发明内容
基于上述发现,本发明的首要目的在于提供一种通过联合检测样本中YKL40和MASP2蛋白来提高样本分类准确性的方法。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测样本中YKL40和MASP2蛋白的试剂盒。
本发明的又一目的在于提供一种通过联合检测样本中癌症高表达蛋白和组织或器官特异表达蛋白来提高样本分析敏感度的方法。
本发明的再一目的在于提供一种用于检测样本中癌症高表达蛋白和组织或器官特异表达蛋白的试剂盒。
为实现上述目的,本发明采用如下技术手段:
一种提高样本分类准确性的方法,其特征在于,联合检测样本中的蛋白YKL-40和MASP2。
上述联合检测包括:
(1)检测样本中YKL-40和MASP2的含量;
(2)对测得的YKL-40和MASP2含量进行数学分析;以及
(3)根据数学分析结果,对测定样本进行分类。
一种上述方法在疾病包括癌症的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测中的应用。
一种用于检测样本中YKL40和MASP2蛋白的试剂盒,其包含:
(1)能够结合YKL40和MASP2的抗体;以及
(2)当YKL40和/或MASP2结合于(1)中限定的抗体时,能够结合于YKL40和MASP2的标记抗体。
一种提高个体癌症检测敏感度的方法,包括:
(1)测试个体样本内癌症高表达的蛋白含量;
(2)测试个体样本内特定组织或器官特异表达的蛋白含量;
(3)对测得的样本内癌症高表达蛋白含量和组织或器官特异表达的蛋白含量进行数学分析;以及
(4)根据数学分析结果,将个体分为癌症或健康。
一种用于检测样本中癌症高表达蛋白和组织或器官特异表达蛋白的试剂盒,其包含:
(1)能够结合癌症高表达蛋白和组织或器官特异表达蛋白的抗体;以及
(2)当癌症高表达的蛋白和/或组织或器官特异表达蛋白结合于(1)中限定的抗体时,能够结合于癌症高表达蛋白和组织或器官特异表达蛋白的标记抗体。
研究表明,采用本发明的方法及试剂盒对个体的样本中蛋白YKL40和MASP2进行联合检测,可以有效提高癌症诊断的灵敏度、特异性和准确率,并且可以推广至许多疾病的诊断、预后评估、治疗效果评估及病程监测。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
众所周知,当个体开始罹患癌症、或处于癌症临床阶段时,癌症病毒或癌症基因会高表达,这种高表达的蛋白比如YKL-40可以作为癌症的生物标志物;另一方面,该个体的有关组织或器官功能会下降,致使在该组织或器官中特异表达的蛋白、比如在肝脏中特异表达的MASP2的表达水平降低,因此组织或器官特异表达蛋白的低表达水平同样具有用作癌症生物标志物的潜力。本领域技术人员熟知,单一生物标志物的测试有时会造成假阳性或假阴性的增加,降低了测试的准确率。因此,同时测试个体样本内癌症高表达的蛋白比如YKL-40含量和特定组织或器官特异表达的蛋白比如在肝脏中特异表达的MASP2低表达水平,即,在原有的配对标记物的基础上进一步增加新标记物以提高检测敏感度,将会提高癌症测试的敏感度,这已在下述的实施例中得以验证。
毫无疑问,本发明提高个体癌症检测敏感度的方法及相关试剂盒可以应用于各种癌症和器官病变的诊断、预后评估、治疗效果评估及病程监测。
比如,以血液样本的联合检测为例,针对某一特定组织或器官的癌症或疾病的应用,其包括如下步骤:测定个体血液样本中癌症或疾病高表达的蛋白或基因;测定特定组织或器官特异的蛋白或基因在血液中的低表达;对测得的蛋白含量或基因表达结果进行数学分析;以及根据数学分析结果,对测定个体样本进行分类,做出癌症或疾病的诊断结果。这种结果可分为:健康、癌症或疾病前期、癌症或疾病中期、癌症或疾病晚期等。
应理解,本说明书中术语“联合检测”的含义为:不仅包括检测样本中特定蛋白的含量;还可以包括对测得的蛋白含量进行数学分析;并且还可以进一步包括根据数学分析结果,对测定样本进行分类。
ELISA
本发明使用ELISA技术对个体的样本进行癌症高表达蛋白比如YKL40和组织或器官特异表达蛋白比如MASP2的检测。
酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)上分子生物学领域常用的蛋白质含量分析方法,其可用于测定抗原,也可用于测定抗体。根据试剂的来源、样本的性状以及检测的具备条件,本发明可以采用多种不同类型,比如:双抗体夹心法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法、捕获法测IgM抗体、以及应用亲和素和生物素的ELISA等。
试剂盒
