JP4801930B2 - 新規肝がんバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた肝がんの検出方法 - Google Patents
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[1] 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノーゲンα鎖、配列番号3で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノペプチドA like、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなる補体C4A、配列番号7で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター、配列番号9で表されるアミノ酸配列からなるゲルソリン、配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるアポリポプロテインA1、配列番号13で表されるアミノ酸配列からなるα2マクログロブリン、配列番号15で表されるアミノ酸配列からなるα1アンチトリプシン、配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノーゲンα鎖の部分ペプチド、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるフィブリノペプチドA likeの部分ペプチド、配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる補体C4Aの部分ペプチド、配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチド、配列番号10で表されるアミノ酸配列からなるゲルソリンの部分ペプチド、配列番号12で表されるアミノ酸配列からなるアポリポプロテインA1の部分ペプチド、配列番号14で表されるアミノ酸配列からなるα2マクログロブリンの部分ペプチド、配列番号16で表されるアミノ酸配列からなるα1アンチトリプシンの部分ペプチド、配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つのタンパク質またはペプチドからなる肝がん検出のための肝がんバイオマーカー。
[4] 配列番号2、6、8、14、16および17からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるペプチドである、肝がん患者生体試料中において、正常人生体試料中と比較し出現または増加する肝がんバイオマーカー。
[6] 生体試料中の[1]〜[5]のいずれかの少なくとも1つの肝がんバイオマーカーを測定することを含む、肝がんの検出方法。
[8] 生体試料中の[5]の少なくとも1つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して少なく存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
[10] 配列番号1〜17からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質およびペプチド群の少なくとも1つを測定するための肝がんの検出キット。
[12] 配列番号1〜17からなる群から選択される配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質およびペプチド群の少なくとも1つに対する抗体もしくはアプタマーを含む肝がんの検出キット。
[14] 抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている[12]または[13]の検出キット。
[17] 検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる[15]または[16]の肝がんの検出方法。
1.酵素免疫吸着測定法(ELISA)
特定のインタクトなタンパク質とその部分ペプチドに対する抗体をあらかじめ特殊な化学修飾をしたマイクロタイタープレート等の担体に結合させる。結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。使用する抗体は(1)特定のタンパク質の完全長のみを認識する抗体、(2)部分ペプチドのみを認識する抗体、(3)特定のタンパク質とその部分ペプチドの両方を認識する抗体のすべて、または上記(1)と(2)、(1)と(3)、もしくは(2)と(3)の組み合わせでもよい。試料を原液または緩衝液で段階希釈後、抗体を結合させたマイクロタイタープレートにこれを適当量加え、インキュベーションする。その後洗浄し、捕捉されなかったタンパク質および部分ペプチドを除く。次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた2次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測することによって評価判定を行う。
