JP2008531608A - Ykl−40モノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
本発明はYKL−40が顕著な役割を果たす、例えば細胞とりわけ癌細胞の成長を阻害し、そして/またはアポトーシスを誘導する生物学的過程を変調することができる抗ヒトYKLモノクローナル抗体に関する。本発明はまた該抗体を含む医薬組成物、ならびに細胞成長、細胞分化、細胞外マトリックスのリモデリング、転移の阻害および/またはアポトーシスによる細胞死の誘導が治癒成功の要件である疾患を処置するための該抗体に関し、そしておよび/または医薬組成物を使用する。本発明の抗体はYKL−40上の特異的エピトープに結合することにより前記で述べた過程におけるYKL−40の生物学的機能を阻害することができる。
Description
発明の分野
本発明は細胞とりわけ癌細胞の成長を阻害し、そして/またはアポトーシスを誘導することができる抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体、該抗体を含む医薬組成物、ならびに細胞成長、細胞分化、細胞外マトリックスのリモデリング、転移の阻害および/またはアポトーシスによる細胞死の誘導が治癒成功の要件である疾患を処置するための該抗体および/または医薬組成物の使用に関する。
本発明は細胞とりわけ癌細胞の成長を阻害し、そして/またはアポトーシスを誘導することができる抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体、該抗体を含む医薬組成物、ならびに細胞成長、細胞分化、細胞外マトリックスのリモデリング、転移の阻害および/またはアポトーシスによる細胞死の誘導が治癒成功の要件である疾患を処置するための該抗体および/または医薬組成物の使用に関する。
発明の背景
YKL−40はインビトロでヒト骨肉腫細胞系MG63により多量に分泌されるタンパク質として最初に同定され、そしてそのアミノ酸配列の最後の3個のN末端アミノ酸、Tyr(Y)、Lys(K)およびLeu(L)により命名され、そして分子量およそ40kDaであった(Johansenら、1992)。
YKL−40はインビトロでヒト骨肉腫細胞系MG63により多量に分泌されるタンパク質として最初に同定され、そしてそのアミノ酸配列の最後の3個のN末端アミノ酸、Tyr(Y)、Lys(K)およびLeu(L)により命名され、そして分子量およそ40kDaであった(Johansenら、1992)。
YKL−40のアミノ酸配列分析によりタンパク質がグリコシルヒドロラーゼファミリー18に属することが示された(Hakalaら、1993)。ファミリーはキチナーゼを含む酵素およびまた酵素活性を有さないタンパク質からなる。YKL−40(CHI3L1)に関する遺伝子は染色体1q31−1q32に位置し、そして10個のエクソンからなり、そして約8kbのゲノムDNAにわたる(Rehliら、1997)。Sp1ファミリー転写因子はYKL−40プロモーター活性の制御に主な役割を有しているようである(Rehliら、2003)。ヒトYKL−40の結晶学的構造が記載されている(Fusettiら、2003;Houstonら、2003)。タンパク質は2個の球状ドメイン:トリオースリン酸イソメラーゼ(TIM)バレルフォールドを有する(β/α)8ドメイン構造からなる大きなコアドメイン、およびβ鎖7とαらせん7との間のループに挿入された5個の逆平行β鎖および1個のαらせんからなる小型のα/βドメインを含有する。これはYKL−40の活性部位に溝様の特徴を付与する。YKL−40の構造はいくつかのタンパク質、例えばヒトキトトリオシダーゼ(Fusettiら、2002)、マウスYm1(Sunら、2001)、キイロショウジョウバエ成虫原基成長因子2(Varelaら、2002)およびグリコシルヒドロラーゼファミリー18のいくつかのその他の膜(Coulson、1994)の構造にある程度類似するが、大きな相違もまた存在する。これらの相違の1つはキチナーゼ様触媒活性に必須の3個のアミノ酸(Asp、GluおよびAsp)のうちの1個、主にGlu>Leuの変異であり、これはYKL−40の糖分解酵素としての機能を完全に排除する。YKL−40はキチンに結合できるが、酵素活性を有さない(Renkemaら、1998)。YKL−40は糖タンパク質であり、そしてこれはまたその他の哺乳動物キチナーゼ様タンパク質と比較してYKL−40の独特な特性である。
YKL−40はヘパリンに結合することができる。タンパク質のアミノ酸配列は表面ループに位置する1個のヘパリン結合モチーフ(143GRRDKQH149)を含有する(Fusettiら、2003)。YKL−40はまたヒアルロナンに結合することもできる。折り畳まれたタンパク質は外面に2個の潜在的ヒアルロナン結合部位を含有する。ヒトYKL−40はファミリー18のキチナーゼと類似の様式で異なる長さのキチンに結合することができる。9個の糖結合サブサイトがYKL−40の43Åの溝で同定された(Fusettiら、2003)。短いまたは長いオリゴ糖のヒトYKL−40への結合もまた可能である。長いおよび短いオリゴ糖に関して選択的親和性を有する2個の異なる結合部位の存在(その他の哺乳動物キチナーゼ様タンパク質では見出されていない)は、これらのオリゴ糖を担持する2個の標的間の架橋剤としてYKL−40の機能的活性に関する重要性を有し得る。
YKL−40は多くの生物学的活性を有する。したがって、ヒトYKL−40は軟骨細胞および滑膜細胞のような結合組織の細胞の成長因子として作用できることが示されている(De Ceuninckら、2001;Reckliesら、2002)。YKL−40はまたインスリン様成長因子1(IGF−1)に類似する様式で線維芽細胞の成長を促進する(Reckliesら、2002)。線維芽細胞ではYKL−40はMAPキナーゼおよびPI3Kシグナリングカスケードの活性化を惹起し、細胞外シグナル調節キナーゼ(EPK)−1/2MAPキナーゼおよびタンパク質キナーゼB(AKT)の双方のリン酸化を導く。YKL−40による細胞質シグナル伝達経路の活性化は原形質膜の1つまたはそれより多い受容体分子を有するYKL−40の相互作用を介して媒介されることが示唆されているが、YKL−40の生物学的効果を媒介する細胞受容体の同定に関しては現在のところわかっていない。
YKL−40が内皮細胞の化学誘引物質として作用し、そして塩基性繊維芽細胞成長因子による刺激に匹敵してこれらの細胞の遊走を刺激する(Malindaら、1999)。
YKL−40は枝分かれした細管の形成を促進することにより血管内皮細胞形態を変調するが、これはYKL−40が遊走刺激および血管内皮細胞の再構築により血管形成において役割を果たし得ることを示している(Malindaら、1999)。YKL−40はまた血管平滑筋細胞の接着および遊走因子でもある(Nishikawaら、2003)。YKL−40は2つの独立したメカニズム:細胞外ヒアルロナンへの結合により、ならびに細胞によるヒアルロナンの合成および分泌との干渉により細胞付着に利用可能な局所細胞外ヒアルロナン濃度に影響し得ることが示唆されている。したがって、YKL−40は炎症、線維症、アテローム発生ならびに癌成長および癌転移の間に生じる組織リモデリング過程の間の細胞接着および遊走の程度に影響し得る。
マウスではYKL−40は、そのタンパク質の発現が離乳の数日後に乳房上皮細胞において誘導されるので「乳房退行タンパク質(Brp−39)」と称された。YKL−40が、どの細胞が退縮の間に生じる大幅な組織リモデリングを生き延びるべきかを決定する保護シグナリング因子として乳房退縮の間のプログラム細胞死の調節に関与することが提唱された(Mohantyら、2003)。
YKL−40は様々な型の細胞によりインビトロおよびインビボで、とりわけ炎症、細胞外マトリックスの分解/リモデリングまたは進行中の線維形成を特徴とする組織において発現される。YKL−40は活性化された好中球により(Volckら、1998)、分化の後期のマクロファージ(Kirckpatrickら、1997;Krauseら、1996;Rehliら、1997;Renkemaら、1998;Rehliら、2003)、関節炎性軟骨細胞(Hakalaら、1993;Johansenら、2001;Volckら、2001)、分化型血管平滑筋細胞(Shackeltonら、1995;Malindaら、1999;Nishikawaら、2003)、および繊維芽細胞様滑膜細胞(Hakalaら、1993;Nyirkosら、1990;Dasuriら、2004)により分泌される。ヒト胎児軟骨細胞におる研究によりYKL−40が分化マーカーであることが示されている(Imabayashiら、2003)。炎症性滑膜(Kirkpatrickら、1997;Baetenら、2000;Volckら、2001)、アテローム性プラーク(Bootら、1999)、巨細胞性動脈炎を有する患者の動脈炎性血管(Johansenら、1999a)のマクロファージの亜集団により、および関節炎性軟骨細胞(Volckら、2001)によりインビボYKL−40 mRNAおよびタンパク質発現が見出され、そして小細胞性肺癌からの生検の腫瘍周囲マクロファージはYKL−40 mRNAを発現する(Junkerら、2005b)。
ヒト肝臓におけるYKL−40 mRNAの強い発現が線維症の存在に関連することが示された。肝臓生検の免疫組織化学的研究により線維症を有する肝臓の部分におけるYKL−40タンパク質発現が示されたが、肝細胞では発現は観察されなかった(Johansenら、1997;Johansenら、2000)。サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション分析およびRT−PCRにより、YKL−40はC型肝炎ウイルス(HCV)により引き起こされた硬変肝臓組織において最も過剰発現されるタンパク質の1つであることが実証された(Shackelら、2003)。
活動性関節リウマチ(Johansenら、1993;Harveyら、1998;Johansenら、1999b;Volckら、2001)、重篤な細菌感染(Nordenbaekら、1999;Kronborgら、2002)、活動性炎症性腸疾患(Koutroubakisら、2003;Vindら、2003)、および肝臓線維症(Johansenら、1997;Johansenら、2000;Tranら、2000;NOjgaardら、2003)のような炎症および線維症を特徴とする非悪性疾患を有する患者の血清YKL−40は上昇している。
YKL−40はいくつかの型のヒト癌腫(乳房、結腸、肺、腎臓、卵巣、前立腺、子宮、骨肉腫、乏突起膠腫、神経膠芽腫および胚細胞癌)(A search of the YKL−40 sequence against the dbest database at the National Center for Biotechnology Information;Johansenら、1992;Junkerら、2005a)により、およびneu/ras発癌遺伝子により惹起されるネズミ乳房腫瘍により発現および分泌される(Morrisonら、1994)。マイクロアレイ遺伝子分析によりYKL−40遺伝子は甲状腺乳頭癌(Huangら、2001)、高悪性度神経膠腫(Tanwarら、2002)および細胞外粘液性軟骨肉腫(Sjogrenら、2003)において最も過剰発現される遺伝子の1つとして同定された。YKL−40は骨肉腫細胞系MG63、神経膠芽腫細胞および骨髄性白血病細胞系(U937、THP−1、HL−60)によりインビトロで発現および分泌される(Johansenら、1992;Rehliら、2003;Kirkpatrickら、1995;Verhoeckxら、2004)。YKL−40は小細胞性肺癌細胞系ではインビトロでもインビボでも発現されないが、小細胞性肺癌生検における腫瘍関連マクロファージにより強く発現される(Junkerら、2005b)。
癌患者の血清におけるYKL−40タンパク質のレベル上昇は今では多くの研究により報告されている(Johansenら、1995;Cintinら、1999;Cintinら、2002;Tanwarら、2002;Brassoら、2003;Dehnら、2003;Geertsenら、2003;HOgdallら、2003;Jensenら、2003;Johansenら、2003;Dupontら、2004;Johansenら、2004)。いくつかの研究により乳房、結腸直腸、卵巣、腎臓、小細胞性肺および前立腺癌腫の患者でYKL−40の血清濃度レベル上昇が、短期再発なし期間および短期全生存の独立した予後パラメーターであることが実証された。この観察は最初の癌診断時および再燃時に局所的なまたは進行した癌を有する患者において成された(Johansenら、1995;Cintinら、1999;Cintinら、2002;Brassoら、2003;Dehnら、2003;Geertsenら、2003;HOgdallら、2003;Jensenら、2003;Johansenら、2003;Dupontら、2004;Johansenら、2004)。これらのおよびその他の知見に基づいて、YKL−40は癌の存在または不在ならびに癌再発の予後および癌患者の生存に関する診断マーカーとして示唆され(特許文献1)、そして結合組織の分解のための、および記載された(特許文献2;特許文献3)結合組織の分解に関連する疾患(例えば癌)の同定のための方法において用いられるマーカーとして記載された。後者の方法の双方の群は患者由来の試料中のタンパク質を検出するための抗YKL−40抗体を用いることに基づく。
YKL−40に対する抗体は以前から知られており、例えば癌患者の血清/血漿中のYKL−40のレベルの検出およびモニタリングのために用いられてきたが、YKL−40の機能を阻害することができる機能的抗YKL−40抗体は生成されておらず、また記載されていない。
参考文献
発明の要旨
本発明はヒトYKL−40に対するモノクローナル抗体が細胞成長、細胞分化、細胞生存および転移を有意に阻害することができるという知見に関する。
本発明はヒトYKL−40に対するモノクローナル抗体が細胞成長、細胞分化、細胞生存および転移を有意に阻害することができるという知見に関する。
したがって、一態様では本発明は抗ヒトYKL−40抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質に関し、該抗体、結合フラグメントまたはその組換えタンパク質は;
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくは癌細胞成長のような細胞成長を阻害する;および/または
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくは癌細胞死のような細胞死を誘導する;および/または
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくは癌細胞分化のような細胞分化を阻害する;および/または
癌細胞転移の可能性を阻害する;
ことができる。
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくは癌細胞成長のような細胞成長を阻害する;および/または
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくは癌細胞死のような細胞死を誘導する;および/または
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくは癌細胞分化のような細胞分化を阻害する;および/または
癌細胞転移の可能性を阻害する;
ことができる。
本発明による抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体は細胞成長、分化、生存および細胞外組織リモデリングに関連するヒトYKL−40の機能的活性を阻害することができる。とりわけ本発明は;
癌細胞成長の発達/進行、および/または
癌細胞転移の発達/進行、および/または
癌細胞分化の発達/進行、および/または
癌細胞生存の発達/進行、および/または
血管形成の発達/進行、および/または
細胞外マトリックスリモデリングの発達/進行、および/または
肝臓線維症の発達/進行、および/または
肺線維症の発達/進行、および/または
組織線維症の発達/進行、および/または
器官線維症の発達/進行、および/または
関節リウマチの発達/進行
におけるYKL−40の生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。
癌細胞成長の発達/進行、および/または
癌細胞転移の発達/進行、および/または
癌細胞分化の発達/進行、および/または
癌細胞生存の発達/進行、および/または
血管形成の発達/進行、および/または
細胞外マトリックスリモデリングの発達/進行、および/または
肝臓線維症の発達/進行、および/または
肺線維症の発達/進行、および/または
組織線維症の発達/進行、および/または
器官線維症の発達/進行、および/または
関節リウマチの発達/進行
