JP2013515273A - インスリン様増殖因子1受容体(igf−1r)タンパク質srm/mrmアッセイ - Google Patents
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Description
インスリン様増殖因子1受容体タンパク質(IGF−1R、またCD221タンパク質とも呼ばれる)のサブシーケンス由来の特異的ペプチドが提供される。各ペプチドに対するペプチド配列およびフラグメント/遷移イオンは、質量分析ベース選択反応モニタリング(SRM)(多重反応モニタリング(MRM)とも呼ばれる)アッセイでは特に有用で、この分析は、SRM/MRMと呼ばれる。IGF−1Rタンパク質のSRM/MRM定量分析用として、この内の1つのペプチドの使用について記載する。
本明細書に記載のアッセイは、IGF−1Rタンパク質由来の特定の非修飾ペプチドの相対的または絶対的量を測定し、また、IGF−1Rタンパク質由来の特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的量も測定できる。修飾の例には、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が含まれる。
原理的には、例えば、既知の特異性のプロテアーゼ(例えば、トリプシン)で消化されることにより調製されるIGF−1Rタンパク質由来のいずれの予測されるペプチドも、質量分析ベースSRM/MRMアッセイを使って検体中のIGF−1Rタンパク質の存在量を測定するための代用レポーターとして使用可能である。同様に、IGF−1Rタンパク質中で潜在的に修飾されることが解っている部位のアミノ酸残基を含むいずれの予測されるペプチド配列も、また、検体中のIGF−1Rタンパク質の修飾の度合いのアッセイに使用できる可能性がある。
1.IGF−1Rタンパク質のためのSRM/MRM候補フラグメントペプチドの特定
a.1つ以上のプロテアーゼ(これには、トリプシンを含んでも含まなくてもよい)を使ってタンパク質を消化して、ホルマリン固定生物検体からLiquid Tissue(登録商標)タンパク質ライセートを調製する。
b.イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Liquid Tissue(登録商標)ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、IGF−1Rタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。この場合、個別フラグメントペプチドは、どのペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化、も含まない。
c.イオントラップタンデム質量分析計を用いて、Liquid Tissue(登録商標)ライセート中の全タンパク質フラグメントを分析し、ペプチド修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化残基を有するIGF−1Rタンパク質由来の全フラグメントペプチドを特定する。
d.完全長IGF−1R完全タンパク質から特異的消化方法により生成された全ペプチドを測定することは可能ではあるが、SRM/MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生物検体から調製される複合Liquid Tissue(登録商標)タンパク質ライセートで直接質量分析により特定されるものである。
e.ホルマリン固定生物検体由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセートの分析を行う場合、患者組織中で特異的に修飾され(リン酸化された、グリコシル化された、等)、質量分析計中でイオン化され、検出されるペプチドは、IGF−1Rタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための候補ペプチドとして特定される。
2.IGF−1Rタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
a.Liquid Tissue(登録商標)ライセート中で特定された個別フラグメントペプチドのための三連四重極質量分析計を使ったSRM/MRMアッセイがIGF−1Rタンパク質由来のペプチドに適用される。
i.最適クロマトグラフィー条件のためのフラグメントペプチドに対する最適保持時間の決定。使用されるクロマトグラフィーには、これに限定されないが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、が含まれる。
ii.各ペプチドに対するSRM/MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドに対する前駆物質電荷状態、各ペプチドに対する前駆物質m/z値、各ペプチドに対するm/z遷移イオン、および各フラグメントペプチドに対する各遷移イオンのイオンタイプの測定を行う。
iii.次に、(i)および(ii)からの情報を使って、三連四重極質量分析計によりSRM/MRMアッセイを行うことができる。この場合、各ペプチドは、三連四重極質量分析計で行われる独特のSRM/MRMアッセイを明確に規定する特徴的かつ固有のSRM/MRMシグネチャピークを有する。
b.SRM/MRM質量分析における固有のSRM/MRMシグネチャピーク面積の関数として、検出されるIGF−1Rタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質ライセート中の相対的および絶対的量のタンパク質を表すことができるように、SRM/MRM分析を行う。
i.相対的定量は、下記により行うことができる:
1.1つのホルマリン固定生物検体由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で検出された所与のIGF−1RペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四、またはそれを超えるホルマリン固定生物検体由来の少なくとも第二、第三、第四、またはそれを超えるLiquid Tissue(登録商標)ライセート中の同じIGF−1Rフラグメントペプチドの同じSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより、IGF−1Rタンパク質の増加または減少を測定する。
2.1つのホルマリン固定生物検体由来のLiquid Tissue(登録商標)ライセート中で検出された所与のIGF−1RペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積を、異なる、別の生物学的ソース由来の他の検体中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成したSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより、IGF−1Rタンパク質の増加または減少を測定する。この場合、2検体間のペプチドフラグメントに対するSRM/MRMシグネチャピーク面積比較は、各検体で分析されたタンパク質の量に正規化されている。
3.IGF−1Rタンパク質のレベルの変化を、種々の細胞性条件下でそれらの発現レベルを変化させない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所与のIGF−1Rペプチドに対するSRM/MRMシグネチャピーク面積を、ホルマリン固定生物検体由来の同じLiquid Tissue(登録商標)ライセート内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドからのSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより、IGF−1Rタンパク質の増加または減少を測定する。
4.これらのアッセイは、IGF−1Rタンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に対し適用可能である。この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および/またはグリコシル化が含まれ、また、修飾ペプチドの相対的レベルは、非修飾ペプチドの相対的量測定と同じ方法で測定される。
ii.所与のペプチドの絶対的定量は、個別の生物検体中の所与のフラグメントIGF−1Rタンパク質由来のペプチドのSRM/MRMシグネチャピーク面積を、生物検体由来のタンパク質ライセート中に添加された内部フラグメントペプチド標準のSRM/MRMシグネチャピーク面積と比較することにより行うことができる。
1.内部標準は、標識した合成バージョンのフラグメントIGF−1Rタンパク質由来の参照されるペプチドである。この標準は、既知量で検体中に添加され、SRM/MRMシグネチャピーク面積が、生物検体中の内部フラグメントペプチド標準および元のフラグメントペプチドの両方に対し、別々に測定され、その後、両ピーク面積が比較される。
2.これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用でき、この場合、修飾には、これに限定されないが、リン酸化および/またはグリコシル化が含まれ、また、絶対的レベルの修飾ペプチドは、絶対的レベルの非修飾ペプチドの測定と同じ方法で測定可能である。
3.フラグメントペプチド定量化の癌診断および治療への適用
a.IGF−1Rタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量化を行い、癌の分野で十分理解されている、IGF−1Rタンパク質発現と患者腫瘍組織中の癌の病期/グレード/状態の間の、以前測定されている関連性が確認されることを証明する。
b.IGF−1Rタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量化を行い、異なる治療戦略から来る臨床的転帰との相関を証明する。この場合、この相関は、この分野ですでに証明されているか、または患者およびこれらの患者由来の組織のコホート全体の相関調査により将来証明可能である。以前確立された相関関係または将来得られる相関関係がこのアッセイにより確認されるとすぐに、本アッセイ方法は、最適治療戦略の決定に使用可能である。
Claims (31)
- 生物検体中のインスリン様増殖因子1受容体(IGF−1R)タンパク質のレベルの測定方法であって、前記生物検体から調製したタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量の質量分析による検出および/または定量;ならびに前記検体中の修飾または非修飾IGF−1Rタンパク質のレベルの計算を含み;さらに前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである、方法。
- 1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量の検出および/または定量の前に、前記タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む請求項1に記載の方法。
- 前記分画ステップが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー、からなる群より選択される請求項2に記載の方法。
- 前記生物検体の前記タンパク質消化物が、Liquid Tissue(登録商標)プロトコルにより調製される請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む請求項5に記載の方法。
- 前記質量分析が、タンデム型質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI−TOF質量分析、MALDI質量分析、および/または飛行時間型質量分析を含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および/または複数の選択反応モニタリング(mSRM)である請求項7に記載の方法。