マイクロアレイとは、担体(基板)上に測定しようとする物質に結合し得る物質を整列(アレイ)固定化させたデバイスを総称していう。本発明の場合、上記1のように、インタクトなタンパク質および部分ペプチドに対する抗体またはアプタマーを整列固定化させて用いればよい。マイクロアレイの担体としては、スライドガラス、ニトロセルロース膜等種々のものを用いることができる。固定化は、上記1の場合と同様に行うこともできるが、市販のマイクロアレイヤーやスポッターを用いることにより容易に行うことができる。マイクロアレイ法においては、固相化量は少なくてすみ、測定しようとするタンパク質濃度もフェクトモルオーダーで足りる。また、一枚の担体の上に数百から数万の物質を整列固定化することが可能であるので、測定しようとするタンパク質および部分ペプチドの種類および量が多い場合に適している。測定は、上記1と同様に、固相化した抗体等に、生体試料を添加し、マイクロアレイ上に測定しようとするタンパク質または部分ペプチドを結合させ、次に蛍光もしくは化学発光物質または酵素を結合させた2次抗体を加えインキュベーションする。検出はそれぞれの基質を加えた後、蛍光もしくは化学発光物質または酵素反応による可視光を計測すればよい。
タンパク質および分解産物ペプチド等の部分ペプチドを質量分析計を用いた質量分析法により解析することもできる。質量分析計は、試料導入部、イオン化室、分析部、検出部、記録部等を含む。イオン化法としては電子衝撃イオン化(EI)法、化学イオン化(CI)法、フィールドデソープション(FD)法、二次イオン化(SIMS)法、高速原子衝突(FAB)法、matrix-assisted laser desorption ionization(MALDI)法、エレクトロスプレーイオン化(ESI)法等を用いればよい。また、分析部は、二重収束質量分析計、四重極型質量分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計等が用いられる。
(1)方法
肝がん患者および健常人から得た血清タンパク質100μgをそれぞれ以下のような二次元電気泳動にて解析した。
本方法において、およそ500のタンパク質由来スポットが検出された。図1が肝がん患者(HCC)由来の血清タンパク質のパターンであり、図2が健常人由来のものである。図中丸で囲んだものは肝がん患者において検出されなかった血清タンパク質である。そのうち、Aはα-1 アンチトリプシンであり、Bはハプトグロビンである。この結果はα-1 アンチトリプシンならびにハプトグロビンが肝がん患者血清において消失していることを示している。
(1)方法
健常人および肝がん患者の血清25μlの各々に475μlの0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を加え、100℃で15分間煮沸した。その後、分子量1万以下のペプチドを回収するためにミリポア社YM-10を用いて限外ろ過をおこなった。回収サンプルを二次元HPLC(SCX陽イオン交換ならびにC18逆相カラム)を用いて1サンプルあたり1,140に分画した。分画されたすべてのサンプルはオンラインで接続されたスポッティングロボット(AccuSpotと命名)を用いて質量分析機(AXIMA CFR plus)サンプル台上にスポットし、マトリックス溶液(α-シアノ-ヒドロキシケイ皮酸, CHCA)を混合して共結晶化後にレーザーを照射しリフレクトロンモードで質量を自動測定した。健常人コントロールと肝がん患者サンプルとの発現差異ペプチドの検出は、我々が開発したソフト、ディファレンシャルディスプレイビューワー(Differential Display Viewer)を用いておこなった。発現量に差異の認められたペプチドは、そのまま質量分析機AXIMA QITでMS/MSならびにMSのn乗解析にてアミノ酸配列を決定し、由来タンパク質を同定した。
上記2D-LC MALDI-TOF/MS法を用いて、健常人および肝がん患者血清由来ペプチドを網羅的に差異解析した結果、疾患特異的に検出された、あるいは検出されなかったペプチド断片が以下のように同定された。
インタクトタンパク質
001 MFSMRIVCLV LSVVGTAWTA DSGEGDFLAE GGGVRGPRVV ERHQSACKDS
051 DWPFCSDEDW NYKCPSGCRM KGLIDEVNQD FTNRINKLKN SLFEYQKNNK
101 DSHSLTTNIM EILRGDFSSA NNRDNTYNRV SEDLRSRIEV LKRKVIEKVQ
151 HIQLLQKNVR AQLVDMKRLE VDIDIKIRSC RGSCSRALAR EVDLKDYEDQ