におけるYKL−40の生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。
本発明はYKL−40の特異的エピトープに結合したときに、前記で述べた過程におけるYKL−40の生物学的機能を阻害することができる抗体を特色とする。
したがってさらなる態様では本発明は前記の抗体により認識され得るエピトープに関する。本発明のエピトープは、それが本明細書にて配列番号2、3、4、5、6もしくは7として同定されたいずれかの配列のアミノ酸残基を含むか、または該配列もしくはそのフラグメントの少なくとも1つからなる。本発明によれば該エピトープは結合部位であり、その受容体に対するYKL−40の結合部位の一部を構成するか、またはいくつかのその他の分子、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンもしくはヒアルロナンのような例えばYKL−40リガンドと相互作用することによりYKL−40による受容体の活性化の支援に関与する。前記で定義したエピトープを認識することができる抗体の;
i) 細胞成長(癌を含む)を阻害する、および/または
ii) 細胞分化(癌を含む)を阻害する、および/または
iii) 細胞生存(癌を含む)を阻害する、および/または
vi) 細胞死(癌を含む)を誘導する、および/または
v) 細胞外マトリックスリモデリングの発達/進行を阻害する、および/または
vi) 肝臓線維症の発達/進行を阻害する、および/または
vii) 関節リウマチの発達/進行を阻害する、および/または
viii) 器官線維症の発達/進行を阻害する、および/または
ix) 組織線維症の発達/進行を阻害する、および/または
x) 血管形成の発達/進行を阻害する、および/または
xi) 転移を阻害する
ための使用もまた本発明の態様である。本発明はとりわけ癌ならびに/または例えば炎症性疾患および線維症に関連する疾患のような非悪性疾患の処置のための抗体の使用を特色とする。
i) 細胞成長(癌を含む)を阻害する、および/または
ii) 細胞分化(癌を含む)を阻害する、および/または
iii) 細胞生存(癌を含む)を阻害する、および/または
vi) 細胞死(癌を含む)を誘導する、および/または
v) 細胞外マトリックスリモデリングの発達/進行を阻害する、および/または
vi) 肝臓線維症の発達/進行を阻害する、および/または
vii) 関節リウマチの発達/進行を阻害する、および/または
viii) 器官線維症の発達/進行を阻害する、および/または
ix) 組織線維症の発達/進行を阻害する、および/または
x) 血管形成の発達/進行を阻害する、および/または
xi) 転移を阻害する
ための使用もまた本発明の態様である。本発明はとりわけ癌ならびに/または例えば炎症性疾患および線維症に関連する疾患のような非悪性疾患の処置のための抗体の使用を特色とする。
本発明はまた前記の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた
i) 本発明の抗体の生成、ならびに/または
ii) 細胞増殖、分化および生存に関連するYKL−40受容体の機能的活性を変調すること、ならびに/または
iii) YKL−40の生物学的機能を変調すること、ならびに/または
vi) 医薬の製造
のためのエピトープを含むかまたはそれにより含まれるペプチド配列にも関する。
i) 本発明の抗体の生成、ならびに/または
ii) 細胞増殖、分化および生存に関連するYKL−40受容体の機能的活性を変調すること、ならびに/または
iii) YKL−40の生物学的機能を変調すること、ならびに/または
vi) 医薬の製造
のためのエピトープを含むかまたはそれにより含まれるペプチド配列にも関する。
本発明は前記で定義したような抗体および/またはペプチド配列を含む医薬組成物にも関係する。
発明の詳細な説明
抗体
配列番号2−7から選択される少なくとも1つの配列を含むヒトYKL−40上のエピトープを認識し、そして選択的に結合できる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を提供し、そしてそれにより細胞成長、細胞分化、細胞生存および細胞外組織リモデリング過程に関連するYKL−40の生物学的活性を阻害することは本発明の目的である。
抗体
配列番号2−7から選択される少なくとも1つの配列を含むヒトYKL−40上のエピトープを認識し、そして選択的に結合できる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を提供し、そしてそれにより細胞成長、細胞分化、細胞生存および細胞外組織リモデリング過程に関連するYKL−40の生物学的活性を阻害することは本発明の目的である。
抗体分子は免疫グロブリンと称される血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本単位、免疫グロブリンフォールドまたはドメインは免疫系およびその他の生物学的認識系の多くの分子において種々の形態で用いられる。典型的な免疫グロブリンは可変領域として公知の抗原結合領域および定常領域として公知の不変化領域を含有する4個のポリペプチド鎖を有する。
元来の抗体および免疫グロブリンは通常約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、2個の同一の軽(L)鎖および2個の同一の重(H)鎖からなる。各軽鎖は1個の共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド連結の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖はまた規則的な間隔で鎖間ジスルフィド橋を有する。各重鎖は一方の末端で1つの可変ドメイン(VH)とそれに続く多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端で1つの可変ドメイン(VL)およびその他方の末端で1個の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。特定のアミノ酸残基は軽および重鎖可変ドメインの間のインターフェースを形成すると考えられている(Novotny JおよびHaber E.Proc Natl Acad Sci USA.82(14):4592−6,(1985))。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも5個の主要な免疫グロブリンのクラス:IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMがあり、そしてこれらのうちのいくつかをさらにサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG−1、IgG−2、IgG−3およびIgG−4;IgA−1およびIgA−2に分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに相当する重鎖定常ドメインをそれぞれアルファ(α)、デルダ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)およびミュー(μ)と称する。抗体の軽鎖をその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)およびラムダ(λ)と称される2個の明確に異なる型のうちの1つに割り当てることができる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。
抗体の可変ドメインの局面で「可変」なる用語は、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列が大きく異なるという事実を指す。可変ドメインは結合のためであり、そして各特定の抗体のその特定の抗原に関する特異性を決定する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様に分布されているものではない。それは軽鎖および重鎖可変ドメインの双方で超可変領域としても公知である相補性決定領域(CDR)と称される3個のセグメントに集中する。
可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク(FR)と称される。元来の重および軽鎖各々の可変ドメインは、主にβシート立体配置をとり、ループ連結を形成する3個のCDRにより連結され、そしてβシート構造の一部を形成している場合もある4個のFR領域を含む。各鎖のCDRはFR領域により一緒に近接しており、そしてその他の鎖のCDRと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
したがって本発明における使用が企図される抗体は全免疫グロブリン、Fv、Fabおよび類似のフラグメントのような抗体フラグメント、可変ドメイン相補性決定領域(CDR)を含む一本鎖抗体等の形態を含む種々の形態のいずれかでよく、その全ては本明細書中で用いられる際には広義の用語「抗体」に入る。本発明は抗体、ポリクローナルまたはモノクローナルの任意の特異性の使用を企図し、そして具体的な抗原を認識およびそれと免疫反応する抗体に限定するものではない。好ましい実施態様では、以下に記載する治療方法およびスクリーニング方法の双方の局面で、本発明の抗原またはエピトープに免疫特異的である抗体またはそのフラグメントを使用する。
「抗体フラグメント」なる用語は全長抗体の一部、一般的には抗原結合または可変領域を指す。抗体フラグメントの実例にはFab、Fab’、F(ab’)2およびFvフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化によりFabフラグメントと称され、各々が単一の抗原結合部位を有する2個の同一の抗原結合フラグメント、および容易に結晶化するその能力のためにそのように称される残りの「Fc」フラグメントが生成される。ペプシン処理により抗原を架橋することができる2個の抗原結合フラグメントを有するF(ab’)2フラグメント、および残りのその他のフラグメント(それはpFc’と称される)を生じる。さらなるフラグメントにはダイアボディー、直鎖抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれ得る。本明細書中で使用される際には抗体に関する「機能的フラグメント」とはFv、F(ab)およびF(ab’)2フラグメントを指す。
本明細書では「抗体フラグメント」なる用語は「抗原結合フラグメント」と互換的に使用される。
抗体フラグメントは約4個のアミノ酸、5個のアミノ酸、6個のアミノ酸、7個のアミノ酸、9個のアミノ酸、約12個のアミノ酸、約15個のアミノ酸、約17個のアミノ酸、約18個のアミノ酸、約20個のアミノ酸、約25個のアミノ酸、約30個のアミノ酸、またはそれより多いくらいの小型でよい。一般に本発明の抗体フラグメントはそれが、
配列番号1の83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/もしくは318−329または本明細書で配列番号2−7として同定されたいずれかの配列から選択されるペプチド配列、または該配列のフラグメントを含むエピトープに対して特異性を有して結合する抗体に相対して類似のまたは免疫学的な特質を有する限り、任意のサイズ上限を有し得る。したがって本発明の局面では「抗体フラグメント」なる用語は「抗原結合フラグメント」なる用語と同一である。
配列番号1の83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/もしくは318−329または本明細書で配列番号2−7として同定されたいずれかの配列から選択されるペプチド配列、または該配列のフラグメントを含むエピトープに対して特異性を有して結合する抗体に相対して類似のまたは免疫学的な特質を有する限り、任意のサイズ上限を有し得る。したがって本発明の局面では「抗体フラグメント」なる用語は「抗原結合フラグメント」なる用語と同一である。
抗体フラグメントはその抗原または受容体と選択的に結合するいくらかの能力を保持する。抗体フラグメントのいくつかの型を以下で定義する:
(1)Fabは抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントである。Fabフラグメントは全抗体を酵素パパインで消化して無傷の軽鎖および1本の重鎖の一部を生じることにより生成することができる。
(2)Fab’は全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して無傷の軽鎖および1本の重鎖の一部を生じることにより得ることができる。抗体分子あたり2個のFab’フラグメントが得られる。
(1)Fabは抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントである。Fabフラグメントは全抗体を酵素パパインで消化して無傷の軽鎖および1本の重鎖の一部を生じることにより生成することができる。
(2)Fab’は全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して無傷の軽鎖および1本の重鎖の一部を生じることにより得ることができる。抗体分子あたり2個のFab’フラグメントが得られる。
Fab’フラグメントは抗体ヒンジ領域からの1個またはそれより多いシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端で数個の残基が加えられていることによりFabフラグメントとは異なる。
(3)F(ab’)2は全抗体を酵素ペプシンで処理するが続いて還元しないことにより得ることができる抗体のフラグメントである。
(4)F(ab’)2は2個のジスルフィド結合により一緒になっている2個のFab’フラグメントの二量体である。
(3)F(ab’)2は全抗体を酵素ペプシンで処理するが続いて還元しないことにより得ることができる抗体のフラグメントである。
(4)F(ab’)2は2個のジスルフィド結合により一緒になっている2個のFab’フラグメントの二量体である。
Fvは完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は堅固な非共有結合的に会合した1個の重および1個の軽鎖可変ドメイン(VH−VL二量体)からなる。各可変ドメインの3個のCDRが相互作用するこの立体配置でVH−VL二量体の表面上の抗原結合部位が定義される。合計で6個のCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3個のCDRのみを含むFvの半分)でさえ抗原を認識しそして結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性は低い。
(5)一本鎖抗体(「SCA」)は軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有し、遺伝子融合された一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結された、遺伝子操作された分子として定義される。かかる一本鎖抗体はまた「一本鎖Fv」または「sFv」抗体フラグメントとも称される。一般的にFvポリペプチドはさらに、sFvが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするVHおよびVLドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。sFvの概説に関してはThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113:269−315、RosenburgおよびMoore編、スプリンガー・ヴェルラグ、ニューヨーク州、1994年のPluckthunを参照されたい。
(5)一本鎖抗体(「SCA」)は軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有し、遺伝子融合された一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結された、遺伝子操作された分子として定義される。かかる一本鎖抗体はまた「一本鎖Fv」または「sFv」抗体フラグメントとも称される。一般的にFvポリペプチドはさらに、sFvが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするVHおよびVLドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。sFvの概説に関してはThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113:269−315、RosenburgおよびMoore編、スプリンガー・ヴェルラグ、ニューヨーク州、1994年のPluckthunを参照されたい。
