔ細胞等の免疫細胞の細胞膜に多く発現する免疫チェックポイントタンパク質であって、リガンド（例えば、ＰＤ－Ｌ１）と結合することにより、免疫反応の負の制御に関与するタンパク質である。
　ヒトＰＤ－１のシグナルペプチドの全長配列は、配列番号１に示される計２３アミノ酸残基からなる配列である。かかるアミノ酸配列は、ヒトＰＤ－１を構成するアミノ酸配列の１～２３番目のアミノ酸配列である。なお、ＰＤ－１の遺伝子情報ならびにアミノ酸情報は、種々の公的な国際機関のデータベースから取得することができる。かかるデータベースとしては、例えば、Universal Protein Resource(UniProt)が挙げられる。
　ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体は、腫瘍細胞に添加されることで、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。従来の抗ＰＤ－１抗体による腫瘍細胞抑制効果は、典型的には、免疫細胞に発現するＰＤ－１と、腫瘍細胞等に発現するリガンド（例えばＰＤ－Ｌ１）との相互作用による免疫反応の負の制御を阻害するものであり、免疫細胞の活性化による腫瘍細胞の増殖の抑制を促すものであった。しかしながら、本発明者により、免疫細胞の存在を問わず、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を腫瘍細胞に添加することで腫瘍細胞の増殖が抑制されるという新たな知見が見出された。
　ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体の製造方法は、配列番号１に示すアミノ酸配列の全体又はその一部を含む合成ペプチドと、コンジュゲート形成用ポリマーと、キャリアタンパク質とを有するコンジュゲートを抗原として準備すること、および、抗原で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体を取得することを包含する。
　抗原として使用されるコンジュゲートに含まれる合成ペプチドは、典型的には、配列番号１に示すＰＤ－１シグナルペプチドを構成するアミノ酸配列（以下「ＰＤ－１ｓｐ配列」ともいう）で構成されている。また、合成ペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列を部分的に含んでいてもよく、例えば、ＰＤ－１ｓｐ配列を改変した改変アミノ酸配列で構成されていてもよい。かかる改変アミノ酸配列としては、例えば、ＰＤ－１ｓｐ配列に１個、２個若しくは３個のアミノ酸残基が置換、欠失若しくは挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。また、改変アミノ酸配列は、ＰＤ－１ｓｐ配列のＮ末端側及び／又はＣ末端側に１個若しくは２個以上のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列であり得る。免疫動物から得られるポリクローナル抗体は、合成ペプチドの様々な部分をエピトープとするため、このような改変アミノ酸配列であっても、ＰＤ－１シグナルペプチドを抗原とする抗体を得ることができ得る。
　ＰＤ－１シグナルペプチドを抗原とする抗体を免疫動物で効率よく産生させるため、合成ペプチドはＰＤ－１ｓｐ配列との同一性（identity）が高いことが好ましい。例えば、同一性が８０％以上であるとよく、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上（例えば１００％）であるとよい。
　なお、本明細書において「同一性」とは、当該技術分野における一般的な解釈と同様であり、２以上の配列をアライメントしたときに、これらの配列不変性の程度を意味している。同一性の値は、例えば、種々の公的に利用可能なプログラムを用いて算出することができ、かかるプログラムとしては、例えば、国立遺伝学研究所から提供されているＣｌｕｓｔａｌＷや、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）から提供されているＢＬＡＳＴ等を使用できる。なお、特に限定されるものではないが、このようなプログラムを用いる場合には、同一性の計算に関与する各種条件をデフォルト値で用いることができる。
　合成ペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、特に限定されるものではないが、同一性を高める観点から、２５個以下が好ましく、２４個以下であり得る。また、同様の観点から、合成ペプチドを構成するアミノ酸残基の数は、２１個以上が好ましく、２２個以上がより好ましく、例えば２３個であり得る。
　合成ペプチドは、一般的な化学合成方法に準じて容易に製造することができる。例えば、従来公知の固相合成法または液相合成法のいずれを採用してもよい。アミノ基の保護基としてＢｏｃ（t-butyloxycarbonyl）あるいはＦｍｏｃ（9-fluorenylmethoxycarbonyl）を適用した固相合成法が好適である。
　あるいは、遺伝子工学的手法に基づいて合成ペプチドを生合成してもよい。すなわち、所望する合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（ＡＴＧ開始コドンを含む。）のポリヌクレオチド（典型的にはＤＮＡ）を合成する。そして、合成したポリヌクレオチド（ＤＮＡ）と該アミノ酸配列を宿主細胞内で発現させるための種々の調節エレメント（プロモーター、リボゾーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー、発現レベルを制御する種々のシスエレメントを包含する。）とから成る発現用遺伝子構築物を有する組換えベクターを、宿主細胞に応じて構築する。