201 QKQLEQVIAK DLLPSRDRQH LPLIKMKPVP DLVPGNFKSQ LQKVPPEWKA
251 LTDMPQMRME LERPGGNEIT RGGSTSYGTG SETESPRNPS SAGSWNSGSS
301 GPGSTGNRNP GSSGTGGTAT WKPGSSGPGS TGSWNSGSSG TGSTGNQNPG
351 SPRPGSTGTW NPGSSERGSA GHWTSESSVS GSTGQWHSES GSFRPDSPGS
401 GNARPNNPDW GTFEEVSGNV SPGTRREYHT EKLVTSKGDK ELRTGKEKVT
451 SGSTTTTRRS CSKTVTKTVI GPDGHKEVTK EVVTSEDGSD CPEAMDLGTL
501 SGIGTLDGFR HRHPDEAAFF DTASTGKTFP GFFSPMLGEF VSETESRGSE
551 SGIFTNTKES SSHHPGIAEF PSRGKSSSYS KQFTSSTSYN RGDSTFESKS
601 YKMADEAGSE ADHEGTHSTK RGHAKSRPVR GIHTSPLGKP SLSP(配列番号1)
GSESGIFTNTKESSSHHPGIAEFPSRG(配列番号2)
インタクトタンパク質
001 MFSMRIVCLV LSVVGTAWTA DSGEGDFLAE GGGVRGPRVV ERHQSACKDS
051 DWPFCSDEDW NYKCPSGCRM KGLIDEVNQD FTNRINKLKN SLFEYQKNNK
101 DSHSLTTNIM EILRGDFSSA NNRDNTYNRV SEDLRSRIEV LKRKVIEKVQ
151 HIQLLQKNVR AQLVDMKRLE VDIDIKIRSC RGSCSRALAR EVDLKDYEDQ
201 QKQLEQVIAK DLLPSRDRQH LPLIKMKPVP DLVPGNFKSQ LQKVPPEWKA
251 LTDMPQMRME LERPGGNEIT RGGSTSYGTG SETESPRNPS SAGSWNSGSS
301 GPGSTGNRNP GSSGTGGTAT WKPGSSGPGS TGSWNSGSSG TGSTGNQNPG
351 SPRPGSTGTW NPGSSERGSA GHWTSESSVS GSTGQWHSES GSFRPDSPGS
401 GNARPNNPDW GTFEEVSGNV SPGTRREYHT EKLVTSKGDK ELRTGKEKVT
451 SGSTTTTRRS CSKTVTKTVI GPDGHKEVTK EVVTSEDGSD CPEAMDLGTL
501 SGIGTLDGFR HRHPDEAAFF DTASTGKTFP GFFSPMLGEF VSETESRGSE
551 SGIFTNTKES SSHHPGIAEF PSRGKSSSYS KQFTSSTSYN RGDSTFESKS
601 YKMADEAGSE ADHEGTHSTK RGHAKSRPVR GIHTSPLGKP SLSP(配列番号3)
DSGEGDFLAEGGGV(配列番号4)
インタクトタンパク質
0001 MRLLWGLIWA SSFFTLSLQK PRLLLFSPSV VHLGVPLSVG VQLQDVPRGQ
0051 VVKGSVFLRN PSRNNVPCSP KVDFTLSSER DFALLSLQVP LKDAKSCGLH
0101 QLLRGPEVQL VAHSPWLKDS LSRTTNIQGI NLLFSSRRGH LFLQTDQPIY
0151 NPGQRVRYRV FALDQKMRPS TDTITVMVEN SHGLRVRKKE VYMPSSIFQD
0201 DFVIPDISEP GTWKISARFS DGLESNSSTQ FEVKKYVLPN FEVKITPGKP
0251 YILTVPGHLD EMQLDIQARY IYGKPVQGVA YVRFGLLDED GKKTFFRGLE
0301 SQTKLVNGQS HISLSKAEFQ DALEKLNMGI TDLQGLRLYV AAAIIEYPGG
0351 EMEEAELTSW YFVSSPFSLD LSKTKRHLVP GAPFLLQALV REMSGSPASG
0401 IPVKVSATVS SPGSVPEVQD IQQNTDGSGQ VSIPIIIPQT ISELQLSVSA
0451 GSPHPAIARL TVAAPPSGGP GFLSIERPDS RPPRVGDTLN LNLRAVGSGA
0501 TFSHYYYMIL SRGQIVFMNR EPKRTLTSVS VFVDHHLAPS FYFVAFYYHG
0551 DHPVANSLRV DVQAGACEGK LELSVDGAKQ YRNGESVKLH LETDSLALVA
0601 LGALDTALYA AGSKSHKPLN MGKVFEAMNS YDLGCGPGGG DSALQVFQAA