「ダイアボディー」なる用語は2個の抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは同一のポリペプチド鎖(VH−VL)で軽鎖可変ドメイン(VL)に連結された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。短すぎて同一鎖で2個のドメイン間で対を為すことができないリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を為さざるを得ず、そして2個の抗原結合部位を創成する。ダイアボディーは例えば欧州特許第404,097号;国際公開公報第93/11161号およびHollingerら、Proc.Natl.Acad Sci.USA 90:6444−6448(1993)においてさらに十分に記載されている。
本発明はヒトYKL−40に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方、抗原結合フラグメントならびに本発明による少なくとも1つの機能的活性を保持する組換えタンパク質を企図する。
ポリクローナル抗体の調製は当業者に周知である。例えばImmunochemical Protocols(Manson編)、1−5頁(ヒューマンプレス)のGreenら(1992)「Production of Polyclonal Antisera」;Current Protocols in Immunology、セクション2.4.1のColiganら、「Production of Polyclonal Antisera in Rabbits,Rats,Mice and Hamsters」(これらは出典明示により本明細書の一部とする)を参照されたい。
同様にモノクローナル抗体の調製は従来どおりである。例えばKohlerおよびMilstein、Nature 256:495−7(1975);Coliganら、セクション2.5.1−2.6.7;およびAntibodies:A Laboratory ManualのHarlowら、726頁、コールドスプリングハーバー出版(1988)参照。種々の十分に確立された技術によりモノクローナル抗体をハイブリドーマ培養から単離および精製することができる。かかる単離技術にはプロテインAセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えばMethods in Molecular Biology 10:79−104(1992)、ヒューマンプレス、ニューヨーク州のColiganら、セクション2.7.1−2.7.12およびセクション2.9.1−2.9.3;Barnesら、「Purification of lmmunoglobulin G(IgG)」参照。
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ操作の方法は当業者に周知である。例えば本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体を、最初にKohlerおよびMilstein、Nature 256:495−7(1975)により記載されたハイブリドーマ法により作ることができるか、または米国特許第4,816,567号に記載されるような組換え法により作ることができる。本発明で使用するためのモノクローナル抗体をClacksonら、Nature 352:624−628(1991)およびMarksら、J Mol Biol 222:581−597(1991)に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。ヒト特異的および認識可能な配列を含有する抗体を作成するための別の方法は、組換え手段によりモノクローナル抗体をヒト化することを伴う。概説に関してはHolmesら、J Immunol 158:2192−2201(1997)およびVaswaniら、Annals Allergy, Asthma & Immunol 81:105−115(1998)を参照されたい。
本明細書で使用される際には「モノクローナル抗体」なる用語は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち集団を含む個々の抗体は微量で存在し得る可能な天然発生変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向する。さらに典型的には様々な決定基(エピトープ)に対して指向する様々な抗体を含む従来のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はその他の免疫グロブリンにより夾雑されることなくハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするとは解釈すべきでない。
本明細書のモノクローナル抗体は具体的には、重および/または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、残りの(複数の)鎖は別の種から誘導されたかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびそれらが望ましい生物学的活性を呈する限りかかる抗体のフラグメントの対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含む(米国特許第4,816,567号);Morrisonら、Proc Natl Acad Sci 81:6851−6855(1984)。
抗体フラグメントを作成する方法もまた当分野において公知である(例えばHarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州、1988年(出典明示により本明細書の一部とする)参照)。本発明の抗体フラグメントを抗体のタンパク質溶解性加水分解により、またはそのフラグメントをコードするDNAの大腸菌における発現により調製することができる。従来の方法の全抗体のペプシンまたはパパイン消化により抗体フラグメントを得ることができる。例えばペプシンでの抗体の酵素的切断により抗体フラグメントを生成して、F(ab‘)2と示される5Sフラグメントを提供することができる。チオール還元剤および場合によってはジスルフィド連結の切断の結果得られるスルフヒドリル基の遮断基を用いてこのフラグメントをさらに切断して3.5SFab’一価フラグメントを生成することができる。これに代えて、ペプシンを用いる酵素的切断により2個の一価Fab’フラグメントおよびFcフラグメントを直接生成する。これらの方法は例えば米国特許第4,036,945号および米国特許第4,331,647号、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されている。これらの特許はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
無傷の抗体により認識される抗原にフラグメントが結合する限り、一価軽重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離のような抗体の切断、さらにフラグメントの切断、またはその他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術をも用いることができる。例えばFvフラグメントはVHおよびVL鎖の会合を含む。この会合は非共有結合的でよいか、または可変鎖は分子間ジスルフィド結合により連結されるか、またはグルタルアルデヒドのような化学物質により架橋され得る。好ましくは、Fvフラグメントはペプチドリンカーにより連結されたVHおよびVL鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質(sFv)は、オリゴヌクレオチドにより連結されたVHおよびVLドメインをコードするDNA配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、それを続いて大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は2個のVドメインを橋渡しするリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。sFvを生成するための方法は例えばWhitlowら、Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:97(1991);Birdら、Science 242:423−426(1988);米国特許第4,946,778号;およびPackら、BioTechnology 11:1271−77(1993)により記載されている。
抗体フラグメントの別の形態は単一の相補性決定領域(CDR)をコードするペプチドである。CDRペプチド(「最小認識単位」)はしばしば抗原認識および結合に関与する。目的の抗体のCDRをコードする遺伝子をクローニングまたは構築することによりCDRペプチドを得ることができる。例えば抗体生成細胞のRNAからの可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いることによりかかる遺伝子を調製する。例えばLarrickら、Methods:a Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991)参照。
本発明はヒトおよびヒト以外の(例えばネズミ抗体)のヒト化形態の抗体を企図する。かかるヒト化抗体は、エピトープ認識配列のようなヒト以外の免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント(Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2または抗体のその他の抗原結合配列のような)である。大部分のヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)であり、そこでレシピエントの相補性決定領域(CDR)からの残基は望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種(ドナー抗体)のCDRからの残基により置き換えられる。本明細書に記載する(複数の)エピトープを認識する(複数の)配列のような本発明の(複数の)抗体の(複数の)最小配列を含有する(複数の)ヒト化抗体は本発明の好ましい実施態様である。とりわけ本発明はマウス抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体201F9および116F9のヒト化形態に関する。
ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は対応するヒト以外の残基により置き換えられる場合もある。さらにヒト化抗体はレシピエント抗体でも移入されたCDRまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含み得る。抗体の性能をさらに精巧にし、そして最適化するためにこれらの修飾を行う。一般にヒト化抗体は少なくとも1個、および典型的には2個の可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでCDR領域の全てまたは実質的に全てはヒト以外の免疫グロブリンのものに相当し、そしてFR領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。さらに詳細にはJonesら、Nature 321:522−525(1986);Reichmannら、Nature 332:323−329(1988);Presta、Curr Op Struct Biol 2:593−596(1992);Holmesら、J Immunol 158:2192−2201(1997)およびVaswaniら、Annals Allergy, Asthma & Immunol 81:105−115(1998)を参照されたい。
天然または組換えヒトYKL−40ポリペプチドまたはそのフラグメントを抗原として使用してポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するための当分野で任意の標準的な方法により抗体の作成を達成することができる。好ましい実施態様ではかかる抗体は本明細書にて配列番号1として同定された、天然発生または組換え生成されたヒトYKL−40(スイスプロット受け入れ番号:P36222)またはそのバリアントもしくはフラグメントを用いて、さらに好ましい実施態様では該ポリペプチドのフラグメントを用いて作成され、該フラグメントは以下の基準の少なくとも2つに合致する免疫原性フラグメントである:
(i)少なくとも5個のアミノ酸の隣接アミノ酸配列である;
(ii)配列番号1として同定された配列から誘導されたアミノ酸配列を含む;または
(iii)配列番号2−7で同定されたアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む。
(i)少なくとも5個のアミノ酸の隣接アミノ酸配列である;
(ii)配列番号1として同定された配列から誘導されたアミノ酸配列を含む;または
(iii)配列番号2−7で同定されたアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む。
処置される抗体により、例えば本発明による免疫原性免疫原性フラグメントを該個体に投与することにより抗体をインビボで生成することもできる。したがって、本発明はさらに前記で記載した免疫原性フラグメントを含むワクチンに関する。
本出願はまた本発明の抗体を生成するための方法にも関し、該方法は本明細書で記載したYKL−40またはYKL−40の免疫原性フラグメントを提供する工程を含む。
本発明は細胞成長、分化、生存、転移可能性および例えば線維症の発達を伴う細胞外マトリックスリモデリングのような組織リモデリングに関連したYKL−40の生物学的機能を阻害することができる抗体に関する。一実施態様ではかかる抗体は抗ヒトYKL−40抗体もしくは抗体フラグメントまたはその組換えタンパク質でよく、それは配列番号1のアミノ酸残基83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/もしくは318−329、または配列番号2−7から選択される配列、または該配列のフラグメントを含むエピトープに結合することができる。好ましくはエピトープは配列YKL−40(配列番号1)内に位置する。
別の実施態様では本発明は、抗ヒトYKL−40抗体ではない抗体に関し、該抗体は前記の抗ヒトYKL−40抗体により認識されるエピトープを認識し、そしてそれに結合することができる。
さらに別の実施態様では、本発明は本明細書に記載したエピトープに結合し、そしてそれにより
癌細胞成長の発達/進行、および/または
癌細胞分化の発達/進行、および/または
癌細胞生存の発達/進行、および/または
癌細胞転移の発達/進行、および/または
血管形成の発達/進行、および/または
細胞外マトリックスリモデリングの発達/進行、および/または
肝臓線維症の発達/進行、および/または
肺線維症の発達/進行、および/または
組織線維症の発達/進行、および/または
器官線維症の発達/進行、および/または
関節リウマチの発達
に関連するYKL−40の機能を阻害することができる非抗体化合物に関する。
癌細胞成長の発達/進行、および/または
癌細胞分化の発達/進行、および/または
癌細胞生存の発達/進行、および/または
癌細胞転移の発達/進行、および/または
血管形成の発達/進行、および/または
細胞外マトリックスリモデリングの発達/進行、および/または
肝臓線維症の発達/進行、および/または
肺線維症の発達/進行、および/または
組織線維症の発達/進行、および/または
器官線維症の発達/進行、および/または
関節リウマチの発達
に関連するYKL−40の機能を阻害することができる非抗体化合物に関する。
「エピトープ」なる用語は(抗原の)抗体(それにより免疫応答を引き起こす)により認識される(その抗原分子上の)特異的な原子の群を意味する。「エピトープ」なる用語は「抗原結合基」なる用語と等価である。エピトープは隣接アミノ酸配列内のように近接して位置するか、または抗原のアミノ酸配列の遠位部分に位置する例えば4、5、6、7、8個のアミノ酸残基のような3個またはそれより多いアミノ酸残基を含むことができるが、タンパク質フォールディングのために互いに接近している。
本発明は
1)配列番号1のアミノ酸残基83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/もしくは318−329;
から選択され、
2)配列番号2−7もしくはそのフラグメントから選択される配列からなるか、または
3)配列番号2−7の配列のいずれかから誘導されたアミノ酸残基の組み合わせを含む、
少なくとも3個のアミノ酸残基を含むエピトープに関する。