　一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞（例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞）に導入し、所定の条件で当該宿主細胞または該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞（分泌された場合は培地中）からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的のペプチドを得ることができる。
　なお、組換えベクターの構築方法および構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特にここで開示される技術を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
　あるいは、無細胞タンパク質合成システム用の鋳型ＤＮＡ（即ち合成ペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む合成遺伝子断片）を構築し、ペプチド合成に必要な種々の化合物（ＡＴＰ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノ酸類等）を使用し、いわゆる無細胞タンパク質合成システムを採用して目的のポリペプチドをインビトロ合成することができる。無細胞タンパク質合成システムについては、例えばShimizuらの論文(Shimizu et al., Nature Biotechnology, 19, 751-755(2001))、Madinらの論文(Madin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(2), 559-564(2000))が参考になる。これら論文に記載された技術に基づいて、本願出願時点において既に多くの企業がペプチドの受託生産を行っており、また、無細胞タンパク質合成用キット（例えば、日本の（株）セルフリーサイエンスから入手可能）が市販されている。
　合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列及び／又は該配列と相補的なヌクレオチド配列を含む一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドは、従来公知の方法によって容易に製造（合成）することができる。すなわち、設計したアミノ酸配列を構成する各アミノ酸残基に対応するコドンを選択することによって、合成ペプチドのアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列が容易に決定され、提供される。そして、ひとたびヌクレオチド配列が決定されれば、ＤＮＡ合成機等を利用して、所望するヌクレオチド配列に対応するポリヌクレオチド（一本鎖）を容易に得ることができる。さらに得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型として用い、種々の酵素的合成手段（典型的にはＰＣＲ）を採用して目的の二本鎖ＤＮＡを得ることができる。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもよく、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）の形態であってもよい。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖で提供され得る。一本鎖で提供される場合は、コード鎖（センス鎖）であってもよく、それと相補的な配列の非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。
　こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中でまたは無細胞タンパク質合成システムにて、合成ペプチド生産のための組換え遺伝子（発現カセット）を構築するための材料として使用することができる。
　ここで開示されるコンジュゲートにおいて、合成ペプチドのＮ末端側またはＣ末端側にコンジュゲート形成用ポリマーが付加されていることが好ましい。コンジュゲート形成用ポリマーは、一般に免疫動物へ投与する抗原に付加されているポリマーを特に制限なく用いることができ、例えば、親水性ポリマーや、アルキルリンカー、アミノヘキサノイルスペーサー等の非ペプチド性リンカー等が挙げられる。このなかでも、親水性ポリマーを用いることが好ましい。ＰＤ－１ｓｐ配列の全体又はその一部を含む合成ペプチドは、疎水性アミノ酸残基の割合が高く、水溶液中で凝集しやすい。そのため、合成ペプチドに親水性ポリマーを付加することによって、コンジュゲートの沈殿や凝集を抑制することができる。
　親水性ポリマーとしては、例えば、種々のポリエチレングリコール誘導体を用いることができ、このなかでも、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を好ましく用いることができる。ＰＥＧは抗原性が低く、生体内で分解され難い性質を有するため、生体適合性に優れている。ＰＥＧとしては、例えば、ＰＥＧユニット（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－）が２～２４個繰り返されたものを使用することができ、好ましくは５～１５個、より好ましくは８～１２個繰り返されたものを使用することができる。一好適例としては、ＰＥＧユニットが８個繰り返されたＰＥＧ８を使用することができる。
　コンジュゲート形成用ポリマーは、従来公知の方法で合成ペプチドに付加することができる。例えば、コンジュゲート形成用ポリマーの一端にアミノ基、他端にカルボキシル基を有する誘導体を準備することで、コンジュゲート形成用ポリマーをアミノ酸残基のように取り扱うことができるため、上述した固相合成法（例えばＦｍｏｃ法）によって合成ペプチドにアミド結合させることができる。