本发明的ELISA优选使用试剂盒完成,这样可以实现快捷操作,从而避免常规实验检测的繁琐。本发明的ELISA试剂盒包括YKL40的免疫酶标试剂盒、MASP2免疫酶标试剂盒、YKL40和MASP2检测试剂盒。为提高疾病诊断的灵敏度、特异性和准确率,优选使用YKL40和MASP2检测试剂盒,其可以分别或同时测得两组检测结果,以达到快捷功效。
本发明的YKL40和MASP2检测试剂盒至少包含:
(1)能够结合YKL40和MASP2的抗体;以及
(2)当YKL40和/或MASP2结合于(1)中限定的抗体时,能够结合于YKL40和MASP2的标记抗体。
上述试剂盒还可包含:
(3)由含有已知量YKL40和MASP2的溶液组成的标准样,该标准样可以来源于基因工程菌表达、动物或人的体液;以及
(4)用于检测的抗体标记物,例如,作为报告方法的酶标签比如辣根过氧化物酶,或者荧光标记,其可以与抗体结合形成偶联物。
更有选试剂盒还可进一步包括下属物品中的至少之一:(5)携带工具,其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间,该容器例如是药瓶、试管、和类似物,每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分;(6)辅助试剂,比如,显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂以及类似物;(7)说明书,其可以写在瓶子、试管和类似物上,或者写在一张单独的纸上,或者在容器的外部或内部;也可以是多媒体的形式,比如CD、电脑光盘、录像等等。
优选抗体可以固定于固相载体上,形成捕获抗体。
所含抗体包括任何能够结合YKL40和MASP2的抗体片段,并且可以是重组体、嵌合抗体、人源化抗体和鼠源性抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体,优选单克隆抗体。
优选抗体偶联物能够用ELISA阅读机,比如,酶标仪进行光度测定。
样本
本发明所用样本可以包含多种形式,比如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、或眼泪。其中优选血清。
样本制备可根据普通方法比如离心等进行,例如,参见如下文献:Young,D.S.& Bermes,E.W.″Specimen collection and processing″in Tietz Textbook of Clinical Chemistry 2nd Edition″Eds.Burtis,C.A.& Ashwood,E.R.,Saunders(1994);Methods in Enzymology,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds),1981,72(B);Practice and Theory of Enzyme Immunoassays,P Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,R.J.Burden and P.H.VanKnippenberg(Eds),Elsevier,1985;Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques,T.Chard,ibid,3rd Edition,1987;Methods in Enzymology,H.Van Vunakis and J.J.Langone(Eds)1981,74(C)。
ROC曲线
在用ELISA检测出样本中癌症高表达蛋白比如YKL40和组织或器官特异表达蛋白比如MASP2的浓度后,可用数学分析方法对测得的样本中癌症高表达蛋白比如YKL40和组织或器官特异表达蛋白比如MASP2浓度进行统计学处理,在此基础上获得具有样本分类意义的分级标准。这样的数学方法优选由计算机完成,比如用这些数据绘制ROC曲线,从而对个体的样本进行分类。
ROC曲线全称为受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve),又称为接收者操作特性曲线,主要用于临床生化诊断试验。ROC曲线是反映真阳性率(灵敏度,又称敏感性,sensitivity)和假阳性率(1-特异性,specificity)连续变量的综合指标,是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的的分界值(阈值或临界值,cut-offvalue,是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量,从而计算出一系列灵敏度和特异性,再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线,曲线下面积(AUC)越大,诊断准确性越高。在ROC曲线上,最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。ROC曲线AUC值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下,AUC越接近于1,说明诊断效果越好。AUC在0.5~0.7时有较低准确性,AUC在0.7~0.9时有一定准确性,AUC在0.9以上时有较高准确性。