1)配列番号1のアミノ酸残基83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/もしくは318−329;
から選択され、
2)配列番号2−7もしくはそのフラグメントから選択される配列からなるか、または
3)配列番号2−7の配列のいずれかから誘導されたアミノ酸残基の組み合わせを含む、
少なくとも3個のアミノ酸残基を含むエピトープに関する。
好ましい実施態様では、エピトープはヒトYKL−40に位置し、3から6個のアミノ酸残基のものであり、そしてG、A、W、S、R、Tおよび/またはKを含む。
好ましくは本発明は前記のエピトープを認識し、そしてそれに結合する能力を特徴とするヒトYKL−40に対するモノクローナル抗体に関する。
さらにとりわけ本発明は好ましくはモノクローナル抗体115F9、116F9および201F9として同定される機能的に活性なマウス抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体の群に関する。
本発明によれば抗体115F9、116F9および201F9は前記で定義したようなエピトープに結合することができ、そしてそれにより本明細書に記載したYKL−40タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性を阻害することにより細胞成長および生存に関連するYKL−40の機能を阻害する。
機能的に活性な抗体
したがって本発明は、配列番号2−7として同定された配列、そのフラグメントのいずれか、該抗体、ヒトYKL−40もしくはYKL−40機能的相同体の少なくとも1つの生物学的活性を変調することができる抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質、またはその機能的フラグメントから選択される配列を含むかまたはそれからなるエピトープを認識することができる抗体、抗原結合フラグメント、またはその組換えタンパク質に関し、該活性はi)細胞成長、ii)細胞生存、iii)細胞分化、vi)細胞外マトリックスリモデリング、v)肝臓線維症の発達、vi)組織線維症の発達、vii)器官線維症の発達、viii)血管形成の発達、ix)関節リウマチの発達、x)炎症の発達、および/またはxi)転移の発達に関連している。
したがって本発明は、配列番号2−7として同定された配列、そのフラグメントのいずれか、該抗体、ヒトYKL−40もしくはYKL−40機能的相同体の少なくとも1つの生物学的活性を変調することができる抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質、またはその機能的フラグメントから選択される配列を含むかまたはそれからなるエピトープを認識することができる抗体、抗原結合フラグメント、またはその組換えタンパク質に関し、該活性はi)細胞成長、ii)細胞生存、iii)細胞分化、vi)細胞外マトリックスリモデリング、v)肝臓線維症の発達、vi)組織線維症の発達、vii)器官線維症の発達、viii)血管形成の発達、ix)関節リウマチの発達、x)炎症の発達、および/またはxi)転移の発達に関連している。
好ましい実施態様では抗体は抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体である。
「細胞成長」なる用語は本明細書では「細胞増殖」なる用語と互換的に用いられ、そして細胞分割により細胞数が大幅に増加する現象を指す。
「細胞生存」なる用語は、特に死にそうになるかまたは破壊されそうになった後に、または例えば細胞恒常性に影響してアポトーシスによる細胞自己破壊を誘導する因子でのような不適切に処置された後に、生存または存在し続ける細胞の現象を指す。「細胞生存の阻害/刺激」なる表現は本明細書では「アポトーシス/細胞死の刺激/阻害」なる表現と互換的に用いられる。
本内容では「YKL−40機能的相同体」なる表現は:
前記で定義されるヒトYKL−40の免疫原性フラグメントの1つを含む;
細胞成長、生存、分化、アポトーシス、血管形成、細胞外マトリックスリモデリング、転移の発達、肝臓線維症の発達、組織線維症の発達、器官線維症の発達、関節リウマチの発達および/または炎症の発達に関連するYKL−40生物学的活性の少なくとも1つが可能である;
本発明の抗体、好ましくはモノクローナル抗体115F9、116F9および/または201F9により認識され得る;
ポリペプチドを意味する。
前記で定義されるヒトYKL−40の免疫原性フラグメントの1つを含む;
細胞成長、生存、分化、アポトーシス、血管形成、細胞外マトリックスリモデリング、転移の発達、肝臓線維症の発達、組織線維症の発達、器官線維症の発達、関節リウマチの発達および/または炎症の発達に関連するYKL−40生物学的活性の少なくとも1つが可能である;
本発明の抗体、好ましくはモノクローナル抗体115F9、116F9および/または201F9により認識され得る;
ポリペプチドを意味する。
本内容では「変調する」なる用語は抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質がヒトYKL−40またはその機能的相同体またはその生物学的に活性なフラグメントの生物学的活性を増強または減少させることができることを意味する。好ましい実施態様では、本発明は細胞増殖、細胞成長、細胞分化、細胞生存の刺激、細胞の接着および/または運動性の変調のようなYKL−40の少なくとも1つの生物学的活性を変調することができる抗体、抗原結合フラグメント、またはその組換えタンパク質を特性とする。好ましい実施態様では細胞は腫瘍細胞である。腫瘍細胞は好ましい実施態様では癌細胞または血液学的に悪性の細胞である。癌細胞は原発性または転移性のいずれかの癌に由来してよい。
「原発性癌」とは癌細胞の少なくとも1つの特徴的な特性を獲得しているが、未だ近隣組織に浸潤しておらず、そして原発巣の場所で局在する腫瘍に一緒にある腫瘍細胞の群を意味する。「転移性癌」とは原発性癌の細胞に由来し、該原発性癌を取り巻く組織に浸潤しており、身体中に散在し、新しい離れた場所で接着し、そして新しい腫瘍に成長した腫瘍細胞の群を意味する。
本発明の原発性および転移性癌の実例には、限定するものではないが乳房、結腸直腸、膵臓、胃、消化管間質性腫瘍(GIST)、肝細胞、肺、小細胞性肺、卵巣、子宮、子宮頸、膀胱、腎臓、前立腺、精巣の癌腫、甲状腺癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、頭部/頸部その他の胃腸管系および胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍が挙げられる。
本発明による機能的抗体は増殖、分化を変調し、そして/または原発性および転移性癌細胞の双方の細胞生存に影響し、好ましくは該細胞の細胞成長/増殖/分化を阻害し、そして/または該細胞のアポトーシス/細胞死を誘導/刺激することができる。ヒトYKL−40の生物学的活性は内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、血液細胞(例えば単球/マクロファージ、好中球および前駆細胞)、肝星細胞、血管平滑筋細胞、上皮細胞のような非癌細胞の増殖および生存の刺激において重要な役割を果たすことが以前から示されているので、その他の実施態様では本発明の機能的抗体はまたこれらの細胞の増殖を変調し、そして/または細胞生存に影響することができる。かかるYKL−40生物学的活性の実例を、限定するものではないが、
i)キチンの結合
ii)ヘパリンの結合
iii)硫酸ヘパランの結合
iv)ヒアルロナンの結合
v)長いおよび/もしくは短いオリゴ糖の結合
vi)細胞成長因子としての役割
vii)細胞の化学誘引物質としての役割
viii)ヒアルロナンの合成との干渉
ix)細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激
x)分化の刺激
xi)血管形成の刺激
xii)線維形成の刺激
xiii)細胞外マトリックスリモデリングの刺激ならびに/または
xiv)炎症の刺激
のYKL−40の能力から選択することができる。
i)キチンの結合
ii)ヘパリンの結合
iii)硫酸ヘパランの結合
iv)ヒアルロナンの結合
v)長いおよび/もしくは短いオリゴ糖の結合
vi)細胞成長因子としての役割
vii)細胞の化学誘引物質としての役割
viii)ヒアルロナンの合成との干渉
ix)細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激
x)分化の刺激
xi)血管形成の刺激
xii)線維形成の刺激
xiii)細胞外マトリックスリモデリングの刺激ならびに/または
xiv)炎症の刺激
のYKL−40の能力から選択することができる。
したがって本明細書に記載する(複数の)エピトープを特異的に認識する本発明の機能的に活性な抗体、そのその抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質は前記のYKL−40の生物学的活性のいずれか、好ましくは細胞増殖または生存に影響する過程に関連する任意の活性を変調することができる。
抗体115F9、116F9および201F9は、前記したYKL−40活性のいずれか1つまたは活性の2つもしくはそれより多くを変調することができる本発明の好ましい機能的に活性な抗体である。
ペプチドフラグメント
本発明のエピトープを配列番号1の3から6個のアミノ酸残基により表すことができ、該アミノ酸残基は好ましくは配列番号1の配列によるアミノ酸残基83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/または318−329を含むYKL−40の部分に位置し、ここで好ましいアミノ酸残基はG、A、W、S、R、Tおよび/またはKである。またエピトープを配列番号2−7から選択される配列またはそのフラグメントのような配列番号1の配列から誘導された隣接アミノ酸配列により表すことができる。
本発明のエピトープを配列番号1の3から6個のアミノ酸残基により表すことができ、該アミノ酸残基は好ましくは配列番号1の配列によるアミノ酸残基83−90、96−105、137−150、210−220、304−314および/または318−329を含むYKL−40の部分に位置し、ここで好ましいアミノ酸残基はG、A、W、S、R、Tおよび/またはKである。またエピトープを配列番号2−7から選択される配列またはそのフラグメントのような配列番号1の配列から誘導された隣接アミノ酸配列により表すことができる。
したがって、本発明の一態様は以下:
本発明による前記の配列はヒトYKL−40の免疫原性フラグメントであり、そしてこれらの配列の少なくとも1つを含むかまたはそれからなるエピトープは前記の本発明の機能的抗体により認識される。したがって、一態様では前記で同定されたペプチドフラグメントを用いて本発明の機能的抗体を上昇させることができる。
本発明の別の態様ではペプチドフラグメントを、受容体の結合部位でYKL−40タンパク質と競合することができるYKL−40受容体の代替えリガンドとして用いることができる。ペプチドフラグメントのYKL−40受容体に対する競合結合は、受容体結合および活性化により実行されるYKL−40の機能を減弱させることができる。したがってペプチドフラグメントを、受容体結合により実行されるYKL−40タンパク質の機能を阻害するための化合物として用いることができる。好ましくはペプチドフラグメントを用いて
i)細胞成長の刺激
ii)細胞生存の刺激
iii)細胞増殖の刺激
iv)細胞分化の刺激
v)細胞外マトリックスリモデリングの刺激
vi)肝臓線維症の発達の刺激
vii)器官線維症の発達の刺激
viii)組織線維症の発達の刺激
ix)関節リウマチの発達の刺激
x)転移の発達の刺激
xi)血管形成の刺激
xii)炎症の刺激
の過程に関連するYKL−40の機能を阻害できる。
i)細胞成長の刺激
ii)細胞生存の刺激
iii)細胞増殖の刺激
iv)細胞分化の刺激
v)細胞外マトリックスリモデリングの刺激
vi)肝臓線維症の発達の刺激
vii)器官線維症の発達の刺激
viii)組織線維症の発達の刺激
ix)関節リウマチの発達の刺激
x)転移の発達の刺激
xi)血管形成の刺激
xii)炎症の刺激
の過程に関連するYKL−40の機能を阻害できる。
本出願ではアミノ酸残基の標準的な一文字コードおよび標準的な三文字コードを適用する。アミノ酸の略語はBiochemical Nomenclature Eur.J.Biochem 184:9−37(1984)のIUPAC−IUB合同委員会での推奨に従う。記載および請求の範囲全体で天然アミノ酸に関して三文字コードまたは一文字コードのいずれかを用いる。LまたはD体が明記されていない場合、問題のアミノ酸は天然L体(Pure & Appl.Chem.Vol.56(5)595−624(1984)参照)、またはD体を有すると理解されるべきであり、それで形成されたペプチドはL体、D体またはL体およびD体が混合された配列から構成され得る。
明記されていない場合、本発明のペプチドのC末端アミノ酸は遊離のカルボキシル酸として存在すると理解されるべきであり、これをまた「−OH」として明記することもできる。しかしながら本発明の化合物のC末端アミノ酸はアミド化誘導体でよく、それは「−NH2」として示される。他に記載されない場合、ポリペプチドのN末端アミノ酸は遊離アミノ基を含み、これはまた「H−」として明記され得る。
他に記載されない場合、アミノ酸は天然発生であってもなくても、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸および/またはガンマアミノ酸のような任意のアミノ酸から選択され得る。したがってその群は限定するものではないが:Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Alb、Nal、Sar、Orn、リジン類似体、DAP、DAPAおよび4Hypを含む。
本発明によれば塩基性アミノ酸残基はアミノ酸Arg、LysおよびHisの残基により、酸性アミノ酸残基はアミノ酸GluおよびAspの残基により表される。塩基性アミノ酸残基は荷電アミノ酸残基の群から構成される。疎水性アミノ酸残基の群はアミノ酸Leu、Ile、Val、Phe、Trp、TyrおよびMetの残基により表される。
本発明によれば、例えばアミノ酸のグリコシル化および/またはアセチル化のようなペプチドの修飾を実施することができる。
一実施態様では、バリアントは、保存的置換を含む挿入、欠失および置換の数および範囲が増加するので、好ましい予め決定された配列から徐々に異なっているアミノ酸配列を呈するとして理解され得る。この差異は予め決定された配列とバリアントとの間の相同性の低下として測定される。
本発明によれば、ペプチド配列は5個またはそれより多いアミノ酸残基の長さを有し得る。6−8個のアミノ酸残基の長さが好ましく、本発明のエピトープ/免疫原性フラグメントは好ましくは6−8個のアミノ酸残基を含む。しかしながら例えば4、5または6個のような3から7個のアミノ酸残基からなる前記の配列の免疫原性フラグメントもまた本発明の範囲内である。
本発明のペプチドフラグメントのアミノ酸残基の数に関する上限は変化し得る。したがって本発明の免疫原性フラグメントを含むペプチドフラグメントは250個までのアミノ酸残基の長さを有し得る。例えばそれは5から125個のような5から150個のアミノ酸残基、例えば5から80個のような5から100個、例えば5から65個、5から50個、5から30個または5から20個を含み得る。
したがって本発明はまた8から20個のような8から25個、例えば8から15のアミノ酸残基を含むかまたはそれからなるペプチドフラグメントを特性とする。その他の実施態様ではペプチドフラグメントの長さは12から25個のような10から25個、例えば14から25個でよいか、またはそれは14から20個もしくは14から18個のアミノ酸残基でよい。いくつかの実施態様では本発明の免疫原性配列(配列番号2−7)を含むペプチドフラグメントは26から50個のアミノ酸残基のような25個を超えるアミノ酸残基、例えば28−30、31−35、36−40、41−45または46−49個のアミノ酸残基からなり得る。
全ての前記のペプチドフラグメントは配列番号2−7またはそのフラグメントもしくはバリアントから選択される配列の少なくとも1つを含むかまたはそれからなることは理解される。
本発明のペプチドフラグメントは一を超える配列番号2−7の免疫原性配列またはそのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなり得る。ペプチドフラグメントを単量体として処方することができる。これは、それらを免疫原性配列を含む個々のペプチド配列のシングルコピーとして表すことができることを意味する。ペプチドフラグメントはまた同一配列の一を超えるコピーを含むかまたはそれからなり得る。したがって本発明はまた前記の個々のペプチド配列の重合体にも関する。ペプチド配列の重合体を単一のペプチド鎖により表すことができ、ここで個々のペプチド配列は鎖内で2回またはそれより多く繰り返されるか、またはそれは分子でよく、ここで個々のペプチド配列のコピーはリンカー基を介して互いに連結されている。かかる重合体の非限定的な実例はデンドリマー重合体でよく、ここでペプチド配列の個々のコピーはリジンのようなコア分子に付着している。