0651 GLAFSDGDQW TLSRKRLSCP KEKTTRKKRN VNFQKAINEK LGQYASPTAK
0701 RCCQDGVTRL PMMRSCEQRA ARVQQLDCRE PFLSCCQFAE SLRKKSRDKG
0751 QAGLQRALEI LQEEDLIDED DIPVRSFFPE NWLWRVETVD RFQILTLWLP
0801 DSLTTWEIHG LSLSKTKGLC VATPVQLRVF REFHLHLRLP MSVRRFEQLE
0851 LRPVLYNYLD KNLTVSVHVS PVEGLCLAGG GGLAQQVLVP AGSARPVAFS
0901 VVPTAAAAVS LKVVARGSFE FPVGDAVSKV LQIEKEGAIH REELVYELNP
0951 LDHRGRTLEI PGNSDPNMIP DGDFNSYVRV TASDPLDTLG SEGALSPGGV
1001 ASLLRLPRGC GEQTMIYLAP TLAASRYLDK TEQWSTLPPE TKDHAVDLIQ
1051 KGYMRIQQFR KADGSYAAWL SRDSSTWLTA FVLKVLSLAQ EQVGGSPEKL
1101 QETSNWLLSQ QQADGSFQDP CPVLDRSMQG GLVGNDETVA LTAFVTIALH
1151 HGLAVFQDEG AEPLKQRVEA SISKANSFLG EKASAGLLGA HAAAITAYAL
1201 TLTKAPVDLL GVAHNNLMAM AQETGDNLYW GSVTGSQSNA VSPTPAPRNP
1251 SDPMPQAPAL WIETTAYALL HLLLHEGKAE MADQAAAWLT RQGSFQGGFR
1301 STQDTVIALD ALSAYWIASH TTEERGLNVT LSSTGRNGFK SHALQLNNRQ
1351 IRGLEEELQF SLGSKINVKV GGNSKGTLKV LRTYNVLDMK NTTCQDLQIE
1401 VTVKGHVEYT MEANEDYEDY EYDELPAKDD PDAPLQPVTP LQLFEGRRNR
1451 RRREAPKVVE EQESRVHYTV CIWRNGKVGL SGMAIADVTL LSGFHALRAD
1501 LEKLTSLSDR YVSHFETEGP HVLLYFDSVP TSRECVGFEA VQEVPVGLVQ
1551 PASATLYDYY NPERRCSVFY GAPSKSRLLA TLCSAEVCQC AEGKCPRQRR
1601 ALERGLQDED GYRMKFACYY PRVEYGFQVK VLREDSRAAF RLFETKITQV
1651 LHFTKDVKAA ANQMRNFLVR ASCRLRLEPG KEYLIMGLDG ATYDLEGHPQ
1701 YLLDSNSWIE EMPSERLCRS TRQRAACAQL NDFLQEYGTQ GCQV
(配列番号5)
TLEIPGNSDPNMIPDGDFNSYVRVTASD (配列番号6)
インタクトタンパク質
001 MKPPRPVRTC SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF RPGVLSSRQL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR VMNMKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER RLDYQEGPPG VEISCWSVEL (配列番号7)
VPDHAAYHPF (配列番号8)
インタクトタンパク質
001 MAPHRPAPAL LCALSLALCA LSLPVRAATA SRGASQAGAP QGRVPEARPN
051 SMVVEHPEFL KAGKEPGLQI WRVEKFDLVP VPTNLYGDFF TGDAYVILKT
101 VQLRNGNLQY DLHYWLGNEC SQDESGAAAI FTVQLDDYLN GRAVQHREVQ
151 GFESATFLGY FKSGLKYKKG GVASGFKHVV PNEVVVQRLF QVKGRRVVRA
201 TEVPVSWESF NNGDCFILDL GNNIHQWCGS NSNRYERLKA TQVSKGIRDN
251 ERSGRARVHV SEEGTEPEAM LQVLGPKPAL PAGTEDTAKE DAANRKLAKL
301 YKVSNGAGTM SVSLVADENP FAQGALKSED CFILDHGKDG KIFVWKGKQA
351 NTEERKAALK TASDFITKMD YPKQTQVSVL PEGGETPLFK QFFKNWRDPD
401 QTDGLGLSYL SSHIANVERV PFDAATLHTS TAMAAQHGMD DDGTGQKQIW
