KR102370435B1 - 유방암의 아형 분류에 사용되는 단백질의 질량분석기 기반 정량 방법 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 유방암의 아형 분류에 널리 사용되는 HER2, ER, PR, 및 AR 마커를 유방암 조직시료로부터 질량분석법을 이용하여 정량하는 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 염색 기반의 방법이 내재하는 한계점을 극복하여, 종양 조직 내 단백질 발현량을 정확하게 측정할 수 있다.

Description

유방암의 아형 분류에 사용되는 단백질의 질량분석기 기반 정량 방법 및 그 용도 {Mass spectrometry-based method of quantifying receptor proteins used for breast cancer subtyping and its use}

본 발명은 유방암 조직 HER2, PR, ER, 및 AR 단백질의 질량분석기 기반 정량 방법과 관련된 기술이다.

유방암은 우리나라에서 여성암 발생률 2위 (14.8%)를 차지하며, 유방암 발생률은 여성 인구 10만명 당 52.1명으로 아시아 국가 중 1위를 기록하고 있는 만큼 현대인에게 빈번하게 발생할 수 있는 암 종이다. 유방암은 또한 사회경제적 부담이 큰 질병이다. 심사평가원 통계에 따르면 최근 5년간 국내 유방암 환자가 약 4만여명 증가하였으며, 유방암 관련 청구 건수 및 요양급여비용이 2013년 대비 2017년에 각각 123.2%, 151.4% 증가하였다.

병원에서는 유방암 환자의 종양 조직을 생검하고 3가지 단백질 마커의 음성/양성을 조사해 크게 HER2 과발현, Luminal A, Luminal B, Basal, Normal-like 등의 5가지의 아형으로 구분한다. 5가지의 아형은 각각 치료 전략과 예후가 상이하다. 예를 들어, HER2 단백질이 과발현된 유방암은 HER2 단백질이 세포막에 과발현되어 있으며, ER (에스트로젠 수용체) 및 PR (프로제스테론 수용체) 단백질은 음성인 아형이다. 이 유형의 유방암은 전체 유방암의 15 ~ 20%를 차지한다. HER2 유형의 유방암은 다른 종류의 유방암에 비해 공격성이 크며, 재발 가능성이 높아 예후가 좋지 않고, 그에 따라 생존율이 낮다. 그러나 이 유형의 유방암은 Traszumab (판매명: Herceptin) 약제에 대한 반응성이 좋아 환자들은 일반적으로 투여받는다. 따라서, 유방암 환자의 마커 발현의 정확한 측정은 수용체 양성 및 음성 환자의 예후 및 치료 방침을 결정하는데 있어 매우 중요하다고 볼 수 있다.

병원에서 유방암의 아형을 판단하기 위해 단백질 발현을 조사하는 현행 방법은 면역조직화학(Immunohistochemistry) 방법이다. 그러나 면역조직화학 방법에서는 병리학자가 육안으로 단백질이 염색된 정도를 판단하여 정량적, 객관적인 해석이 어렵다. 미국임상종양학회(American society of clinical oncology)와 병리학회(College of Americal pathologists)는 단백질 염색 정도를 통한 발현 판정의 기준을 규정하여 전세계 병리학자들이 가이드라인으로 삼도록 하고 있지만, 애매한 부분이 많고 기준이 해가 지남에 따라 바뀌는 등 객관적인 해석에는 도움을 주지 못하고 있다. 예를 들어, ER의 양성 기준은 조직 내 1% 이상의 세포가 ER 항체로 염색이 되었을 경우이다. ER 단백질은 Luminal 아형을 Basal 또는 HER2 과발현 아형으로부터 구분할 수 있는 마커이므로, 1% 내외의 염색 정도를 이용하는 판독은 아형 분류에 오류를 일으키기 쉽게 만든다. 따라서 염색 기반의 방법이 내재하는 한계점으로 인해 음성과 양성을 가르는 명확한 기준을 제시하지 못하고 있는 실정이고, 이에 종양 조직 내 단백질 발현을 정밀하게 측정하고 객관화 및 수치화할 수 있는 새로운 정량 분석 방법이 필요하다.

미국 특허출원공개공보 US2013/0302328호는 전장 HER2와 절단된 HER2를 정량하는 방법에 관한 것이다.

대한민국 특허출원공개공보 제2018-0036653호는 최적의 암 치료를 위한 HER2 단백질 정량에 관한 것이다. 하지만 상기 문헌은 환자별로, 또는 환자의 샘플별로 HER2 단백질 발현 정도에 차이가 나는 것을 보정할 수 있는 방법이 제시되어있지 않고 상피 세포 특이적 단백질의 펩타이드 서열 및 해당 서열에 해당하는 전구체 전하 상태 등이 개시되어 있지 않다.

본 발명은 유방암 조직 시료에서 질량분석기에 의한 HER2, PR, ER, 및 AR 단백질의 발현정도를 정확하게 측정하는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 유방암 아형 분류에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 유방암 조직 시료로부터 단백질 분해물을 제조하는 단계; 및 상기 유방암 조직시료에서 유방암 아형 분류 마커로서 HER2, ER(Estrogen Receptor), PR(Progesteron Receptor) 및 AR(Androgen Receptor) 단백질의 발현량을 질량분석법으로 결정하는 단계를 포함하며, 상기 발현량을 상기 각 마커의 발현 상태와 연관시키는 단계로, 상기 HER2의 발현 상태는 0 (음성), 1+ (음성), 2+ (경계선) 또는 3+ (양성 또는 과발현)중 어느 하나 이상이고, 상기 ER, PR 및 AR의 각각의 발현 상태는 양성 또는 음성이고, 상기 질량분석법에 사용되는 상기 각 단백질의 펩타이드는 표 1와 같으며, 상기 HER 및 PR은 하나 이상의 펩타이드가 사용되는 것인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법을 제공한다.