- 前記IGF−1Rフラグメントペプチドが、下記に設定されるアミノ酸配列を含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号38、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、および配列番号78。
- 前記生物検体が血液サンプル、尿検体、血清検体、腹水検体、痰検体、リンパ体液、唾液検体、細胞、または固形組織である請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組織がホルマリン固定組織である請求項10に記載の方法。
- 前記組織がパラフィン包埋組織である請求項10または11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組織が腫瘍から入手される請求項10に記載の方法。
- 前記腫瘍が原発性腫瘍である請求項13に記載の方法。
- 前記腫瘍が2次腫瘍である請求項13に記載の方法。
- 修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドを定量することをさらに含む請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 1つの生物検体中の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号38、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、または配列番号78で示されるIGF−1Rの約8〜約45アミノ酸残基のアミノ酸配列を含む1つ以上のIGF−1Rフラグメントペプチドの量を、異なる、別の生物検体中の同じIGF−1Rフラグメントペプチドの量と比較することを含むIGF−1Rフラグメントペプチドを定量する請求項16に記載の方法。
- 1つ以上のIGF−1Rフラグメントペプチドの定量が、既知量の添加内部標準ペプチドに対する比較により、生物検体中の各IGF−1Rフラグメントペプチドの量を測定することを含み、ここで生物検体中の各IGF−1Rフラグメントペプチドが同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドに対し比較される請求項17に記載の方法。
- 前記内部標準ペプチドが同位体で標識したペプチドである請求項18に記載の方法。
- 前記同位体で標識した内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、2Hまたはこれらの組み合わせから選択される1つ以上の安定重同位体を含む請求項19に記載の方法。
- タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量の検出および/または定量により、修飾または非修飾IGF−1Rタンパク質の存在および被験者の癌との関連性が示される請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量、または前記IGF−1Rタンパク質のレベルの前記検出および/または定量結果と、診断上の癌の病期/グレード/状態とを関連付けることをさらに含む請求項21に記載の方法。
- 1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量、または前記IGF−1Rタンパク質のレベルの前記検出および/または定量結果の、診断上の癌の病期/グレード/状態に対する関連付けが、他のタンパク質由来の他のタンパク質またはペプチドの量の検出および/または定量と組み合わされて、多項目同時測定により、診断上の癌の病期/グレード/状態に関する追加の情報を提供する請求項22に記載の方法。
- 前記生物検体が採取された被験者に対し、1つ以上のIGF−1Rフラグメントペプチドの存在、非存在、もしくは量またはIGF−1Rタンパク質のレベルに基づいて治療を選択することをさらに含む請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物検体が採取された患者に対し、治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、投与される治療薬および/または治療薬の量が、1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量またはIGF−1Rタンパク質のレベルに基づいている請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 治療薬がIGF−1Rタンパク質に結合する、および/またはその生物活性を阻害する請求項24および25に記載の方法。
- 前記生物検体が、Liquid Tissue(登録商標)プロトコルおよび試薬を使って、1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドの量を定量するための処理を受けているホルマリン固定腫瘍組織である請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上の修飾または非修飾IGF−1Rフラグメントペプチドが、2つ以上、3つ以上、4以上、5以上、6以上、8以上、または10以上の表1のペプチドである請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 表2のペプチドの量の定量化を含む請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 1つ以上、2つ以上、3つ以上、4以上、5以上、6以上、8以上、または10以上の表1のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む組成物。
- 表2のペプチドまたはそれらに対する抗体を含む請求項30に記載の組成物。
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