　合成ペプチドのＣ末端側にコンジュゲート形成用ポリマーが付加されている場合には、合成ペプチドのＮ末端側のα－アミノ基はアセチル化されていることが好ましい。これにより、合成ペプチドが生体内で分解され難くなる。
　また、合成ペプチドのＮ末端側にコンジュゲート形成用ポリマーが付加されている場合には、合成ペプチドのＣ末端側のカルボキシル基はアミド化されていることが好ましい。これにより、水溶性を向上させることができる。
　コンジュゲートは、さらにキャリアタンパク質を備えることが好ましい。キャリアタンパク質は、コンジュゲートの抗原性を高めることができるため、免疫動物の免疫反応を誘導し、抗体産生を促すことができる。キャリアタンパク質の種類は特に限定されるものではないが、例えば、抗原性刺激のあるキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）またはオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：ＯＶＡ）あるいはウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；ＯＶＡ）等をいずれも好適に用いることができる。なお、キャリアタンパク質は、免疫動物とは異なる生物種由来のものを使用することが好ましい。
　キャリアタンパク質は、架橋剤を介して合成ペプチドまたはコンジュゲート形成用ポリマーと連結され得る。架橋剤は、ペプチドの架橋に通常用いられているホモ二官能性基またはヘテロ二官能性基を有するものを好ましく使用し得る。架橋剤が有する一般的な官能基としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化エステル（ＮＨＳエステル）、マレイミド、アジドおよびヨードアセトアミドが挙げられる。このなかでも、ＮＨＳエステルは、アミンと中性以上のｐＨで効率良く反応し、非常に安定なアミド結合を形成することができる。また、マレイミドは、反応がＳＨ基選択的で、中性ではアミンに比べＳＨ基との反応性に優れている。
　ホモ二官能性基を有する好適な架橋剤としては、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－ＤＳＴ）等が挙げられる。特に、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）を好ましく使用し得る。
　また、ヘテロ二官能性基を有する好適な架橋剤としては、Ｎ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４－［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、スクシンイミジル４－（マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ－マレイミドプロピオニックアシド－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）等を好ましく用いることができる。特に、反応性官能基にＮＨＳエステルおよびマレイミドを備えたＥＭＣＳやＭＢＳを好ましく用いることができる。
　キャリアタンパク質を備えるコンジュゲートの一好適例では、合成ペプチドのＮ末端側またはＣ末端側にコンジュゲート形成用ポリマーが付加されており、該コンジュゲート形成用ポリマーの端部のうち、合成ペプチドと結合していない側の一端に、Ｃｙｓ残基が付加されており、該Ｃｙｓ残基にキャリアタンパク質が架橋剤を介して結合されている。ＰＤ－１ｓｐ配列にはＣｙｓ残基が含まれていないため、かかる構成によれば、ＳＨ基選択的な官能性基（例えばマレイミド）を有する架橋剤により、キャリアタンパク質と、付加されたＣｙｓ残基とを容易に結合させることができる。
　次いで、上記作製したコンジュゲートを抗原として非ヒト哺乳動物へ免疫し、免疫した非ヒト哺乳動物から抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を取得する。
　免疫する哺乳動物としては、例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ等の実験動物が用いられるが、モノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体を得るためには、ラット、マウス、ウサギが好適である。免疫方法は、例えば、皮下、皮内、腹腔内、静脈内、筋肉内等のいずれの投与経路を用いてもよいが、主として、皮下、皮内、腹腔内、静脈内に注入するのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等も特に制限なく種々の方法を用いることが可能であるが、例えば、１～２週間隔で約２～１０回免疫し、最終免疫後、約２～７日後に生体内から検体を採取する方法がよく用いられる。また、免疫量は１回に投与する抗原量を限定するものではないが、例えば、ウサギ１羽当たり２５～３００μｇ程度を用いることが好ましい。また、特に限定するものではないが、初回の免疫では、コンジュゲートをアジュバント（例えば、ＦＣＡ（Freund’s complete adjuvant））とよく混合して免疫動物に投与し、免疫細胞を増殖させた後、１～２週間隔で再び該コンジュゲートをアジュバント（例えば、ＦＣＡまたはＦＩＡ（Freund’s incomplete adjuvant））をよく混合して投与することが好ましい。これにより、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む抗血清を好適に取得することができる。なお、目的のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、硫安塩析法等の公知の方法により行うことができる。