451 RIEGSNKVPV DPATYGQFYG GDSYIILYNY RHGGRQGQII YNWQGAQSTQ
501 DEVAASAILT AQLDEELGGT PVQSRVVQGK EPAHLMSLFG GKPMIIYKGG
551 TSREGGQTAP ASTRLFQVRA NSAGATRAVE VLPKAGALNS NDAFVLKTPS
601 AAYLWVGTGA SEAEKTGAQE LLRVLRAQPV QVAEGSEPDG FWEALGGKAA
651 YRTSPRLKDK KMDAHPPRLF ACSNKIGRFV IEEVPGELMQ EDLATDDVML
701 LDTWDQVFVW VGKDSQEEEK TEALTSAKRY IETDPANRDR RTPITVVKQG
751 FEPPSFVGWF LGWDDDYWSV DPLDRAMAEL AA (配列番号9)
GLGLSYLSSHIANVERVPFD(配列番号10)
インタクトタンパク質
1 DEPPQSPWDR VKDLATVYVD VLKDSG (配列番号11)
アポリポプロテインA1由来ペプチド
DEPPQSPWDRVKDLATVYVD (配列番号12)
インタクトタンパク質
0001 MGLLMSRVQY RLESIWSPPA PSFCNMGKNK LLHPSLVLLL LVLLPTDASV
0051 SGKPQYMVLV PSLLHTETTE KGCVLLSYLN ETVTVSASLE SVRGNRSLFT
0101 DLEAENVVLH CVAFAVPKSS SNEEVMFLTV QVKGPTQEFK KRTTVMVKNE
0151 DSLVFVQTDK SIYKPGQTVK FRVVSMDENF HPLNELIPLV YIQDPKGNRI
0201 AQWQSFQLEG GLKQFSFPLS SEPFQGSYKV VVQKKSGGRT EHPFTVEEFV
0251 LPKFEVQVTV PKIITILEEE MNVSVCGLYT YGKPVPGHVT VSICRKYSDA
0301 SDCHGEDSQA FCEKFSGQLN SHGCFYQQVK TKVFQLKRKE YEMKLHTEAQ
0351 IQEEGTVVEL TGRQSSEITR TITKLSFVKV DSHFRQGIPF FGQVRLVDGK
0401 GVPIPNKVIF IRGNEANYYS NATTDEHGLV QFSINTTNVM GTSLTVRVNY
0451 KDRSPCYGYQ WVSEEHEEAH HTAYLVFSPS KSFVHLEPMS HELPCGHTQT
0501 VQAHYILNGG TLLGLKKLSF YYLIMAKGGI VRTGTHGLLV KQEDMKGHFS
0551 ISIPVKSDIA PVARLLIYAV LPTGDVIGDS AKYDVENCLA NKVDLSFSPS
0601 QSLPASHAHL RVTAAPQSVC ALRAVDQSVL LMKPDAELSA SSVYNLLPEK
0651 DLTGFPGPLN DQDDEDCINR HNVYINGITY TPVSSTNEKD MYSFLEDMGL
0701 KAFTNSKIRK PKMCPQLQQY EMHGPEGLRV GFYESDVMGR GHARLVHVEE
0751 PHTETVRKYF PETWIWDLVV VNSAGVAEVG VTVPDTITEW KAGAFCLSED
0801 AGLGISSTAS LRAFQPFFVE LTMPYSVIRG EAFTLKATVL NYLPKCIRVS
0851 VQLEASPAFL AVPVEKEQAP HCICANGRQT VSWAVTPKSL GNVNFTVSAE
0901 ALESQELCGT EVPSVPEHGR KDTVIKPLLV EPEGLEKETT FNSLLCPSGG
0951 EVSEELSLKL PPNVVEESAR ASVSVLGDIL GSAMQNTQNL LQMPYGCGEQ
1001 NMVLFAPNIY VLDYLNETQQ LTPEVKSKAI GYLNTGYQRQ LNYKHYDGSY
1051 STFGERYGRN QGNTWLTAFV LKTFAQARAY IFIDEAHITQ ALIWLSQRQK
1101 DNGCFRSSGS LLNNAIKGGV EDEVTLSAYI TIALLEIPLT VTHPVVRNAL
1151 FCLESAWKTA QEGDHGSHVY TKALLAYAFA LAGNQDKRKE VLKSLNEEAV
1201 KKDNSVHWER PQKPKAPVGH FYEPQAPSAE VEMTSYVLLA YLTAQPAPTS
1251 EDLTSATNIV KWITKQQNAQ GGFSSTQDTV VALHALSKYG AATFTRTGKA
1301 AQVTIQSSGT FSSKFQVDNN NRLLLQQVSL PELPGEYSMK VTGEGCVYLQ