일 구현예에서는 단백질 발현량에 근거한 발현상태 결정을 위해 임계값을 사용할 수 있으며, 이러한 임계값은 HER2, ER, PR, AR 단백질의 펩타이드 정량 분석 수치를 이용해 인접한 HER2, ER, PR, AR의 IHC 스코어를 구분하는 ROC 곡선을 그린 뒤 Youden 지수 (Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430)(J 지수)가 최대가 되는 수치 (J 지수 = 민감도 + 특이도 - 1)로 결정할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 조직 시료는 FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)이다.

일 구현예에서는 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함한다.

일 구현예에서 질량 분석법에 사용되는 모드는 병렬 반응 모니터링(Parallel Reaction Monitoring, PRM), 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM), 특히 PRM이다.

일 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 단백질 분해물은 트립신 분해물이다.

일 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 단백질 분해물을 정량하기 전에 분획하는 단계를 추가로 포함한다.

일 구현예에서 본원의 방법에서 상기 분획하는 단계는 액체 크로마토그래피로 수행될 수 있다.

일 구현예에서 본원의 방법에서 각 마커의 발현 상태는 상기 각 펩타이드에서 단편화되어 나온 본원에 개시된 프러덕트 이온 5개의 피크의 면적으로 결정된다.

일 구현예에서 본원의 방법에서 단백질의 발현 상태를 유방암의 아형 분류와 연관시키는 단계를 추가로 포함한다.

본원에 따른 방법은 유방암의 아형 분류에 널리 사용되는 HER2, ER, PR, AR 마커를 유방암 조직시료로부터 질량분석법을 이용하여 정량한다. 본원에 따른 방법은 염색 기반의 방법에 내재하는 판독 오류 및 이로 인한 아형 분류의 오류라는 한계점을 극복하여, 종양 조직 내 단백질 발현량을 정확하고 신속하게 측정할 수 있다.

도 1은 본원에 따른 방법의 일 구현예에 사용된 질량분석 방법인 Q-Exactive LC-MS/MS (PRM 모드) 분석 모식도이다.
도 2는 본원에 따른 방법의 일 구현예에 사용된 유방암 마커 4개 단백질의 PRM-MS assay development 과정이다.
도 3a 내지 도 3d는(은) 본원에 따른 방법의 일 구현예에서 Collision energy의 최적화를 위한 반복 분석의 결과이다.
도 4는 본원에 따른 방법의 일 구현예에서, 면역조직화학법의 결과와 (왼쪽 사진) PRM-MS assay의 결과 Peak (오른쪽)이다. PRM-MS 분석 피크가 염색 정도와 양의 상관성이 있음을 보여주며, 또한 PRM-MS 분석이 동시 다중 검출이 가능함을 나타낸다.
도 5는 본원에 따른 방법의 일 구현예에 사용된 유방암 FFPE 조직 슬라이드를 이용한 PRM-MS assay 플로우차트이다.
도 6은 본원에 따른 방법의 일 구현예에 사용된 유방암 PRM-MS assay의 반복 분석 내 변동 계수 분포도이다.
도 7은 본원에 따른 방법의 일 구현예에서, 면역조직화학으로 구분된 HER2 시료군을 구분하는 PRM-MS로 정량화된 7개 펩타이드이다.
도 8은 본원에 따른 방법의 일 구현예에서, 면역조직화학으로 구분된 PR, ER, AR 시료군을 구분하는 PRM-MS로 정량화된 펩타이드들이다. PR의 경우, 도 8의 A에서 나타난 4개의 펩타이드이고, ER과 AR은 각각 B와 C에 나타나있다.
도 9는 본원 방법에 따른 일 구현예에서 7명의 유방암 환자의 조직 검체를 이용해 PRM-MS 분석을 수행한 결과로 다중 표적의 동시 정량이 가능함을 나타내다. 세로축 Log2 (L/H ratio)의 L은 Light, 즉 생체 시료 내의 펩타이드의 Peak 면적으로 단백질 존재량을 나타내고, H는 Heavy, 즉 전처리 과정에서 일정량을 시료에 주입한 펩타이드 표준물의 피크 면적을 의미한다. 따라서 L/H 비는 생체 시료 내의 단백질 존재량을 표준물의 존재량으로 표준화(Normalization)한 값이며, 표준화된 단백질 존재량을 뜻한다. 수치 간의 용이한 비교를 위해 이항 로그로 치환한 값을 사용하였다.

본원은 유방암의 아형분류에 사용되는 4가지 마커를 질량분석법을 이용하여 동시에 정확하게 발현 상태를 결정할 수 있는 방법에 관한 것이다.

유방암은 단백질 마커의 종양 내 발현 상태에 따라 HER2 과발현, Luminal A, Luminal B, Basal, 및 Normal-like 등의 5가지 아형으로 나뉜다. 유방암의 예후와 항암제에 대한 반응의 상이성으로 인해, 치료 전략은 아형에 따라 상이하기 때문에, 정확한 발현량 결정에 근거한 발현상태를 기초로 정확한 아형을 결정하는 것이 필요하다.

