JP6046147B2 - がんの評価のための多重mrmアッセイ - Google Patents
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Description
エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、および抗原Ki67(Ki67)タンパク質の下位配列に由来する特異ペプチドが提供されている。ペプチド配列および各ペプチドの断片化/遷移イオンは、質量分析ベースの選択反応モニタリング(SRM)で特に有用であり、これは多重反応モニタリング(MRM)アッセイとも呼ばれる。このようなアッセイは本明細書ではSRM/MRMとも呼ばれる。これらのタンパク質のSRM/MRM定量分析のためのペプチドの使用(個別に、同時に、またはさまざまな組み合わせで)についての情報が記述されている。
I. ER、PRおよび/またはKi67タンパク質に対するSRM/MRM候補断片ペプチドの特定:
a. タンパク質を消化するために、プロテアーゼ(トリプシンを含むことも含まないこともある)を使用してホルマリン固定生体試料からLiquid TissueTMタンパク質溶解物を調製する。
b. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、個別の断片ペプチドがリン酸化またはグリコシル化などのいかなるペプチド修飾も含まない、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
c. Liquid TissueTM溶解物のすべてのタンパク質断片をイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基などのペプチド修飾を持つER、PRおよび/またはKi67タンパク質からのすべての断片ペプチドを特定する。
d. 全長ER、PRおよび/またはKi67タンパク質全体から特定の消化方法で生成されたすべてのペプチドを測定できる可能性があるが、SRM/MRMアッセイの開発に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製された複合Liquid TissueTM溶解物中で直接、質量分析によって特定されるものである。
e. 患者組織で特に修飾(リン酸化、グリコシル化など)され、ホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物を分析する時、質量分析計内でイオン化され、そのため検出されるペプチドは、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質のペプチド修飾のアッセイのための候補ペプチドとして特定される。
a. Liquid TissueTM溶解物中で特定された個別の断片ペプチドに対する三連四重極質量分析計でのSRM/MRMアッセイが、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質からのペプチドに適用される。
i. ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、または逆相高性能液体クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない、最適なクロマトグラフィー条件に対する断片ペプチドの最適保持時間を決定する。
ii. 各ペプチドに対するSRM/MRMアッセイを開発するために、ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の荷電状態、各ペプチドの前駆体のm/z値、各ペプチドのm/z遷移イオン、および各断片ペプチドに対する各遷移イオンのイオン型を決定する。
iii. 次にSRM/MRMアッセイは、(i)および(ii)からの情報を使用して三連四重極質量分析計で実施できるが、ここで各ペプチドは固有のSRM/MRMアッセイを三連四重極質量分析計で実施したものとして正確に定義する特徴および固有SRM/MRM特徴ピークを持つ。
b. SRM/MRM質量分析からの固有SRM/MRM特徴ピーク面積の関数として検出されるER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量が、特定のタンパク質溶解物中のER、PRおよび/またはKi67タンパク質の相対的および絶対的量の両方を示すことができるように、SRM/MRM分析を実施する。
i. 相対的定量は以下によって達成しうる。
1. 1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物中で検出される所定のER、PRおよび/またはKi67ペプチドからのSRM/MRM特徴ピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第二、第三、第四またはそれ以上のLiquid TissueTM溶解物中の同じER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの同じSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
2. ペプチド断片に対する2つのサンプル間のSRM/MRM特徴ピーク面積の比較が各サンプルで分析されたタンパク質の量に対して正規化される場合、1つのホルマリン固定生体試料からのLiquid TissueTM溶解物で検出された所定のER、PRおよび/またはKi67ペプチドからのSRM/MRM特徴ピーク面積を、異なる別の生体起源から由来するその他のサンプルのその他のタンパク質の断片ペプチドから作成されたSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
3. さまざまな細胞条件下で発現レベルが変化しないその他のタンパク質に対してER、PRおよび/またはKi67タンパク質の変化するレベルを正規化するために、所定のER、PRおよび/またはKi67ペプチドに対するSRM/MRM特徴ピーク面積を、ホルマリン固定生体試料の同じLiquid TissueTM溶解物内の異なるタンパク質から由来するその他の断片ペプチドからのSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の存在の増加または減少を決定する。
4. 修飾がリン酸化および/またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの相対的レベルが未修飾ペプチドの相対的量を決定するのと同じ方法で決定される場合、これらのアッセイは、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドの両方に適用できる。
ii. 所定のペプチドの絶対的定量は、個別の生体試料のER、PRおよび/またはKi67タンパク質からの所定の断片ペプチドに対するSRM/MRM特徴ピーク面積を、その生体試料からのタンパク質溶解物に混入した断片ペプチド内部標準のSRM/MRM特徴ピーク面積と比較することによって達成されうる。
1. 内部標準は、調査しているER、PRおよび/またはKi67タンパク質からの断片ペプチドの標識合成版である。この標準は既知量をサンプルに混入し、SRM/MRM特徴ピーク面積は、生体試料中の断片ペプチド内部標準および天然断片ペプチドの両方に対して別々に決定でき、その後両方のピーク面積の比較ができる。