ROC曲线的评价方法与传统的评价方法不同,根据实际情况,允许有中间状态,可以把试验结果分为多个有序分类,比如:正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级。
上述有序分类,对于疾病的诊断而言,可分为:阴性、不确定、阳性。进一步地,对于癌症诊断而言,可分为:癌症、健康。
因此,以检测样本中蛋白YKL40和MASP2为例,本发明提高样本分类准确性的方法,可以包括如下步骤:
(1)分别测定样本中蛋白YKL-40和MASP2的含量;
(2)以YKL40与MASP2蛋白含量的比值为变量,根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线,并计算曲线下面积AUC;以及
(3)按照期望的灵敏度和特异性,对测定样本进行分类(癌症或健康)。
ROC曲线的绘制可以使用现有技术领域的软件或系统,比如:MedCalc 9.2.0.1医学统计软件、SPSS 9.0、ROCPOWER.SAS、DESIGNROC.FOR、MULTIREADER_POWER.SAS、CREATE_ROC.SAS、GB STAT V10.0(Dynamic Microsystems,Inc.Silver Spring,MD,USA)等等。
肝癌的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测
本发明在医学领域的具体应用,主要体现在肝癌的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测方面,包括操作方法以及实现该方法的器具—试剂盒。众所周知,肝炎的病程与肝癌转化密切相关,典型的病程为:肝炎(比如乙肝、丙肝)→肝硬化→肝癌。本发明人的研究发现,肝炎病毒的表达也可以作为肝癌检测的生物标志,其与YKL40和MASP2的表达结合起来,进行联合检测可以显著提高肝癌诊断的成功率。因此,本发明还提供了一种用于肝癌的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测的方法,其包括:检测个体血液样本中肝炎病毒的表达;检测个体血液样本中YKL40和MASP2的表达;对测得的肝炎病毒表达水平和YKL40和MASP2的表达水平进行数学分析;以及根据数学分析结果,对测定血液样本进行分类,做出肝癌的判断结果。这种结果可分为:肝癌前期、肝癌中期、肝癌晚期等。
其中,肝炎病毒的表达可以采用本技术领域标准的方法进行,比如标准的血样检测试纸法、血样检测试剂盒法,以及常规的血样化验方法,等等。
显而易见,将血液样本中肝炎病毒表达、YKL40和MASP2的表达整合在一个试剂盒中检测,将会带来肝癌检测的便利性、时效性、经济性。因此,本发明还提供了一种用于肝癌的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测的联合测试试剂盒,其至少包含:(1)能够结合肝炎病毒、YKL40和MASP2的抗体;以及(2)当肝炎病毒和/或YKL40和/或MASP2结合于(1)中限定的抗体时,能够结合于肝炎病毒和/或YKL40和MASP2的标记抗体。优选试剂盒还包含:(3)由含有已知量肝炎病毒、YKL40和MASP2的溶液组成的标准样,该标准样可以来源于基因工程菌表达、动物或人的体液;以及(4)用于检测的抗体标记物,例如,作为报告方法的酶标签比如辣根过氧化物酶,或者荧光标记,其可以与抗体结合形成偶联物。
以下以个体的血清为样本进行肝癌诊断为例,对本发明作进一步详细说明。
实施例1
样本的采集
在浙江大学医学院一附院随机采取25例50-60岁肝癌患者的血清1mL;作为阳性对照,另采取15例50-60岁健康志愿者的正常血样1mL,进行YKL40和MASP2浓度测试。
测YKL-40含量
根据厂商的指导,使用Quidel公司(San Diego,CA,美国)的YKL-40试剂盒、并且使用Bio-Rad 680型酶标仪(美国)进行ELISA操作,包括:
1、取出冷藏储存的试剂盒,放置,恢复温度至室温(20-25℃)。计算要检测的标本总数和质控数。每个标本需要一个抗原包被孔。每次实验都要做阳性对照、阴性对照和校准品。确定需要的微孔数量。当板条温度至室温时,打开板条的保护袋,拿出抗原包被的微孔板条。本次实验不需要使用的试剂条应放入这个可重新密封的袋子,密封,重新存放在2-8℃。