한 양태에서 본원에 따른 방법은 유방암 환자의 아형 분류에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 유방암 조직 시료로부터 단백질 분해물을 제조하는 단계; 및 상기 유방암 조직시료에서 유방암 아형 분류 마커로서 HER2, ER (Estrogen Receptor), PR (Progesteron Receptor) 및 AR (Androgen Receptor) 단백질의 발현량을 질량분석법으로 결정하는 단계를 포함하며, 상기 발현량을 상기 각 마커의 발현 상태와 연관시키는 단계로, 상기 발현 상태는 HER2의 경우 0 (음성), 1+ (음성), 2+ (경계선) 또는 3+ (양성 또는 과발현)중 어느 하나 이상이고, 상기 ER, PR 및 AR의 각각의 발현 상태는 양성 또는 음성이고, 상기 질량분석법에 사용되는 상기 각 단백질의 펩타이드는 표 1과 같으며, 상기 HER 및 PR은 하나 이상의 펩타이드가 사용되는 것인, 유방암 아형 분류 마커의 질량분석을 통한 발현량에 근거한 발현 상태 결정방법을 제공한다.

[표 1]

표 1에서 서열중 시스테인 잔기 (C)에는 modification 발생으로 인하여 질량대전하값이 변하게 되므로 상기 잔기 옆에 전하량을 표시하였다.

본원에 따른 방법에 사용되는 질량분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함할 수 있다. 이때 사용되는 질량 분석법 모드는, 예를 들어 병행 반응 모니터링(Parallel Reaction Monitoring, PRM), 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM) 일 수 있다.

일 구현예에서는 PRM 모드가 사용된다. PRM-MS 분석 원리는 표적 단백질들을 모두 펩타이드로 가수분해 시킨 후에, 각 타겟 단백질들에 특이적인 mass to charge (m/z)를 가지는 펩타이드들을 선택하고 미리 장비에 입력한다. 이 특이적인 펩타이드들은 질량분석기에 주입될 때, 전하를 띄게 되어 Precursor ion (MS1)이 된다. 그리고 Precursor ion을 질량분석기 내에서 질소 분자와 충돌시켰을 때 발생하는 파편들을 Product ion (MS2)이라 한다. 분석자는 Product ion 중에서 존재량이 많으며, 반복적으로 검출되는 Ion 약 5개를 선택한다. 모든 타겟 단백질 (300개 단백질 이상)에 대해서 Precursor ion 및 Product ion을 측정하면 시료에 있는 모든 타겟 단백질의 양을 동시에 상대 혹은 절대 정량할 수 있다. 상대 혹은 절대 정량을 위해서는 Stable isotope-labeled synthetic(SIS) 펩타이드, 즉 동위원소로 치환된 동일 아미노산 순서를 가진 합성 펩타이드는 내부 표준 물질로 사용하는데, 내부 표준 물질의 주입량을 알고 있기 때문에 타겟 펩타이드 양을 비례적으로 계산할 수 있다. Product ion들은 질량분석 과정의 종점인 검출기에서 Digital signal로 전환되어 Peak으로 나타내어지며 Peak 면적을 통해 정량화된다. 면역 반응 분석법에 비해서, PRM-MS 방법은 한 번의 분석으로 300개 ~ 500개 타겟단백질을 동시에 정량 할 수 있고, 다수 시료에서 높은 재현성으로 절대 정량 할 수 있다는 장점을 지내고 있다.

유방암은 단백질 마커의 종양 내 발현 정도에 따라 HER2 과발현, Luminal A, Luminal B, Basal, 및 Normal-like 등의 5가지 아형으로 나뉜다. 유방암의 예후와 항암제에 대한 반응의 상이성으로 인해, 치료 전략은 아형에 따라 상이하다. 이러한 아형을 결정하는 단백질 마커는 HER, ER, 및 PR 등의 3개 단백질이며 최근에는 AR 단백질을 더해 세부 분류를 나누는 시도를 하였다 (McGhan, Ann Surg Oncol, 2014). 예를 들면 본원 펩타이드 검출법을 이용해 상기 네 가지 단백질의 발현량에 근거한 발현 상태를 판정하여 그 결과를 유방암 아형과 연관시킬 수 있다. 일례로, 어떤 유방암 조직 내 HER2가 2-positive (2+)이고 PR, ER, AR이 negative라면 HER2 과발현 아형으로 판정할 수 있으며, 이에 따라 치료 계획도 수립할 수 있게 된다. 또 다른 예로, HER2가 negative, ER이 positive, PR이 positive인 경우, Luminal A 아형으로 분류할 수 있다. 또 다른 예로 Luminal B 아형은 ER이 positive, PR이 positive인 경우이면서 HER2가 positive인 경우에 분류된다. 또한 Basal subtype은 HER, ER, PR 모두가 negative인 경우이며, 마지막으로 Normal-like subtype은 어떤 아형에도 해당되지 않는 경우를 말한다.

예를 들어, HER2 단백질이 과발현된 유방암은 HER2 단백질이 세포막에 과발현되어 있으며, ER (에스트로젠 수용체) 및 PR (프로제스테론 수용체) 단백질은 음성인 아형이다. 이 유형의 유방암은 전체 유방암의 15 ~ 20%를 차지한다. HER2 유형의 유방암은 다른 종류의 유방암에 비해 공격성이 크며, 재발 가능성이 높아 예후가 좋지 않고, 그에 따라 생존율이 낮다. 그러나 이 유형의 유방암은 Traszumab (판매명: Herceptin) 약제에 대한 반응성이 좋아 환자들은 일반적으로 투여받는다.