2. 修飾がリン酸化および/またはグリコシル化を含むがこれに限定されず、修飾ペプチドの絶対レベルが未修飾ペプチドの絶対レベルを決定するのと同じ方法で決定できる場合、これは未修飾断片ペプチドおよび修飾断片ペプチドに適用できる。
a. ER、PRおよびまたはKi67タンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量を実施し、がん分野でよく知られた、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質発現と患者腫瘍組織のがんの病期/悪性度/状態との以前に決定された関連性が確認されることを実証する。
b. ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の断片ペプチドレベルの相対的および/または絶対的定量を、個別に、組み合わせで、またはすべて同時に実施し、異なる治療戦略の臨床転帰との相関関係を実証するが、ここでこの相関関係は本分野ですでに実証されているか、または患者のコホートおよびこれらの患者からの組織にわたる相関関係研究を通して将来実証できる。以前に確立された相関関係または将来生じる相関関係のいずれかがこのアッセイによって確認されたら、次にこのアッセイ方法を使用して最適な治療戦略を決定できる。
1. 生体試料中のER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量を測定する方法であって、質量分析を用いて生体試料から調製されたタンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量を検出および/または定量すること、およびサンプル中の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量を計算することを含み、前記量が相対的レベルまたは絶対的レベルである方法。
2. 1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量を検出および/または定量する前に、タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、実施形態1の方法。
3. 分画ステップが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、および逆相高性能液体クロマトグラフィーから成るグループから選択される、実施形態2の方法。
4. 生体試料のタンパク質消化物がLiquid TissueTMプロトコルによって調製される、実施形態1〜3のいずれかの方法。
5. タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、実施形態1〜3のいずれかの方法。
6. タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、実施形態5の方法。
7. 質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、MALDI-TOF質量分析、MALDI質量分析、または飛行時間型質量分析、またはその任意の組み合わせを含む、実施形態1〜6のいずれかの方法。
8. 使用される質量分析のモードが、選択反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、または多重選択反応モニタリング(mSRM)、またはその任意の組み合わせである、実施形態7の方法。
9. 1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドが、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、およびSEQ ID NO:10として規定されるものから独立して選択される2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つまたは10の異なるアミノ酸配列を含む、実施形態1〜8のいずれかの方法。
10. 生体試料が血液サンプル、尿サンプル、血清サンプル、腹水サンプル、喀痰サンプル、リンパ液、唾液サンプル、細胞、または固体組織である、実施形態1〜9のいずれかの方法。
11. 組織がホルマリン固定組織である、実施形態10の方法。
12. 組織がパラフィン包埋組織である、実施形態10または11の方法。
13. 組織が腫瘍から取得される、実施形態10の方法。
14. 腫瘍が原発腫瘍である、実施形態13の方法。
15. 腫瘍が二次腫瘍である、実施形態13の方法。
16. 修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドを定量することをさらに含む、実施形態1〜15のいずれかの方法。
17. 修飾または未修飾断片ペプチドの定量に、1つの生体試料のSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10に示されるような約8〜約45のER、PRおよび/またはKi67のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む1つ以上のER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量を、異なる別の生体試料の同じER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量と比較することを含む、実施形態16の方法。
18. 1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの定量が、既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中の前記1つ以上のER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドのそれぞれの量を決定することを含み、生体試料中のER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドのそれぞれが、同じアミノ酸配列を持つ内部標準ペプチドと比較される、実施形態17の方法。
19. 内部標準ペプチドが同位体標識ペプチドである、実施形態18の方法。
20. 同位体標識内部標準ペプチドが、18O、17O、34S、15N、13C、および2H、またはその任意の組み合わせから成るグループから選択される1つ以上の安定重同位体を含む、実施形態19の方法。
21. タンパク質消化物中の1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量の検出および/または定量が、修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67タンパク質の存在および被験者におけるがん、特に乳がんとの関連性を示す、実施形態1〜20のいずれかの方法。
22. 1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量、またはER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量の検出および/または定量の結果を、がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けることをさらに含む、実施形態21の方法。