化合物は2個またはそれより多い異なる本発明の免疫原性配列を含むかまたはそれからなり得る。
本発明の免疫原性配列を含むペプチドフラグメントは該配列のバリアントを含むかまたはそれからなり得る。
「ペプチド配列のバリアント」とは例えば1個またはそれより多いアミノ酸残基の置換によりペプチドを修飾することができることを意味する。Lアミノ酸およびDアミノ酸の双方を用いることができる。その他の修飾はエステル、糖等のような誘導体を含み得る。実例はメチルおよびアセチルエステルである。反復配列のような重合化または種々キャリヤ、例えば4個のペプチド、8個のペプチド、16個のペプチドもしくは32個のペプチドを担持するリジンデンドリマーのようなリジンバックボーンへの付着は当分野において周知である。その他のキャリヤはウシ血清アルブミン(BSA)または親油性デンドリマーまたは親油性誘導体により形成されたミセル様キャリヤまたはスターバースト(星状)炭素鎖重合体包合体またはジエチルアミノメタンの誘導体に基づくリガンド提示集合体(LPA)のようなタンパク質部分でよい。
本発明によるペプチドフラグメントのバリアントは同一バリアントもしくはそのフラグメント内または異なるバリアントもしくはそのフラグメント間で、互いに独立して導入された複数の置換のような少なくとも1つの置換を含み得る。したがって複合体のバリアントまたはそのフラグメントは互いに独立した保存的置換を含み、ここで該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のグリシン(Gly)はAla、Val、LeuおよびIleからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のアラニン(Ala)がGly、Val、LeuおよびIleからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のバリン(Val)がGly、Ala、LeuおよびIleからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のロイシン(Leu)がGly、Ala、ValおよびIleからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のイソロイシン(Ile)がGly、Ala、ValおよびLeuからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のアスパラギン酸(Asp)がGlu、AsnおよびGlnからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のアスパラギン(Asn)がAsp、GluおよびGlnからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のグルタミン(Gln)がAsp、GluおよびAsnからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてここで該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のフェニルアラニン(Phe)がTyr、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群から選択され、そして好ましくはTyrおよびTrpからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のチロシン(Tyr)がPhe、Trp、His、Proからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸、好ましくはPheおよびTrpからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該フラグメントの少なくとも1個のアルギニン(Arg)がLysおよびHisからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のリジン(Lys)がArgおよびHisからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のプロリン(Pro)がPhe、Tyr、TrpおよびHisからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも1個のシステイン(Cys)がAsp、Glu、Lys、Arg、His、Asn、Gln、Ser、ThrおよびTyrからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換される。
前記のことからペプチドフラグメントの同一機能等価物または該機能等価物のフラグメントは本明細書前記で定義したような保存アミノ酸の一を超える群からの一を超える保存アミノ酸置換を含み得る。「保存アミノ酸置換」なる用語は「相同アミノ酸置換」なる用語の同義語として用いられる。保存アミノ酸の群は以下のとおりである:
P、A、G、S、T(中性、弱疎水性)
Q、N、E、D、B、Z(親水性、アミン酸)
H、K、R(親水性、塩基性)
L、I、V、M、F、Y、W(疎水性、芳香族)
C(架橋形成)
保存的置換を本発明の好ましい予め決定されたペプチドまたはそのフラグメントの任意の位置に導入することができる。しかしながら非保存的置換、特に限定するものではないが任意の1つまたはそれより多い位置での非保存的置換を導入することも望ましいかもしれない。
P、A、G、S、T(中性、弱疎水性)
Q、N、E、D、B、Z(親水性、アミン酸)
H、K、R(親水性、塩基性)
L、I、V、M、F、Y、W(疎水性、芳香族)
C(架橋形成)
保存的置換を本発明の好ましい予め決定されたペプチドまたはそのフラグメントの任意の位置に導入することができる。しかしながら非保存的置換、特に限定するものではないが任意の1つまたはそれより多い位置での非保存的置換を導入することも望ましいかもしれない。
本発明のペプチドの機能等価フラグメントの形成に至る非保存的置換は、例えば極性、例えばGly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnもしくはGlnのような極性側鎖を有する残基またはAsp、Glu、ArgもしくはLysのような荷電アミノ酸を置換した非極性側鎖(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、PheまたはMet)を有する残基、または非極性のものを荷電したもしくは極性の残基で置換することで実質的に異なり;および/またはii)ProもしくはGlyでの置換またはそれの別の残基での置換のようなペプチドバックボーン配向に及ぼすその影響で実質的に異なり;および/またはiii)電荷、例えばLys、HisもしくはArgのような正に荷電した残基のGluもしくはAspのような負に荷電した残基での置換(およびその逆もまた同様)で実質的に異なり;および/またはiv)立体構造の大きさ、例えば小さい側鎖、例えばAla、GlyもしくはSerを有するもののHis、Trp、PheもしくはTyrのような大きな残基での置換(およびその逆もまた同様)で異なる。
アミノ酸の置換は一実施態様ではその疎水性および親水性の値ならびに荷電、大きさ等を含むアミノ酸側鎖置換の相対的類似性に基づいて行われる。種々の前記の特徴を考慮に入れたアミノ酸置換の実例は当業者に周知であり、そして:アルギニンおよびリジン;グルタミン酸およびアスパラギン酸;セリンおよびスレオニン;グルタミンおよびアスパラギン;ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。
i)細胞成長の刺激、および/または
ii)細胞増殖の刺激、および/または
iii)細胞生存の刺激、および/または
iv)細胞分化の刺激、および/または
v)転移の発達の刺激、および/または
vi)細胞外マトリックスのリモデリングの刺激、および/または
vii)肝臓線維症の発達の刺激、および/または
viii)器官線維症の発達の刺激、および/または
ix)組織線維症の発達の刺激、および/または
x)関節リウマチの発達の刺激、および/または
xi)血管形成の刺激、および/または
xii)炎症の刺激
の過程に関連するYKL−40の機能は以下のYKL−40の生物学的活性:
i)キチンの結合、ならびに/または
ii)ヘパリンの結合、ならびに/または
iii)硫酸ヘパリンの結合、ならびに/または
iv)ヒアルロナンの結合、ならびに/または
v)長いおよび/もしくは短いオリゴ糖の結合、ならびに/または
vi)細胞成長因子としての役割、ならびに/または
vii)細胞分化因子としての役割、ならびに/または
viii)細胞の化学誘引物質としての役割、ならびに/または
ix)ヒアルロナンの合成との干渉、ならびに/または
x)細胞外マトリックスリモデリングとの干渉、ならびに/または
xi)細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激、ならびに/または
xii)血管形成の刺激、ならびに/または
xiii)炎症との干渉、ならびに/または
xiv)線維形成の刺激、
から選択することができる。
ii)細胞増殖の刺激、および/または
iii)細胞生存の刺激、および/または
iv)細胞分化の刺激、および/または
v)転移の発達の刺激、および/または
vi)細胞外マトリックスのリモデリングの刺激、および/または
vii)肝臓線維症の発達の刺激、および/または
viii)器官線維症の発達の刺激、および/または
ix)組織線維症の発達の刺激、および/または
x)関節リウマチの発達の刺激、および/または
xi)血管形成の刺激、および/または
xii)炎症の刺激
の過程に関連するYKL−40の機能は以下のYKL−40の生物学的活性:
i)キチンの結合、ならびに/または
ii)ヘパリンの結合、ならびに/または
iii)硫酸ヘパリンの結合、ならびに/または
iv)ヒアルロナンの結合、ならびに/または
v)長いおよび/もしくは短いオリゴ糖の結合、ならびに/または
vi)細胞成長因子としての役割、ならびに/または
vii)細胞分化因子としての役割、ならびに/または
viii)細胞の化学誘引物質としての役割、ならびに/または
ix)ヒアルロナンの合成との干渉、ならびに/または
x)細胞外マトリックスリモデリングとの干渉、ならびに/または
xi)細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激、ならびに/または
xii)血管形成の刺激、ならびに/または
xiii)炎症との干渉、ならびに/または
xiv)線維形成の刺激、
から選択することができる。
本発明によるこれらのYKL−40の生物学的機能は以下の配列:
本発明によれば、配列番号2−7全てまたはそれの少なくとも1つはYKL−40上の受容体結合部位の形成に関与し、該部位は前記で同定されたYKL−40の生物学的活性の少なくとも1つの実行に関与する。したがって本発明は、より長いペプチド配列での配列番号2−7の配列のいずれかの存在は(i)YKL−40受容体への結合および/または(ii)本発明の機能的に活性な抗体への結合を競合する能力を保有するより長い該ペプチド配列に必須であると考えられる。したがって配列番号2−7の配列の少なくとも1つを含む配列はインビボおよびインビトロでヒトYKL−40の生物学的活性のモジュレーターとして本発明と関係する。したがって、かかる配列が受容体結合に関してYKL−40と競合する場合、配列はそれによりYKL−40により誘起される細胞増殖、分化および/もしくは細胞生存の刺激の下方調節のようにYKL−40の活性を減弱させることができるか、または抗体結合と競合する場合、配列は抗体の活性の阻害を減弱させ、そしてそれによりYKL−40に依存する細胞増殖および/もしくは細胞生存を上方調節することができる。したがって配列番号2−7に選択された配列を含む8−200個のアミノ酸長のペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントはヒトYKL−40の機能的相同体または配列番号2−7として同定されたいずれかの配列の機能的相同体であると考えられる。
個々のペプチド配列の生成
任意の従来の合成方法、組換えDNAテクノロジー、ペプチド配列が誘導される全長タンパク質の酵素的切断、または該方法の組み合わせにより本発明のペプチド配列を調製することができる。
任意の従来の合成方法、組換えDNAテクノロジー、ペプチド配列が誘導される全長タンパク質の酵素的切断、または該方法の組み合わせにより本発明のペプチド配列を調製することができる。
組換え調製
したがって一実施態様では本発明のペプチドを組換えDNAテクノロジーを用いて生成する。
したがって一実施態様では本発明のペプチドを組換えDNAテクノロジーを用いて生成する。
ペプチドまたはそのペプチドが由来する対応する全長タンパク質をコードするDNA配列を確立された標準的な方法、例えばBeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett.22:1859−1869(1981)により記載されたホスホアミジン法またはMatthesら、EMBO J.3:801−805(1984)により記載された方法により合成により調製することができる。ホスホアミジン法によればオリゴヌクレオチドを例えば自動DNA合成器で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲートし、そして適当なベクターでクローニングする。
ペプチドをコードするDNA配列をペプチド起源の対応する全長タンパク質をコードするDNA配列を、標準的なプロトコール(Sambrookら、Molecular cloning:A Laboratory manual、第2版、CSHLプレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1989年)にしたがってDNAアーゼIを用いてフラグメント化することにより調製することもできる。本発明は前記で同定したタンパク質の群から選択される全長タンパク質に関する。これに代えて本発明の全長タンパク質をコードするDNAを、特異的制限エンドヌクレアーゼを用いてフラグメント化することができる。Sambrookら、Molecular cloning:A Laboratory manual、第2版、CSHLプレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、1989年に記載される標準的な手順を用いてDNAのフラグメントをさらに精製する。
全長タンパク質をコードするDNA配列はまた、例えば標準的な技術(Sambrookら、Molecular cloning:A Laboratory manual、第2版、コールドスプリングハーバー、1989年参照)にしたがってゲノムまたはcDNAライブラリーを調製し、そして合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより全長タンパク質の全てまたは一部をコードするDNA配列に関してスクリーニングすることにより得られるゲノムまたはcDNA起源のものでもよい。例えば米国特許第4,683,202号またはSaikiら、Science 239:487−491(1988)に記載されるように特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりDNA配列を調製することもできる。
次いで組換えDNA手順に都合よく供することができる、任意のベクターでよい組換え発現ベクターにDNA配列を挿入する。ベクターの選択はしばしばそれを導入する宿主細胞に依存する。したがってベクターはその複製が染色体複製とは独立している自己複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクター、例えばプラスミドでよい。これに代えてベクターは宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれている(複数の)染色体と一緒に複製されるものでよい。