따라서, 유방암 환자의 마커 발현의 정확한 측정은 수용체 양성 및 음성 환자의 예후 및 치료 방침을 결정하는데 있어 매우 중요하다고 볼 수 있다.

HER2가 과발현되는 경우 이에 특화된 치료제를 선택할 수 있기 때문에, 정확한 발현 상태를 결정하는 것이 중요하다. 현재 사용되는 방법은 먼저 IHC 검사 결과에 따라 발현량에 따라 HER2 스코어가 0 (음성), 1+ (음성), 2+ (경계선) 또는 3+ (양성-Her2 단백질 과발현)로 표시된다.

ER, PR 및 AR은 IHC 검사 결과에 따라 발현 양성 또는 음성(-)으로 분류된다. 상세 기준으로는, 병리학자가 관찰한 세포 중 1% 이상의 세포가 IHC 염색이 되었을 시 양성, 1% 미만의 세포가 IHC 염색되었을 시 음성으로 한다.

본원에 따른 방법은 IHC를 수행하지 않고도 아형분류에 사용되는 마커의 발현 상태를 수치화하여 정확하게 결정할 수 있다. 본원에서는 이러한 상태의 정확한 구분에 특히 각 마커별로 상기 표 1의 펩타이드가 사용된다. 표 1의 각 펩타이드와 해당 m/z, 프러덕트 이온과 해당 m/z, 충돌 에너지의 범위는 본원 실시예를 참조할 수 있다.

일 구현예에서는 유방암 환자에서 유래한 FFPE 조직 시료와 Q-exactive Orbitrap 질량분석기를 이용한 PRM-MS 분석을 통해 HER2 단백질 펩타이드 (ELVSEFSR 483.7482++; FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR 1184.5946++; GIWIPDGENVK 614.3220++; GLQSLPTHDPSPLQR 823.4365++; NPQLC[+57.0]YQDTILWK 839.9165++; ITDFGLAR 446.7480++; VLQGLPR 391.7478++); PR 단백질 펩타이드 (AEGAPPQQGPFAPPPC[+57.0]K 874.924871++; VLLLLNTIPLEGLR 782.495258++; TQDQQSLSDVEGAYSR 892.408294++; QLLSVVK 393.757821++); AR 단백질 펩타이드 (GC[+57.0]VPEPGAAVAASK 657.329544++); ER 단백질 펩타이드 (LLFAPNLLLDR 642.887355++)가 충돌 에너지 16 ~ 26의 범위에서 단편화되어 나온 아래 프러덕트 이온 5개 (ELVSEFSR의 y6, 724.3624+; y4, 538.2620+; y3, 409.2194+; y2, 262.1510+; b3, 342.2023+; FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR의 y12, 1310.6375+; y11, 1253.6161+; y8, 998.4942+; y5, 673.3304+; b2, 247.1441+; GIWIPDGENVK의 y9, 1057.5313+; y7, 758.3679+; y5, 546.2882+; b3, 357.1921+; b4, 470.2762+; GLQSLPTHDPSPLQR의 y10, 1147.5854+; y8, 949.4850+; y6, 697.3991+; b7, 697.3879+; b9, 949.4738+; NPQLC[+57.0]YQDTILWK의 y10, 1339.6715+; y9, 1226.5874+; y8, 1066.5568+; y2, 333.1921+; b3, 340.1615+; ITDFGLAR의 y7, 779.4046+; y6, 678.3570+; y5, 563.3300+; y4, 416.2616+; b3, 330.1660+; VLQGLPR의 y5, 570.3358+; y4, 442.2772+; y2, 272.1717+; b2, 213.1598+; b3, 341.2183+; AEGAPPQQGPFAPPPC[+57.0]K의 y13, 1420.7042+; y9, 970.4815+; y8, 913.4600+; y5, 598.3017+; y3, 404.1962+; VLLLLNTIPLEGLR의 y10, 1125.6626+; y9, 1012.5786+; y8, 898.5356+; y6, 684.4039+; b3, 326.2438+; TQDQQSLSDVEGAYSR의 y12, 1311.6175+; y11, 1183.5590+; y9, 983.4429+; y5, 553.2729+; b3, 345.1405+; QLLSVVK의 y6, 658.4498+; y4, 432.2817+; b3, 355.2340+; b4, 442.2660+; b6, 640.4028+; GC[+57.0]VPEPGAAVAASK의 y11, 997.5313+; y9, 771.4359+; y2, 234.1448+; b2, 218.0594+; b3, 317.1278+; LLFAPNLLLDR의 y9, 1058.5993+; y8, 911.5309+; y7, 840.4938+; y5, 629.3981+; b3, 374.2438+)의 피크면을 기준으로 각 마커 단백질 발현량을 산출한다.

본원에 따른 유방암 아형 결정에 필요한 정량 기준 또는 발현 상태는 당업자의 수준에서 임계값을 결정하여 각 마커의 판단에 사용될 수 있다.