1351 TSLKYNILPE KEEFPFALGV QTLPQTCDEP KAHTSFQISL SVSYTGSRSA
1401 SNMAIVDVKM VSGFIPLKPT VKMLERSNHV SRTEVSSNHV LIYLDKVSNQ
1451 TLSLFFTVLQ DVPVRDLKPA IVKVYDYYET DEFAIAEYNA PCSKDLGNA
(配列番号13)
VPVRDLKPAIVKVYD (配列番号14)
インタクトタンパク質
001 FNKITPNLAE FAFSLYRQLA HQSNSTNIFF SPVSIATAFA MLSLGTKADT
051 HDEILEGLNF NLTEIPEAQI HEGFQELLRT LNQPDSQLQL TTGNGLFLSE
101 GLKLVDKFLE DVKKLYHSEA FTVNFGDTEE AKKQINDYVE KGTQGKIVDL
151 VKELDRDTVF ALVNYIFFKG KWERPFEVKD TEEEDFHVDQ VTTVKVPMMK
201 RLGMFNIQHC KKLSSWVLLM KYLGNATAIF FLPDEGKLQH LENELTHDII
251 TKFLENEDRR SASLHLPKLS ITGTYDLKSV LGQLGITKVF SNGADLSGVT
301 EEAPLKLSKA VHKAVLTIDE KGTEAAGAMF LEAIPMSIPP EVKFNKPFVF
351 LMIEQNTKSP LFMGKVVNPT QK (配列番号15)
VKKLYHSEAFTVNFGD (配列番号16)
インタクトタンパク質
001 MKPPRPVRTC SKVLVLLSLL AIHQTTTAEK NGIDIYSLTV DSRVSSRFAH
051 TVVTSRVVNR ANTVQEATFQ MELPKKAFIT NFSMNIDGMT YPGIIKEKAE
101 AQAQYSAAVA KGKSAGLVKA TGRNMEQFQV SVSVAPNAKI TFELVYEELL
151 KRRLGVYELL LKVRPQQLVK HLQMDIHIFE PQGISFLETE STFMTNQLVD
201 ALTTWQNKTK AHIRFKPTLS QQQKSPEQQE TVLDGNLIIR YDVDRAISGG
251 SIQIENGYFV HYFAPEGLTT MPKNVVFVID KSGSMSGRKI QQTREALIKI
301 LDDLSPRDQF NLIVFSTEAT QWRPSLVPAS AENVNKARSF AAGIQALGGT
351 NINDAMLMAV QLLDSSNQEE RLPEGSVSLI ILLTDGDPTV GETNPRSIQN
401 NVREAVSGRY SLFCLGFGFD VSYAFLEKLA LDNGGLARRI HEDSDSALQL
451 QDFYQEVANP LLTAVTFEYP SNAVEEVTQN NFRLLFKGSE MVVAGKLQDR
501 GPDVLTATVS GKLPTQNITF QTESSVAEQE AEFQSPKYIF HNFMERLWAY
551 LTIQQLLEQT VSASDADQQA LRNQALNLSL AYSFVTPLTS MVVTKPDDQE
601 QSQVAEKPME GESRNRNVHS GSTFFKYYLQ GAKIPKPEAS FSPRRGWNRQ
651 AGAAGSRMNF RPGVLSSRQL GLPGPPDVPD HAAYHPFRRL AILPASAPPA
701 TSNPDPAVSR VMNMKIEETT MTTQTPAPIQ APSAILPLPG QSVERLCVDP
751 RHRQGPVNLL SDPEQGVEVT GQYEREKAGF SWIEVTFKNP LVWVHASPEH
801 VVVTRNRRSS AYKWKETLFS VMPGLKMTMD KTGLLLLSDP DKVTIGLLFW
851 DGRGEGLRLL LRDTDRFSSH VGGTLGQFYQ EVLWGSPAAS DDGRRTLRVQ
901 GNDHSATRER RLDYQEGPPG VEISCWSVEL (配列番号7)
RLAILPASAPPATSNPD (配列番号17)
RLAILPASAPPATSNPD + -GlcNAc-Hex-GlcNAc-Hex
(1)方法
SELDI-TOF-MS(サイファージェンバイオシステムズ)を用いて、肝細胞がん患者の血清と正常人の血清を測定し、正常サンプル対その他の疾患サンプルとして比較解析を行った。
図3に質量ピークをゲル表示で可視化する方法であるゲルビューアによる血清タンパク質プロファイリングを示す。図3は、SELDI-TOF-MS法を用いて正常健常人、肝細胞がん患者からの血清をデュプリケートで解析した結果を示している。正常コントロ一ル対疾患をCM10で解析した結果である。図3は、正常4サンプルおよび肝細胞がん(HCC)3サンプルについて示す。図3において、表示は質量分析装置で得られたピークの強さintensityをヒートマップに変換したものである。矢印で示すように正常では認められなかったペプチドが、肝細胞がん患者に認められる。