ベクターではペプチドまたは全長タンパク質をコードするDNA配列は適当なプロモーター配列に動作可能なように連結されているべきである。プロモーターは選択した宿主細胞において転写活性を示し、そして宿主細胞と同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る任意のDNA配列でよい。哺乳動物細胞におけるコード化DNA配列の転写を指示するための適当なプロモーターの実例はSV40プロモーター(Subramaniら、Mol.Cell Biol.1:854−864(1981))、MT−1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター(Palmiterら、Science 222:809−814(1983))またはアデノウイルス2主要後期プロモーターである。昆虫細胞での使用に適当なプロモーターはポリヘドリンプロモーター(Vasuvedanら、FEBS Lett.311:7−11(1992))である。酵母宿主細胞で使用するのに適当なプロモーターには酵母糖分解遺伝子由来のプロモーター(Hitzemanら、J.Biol.Chem.255:12073−12080(1980);AlberおよびKawasaki、J.Mol.Appl.Gen.1:419−434(1982))またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals、Hollaenderら編、プレナムプレス、ニューヨークのYoungら(1982))またはTPI1(米国特許第4,599,311号)またはADH2−4c(Russellら、Nature 304:652−654(1983))プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞において使用するのに適当なプロモーターは例えばADH3プロモーター(McKnightら、EMBO J.4:2093−2099(1985))またはtpiAプロモーターである。
コード化DNA配列をヒト成長ホルモンターミネーター(Palmiterら、前掲)または(真菌宿主用には)TPI1(AlberおよびKawasaki、前掲)またはADH3(McKnightら、前掲)プロモーターのような適当なターミネーターに動作可能なように連結させてもよい。ベクターはさらにポリアデニル化シグナル(例えばSV40またはアデノウイルス5EIb領域由来)、転写エンハンサー配列(例えばSV40エンハンサー)および翻訳エンハンサー配列(例えばアデノウイルスVA RNAをコードするもの)のようなエレメントを含むことができる。
組換え発現ベクターはさらに問題の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするDNA配列を含むことができる。かかる配列の実例は(宿主細胞が哺乳動物細胞である場合)SV40の複製起点である。ベクターはまた選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)をコードする遺伝子のようなその生成物が宿主細胞における欠損を補う遺伝子、または薬物、例えばネオマイシン、ヒドロマイシンもしくはメソトレキセートに対する抵抗性を付与するものをも含むことができる。
ペプチドまたは全長タンパク質、プロモーターおよびターミネーターを各々コードするDNA配列をライゲートするため、ならびに複製に必要な情報を含有する適当なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は当業者に周知である(例えばSambrookら、前掲参照)。
本発明の組換えペプチドを得るために、コード化DNA配列を第2のペプチドコード化配列およびプロテアーゼ切断部位コード化配列と有効に融合して、融合タンパク質をコードするDNA構築物を提供することができ、ここでプロテアーゼ切断部位コード化配列はHBPフラグメントと第2のペプチドコード化DNAとの間に位置し、組換え発現ベクターに挿入され、そして組換え宿主細胞において発現される。一実施態様では、該第2のペプチドは限定するものではないがグルタチオンSリダクターゼ、仔ウシチモシン、細菌性チオレドキシンまたはヒトユビキチン天然もしくは合成バリアント、またはそのペプチドを含む群から選択される。別の実施態様ではプロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列はアミノ酸配列IEGRを有するXa因子、アミノ酸配列DDDDKを有するエンテロキナーゼ、アミノ酸配列LVPR/GSを有するスロンビンまたはアミノ酸配列XKXを有するアクロモバクター・リティカス切断部位でよい。
発現ベクターを導入する宿主細胞はペプチドまたは全長タンパク質を発現することができる任意の細胞でよく、そして好ましくは無脊椎動物(昆虫)細胞または脊椎動物細胞のような真核細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞または哺乳動物細胞、特に昆虫および哺乳動物細胞である。適当な哺乳動物細胞系の実例はHEK293(ATCC CRL−1573)、COS(ATCC CRL−1650)、BHK(ATCC CRL−1632、ATCC CCL−10)またはCHO(ATCC CCL−61)細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトし、そして細胞に導入されたDNA配列を発現させる方法は例えばKaufmanおよびSharp、J.Mol.Biol.159:601−621(1982);SouthernおよびBerg、J.Mol.Appl.Genet.1:327−341(1982);Loyterら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:422−426(1982);Wiglerら、Cell 14:725(1978);CorsaroおよびPearson、Somatic Cell Genetics 7:603(1981);Grahamおよびvan der Eb、Virol.52:456(1973);ならびにNeumannら、EMBO J.1:841−845(1982)に記載されている。
これに代えて真菌細胞(酵母細胞を含む)を宿主細胞として用いることができる。適当な酵母細胞の実例にはサッカロミセス種またはシゾサッカロミセス種、とりわけサッカロミセス・セレビシエの株が挙げられる。その他の真菌細胞の実例は糸状菌、例えばアスペルギルス種またはニューロスポラ種、とりわけコウジカビまたはクロカビの細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用は例えば欧州特許第238,023号に記載されている。
細胞を培養するために用いる培地は適切な培養添加剤を含有する血清含有もしくは血清不含培地培地のような哺乳動物細胞の成長に適当な任意の従来の培地、または昆虫、酵母もしくは真菌細胞の成長に適当な培地でよい。適当な培地は商業的供給者から入手可能であるか、または公開されている(例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ中の)製法にしたがって調製することができる。
次いで遠心または濾過による培地からの宿主細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いる上澄みまたは濾液のタンパク質様構成成分の沈殿、種々のクロマトグラフィー手順、例えばHPLC、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等による精製を含む従来の手順により、細胞により組換えで生成されたペプチドまたは全長タンパク質を培養培地から回収することができる。
合成による調製
ペプチドの合成による生成のための方法は当分野において周知である。合成ペプチドの生成のための詳細な記載および実践的な助言はSynthetic Peptides:A User‘s Guide(Advances in Molecular Biology)、Grant G.A.編、オックスフォード大学出版局、2002年またはPharmaceutical Formulation:Development of Peptides and Proteins、FrokjaerおよびHovgaard編のTaylorおよびFrancis、1999年に見出すことができる。
ペプチドの合成による生成のための方法は当分野において周知である。合成ペプチドの生成のための詳細な記載および実践的な助言はSynthetic Peptides:A User‘s Guide(Advances in Molecular Biology)、Grant G.A.編、オックスフォード大学出版局、2002年またはPharmaceutical Formulation:Development of Peptides and Proteins、FrokjaerおよびHovgaard編のTaylorおよびFrancis、1999年に見出すことができる。
例えばFmoc化学を用いることにより、およびAcm保護システインでペプチドを合成することができる。逆相HPLCによる精製の後、ペプチドをさらに加工して例えば環状またはCもしくはN末端修飾アイソフォームを得ることができる。環化および末端修飾のための方法は当分野において周知であり、そして前記で引用した手引き書に詳記されている。
好ましい実施態様では、本発明のペプチド配列を合成で、とりわけシークエンスアシステッドペプチド合成(Sequence Assisted Peptide Synthesis:SAPS)により生成する。
SAPSによりペプチドを、濾過用のポリプロピレンフィルターを装着したポリエチレン容器内でバッチ式で、または完全に自動化されたペプチド合成器でN−a−アミノ保護基として9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)もしくはtert−ブチルオキシカルボニル(Boc)、および側鎖官能性に関する適当な一般的な保護基を用いてポリアミド固相法(Dryland,A.およびSheppard,R.C., J.Chem.Soc.Perkin Trans.I:125−137(1986))の連続フロー式でのいずれかで合成することができる。
合成する場合、次いで個々のペプチド配列を当分野において周知の技術を用いて多量体として処方することができ、例えば国際公開公報第00/18791号に記載されるLPA法により配列の二量体を得ることができ、MAP合成によるデンドリマー重合体はPCT/US90/02039に記載されている。
医薬組成物
本発明の局面では、「医薬組成物」なる用語は「医薬」なる用語と同義語として用いられる。
本発明の局面では、「医薬組成物」なる用語は「医薬」なる用語と同義語として用いられる。
いくつかの実施態様では、本発明は前記で定義したようなエピトープを結合することができる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む医薬組成物に関する。好ましくは医薬組成物はモノクローナル抗体115F9、116F9および/もしくは201F9、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質、最も好ましくはモノクローナル抗体201F9、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む。最も好ましくは本発明の医薬組成物は抗体115F9、116F9および/または201F9の(複数の)ヒト化形態を含むかまたは本質的に含む。
その他の実施態様では、本発明はYKL−40の免疫原性フラグメント、配列番号2−7として同定される配列の少なくとも1つを含む該フラグメントを含む医薬組成物に関する。
一実施態様では、医薬組成物は配列番号2として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。別の実施態様では、組成物は配列番号3として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。さらに別の実施態様では、組成物は配列番号4として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。なお別の実施態様では、組成物は配列番号5として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。なおさらに別の実施態様では、組成物は配列番号6として同定されるペプチド配列もしくはそのフラグメントもしくはそのバリアント、または配列番号6として同定されるペプチド配列もしくはそのフラグメントもしくはそのバリアントを含む。いくつかの実施態様では医薬組成物は配列番号2−7の配列の任意の組み合わせを含むことができる。
組成物ではペプチド配列を単離された個々のフラグメントまたは前記で論じたようなその多量体もしくは二量体として処方することができる。
例えば前記で記載した医薬組成物を用いてインビトロまたはインビボで癌細胞の死を促すことができる。
組成物は対象にインビボで投与されるか、またはインビトロでの使用のために有効量の、前記で記載した1つもしくはそれより多い化合物を薬学的に許容される添加物と共に含有する。かかる医薬を経口、経皮、筋肉内、静脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、鼻腔内または肺投与に適当に処方することができる。
本発明の化合物に基づく医薬および組成物の処方開発の計画は概して任意のその他のタンパク質基盤の薬物製剤に関する処方計画に相当する。可能性のある問題およびこれらの問題を打開するのに必要な手引きはいくつかの教本、例えばTherapeutic Peptides and Protein Formulation.Processing and Delivery Systems、A.K.Banga編、テクノミック出版社、バーゼル、1995年で取り扱われている。
注射用は通常液体溶液または懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適当な固体形態のいずれかとして調製される。調製物を乳化することもできる。活性成分はしばしば薬学的に許容され、そして活性成分と適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等またはその組み合わせである。加えて所望により調製物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤のような、または調製物の有効性もしくは輸送を強化する補助物質を含有することができる。
本発明の化合物の処方を当業者に公知の技術により調製することができる。処方は薬学的に許容されるマイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子等を含む担体および賦形剤を含有することができる。
場合によっては活性成分がその効果を奏する部位で、注射により調製物を適当に投与することができる。その他の投与様式に適当であるさらなる処方には坐剤、鼻、肺および時には経口処方が含まれる。坐剤用では伝統的な結合剤および担体にはポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。0.5%から10%、好ましくは1−2%の範囲で(複数の)活性成分を含有する混合物からかかる坐剤を処方することができる。経口処方には、例えば医薬用等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放処方または粉末の形態を取り、そして一般に10−95%、好ましくは25−70%の(複数の)活性成分を含有する。
その他の処方は鼻および肺投与に適当なようなもの、例えば吸入器およびエアロゾルである。
活性化合物を中性または塩形態に処方することができる。薬学的に許容される塩には酸付加塩(ペプチド化合物の遊離アミノ基で形成される)が含まれ、そしてそれは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸で形成される。また遊離カルボキシル基で形成される塩を例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から誘導することもできる。
調製物を用量製剤に適合する様式で、および治療上有効であるような量で投与する。投与される量は、対象の体重および年齢を含む処置される対象、処置される疾患ならびに疾患の段階に依存する。適当な用量範囲は体重kgあたり通常投与あたり活性成分数百μgのオーダーで、好ましくは体重kgあたり約0.1μgから5000μgの範囲である。化合物の単量体形態を用いる場合、適当な投与量はしばしば体重kgあたり約0.1μgから3000μgの範囲、および特に体重kgあたり約0.1μgから1000μgの範囲のような体重kgあたり0.1μgから5000μgの範囲である。化合物の多量体形態を用いる場合、適当な投与量はしばしば体重kgあたり約0.1μgから750μgの範囲のような体重kgあたり0.1μgから1000μgの範囲、および特に体重kgあたり約0.1μgから250μgの範囲のような体重kgあたり約0.1μgから500μgの範囲である。とりわけ鼻に投与する場合、その他の経路により投与される場合よりも低用量が用いられる。投与を一回で実施することができるか、または次に投与を続けることができる。投与量は投与経路にも依存し、そして処置される対象の年齢および体重で変化する。多量体形態の好ましい投与量は体重70kgあたり1mgから70mgの間である。
局所適用または実質的に局所適用が好ましい適応症もある。