일 구현예에서는 단백질 발현량 또는 발현량에 근거한 음성 및 양성을 구분짓는 임계값은 HER2, ER, PR, AR 단백질의 펩타이드 정량 분석 수치를 이용해 인접한 HER2, ER, PR, AR의 IHC 스코어를 구분하는 ROC 곡선을 그린 뒤 Youden 지수 (Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430) (J 지수)가 최대가 되는 수치 (J 지수 = 민감도 + 특이도 - 1)로 결정할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 시료는 FFPE (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) 이다. FFPE 조직 시료는 유방암 진단 및 표적항암치료제 적용 여부를 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 임상 시료 표본으로, 다양한 단계별 시료가 보관되어 있으며, 손쉽게 저비용으로 활용이 가능한 검체이다. 따라서, 유방암 환자 유래 FFPE 조직 시료를 이용한 MRM-MS 분석법을 통해 유방암 아형분류 마커의 펩타이드 정량을 통해 유방암 아형분류를 기존의 방법보다 더 정확하고, 재현성 있게 측정이 가능하다.

본원에 따른 방법에서 질량 분석에 사용하기 위한 단백질 분해물은 트립신 분해물이다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 FFPE 조직시료는 약 4시간 동안 처리된 경우, 가장 정확한 결과를 수득하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 방법 및 재료

1. 시료 및 임상적 특징

본 발명에 사용된 FFPE 조직 시료는 유방절제술을 시행한 51명의 유방암 환자로부터 채취되었으며, 모든 환자로부터 서면 동의서를 제공받았다. 두명의 병리학자가 IHC (Immuno Histo Chemistry) 방법으로 판정한 조직 시료의 HER2, ER, PR, 및 AR 단백질의 발현 상태는 표 2와 같다.

[표 2]

2. 유방암 조직 채취 및 FFPE 조직 블록 제작

유방절제술을 통해 절제한 유방암 병변 조직을 채취 후 조직 손상을 방지하고, 조직을 오랫동안 보관하기 위해 포르말린 용액에 조직을 두어 조직을 고정(fixation) 시켰다. 이어 흐르는 물에 고정한 조직을 두어 씻어주는 과정을 통해 조직 겉면에 묻은 formalin 용액을 제거하였다. 이어 탈수 과정을 통해 조직 내 존재하는 수분을 제거 (조직을 물 → 50% 에탄올 → 70% 에탄올 → 85% 에탄올 → 100% 에탄올 순으로 담가서 탈수)하였다. 다음으로 파라핀 침투가 용이하게 하기 위해 Xylene을 이용하여 탈수제를 제거하였다. 이러한 과정을 통해 조직 내 파라핀을 침투시켜서 굳혀 조직을 보호하고, 조직이 오랫동안 보관될 수 있는 상태로 만들어주었다.

(1) 유방암 FFPE 조직 절편 제작 및 H&E 염색

박절기(microtome)를 이용하여 10μm 두께로 FFPE tissue block을 박절(section)하여 FFPE 조직 절편을 얻었고, 각 시료마다 3장의 절편을 제작하였다. 박절된 조직 절편은 유리 슬라이드에 올린 뒤 자연 부착이 이루어지도록 말렸다.

3장의 조직 절편 중 1장은 H&E (Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 세포의 핵 및 세포질 염색에 사용하였다. H&E 염색 한 FFPE 조직 절편을 이용하여 병리학자가 종양 형성 부위를 표기하였다. 남은 2장의 조직 슬라이드는 실험 전까지 보관하였다.

(2) 유방암 FFPE 조직 절편의 파라핀 제거, 수화 및 단백질 추출

1 M Tris-Cl (pH 8.5) 용액을 이용해서 10% SDS 용액과 0.5 M TCEP 용액을 희석하여서 4% SDS, 4 mM TCEP 용액으로 만들었다. 유방암 FFPE 조직 절편에서 파라핀을 제거하고 다음과 같이 수화하였다 (Xylene → Xylene → 100% 에탄올 → 100% 에탄올 → 70% 에탄올 → 50% 에탄올 → 물 순으로 3분씩 담가서 수행). 상기 과정이 완료된 FFPE 조직 절편에 300 mM Tris-Cl (pH 8.5) 용액을 200μL 씩 적셔서 조직이 마르는 것을 방지하였다. 이 용액은 조직의 scrap 전에 흘려서 제거하였다. 에펜돌프 튜브에 100μL의 4% SDS, 4 mM TCEP 용액을 넣고, 여기에 유방암 FFPE 조직 절편에서 종양 부분만을 scraper를 이용하여 긁어낸 유방암 조직을 넣고, 프로브 소니케이터를 이용해서 조직을 파쇄 (Amplitude: 30%) 펄스 ON, OFF 각각 4초씩 20회 반복하고 Water bath에서 3시간 가열 (95℃)하였다. 이를 상온에서 식힌 후, 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 (20℃ 유지)하였다. 원심분리 후 펠렛을 제외한 상층액을 새 에펜돌프 튜브로 옮겼다.