　このようにして得られた抗体は、配列番号１に示すアミノ酸で構成されるＰＤ－１シグナルペプチドを抗原とすることができる抗ＰＤ－１ｓｐ抗体である。得られた抗体のＰＤ－１シグナルペプチドへの抗体価は、例えば、ＰＤ－１シグナルペプチドを固相化したマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）法により評価することができる。
　また、公知方法により、ＰＤ－１シグナルペプチドを抗原とするモノクローナル抗体を得ることができる。例えば、上記コンジュゲートで免疫した哺乳動物の脾臓からＢ細胞を回収し、ミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを作製する。そして、作製したハイブリドーマをスクリーニングし、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を産生するハイブリドーマを選別することで、ＰＤ－１シグナルペプチドを抗原とするモノクローナル抗体を得ることができ得る。
　抗ＰＤ－１ｓｐ抗体は、腫瘍細胞の増殖を抑制（或いは阻害）する用途の組成物（即ち、抗腫瘍剤等の薬学的な抗腫瘍組成物）の有効成分として好適に使用し得る。なお、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体は、抗腫瘍活性を失わない限りにおいて、使用形態に応じて薬学（医薬）上許容され得る種々の担体を含み得る。例えば、希釈剤、賦形剤等としてペプチド医薬において一般的に使用される担体を適用し得る。
　抗腫瘍組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、抗腫瘍組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
　抗腫瘍組成物（抗腫瘍剤）の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
　なお、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体（主成分）及び種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の組成物（薬剤）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製法自体はここで開示される技術を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修， PergamonPress刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
　ここで開示される抗腫瘍組成物（抗腫瘍ペプチド）の適用対象細胞は、腫瘍細胞（がん細胞）であれば特に制限されず、ヒトに発生する種々のタイプの腫瘍細胞に対して適用可能である。例えば、多くの種類の扁平上皮がんや腺がんが含まれる。例えば、乳がん、すい臓がん、前立腺がん、肺がん（非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん）等のがん細胞、或いはまた、メラノーマ、基底細胞がん等の皮膚がん、神経芽細胞腫（神経芽腫）、網膜芽細胞腫、褐色細胞腫その他の細胞腫を構成する細胞が挙げられる。
　抗腫瘍組成物は、従来のペプチド製剤と同様、その形態及び目的に応じた方法や用量で使用することができる。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者(即ち生体)の患部（典型的には悪性腫瘍組織）に所望する量だけ投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち腫瘍細胞を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。
　或いは、生体外（インビトロ）において培養している腫瘍細胞（生体から摘出された細胞塊又は組織又は器官である場合を包含する。）に対し、ここで開示される抗腫瘍組成物の適当量（換言すれば、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体の適当量）を、少なくとも１回、対象とする培養細胞（組織等）の培地に供給するとよい。１回当たりの供給量及び供給回数は、培養する腫瘍細胞の種類、細胞密度（培養開始時の細胞密度）、継代数、培養条件、培地の種類、等の条件によって異なり得るため特に限定されない。
　以下、ここで開示される技術に関するいくつかの具体例を説明するが、ここで開示される技術をかかる具体例に示すものに限定することを意図したものではない。
　＜コンジュゲートの準備＞
　ウサギに免疫するための抗原として、例１～３のコンジュゲートを合成した。例１～３のコンジュゲートの構成を表１に示す。まず、例１のコンジュゲートの製造のために、固相合成法（Ｆｍｏｃ法）により、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、該合成ペプチドのＣ末端側に付加されたＰＥＧ８と、該ＰＥＧ８の末端に付加されたＣｙｓ残基とを合成した。かかる合成は、ペプチド合成機のマニュアルに従い実施した。なお、ＰＥＧ８は、一端にカルボキシル基、他端にアミノ基を有する化合物を用いることで、隣接するアミノ酸とアミド結合で結合させた。次に、マレイミド法により、キャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と上記合成したＣｙｓ残基とを架橋剤であるＮ－（６－マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）を介して結合した。このようにして、例１のコンジュゲートを得た。例２のコンジュゲートは、例１のコンジュゲートの製造方法のうち、合成ペプチドを構成するアミノ酸配列を配列番号２に示すアミノ酸配列に変更したこと以外は同様にすることで製造した。例３のコンジュゲートは、例１のコンジュゲートの製造方法のうち、合成ペプチドを構成するアミノ酸配列を配列番号３に示すアミノ酸配列に変更したこと、および、合成ペプチドのＮ末端側のアミノ基をアセチル化したこと以外は同様にして製造した。なお、ペプチド合成機の使用態様自体は本開示を特徴づけるものではないため、詳細な説明は省略する。