本発明の化合物のいくつかは十分に活性であるが、その他のいくつかでは、調製物がさらに薬学的に許容される添加剤および/または担体を含む場合に効果が強化される。かかる添加剤および担体は当分野において公知である。活性物質のその標的への分配を促進する化合物を含むのが有利である場合もある。
多くの場合、処方を多回投与することが必要である。投与は静脈内注入のような連続注入、または一日数回のようなより多い投与量で、毎日、週数回、毎週等の投与でよい。個体が細胞死に至り得る(複数の)因子に供されている前またはその直後に医薬の投与を開始するのが好ましい。好ましくは因子の出現から5時間内のような、因子の出現から8時間内に医薬を投与する。多くの化合物は長時間効果を呈し、それにより化合物の投与を1週または2週のような長い間隔で行うことができる。
神経ガイドでの使用に関連して、投与は(複数の)活性化合物の放出制御に基づいて連続してまたは少量ずつでよい。さらに前駆体を用いて放出速度および/または放出部位を制御することができる。経口投与としてその他の種類のインプラントおよびウェルも同様に放出制御および/または前駆体の使用に基づいてよい。
本発明はまた細胞死の誘導、細胞成長、肝臓線維症または関節リウマチの発達の阻害を必要とする個体の処置にも関する。処置は有効量の、前記で定義したような1つまたはそれより多い化合物を含む本発明の医薬組成物の投与を伴う。
処置
前記で論じたように本明細書に記載する抗体およびペプチドフラグメントを以下に列挙するYKL−40の生物学的活性:
i)キチンの結合
ii)ヘパリンの結合
iii)硫酸ヘパランの結合
iv)ヒアルロナンの結合
v)長いおよび/もしくは短いオリゴ糖の結合
vi)細胞成長因子としての役割
vii)分化因子としての役割
viii)細胞の化学誘引物質としての役割
ix)ヒアルロナンの合成との干渉
x)細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激
xi)血管形成の刺激
xii)線維形成の刺激
xiii)細胞外マトリックスリモデリングとの干渉
xiv)炎症との干渉ならびに/または
xv)転移の発達の刺激
の少なくとも1つを阻害または刺激のような変調のための使用することができる。
前記で論じたように本明細書に記載する抗体およびペプチドフラグメントを以下に列挙するYKL−40の生物学的活性:
i)キチンの結合
ii)ヘパリンの結合
iii)硫酸ヘパランの結合
iv)ヒアルロナンの結合
v)長いおよび/もしくは短いオリゴ糖の結合
vi)細胞成長因子としての役割
vii)分化因子としての役割
viii)細胞の化学誘引物質としての役割
ix)ヒアルロナンの合成との干渉
x)細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激
xi)血管形成の刺激
xii)線維形成の刺激
xiii)細胞外マトリックスリモデリングとの干渉
xiv)炎症との干渉ならびに/または
xv)転移の発達の刺激
の少なくとも1つを阻害または刺激のような変調のための使用することができる。
前記のヒトYKL−40の活性は細胞成長、増殖、分化および生存、細胞外マトリックスリモデリング、線維症ならびに血管形成を刺激するタンパク質の能力に関連している。したがって本発明の抗体およびペプチドフラグメントを細胞成長、増殖、分化および生存、転移および/または細胞外マトリックスリモデリングの発達、線維症、血管形成ならびに炎症を阻害するために使用することもできる。かかる抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物の使用を含む、それを必要とする個体の処置が治癒の成功に至り得る多くの疾患および病理学的状態がある。「抗体」なる用語は本発明の局面では抗体、抗原結合フラグメントおよびその組換えタンパク質の双方を指す。
したがって抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマおよびその他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌を成功裏に処置することができる。
または、抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマおよびその他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の転移性癌を処置することができる。
さらに別の実施態様では抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて例えば関節リウマチ、その他の炎症性関節疾患、細菌感染、活動性炎症性腸疾患または肝臓線維症(例えばB型もしくはC型肝炎ウイルスまたはアルコール依存症に引き起こされる)を処置することができる。
なおその他の実施態様では、抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて例えば関節リウマチ、巨細胞性動脈炎、強直性脊椎炎、結核、サルコイドーシス、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルコール性肝臓線維症、C型肝炎のような、該阻害が治癒に有利であり得る任意の病理学的状態で
任意の非腫瘍性細胞の増殖を阻害;
血管形成を阻害;
細胞外マトリックスリモデリングを阻害;
組織線維症を阻害;
することもできる。
任意の非腫瘍性細胞の増殖を阻害;
血管形成を阻害;
細胞外マトリックスリモデリングを阻害;
組織線維症を阻害;
することもできる。
なおさらなる態様では本発明は、本発明の抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を投与することにより前記で論じたような疾患または状態を処置する方法に関する。
加えて本発明はインビトロアッセイおよび方法における、例えば新しい抗癌性化合物をスクリーニングするためのアッセイにおける本発明の抗体および/もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物の使用に関する。
1.抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体によるインビトロでの癌細胞成長および生存の阻害
ヒト悪性グリア芽腫U87、ヒト骨肉腫MG63およびU2OS、ならびにヒト悪性メラノーマSK−MEL28の細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)および抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(ギブコ)中で培養を通常どおりに維持した。全ての細胞系をATTCから入手した。
ヒト悪性グリア芽腫U87、ヒト骨肉腫MG63およびU2OS、ならびにヒト悪性メラノーマSK−MEL28の細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)および抗生物質(ペニシリンおよびストレプトマイシン)を補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(ギブコ)中で培養を通常どおりに維持した。全ての細胞系をATTCから入手した。
抗ヒトYKL−40抗体(Ab):
116F9(マウスモノクローナル;最高Ab希釈1:100はAb濃度0.06mg/mlに等しい)
115F9(マウスモノクローナル;最高Ab希釈1:50はAb濃度0.03mg/mlに等しい)
201F9(マウスモノクローナル;最高Ab希釈1:250はAb濃度0.03mg/mlに等しい)
R668(ウサギポリクローナル;最高Ab希釈1:50はAb濃度0.0075mg/mlに等しい)
手順:
細胞を96ウェルプレート(12ウェル×8列)に培地200μl中5000セル/ウェルの密度で播種した。細胞を接着させ、そして一晩成長させた。翌日成長培地を捨て、そして細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で濯いだ。続いて以下に示すような様々の希釈の抗体を含有する新鮮培地200μlで細胞を処理した:
116F9(マウスモノクローナル;最高Ab希釈1:100はAb濃度0.06mg/mlに等しい)
115F9(マウスモノクローナル;最高Ab希釈1:50はAb濃度0.03mg/mlに等しい)
201F9(マウスモノクローナル;最高Ab希釈1:250はAb濃度0.03mg/mlに等しい)
R668(ウサギポリクローナル;最高Ab希釈1:50はAb濃度0.0075mg/mlに等しい)
手順:
細胞を96ウェルプレート(12ウェル×8列)に培地200μl中5000セル/ウェルの密度で播種した。細胞を接着させ、そして一晩成長させた。翌日成長培地を捨て、そして細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で濯いだ。続いて以下に示すような様々の希釈の抗体を含有する新鮮培地200μlで細胞を処理した:
各抗体処理の1個のプレートを正常酸素圧状態でインキュベートし、そして別のプレートをMTT(臭化3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム、シグマ)での処置の72時間前に低酸素(0.1%)状態でインキュベートした。
MTTアッセイ:
Mossmann T.J Immunol Methods 65:55−63(1983)にしたがってMTTアッセイ(培養中の生存および死亡細胞を区別することを可能にする)を実施した。
Mossmann T.J Immunol Methods 65:55−63(1983)にしたがってMTTアッセイ(培養中の生存および死亡細胞を区別することを可能にする)を実施した。
MTT40μlを各ウェル(2mg/mlストック溶液)に加え、そしてプレートを正常酸素圧インキュベーター中37℃で1時間インキュベートした。その後培地を捨て、そしてDMSO100μlを各ウェルに加えた。プレートを10秒間振盪し、そして570nm(690nmでバックグラウンド補正)OD(光学密度)値を読んだ。結果を6ウェルのODの平均+/−標準偏差として示す。
図1からわかるように、モノクローナル抗体(MAb)116F9および201F9は、培養培地中のFCSの存在とは関係なく72時間処理した後、対照ウェル(図1で「対照」および図2で「陰性」と記す抗体不含)と比較して処理ウェル(抗体を伴う)中の細胞数の減少により反映される、U87グリア芽腫細胞の成長に及ぼす抑制効果を有する。モノクローナル抗体115F9およびポリクローナル抗体R667(示していない)は被験癌細胞の成長を阻害しなかった。モノクローナル抗体116F9をさらに2つのヒト骨肉腫細胞系MG63およびU2OSならびに1つのヒト悪性メラノーマ細胞系SK−MEL28培養下で試験した。
図2で示す結果により、モノクローナル抗体116F9は双方の骨肉腫細胞において成長抑制効果を有するが、メラノーマSK−MEL28細胞では有さないことが実証される。2つの被験骨肉腫細胞系はYKL−40の高い発現レベルを特徴とするが、一方SK−MEL28細胞系の発現レベルはあったとしても非常に低い。
これらの結果により、YKL−40に対するモノクローナル抗体(モノクローナル抗体116F9および201F9)はYKL−40発現癌細胞において成長抑制効果を有する。その効果は細胞成長および生存の阻害もしくはアポトーシスの誘導によるか、またはその双方によるものであろう。
実施例2.インビボでの抗ヒトYKL−40モノクローナル抗体による癌細胞成長の阻害
ヒトグリア芽腫U87細胞(4×106セル/腫瘍)をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が平均体積1000mm3に達したときに、マウスを各群10匹の3群に分けた。A群は40mg/kgモノクローナル抗体201F9腹腔内投与で処置1日目から、およびその後週2回処置した。B群は28mg/kgモノクローナル抗体116F9腹腔内投与で処置1日目から、およびその後週2回処置した。C群(対照)にはPBS(リン酸塩緩衝NaCl)を週2回腹腔内投与した。腫瘍サイズを毎日測定し、そして腫瘍サイズが体積100mm3に達したときにマウスを屠殺した。600mm3までの個々の腫瘍の成長に及ぼす処置の効果を図3(カプラン・マイヤー曲線)に示す。週2回のモノクローナル抗体201F9(40mg/kg)の注射によりPBS処置動物の腫瘍と比較してU87腫瘍の成長が低減されることを認めることができる(ログランク検定p<0.05)。これは2つの異なる処置期間、腫瘍が体積600mm3に達するまで、および体積900mm3に達するまで(示していない)の日数の場合である。図3はモノクローナル抗体116F9がPBS処置ヌードマウスの腫瘍の成長と比較して、U87腫瘍の成長に有意な阻害効果を有さなかったことを示している。しかしながら、116F9処置マウスは抗体201F9処置マウスと比較して低用量の抗体を投与され、そして高用量で投与された116F9は腫瘍成長に阻害効果を有し得ると推測することができる。
ヒトグリア芽腫U87細胞(4×106セル/腫瘍)をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が平均体積1000mm3に達したときに、マウスを各群10匹の3群に分けた。A群は40mg/kgモノクローナル抗体201F9腹腔内投与で処置1日目から、およびその後週2回処置した。B群は28mg/kgモノクローナル抗体116F9腹腔内投与で処置1日目から、およびその後週2回処置した。C群(対照)にはPBS(リン酸塩緩衝NaCl)を週2回腹腔内投与した。腫瘍サイズを毎日測定し、そして腫瘍サイズが体積100mm3に達したときにマウスを屠殺した。600mm3までの個々の腫瘍の成長に及ぼす処置の効果を図3(カプラン・マイヤー曲線)に示す。週2回のモノクローナル抗体201F9(40mg/kg)の注射によりPBS処置動物の腫瘍と比較してU87腫瘍の成長が低減されることを認めることができる(ログランク検定p<0.05)。これは2つの異なる処置期間、腫瘍が体積600mm3に達するまで、および体積900mm3に達するまで(示していない)の日数の場合である。図3はモノクローナル抗体116F9がPBS処置ヌードマウスの腫瘍の成長と比較して、U87腫瘍の成長に有意な阻害効果を有さなかったことを示している。しかしながら、116F9処置マウスは抗体201F9処置マウスと比較して低用量の抗体を投与され、そして高用量で投与された116F9は腫瘍成長に阻害効果を有し得ると推測することができる。
別の実験では、ヒトグリア芽腫U87細胞(8×106セル/腫瘍)をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が平均体積200mm3に達したときに、マウスを各群10匹の4群に分けた。A群およびC群は処置1日に8Gyの電離放射線(IR)を受けた。A群およびB群は40mg/kgモノクローナル抗体201F9腹腔内投与で処置1日目から、およびその後週2回処置した。D群(対照)にはPBS(リン酸塩緩衝NaCl)を週2回腹腔内投与した。腫瘍サイズを毎日測定し、そして腫瘍サイズが体積1000mm3に達したときにマウスを屠殺した。600mm3までの腫瘍の成長に及ぼす処置の効果を図4に示す。
図4で実証される結果により、電離放射線(IR)もまた腫瘍に有意な成長低減効果を有することが示され、それはモノクローナル抗体201Fの効果に匹敵する。モノクローナル抗体201F9およびIRでの同時処置はモノクローナル抗体およびIRの相乗効果には至らない。ログランク検定のP値を以下の表1にまとめる。
実施例3.モノクローナル抗体201F9に関するYKL−40エピトープマッピング
抗体201F9のヒトYKL−40(スイスプロット受け入れ番号:P36222;配列番号1)のペプチドフラグメントに対する結合を分析することによりエピトープマッピングを実施した。YKL−40配列の(8−14のアミノ酸残基の)381の重複ペプチドフラグメントのペプチドライブラリーを合成し、そしてペプスキャンシステムBV(オランダ)により201F9抗体に対する結合能力に関してスクリーニングした。
抗体201F9のヒトYKL−40(スイスプロット受け入れ番号:P36222;配列番号1)のペプチドフラグメントに対する結合を分析することによりエピトープマッピングを実施した。YKL−40配列の(8−14のアミノ酸残基の)381の重複ペプチドフラグメントのペプチドライブラリーを合成し、そしてペプスキャンシステムBV(オランダ)により201F9抗体に対する結合能力に関してスクリーニングした。
アミノ酸残基81−105、127−165、203−223、279−292、300−316および318−335を含むYKL−40の部分に及ぶペプチドのいくつかの群が有意な結合を実証した。これらのデータおよびこれらのペプチドフラグメントを含むYKL−40の構造部分の分析に基づいて、ペプチドの新しい群が設計され、合成され、そして抗体結合に関してスクリーニングされた。新しいペプチドはYKL−40タンパク質のループ構造のペプチド配列の位置を考慮して望ましいように設計された。