3. 단백질의 정제 및 펩타이드화 (in vitro digestion)

상기 50μg에 해당하는 단백질 시료를 새 1.5 ml Eppendorf tube로 옮겼다. 시료 부피의 5배에 해당하는 아세톤을 넣은 후 시료와 아세톤을 천천히 섞은 뒤 -20℃에서 18시간 동안 Incubation 하였다. Incubation 후 15,000 rpm에서 15분간 원심분리 (4℃ 유지) 아세톤을 버린 뒤 새로이 -20℃로 보관한 아세톤 500μl를 Tube 벽면을 따라 조심스럽게 넣고 15,000 rpm에서 15분간 원심분리 하였다 (4℃ 유지). 아세톤을 버린 뒤 Tube 뚜껑을 열어 둔 채로 2시간 보관하여 Tube 안에 남은 아세톤을 모두 기화 시켰다. 침전된 단백질에 30μl의 SDT buffer (4% SDS, 0.1M DTT, 0.1M Tris-Cl (pH 8.5))를 넣고 Vortexing하여 침전된 단백질을 Buffer에 골고루 녹였다. SDT buffer에 녹인 시료를 95℃에서 30분간 Incubation 후 상온에서 식힌 뒤, Spin-down하여 이물질을 가라앉혔다. Amicon ultracel filter(30K)와 Centrifugal tube를 접합 시킨 후 Filter에 Urea buffer (8M Urea, 0.1M Tris-Cl(pH 8.5))를 350μl 먼저 넣은 후 단백질 시료를 넣었다. 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). Filter에 Urea buffer 350μl 넣은 후 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). 1회 더 반복하였다. Filter에 50 mM IAA 용액을 200μl 넣은 후, 상온에서 30분 간 Incubation 하였다. 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). Filter에 Urea buffer를 350μl 넣은 후 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). 1회 더 반복하였다. Filter에 40 mM Ammonium bicarbonate(ABC) 용액을 350μl 넣은 후 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). 2회 더 반복하였다. Filter를 새로운 Centrifugal tube에 접합한 뒤 Filter에 40mM ABC 용액 100μl을 넣고 0.1 μg/μl Trypsin 용액을 Trypsin:Protein의 비가 1:50이 되도록 첨가한 후 18시간 동안 37℃에서 Incubation 하였다. Incubation 끝난 뒤, Tube를 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지).

4. 펩타이드 탈염화 및 내부표준물 혼합

Filter에 40mM ABC 100μl 넣은 후 14,000 g로 15분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). Filter에 HPLC 사용 등급의 물을 50μl 넣은 후 14,000 g로 20분간 원심분리 하였다 (20℃ 유지). Tube에 10% Trifluoroacetic acid (TFA)를 5μl 넣어 섞은 후 CR paper를 이용하여 약산성도를 확인하였다. 100μl pipette tip에 C18 membrane을 넣어 좁은 쪽을 막고, C18 resin을 1cm 넣었다. C18 Stage tip에 메탄올을 100μl씩 3번, Acetonitrile(ACN)을 100μl씩 3번, 0.1% TFA를 100μl씩 3번 흘려서 Resin activation 및 Equilibration을 시행하였다. C18 Stage tip에 펩타이드 시료를 흘려준 뒤 Flow-through를 다시 C18 Stage tip에 흘렸다. 이후 0.1% TFA를 100μl씩 3번 흘려줘서 세척하였다. 40% ACN/0.1% formic acid 100μl, 60% ACN/0.1% formic acid 100μl, 60% ACN/0.1% formic acid 100μl, 80% ACN/0.1% formic acid 100μl를 차례로 흘려주어 C18 resin에 붙어있는 Peptide를 용출(Elute) 시켰다. 용액 안의 펩타이드 양은 Tryptophan fluorescence assay를 통해 측정하였다. 25μg의 펩타이드를 1시간 이상 -70℃에서 얼린 다음, 동결건조 시켰다.

동결건조된 시료에 3% ACN/0.1% 포름산 27 ul를 넣어 다시 용해시켰다. 50 fmol/ul의 SIS peptide mixture를 3μl 넣어 총 30μl로 만들었다. 용액을 액체 크로마토그래피 용 유리 바이알에 옮겼다.

5. Q-Exactive LC-MS/MS 분석 (Parallel reaction monitoring, PRM, mode)

펩타이드 용액이 들어있는 Glass vial은 Easy Nano Liquid chromatography 2 (Thermo Fisher Scientific, USA)의 Auto-sampler에 넣었다. Liquid chromatography를 통과해 이온화된 펩타이드는 Precursor ion이라 부르며, 질량분석기 Q-exactive Orbitrap MS (Thermo Fisher Scientific, USA) 내 S-lens를 통해 들어간 Precursor ion 중 사용자가 미리 지정한 고유질량을 갖는 Precursor ion들만이 Quadrupole mass filter에서 통과되어 순차적으로 HCD cell로 보내지고, Fragmentation이 일어나 Product ion으로 분해되었다. 발생한 Product ion들은 Orbitrap mass analyzer로 보내지고, Detector에서 Digital signal로 전환되어 기록되었다 (도 1 참조).

6. MS raw file의 사후 분석 및 정량화

LC-MS/MS 분석을 통해 도출된 MS raw file의 사후 처리를 위해 Skyline program에 Raw file을 import 하였다. 7개의 HER2 펩타이드, 4개의 PR 펩타이드, 1개의 ER 펩타이드, 1개의 AR 펩타이드, 그리고 13개의 내부표준물 펩타이드에 대한 정량화 수치를 산출하기 위해 각 펩타이드 Peak의 Integration을 진행하였다.

각 펩타이드에 해당하는 MS Peak을 지정하고, 내부표준물인 SIS peptide와 동시에 검출되었는지 확인한 뒤, 밑넓이를 적분하여 정량화하는 작업을 수행하였다. SIS peptide와 Endogenous peptide peak의 밑넓이 비를 산출하였다.