(1)方法
市販のキットおよび自作の抗体を用いてELISAをおこなった。96穴(ウエル)の培養プレートに抗α-1 トリプシンインヒビター抗体(1次抗体)希釈液を添加して室温で1時間放置して抗体をプレートに吸着させた。溶液除去後、プレートへの抗原の非特異的結合を防ぐために3%血清アルブミン溶液を添加し1時間室温で放置した。溶液除去後に、適当に段階希釈した標準血清、がん患者血清、および健常人血清をそれぞれ別のウエルに入れて、室温1時間放置した。0.1%の界面活性剤を含むバッファーを用いて各ウエルを4回洗浄した。更にそこに酵素(ペルオキシダーゼ)で標識された2次抗体希釈液を添加し、1時間放置後に各ウエルを4回洗浄した。最後に、酵素作用を受けて発色する酵素基質の溶液を加えて30分放置した。各ウエルの吸光度を光度計を用いて測定した。測定結果を標準血清中のα-1 トリプシンインヒビター量を100ユニットとして、それと比較して計算することで、それぞれのがん患者血清ならびに健常人血清中のα-1 トリプシンインヒビター量をユニットで表した。
本実験では、本発明者が見出した二つの現象、すなわち、(i)二次元電気泳動法では肝がん患者において正常人で観察される(生の、分解を受けていない)α-1 アンチトリプシンがほとんど検出されない(消失している)。(ii)一方、本発明者独自の2D-HPLC-MALDI-TOF/MS法では、肝がん患者に特異的に特定のα-1 アンチトリプシンペプチド(配列番号16)が検出される。
Claims (10)
- 配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドの糖鎖付加体、配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチド及び配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドからなる肝がん検出のための肝がんバイオマーカー。
- 肝がん患者生体試料中において、正常人生体試料中と比較し出現または増加する、請求項1記載の肝がんバイオマーカー。
- 生体試料中の請求項1または2に記載の少なくとも1つの肝がんバイオマーカーを測定することを含む、肝がんの検出方法。
- 生体試料中の請求項1または2に記載の少なくとも1つの肝がんバイオマーカーを測定し、該バイオマーカーが正常人と比較して多く存在する場合に、肝がんに罹患していると判断する肝がんの検出方法。
- 検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる請求項3または4に記載の肝がんの検出方法。
- 配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドの糖鎖付加体、配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチド及び配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドを測定するための肝がんの検出キット。
- 配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドの糖鎖付加体、配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチド及び配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドに対する抗体もしくはアプタマーを含む肝がんの検出キット。
- 抗体またはアプタマーが基板上に固相化されている請求項7記載の検出キット。
- 配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチドの糖鎖付加体、配列番号17で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビター重鎖H4前駆体の部分ペプチド及び配列番号8で表されるアミノ酸配列からなるインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドからなる群から選択される少なくとも一つのインターαトリプシンインヒビターの部分ペプチドをバイオマーカーとして用いる肝がんの検出方法であって、生体試料中の該部分ペプチドの種類、存在量および/または存在比を測定し、部分ペプチドプロファイルを得ることを含む、肝がんの検出方法。
- 検出が酵素もしくは蛍光標識抗体法または質量分析法により行われる請求項9記載の肝がんの検出方法。
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