残基83−90(配列番号2)、96−105(配列番号3)、137−150(配列番号4)、210−220(配列番号5)、304−314(配列番号6)および318−329(配列番号7)に及ぶ6個のペプチドが抗体201F9に関して可能な抗原性決定基/エピトープとして同定された。図5はYKL−40の構造におけるペプチドの位置を実証する。ペプチドフラグメントの配列をアラインし、そして配列番号2、3、4、5、6および7の配列が相同性を共有すると思われた。表2(以下では)配列をアラインし、そしてアミノ酸残基の相同性を同一のアミノ酸残基を指す太字で、および相同アミノ酸残基に太線を付して示す。
YKL−40の残基210−220(配列番号5)および137−150(配列番号4)に相当する配列内に位置するアミノ酸残基はYKL−40リガンド/受容体結合に関与することが以前に示されている(Houstonら、J Biol Chem 278:30206−30212(2003)およびFusettiら、J Biol Chem 278:37753−37760(2003))。本データにより、配列は抗体201F9に関する抗原性決定基をも含むことが実証される。抗体によるこれらの残基の占有はYKL−40の生物学的活性を阻害し、そしてしたがって癌細胞の成長の阻害に至る。
Claims (68)
- YKL−40上のエピトープへの結合の際に細胞の成長、分化を阻害し、そして/またはアポトーシスを誘起することができる、ヒトYKL−40(配列番号1)に特異的である抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が、配列番号1として同定されるヒトYKL−40の配列の残基83〜90、96〜105、137〜150、210〜220、304〜314および/または318〜329を含むエピトープを特異的に認識し、そしてそれに結合することができる、請求項1に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が、配列番号1の残基210〜220を含むエピトープを特異的に認識し、そしてそれに結合することができる、請求項2に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記結合フラグメントまたはその組換えタンパク質が、配列番号1の残基210〜220のいずれかから選択される3から6個のアミノ酸残基からなるエピトープを特異的に認識し、そしてそれに結合することができる、請求項3に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗体が抗体115F9、116F9または201F9からなる群から選択される、請求項6に記載の抗体。
- 前記抗体が抗体201F9である、請求項7に記載の抗体。
- 前記抗原結合フラグメントが、請求項2〜8のいずれかに記載の抗体から誘導される、請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 前記抗原結合フラグメントが、Fab、F(ab’)2、またはFvである、請求項9に記載の抗体。
- 前記組換えタンパク質が、請求項2〜8のいずれかに記載の抗体の可変領域を含むsFv、ヒト抗体、ヒト化抗体または組換えタンパク質である、請求項1〜8に記載の抗体。
- 前記細胞が癌細胞である、請求項1に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記癌細胞が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌のものである、請求項12に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 癌細胞が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の転移性癌のものである、請求項12に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記細胞が内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージおよびその他の血液細胞、肝星細胞から選択される、請求項1に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 配列番号1として同定されるヒトYKL−40の配列の3〜8個のアミノ酸残基を本質的に含むエピトープであって、該アミノ酸残基が該配列の残基83〜90、96〜105、137〜150、210〜220、304〜314および/または318〜329から選択される、エピトープ。
- 前記エピトープが配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6もしくは配列番号7として同定される配列または該配列のフラグメントもしくはバリアントから選択される配列を含む、請求項16に記載のエピトープ。
- 前記エピトープが請求項1〜11のいずれかに記載の抗体により認識される、請求項16および請求項17に記載のエピトープ。
- 前記エピトープが配列番号2〜配列番号7のいずかの配列から選択される2つまたはそれより多い配列のアミノ酸残基を含む、請求項18に記載のエピトープ。
- 前記エピトープが配列番号2〜配列番号7のいずれかの配列の1つもしくはそれより多いフラグメントを含む、請求項19に記載のエピトープ。
- 前記エピトープがYKL−40受容体に対するYKL−40の結合部位、または該結合部位の一部であり、該結合部位が細胞成長、分化および/または細胞生存の刺激に依存するYKL−40に関与する、請求項16〜20のいずれかに記載のエピトープ。
- 前記細胞が請求項13〜15で規定されるいずれかの細胞から選択される、請求項19に記載のエピトープ。
- 前記エピトープがYKL−40の配列(配列番号1)内に位置する、請求項16〜22のいずれかに記載のエピトープ。
- YKL−40がスイスプロット受け入れ番号:P36222で同定されるようなヒトYKL−40である、請求項16〜23のいずれかに記載のエピトープ。
- ヒトYKL−40上のエピトープに結合することができる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質であって、該エピトープが請求項2〜8のいずれかに記載の抗体により認識される、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 前記エピトープが請求項15〜24のいずれかに規定されるようなものである、請求項25に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
- 配列番号2〜配列番号7として同定されるいずれかの配列または該配列のフラグメントもしくはバリアントから選択される少なくとも1つの配列を含む、ペプチドフラグメント。
- 前記ペプチドフラグメントが配列番号2〜配列番号7として同定されるいずれかの配列または該配列のフラグメントもしくはバリアントから選択される少なくとも1つの配列からなる、請求項27に記載のペプチドフラグメント。
- 前記ペプチドフラグメントが配列番号1として同定される配列の一部である、請求項27または28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記ペプチドフラグメントが3〜200個のアミノ酸残基からなる、請求項27または29に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが5〜65個のアミノ酸残基からなる、請求項30に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが8〜15個のアミノ酸残基からなる、請求項27−31に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質に結合することができ、該抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が請求項1〜11で規定される、請求項27〜32のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが細胞成長、分化および/または細胞生存に依存するYKL−40の刺激に関与する結合部位でYKL−40受容体に結合することができる、請求項27〜32に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが細胞成長、分化および/または細胞生存に依存するYKL−40を刺激することができる、請求項33または34に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが細胞成長、分化および/または細胞生存に依存するYKL−40を阻害することができる、請求項33または34に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが配列LKNRNPNL(配列番号2)からなる、請求項28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが配列VGGWNFGSQR(配列番号3)からなる、請求項28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが配列LAWLYPGRRDKQHF(配列番号4)からなる、請求項28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが配列GAWRGTTGHHS(配列番号5)からなる、請求項28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが配列RGATVHRTLGQ(配列番号6)からなる、請求項28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが配列YATKGNQWVGY(配列番号7)からなる、請求項28に記載のペプチドフラグメント。
- 前記フラグメントが請求項1〜11または25〜26で規定されるような抗体により認識できるエピトープを含有する免疫原性ペプチドフラグメントである、請求項27〜42のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
- 請求項1〜15および/または24〜25で規定される抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が細胞成長、分化および/または細胞生存を阻害するためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
- 望ましくない細胞成長、細胞分化、細胞生存、細胞外マトリックスリモデリング、線維症、血管形成、炎症および転移の存在を特徴とする病理学的状態の進行の防止および/またはその状態の処置のための医薬の製造のための、請求項1〜15および/または24〜25のいずれかに記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
- 前記病理学的状態が固形癌、もしくは血液学的悪性腫瘍、炎症性疾患または細胞外組織リモデリングの亢進および/もしくは線維症の発達に関連する疾患から選択される、請求項45に記載の使用。
- 前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌から選択される原発性癌である、請求項45に記載の使用。
- 前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の転移性癌から選択される転移性癌である、請求項46に記載の使用。
- 炎症性疾患が関節リウマチ、細菌感染、活動性炎症性腸疾患、炎症性疾患、肝臓線維症、器官線維症、組織線維症および皮膚線維症から選択される、請求項46に記載の使用。
- 前記肝臓線維症がB型もしくはC型肝炎ウイルスまたはアルコール依存症に起因する、請求項49に記載の使用。
- 細胞成長、分化および/または生存を刺激または阻害するための、請求項24〜37のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
- 前記ペプチドフラグメントが細胞成長、分化および/または生存を刺激するために使用される、請求項51に記載の使用。
- 前記ペプチドフラグメントが細胞成長、分化および/または生存を阻害するために使用される、請求項51に記載の使用。
- 請求項1〜11および/または請求項24〜25に規定されるような抗体の生成のための、請求項27〜3のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
- 望ましくない細胞成長、分化または強化された細胞生存の存在を特徴とする病理学的状態の処置のための医薬の製造のための、請求項27〜43のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
- 前記医薬が腫瘍、癌、血液学的悪性腫瘍、線維症および/または炎症性疾患の進行の防止および/または処置のためである、請求項55に記載の使用。
- 前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌から選択される原発性癌である、請求項56に記載の使用。
- 前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部/頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌からのような任意の転移性癌から選択される転移性癌である、請求項56に記載の使用
- 前記炎症性疾患が関節リウマチ、強直性脊椎炎、巨細胞性動脈炎、サルコイドーシス、細菌感染、活動性炎症性腸疾患、B型もしくはC型肝炎ウイルスまたはアルコール依存症により引き起こされる肝臓線維症または組織線維症および器官線維症から選択される、請求項56に記載の使用。
- 細胞の成長、分化および/または生存の阻害が治癒に必要である病理学的状態の処置のための医薬の製造のための、請求項27〜43のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
- 前記細胞が内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球/マクロファージもしくはその他の血液細胞または癌細胞から選択される、請求項60に記載の使用。
- 抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が、請求項1〜11および/もしくは24〜25で規定され、そして/または請求項24〜37のいずれかに記載のペプチドフラグメントが非腫瘍細胞の増殖の阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
- 抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が請求項1〜14および/もしくは22〜23で規定され、そして/または請求項27〜43のいずれかに記載のペプチドフラグメントが血管形成の阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
- 抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が請求項1〜14および/もしくは22〜23で規定され、そして/または請求項24〜37のいずれかに記載のペプチドフラグメントが細胞外マトリックスリモデリングの阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
- 抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が請求項1〜14および/もしくは22〜23で定義され、そして/または請求項27〜43のいずれかに記載のペプチドフラグメントが線維症の阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
- 請求項1〜11および/または請求項24〜25のいずれかに記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む医薬組成物。
- 請求項27〜43のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む医薬組成物。
- 請求項1〜11および/もしくは24〜25のいずれかに記載の抗体、ならびに/または請求項27〜43のいずれかに記載のペプチドフラグメントまたは請求項67に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌ならびに/または炎症性疾患および線維性疾患を処置するための方法。
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