7. 면역조직화학법과의 결과 일치성 검사

상기 PRM-MS assay로 정량화한 각 단백질 마커들이 면역조직화학법으로 분류된 단백질 음성/양성 그룹 간 차이를 대변할 수 있는지 확인하기 위해 Mann-Whitney U-test로 검정하였다.

실시예 1. PRM-MS 어세이 개발과 분석에 사용된 고유 펩타이드 선정

본 실시예에서는 도 2에 표시된 바와 같이 PRM-MS 분석을 통해 각 마커의 정량화 대상이 될 표적 펩타이드를 선정하였다. 표적 펩타이드는 MCF-7, MDA-MB-453, BT-474의 3가지 유방암 세포주의 전단백질 분석(Whole proteome analysis)를 통해 선정되었다 먼저 유방암 세포주의 전단백질(Whole proteome)을 추출한 뒤 체외 단백질 분해 (in vitro digestion) (Modified trypsin/LysC mixture)을 통해 펩타이드로 만들고 정제하였다. 다음으로, 정제된 전펩타이드(Whole peptide)를 액체크로마토그래피로 분리하고 질량분석기에 주입한 뒤 Untargeted shot-gun proteomics 방식으로 분석하였다. 결과로 수집된 데이터를 단백질 서열 분석 프로그램 (Proteome Discoverer version 2.2)에 입력하여 시료 내 모든 펩타이드의 서열을 결정하였다. 마지막으로, 검출된 펩타이드 중 HER2, ER, PR, 및 AR 단백질로부터 고유하게 유래된 펩타이드만을 선정하였는데, 모든 인체 단백질의 서열이 작성되어있는 protein sequence database에서 오직 한 번씩만 HER2, ER, PR, AR 단백질에 존재하는 고유한 서열만을 선정하였다. 전단백질 분석의 결과, HER2 단백질은 8개, PR 단백질은 6개, ER 단백질은 1개, AR 단백질은 10개의 고유 펩타이드 (단백질에 고유한 서열을 갖는 펩타이드)가 발굴되었고, 이들을 표적 펩타이드로 결정하였다.

이 25개의 펩타이드들에 대해 동위원소가 표지된 내부표준물 SIS (unpurified stable-isotope-labeled standard)를 제작하였다. 내부표준물을 섞은 세포주 또는 FFPE 조직 용해 시료를 PRM mode로 5회씩 반복 분석했을 때, 반복적으로 검출이 잘 되는 24개 펩타이드 표적을 최종 표적으로 선정하였다.

24개 펩타이드를 가장 잘 단편화하는 Collision energy는 계단식으로 Energy를 증가시키는 방법으로 최적화하였다 (도 3). Collision energy가 최적화된 24개 펩타이드를 표적으로 하여 51 례의 유방암 조직을 실시예 2와 같이 분석했을 때, HER2 단백질의 7개, PR 단백질의 4개, ER 단백질의 1개, AR 단백질의 1개 펩타이드 등 총 13개 펩타이드가 성공적으로 정량화 되었다. 유방암 4개 단백질 마커의 정량화 표적 물질로서 본 발명에서 제시하는 13개 펩타이드와 그 고유질량값, 그리고 전하량은 표 3과 같다.

[표 3] 51 례의 유방암 조직 슬라이드를 PRM-MS 분석한 결과 성공적으로 정량화된 펩타이드

ROC 커브는 음성/양성을 판독하는 분석에서 주로 사용되는 방법으로 HER2의 경우 발현의 정도를 음성/양성으로 이분(二分)하는 목적의 분석이 아니라 총 4등급의 발현 등급을 구분하는 분석을 수행하였기에 ROC 커브가 작성되지 않아, 표 3에서 AUC 값이 기재되지 않았다. 상기 표에서 RT는 각 분석 물질(펩타이드)의 액체 크로마토그래피 내 머무름 시간(Retention time)을 의미하며, RT의 변동 계수(CV)는 액체 크로마토그래피의 분석 재현성을 나타낸다. Ratio는 펩타이드 각각의 Light-to-heavy ratio를 나타낸다. 시료 내 펩타이드의 양이 Light이고, 이에 상응하는 표준 물질(합성 펩타이드)이 Heavy이다. Ratio CV는 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 정량 분석의 재현성을 나타낸다. 표 3에서 서열중 시스테인 잔기 (C)에는 modification 발생으로 인하여 질량대전하값이 변하게 되므로 상기 잔기 옆에 전하량을 표시하였다.

이 펩타이드들은 Collision energy 16 ~ 32의 범위에서 단편화되고, 이때 발생한 펩타이드의 모든 절편, 즉 프러덕트 이온들은 질량분석기 내 Orbitrap에서 질량이 측정되고 Detector에서 검출되었다.

본 발명에서는 이 프러덕트 이온 중 Signal intensity가 가장 높은 5개의 Ion (표 3 참조)의 Peak 밑넓이를 더한 수치를 정량화에 사용하였고, 위 13개 펩타이드와 그들의 프러덕트 이온의 쌍을 최종 분석 물질로 제시하였다.

실시예 2. 본원에 따른 FFPE 조직을 이용한 PRM-MS 분석 결과

유방암 환자로부터 채취한 유방암 조직을 세척한 뒤 FFPE 처리하여 파라핀으로 둘러싸인 블록으로 만든 후, 박절기(Microtome)를 이용해 10μm 두께로 연속해서 박절하였다. 박절한 FFPE 조직 절편 중 하나는 H&E staining을 하여 세포핵과 세포의 모양을 가시화하였다 (도 4, 왼쪽 패널).