　なお、配列番号２に示すアミノ酸配列は、ヒトＰＤ－Ｌ１の全長シグナルペプチドの全長配列である。また、配列番号３に示すアミノ酸配列は、ヒトＣＴＬＡ－４のシグナルペプチドの一部の配列であって、配列番号４に示すヒトＣＴＬＡ－４の全長シグナルペプチドの４番目から１８番目までのアミノ酸配列に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　＜コンジュゲートを抗原とした抗体産生＞ 
　得られたコンジュゲートを抗原として、日本白色種のウサギに投与（免疫）することにより抗体を作製した。また、抗体価の評価のために免疫前と免疫後にウサギの採血を行った。具体的には、１日目（以下、この日を基準とした日数を記載する）にコンジュゲートを投与する前に５ｍｌの試採血を行い、免疫前血清の調製を行った。また、同日に上記コンジュゲート０．２ｍｇと、等容量のＦＣＡとを混合した組成物を上記ウサギに皮内投与を行った。その後、８日目、１５日目に上記コンジュゲート０．２ｍｇと、等容量のＦＣＡとを混合した組成物を上記ウサギに皮内投与を行った。２２日目、コンジュゲート０．０２５ｍｇを上記ウサギに静脈内投与を行った。２９日目、上記ウサギから５ｍｌの採血を行い、免疫後血清を調製した。
＜血清の抗体価評価＞ 
　ＥＬＩＳＡ法により、免疫前血清および免疫後血清の抗体価を評価した。まず、コンジュゲートに含まれる合成ペプチド部分を５μｇ／ｍｌとなるようにｐＨ７．２のＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）に溶解し、マイクロプレート（NalgeNunc社製、cat#442404、平底９６ウェル）の各ウェルに１００μｌずつ添加し、室温で２時間インキュベートした。次に、各ウェル中の液を除去後、０．２％Ｔｗｅｅｎ－２０（Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate、富士フィルム和光純薬株式会社製）を含むＰＢＳ（洗浄液）で３回洗浄した。その後、当該洗浄液を各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（希釈液）を用いて、免疫前血清、免疫後血清をそれぞれ１０００倍、２０００倍、４０００倍、８０００倍、１６０００倍、３２０００倍、６４０００倍、１２８０００倍希釈を行い、各ウェルの上記洗浄液を除去後、各希釈液１００μｌをそれぞれ別のウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、さらに室温で１５分間インキュベートした。各ウェルの液を除去後、上記洗浄液で３回洗浄を行い、goat f(ab)’2 anti rabbit IgG’s HRP conjugate（MP Biomedicals,LLC-Cappel Products社製）を上記希釈液で５０００倍希釈したものを、各ウェルに１００μｌずつ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした後、さらに室温で１５分間インキュベートした。各ウェルの液を除去後、上記洗浄液で３回洗浄を行い、ＯＰＤ（O-phenylene diamin、SIGMA社製）１０ｍｇをクエン酸－リン酸緩衝液２５ｍｌに溶解し過酸化水素５μｌ添加した基質液を各ウェルに１００μｌずつ添加した。その後、室温で２０分間発色を行い、１Ｍの硫酸を１００μｌずつ各ウェルに加えることで発色を停止させた後、Ｉｍｍｎｏ Ｒｅａｄｅｒを用いて各ウェルの４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１～３に示す。図１は、例１のコンジュゲートを抗原としたウサギの血清の抗体価を示すグラフである。図２は、例２のコンジュゲートを抗原としたウサギの血清の抗体価を示すグラフである。図３は、例３のコンジュゲートを抗原としたウサギの血清の抗体価を示すグラフである。なお、上記吸光度がＩｍｍｎｏ Ｒｅａｄｅｒの測定上限を超えた場合（上記吸光度が３．０を超えた場合）は吸光度３．０として示している。
　図１～３に示すように、例１～３のいずれのコンジュゲートを免疫した場合も、免疫前血清よりも免疫後血清で顕著に高い吸光度を示した。これにより、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるＰＤ－１の全長シグナルペプチド配列に対する抗体（抗ＰＤ－１ｓｐ抗体）を含む抗血清、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＰＤ－Ｌ１の全長シグナルペプチド配列に対する抗体を含む抗血清、および、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるＣＴＬＡ－４のシグナルペプチドの一部の配列に対する抗体を含む抗血清を得られたことがわかる。
＜抗血清の細胞増殖抑制の評価＞
　上記得られた抗血清の腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を評価した。この試験では、腫瘍細胞として、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん細胞由来の樹立細胞株）を使用した。ＨｅＬａ細胞の通常の培養培地として、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製））、２ｍＭのＬ－グルタミン、および、抗生物質（５０ユニット／ｍＬのペニシリンＧ、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を含有したＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium（富士フィルム和光純薬株式会社製、Cat No.043-30085）を使用した。