23. 1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量、またはER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量の検出および/または定量の結果を、がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けることが、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの検出および/または定量された量と多重フォーマットで組み合わされて、がんの診断病期/悪性度/状態についての追加情報を提供する、実施形態22に記載の方法。
24. 生体試料が取得される被験者に対して、1つ以上のER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの有無またはその量またはER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量に基づいて治療を選択することをさらに含む、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25. 生体試料が取得される患者に治療有効量の治療薬を投与することをさらに含み、治療薬および/または投与された治療薬の量が、1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量またはER、PRおよび/またはKi67タンパク質の量に基づいている、実施形態1〜24のいずれか1つに記載の方法。
26. 治療または治療薬が、ER、PRおよび/またはKi67タンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、実施形態24または25の方法。
27. 生体試料が、Liquid TissueTMプロトコルおよび試薬を用いて、1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドの量を定量するために処理されたホルマリン固定腫瘍組織である、実施形態1〜26の方法。
28. 前記1つ以上の修飾または未修飾ER、PRおよび/またはKi67断片ペプチドが、表1のペプチドの1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または6つ以上である、実施形態1〜27のいずれかの方法。
29. 表2のペプチドの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つまたは7つの量の定量を含む、実施形態1〜28のいずれかの方法。
30. 表1のペプチドまたはそれに対する抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、または10を含む組成物であって、前記組成物がSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のペプチドでないER、PRおよび/またはKi67の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のペプチドを随意に除外する組成物。
31. 表2のペプチドまたはそれに対する抗体の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、または7つを含む組成物であって、前記組成物がSEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、または7のペプチドでないER、PRおよび/またはKi67の1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のペプチドを随意に除外する実施形態30の組成物。
Claims (16)
- ホルマリン固定組織であるヒト生体試料中のヒトエストロゲン受容体(ER)タンパク質の量を測定する方法であって、質量分析を用いて、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のSEQ ID NO:2のER断片ペプチドの量を検出および定量すること、および前記生体試料中のERタンパク質の量を計算することを含み、
前記量が相対的レベルまたは絶対的レベルである方法。 - 前記ER断片ペプチドの量を検出および定量する前に、タンパク質消化物を分画するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組織が腫瘍から取得される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ER断片ペプチドの定量が、1つの生体試料の前記ER断片ペプチドの量を、異なる別の生体試料の同じER断片ペプチドの量と比較することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ER断片ペプチドの定量が、同じアミノ酸配列を持つ既知量の追加内部標準ペプチドと比較することによって、生体試料中の前記ER断片ペプチドの量を決定することを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物中の前記ER断片ペプチドの量の検出および/または定量が、修飾または未修飾ERタンパク質の存在および被験者におけるがんとの関連性を示す、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ER断片ペプチドの量、または前記ERタンパク質の量の検出および/または定量の結果を、前記がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けるための情報を提供することをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記ER断片ペプチドの量、または前記ERタンパク質の量の検出および/または定量の結果を前記がんの診断病期/悪性度/状態と関連付けるための情報と、その他のタンパク質、またはその他のタンパク質からのペプチドの検出および/または定量された量の情報とを、多重フォーマットで組み合わせることにより、前記がんの診断病期/悪性度/状態についての追加情報を提供するための、請求項10に記載の方法。
- 前記ER断片ペプチドの量またはERタンパク質の量に基づいて、前記生体試料が取得される患者に投与される治療薬および/または治療有効量の治療薬を選択することを補助するための、請求項1に記載の方法。
- 前記治療薬が、ERタンパク質を発現しているがん細胞に対するものである、請求項12に記載の方法。
- PRおよびKi67断片ペプチドからなる群から選択される、前記タンパク質消化物中の少なくとも1種の追加断片ペプチドの量を、質量分析を用いて検出および定量すること、および、前記生体試料中のPRおよび/またはKi67タンパク質の量を計算することをさらに含み、前記量が相対的レベルまたは絶対的レベルである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記追加断片ペプチドがPR断片ペプチドである、請求項14に記載の方法。
- 前記追加断片ペプチドがKi67断片ペプチドである、請求項14に記載の方法。
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