2、依次在微孔板上加入20μL的标准液、对照液和血清样本。此过程务必在三十分钟内完成。
3、在每个微孔中加入100μL的捕获液,用移液器在孔中反复吹打进行混匀。
4、用微孔板盖盖好板,在室温下(18-25℃)进行温育55-65分钟。
5、按下述步骤手工洗板3次:
A、剧烈摇动并倒掉板中的液体;
B、在孔中加满洗液。保证孔中无残余气泡。
C、再重复前两步骤两次。
D、摇动并去除孔中的洗液。把板翻转,在纸巾上轻拍,以便能拍干所有洗液。观察微孔板,确保无残留的洗液。
6、在酶标抗体复合物的瓶子里加入7mL的再生缓冲液,存放于室温下待用。
7、按照同样的次序把稀释好的酶复合物加100μL到微孔板上
8、用微孔板盖盖好板,在室温下(18-28℃)进行温育55-65分钟。
9、配制底物,在底物缓冲液中加入一片底物固体,30-60分钟后溶解,强烈摇晃,使溶液完全混合。
10、按照步骤5中A到D的方法进行洗板。
11、以同样的速度和次序把底物液加100μL到每孔中。
12、微孔板在室温下(18-28℃)进行温育55-65分钟。
13、以同样的速度和次序在每个孔中加入100μL的终止液。加了终止液后应轻轻敲打微孔板,确保样品全部混匀。
14、设置酶标仪的检测波长在405nm处。检测每个孔的OD值。应在加了终止液的15钟之内进行读数。
15、用一线性校准曲线“Y=mx+b”来分析YKL-40或MASP2的结果。
16、通过标准曲线来读出血清样本和对照液中YKL-40或MASP2的浓度。
结果
经上述步骤,得到的检测结果如表1所示。
表1
由表1可以看出,YKL-40的浓度与肝癌症状有密切的相关性,即,肝癌患者血清中YKL-40蛋白的含量明显高于健康志愿者血清中的含量。
ROC曲线绘制
使用GB STAT V10.0(Dynamic Microsystems,Inc.Silver Spring,MD USA)系统,以YKL-40蛋白含量为变量,根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线,并计算曲线下面积AUC;绘制出ROC曲线并计算曲线下面积(AUC),如图1所示。
图1显示,ROC曲线的AUC为0.98。当YKL-40浓度的阈值为0.87(ng/mL)时,诊断肝癌的灵敏度为0.92(即92%),1-特异性为0.87(即87%),诊断肝癌的成功率为0.9(即90%)。
实施例2
测MASP2含量
采用与实施例1项类似的步骤,不同之处在于:根据厂商的指导,使用荷兰Hycult生物技术公司(Uden,荷兰)的MASP2试剂盒进行ELISA操作,检测血清样本中MASP2蛋白的浓度。结果如表1所示。
由表1可以看出,MASP2的浓度也与肝癌症状有密切的相关性,即,肝癌患者血清中MASP2蛋白的含量明显低于健康志愿者血清中的含量。
ROC曲线绘制
使用GB STAT V10.0系统,以MASP2蛋白含量为变量,根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线,并计算曲线下面积(AUC),如图2所示。
图2显示,当MASP2浓度的阈值为292.9ng/mL时,诊断肝癌的灵敏度为0.87,1-特异性为0.77,实际诊断肝癌的成功率为0.8。
实施例3
结合使用YKL40和MASP2,即,使用GB STATV10.0系统,以YKL40和MASP2蛋白含量的比值为变量,根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线,绘制出ROC曲线并计算曲线下面积AUC,如图3所示。
图3显示,当阈值为12.57(比值)时,诊断的灵敏度为100%,实际诊断肝癌的成功率为90%。大大高于目前常用的甲胎蛋白检测成功率(基本为70%)。
另外,通过图3与图1和2的比较可以看出,当阈值为12.57时,联合检测YKL40和MASP2时的肝癌诊断的灵敏度高于使用任何一种单一标记物(结合使用时的灵敏度为1,使用单一YKL40或MASP2时灵敏度分别为0.92和0.87),实际诊断肝癌的成功率为0.9。
虽然以上以各自独立的YKL40或MASP2试剂盒进行ELISA操作,以肝癌诊断为例,绘制出联合检测YKL40和MASP2的ROC曲线,对本发明的技术方案进行了阐述,但是根据本发明的公开,本发明的方法毫无疑问可以推广至其他一些疾病的诊断、预后评估、治疗效果监测及病情发展监测,这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。因此,在不违背本发明的思想下,本领域技术人员可以在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改,同样应属于本发明的范围。