　また、抗血清が２０ｖｏｌ％となるように抗生物質非含有の培養培地で希釈し、例１～３の２０％抗血清含有培地をそれぞれ調製した。
　まず、１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬとなるように、ＨｅＬａ細胞を培養培地中で懸濁し、かかる懸濁液を９６穴（ウェル）プレートのウェルに１００μＬずつ加えた（即ち、１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）。その後、５％ＣＯ２条件下において３７℃で約２４時間インキュベートした。次いで、各ウェル内の培地を取り除いた後、代わりに２０％抗血清含有培地９０μＬまたは通常の培養培地９０μＬを加え、さらに５％ＣＯ２条件下において３７℃で約２４時間インキュベートした。このとき、各例において、２０％抗血清含有培地を加えたウェル数を３、通常の培養培地を加えたウェル数を３とした。
　上記約２４時間のインキュベーション後、各ウェル内の培地を取り除き、１００μＬの培養培地を加えた。さらに、各ウェルに発色試薬として「水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ－８）」を含有する細胞増殖測定用試薬「Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８」（（株）同仁化学研究所製品）を１０μＬずつ添加した。このとき、細胞が播種されていないウェルに培養培地１００μＬと上記発色試薬１０μＬとを加えたブランクのウェルを設定した。その後、５％ＣＯ２条件下において３７℃で１．５時間インキュベートした。そして、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。２０％抗血清含有培地でインキュベートした系を「抗血清（＋）」、２０％抗血清含有培地の代わりに通常の培養培地でインキュベートした系を「抗血清（－）」として、各例において、それぞれの系における４５０ｎｍ吸光度の平均値を求めた。このとき、かかる平均値はブランクにおける４５０ｎｍ吸光度の値を引いたものを採用した。また、各例において「１００×（抗血清（＋）における４５０ｎｍ吸光度の平均値）／（抗血清（－）における４５０ｎｍ吸光度の平均値）」を求めることで、細胞の生存率（％）を求めた。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、例１の抗血清を添加した場合では、例２および３よりも生存率がはるかに低いことがわかる。即ち、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を腫瘍細胞（ＨｅＬａ細胞）に添加することで、腫瘍細胞の増殖が抑制されることがわかる。換言すれば、抗ＰＤ－１抗体は、抗腫瘍活性（腫瘍細胞増殖抑制活性）を有しているといえる。
　これは、従来の抗ＰＤ－１抗体が、免疫細胞（例えばＴ細胞）に発現しているＰＤ－１と、腫瘍細胞に発現しているＰＤ－Ｌ１との相互作用を阻害（例えばＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合阻害）することで、抗腫瘍活性を発揮していたのに対し、ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体は、免疫細胞が存在しなくとも、腫瘍細胞に添加することで抗腫瘍活性を発揮できるという驚くべき結果といえる。
　以上、ここで開示される技術の具体例を詳細に示したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。
　上述したように、ここで開示される抗ＰＤ－１ｓｐ抗体は、腫瘍細胞の増殖を抑制する（または阻害する）ことができる。そのため、抗ＰＤ－１ｓｐ抗体を使用することによって、少なくとも一種の腫瘍細胞の増殖を抑制する抗腫瘍組成物（抗腫瘍剤）を提供することができる。

Claims (4)

  1. 　以下のアミノ酸配列：
    　　ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷ（配列番号１）
    で構成されているＰＤ－１（Programmed cell death-1）のシグナルペプチドを抗原とする抗体。
  2. 　以下のアミノ酸配列：
    　　ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷ（配列番号１）
    で構成されているＰＤ－１（Programmed cell death-1）のシグナルペプチドを抗原とする抗体の製造方法であって、
    　前記アミノ酸配列の全体又はその一部を含む合成ペプチドと、該合成ペプチドのＮ末端側またはＣ末端側に付加されたコンジュゲート形成用ポリマーと、キャリアタンパク質とを有するコンジュゲートを抗原として準備すること、および、
    　前記抗原で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体を取得すること
    を包含する、製造方法。
  3. 　前記コンジュゲート形成用ポリマーの前記合成ペプチドと結合していない一端には、少なくとも１つのＣｙｓ残基が付加されており、該Ｃｙｓ残基にホモ二官能性基またはヘテロ二官能性基を有する架橋剤を介して前記キャリアタンパク質が連結されている、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　前記コンジュゲート形成用ポリマーが、ポリエチレングリコールである、請求項２または３に記載の製造方法。
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