이어 PRM-MS assay를 통한 HER2, ER, PR, AR 단백질의 정량화 분석을 위해 총 51 례의 유방암 FFPE 조직 슬라이드를 이용하였다. 이 조직 슬라이드들은 수집된 뒤 기존의 면역조직화학법으로 4개 단백질 마커의 음성/양성이 판정되었다. HER2 단백질의 양성도는 발현량에 따라 Negative, 1-positive, 2-positive, 3-positive 등 4가지로, ER과 PR, 그리고 AR은 음성 및 양성으로 구성된다. 본 발명에 사용된 유방암 조직의 양성도 분포는 각 단백질 마커 별로 상이하다 (표 2).

FFPE 조직 슬라이드에서 파라핀을 제거한 뒤 종양 부분의 조직을 수화(Hydration) 하였다. 그 후, 단백질을 추출한 뒤 트립신 효소를 이용하여 in vitro digestion을 수행하였다. 고분해능 질량분석기의 PRM-MS 모드를 이용해 HER2, ER, PR, AR 단백질의 펩타이드를 정량화하고, 결과로 도출된 Peak의 밑넓이를 이용하여 각 시료의 각 단백질 마커 발현량을 수치화하였다 (방법은 도 5 플로우차트 참조).

Peak는 질량분석기 내에서 표적 펩타이드가 Product ion으로 분해된 뒤, 신호 감지기(Detector)에 전기적 신호로 기록되는 것으로 그 신호는 Product ion의 수가 많을수록 강하게 나타나며, 따라서 Peak의 밑넓이가 단백질 발현량을 나타낸다 (Zhang et al., Methods Mol Biol. 2010; 673: 211-222).

실시예 3. PRM-MS assay의 재현성 확인

51 례의 유방암 조직 슬라이드는 PRM-MS assay로 3반복 분석되었다. 모든 표적 펩타이드는 3반복 분석 중에 2-% 미만의 낮은 변동 계수(Coefficient of variation, CV)를 보였다. 13개 표적의 변동 계수의 평균치는 3.98%으로 나타났다 (도 6). 변동 계수는 액체크로마토그래피 및 질량분석기를 이용한 반복 분석에서의 실험적 안정성을 평가하는 데 사용된다. 따라서 상기 본원의 낮은 변동 계수는 본 발명에서 제시하는 분석 방법의 분석적 안정성이 높음을 나타낸다.

실시예 4. 본원에 따른 PRM-MS assay 결과와 면역조직화학법의 결과의 비교분석

HER2 단백질의 7개 표적 펩타이드의 경우, 모든 펩타이드의 정량화된 수치가 면역조직화학으로 구분된 HER2 발현 등급 시료군 사이에서 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.05의 유의한 차이를 보였다. 이 중 839.9165 m/z의 질량대전하량을 가지며 2가 양전하를 띠고 22의 Collision energy에서 최적화된 Fragmentation을 보이는 NPQLC[+57.0]YQDTILWK 펩타이드는 2-positive와 3-positive 시료군만을 구분하였다. 즉, Neg 시료군과 인접한 (약한 신호의) 1-positive 시료군은 구분을 하지 못하나, 그 밖의 인접하지 않은 시료군 사이, 일례로 Neg 시료군과 2-positive 시료군 사이, Neg 시료군과 3-positive 시료군 사이는 통계적으로 유의한 수준으로 구분하였다.

그리고 614.3220 m/z의 질량대전하량을 가지며 2가 양전하를 띠고 16의 Collision energy에서 최적화된 Fragmentation을 보이는 GIWIPDGENVK 펩타이드는 모든 인접한 시료군 사이 (즉, Neg 시료군과 1+, 1+와 2+, 및 2+와 3+ 사이를 모두 구분하였다)에서 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.05의 유의한 차이를 보였다. 다른 5개의 펩타이드는 공통적으로 Negative 시료군과 인접한 1-positive 시료군, 2-positive 시료군과 인접한 3-positive 시료군을 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.05로 유의하게 구분하였다 (도 7). 위 5개 펩타이드는 1-positive 시료군과 인접한 2-positive 시료군은 구분하지 못하였다. HER2 펩타이드 중, NPQLC[+57.0]YQDTILWK를 제외한 모든 펩타이드가 1-positive 시료군과 2-positive 시료군 사이를 제외한 모든 인접/비인접 시료군을 유의하게 분별할 수 있기 때문에, 다음 표 4에서와 같이 각 펩타이드 별로 검출가능한 아형을 근거로, 6개의 HER2 펩타이드를 적절하게 조합하면 단백질 수준의 HER2 발현 정도를 판정할 수 있다.

PR 단백질의 4개 표적 펩타이드의 경우, 모든 펩타이드의 정량화된 수치가 면역조직화학으로 구분된 PR 단백질 발현 등급 시료군 사이에서 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.05의 유의한 차이를 보였다. 이 중 782.4953 m/z의 질량대전하량을 가지며 2가 양전하를 띠고 26의 Collision energy에서 최적화된 Fragmentation을 보이는 VLLLLNTIPLEGLR 펩타이드의 구분 능력이 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.0001로 가장 뛰어났다 (도 8).

ER 단백질의 1개 표적 펩타이드의 경우, 642.8874 m/z의 질량대전하량을 가지며 2가 양전하를 띠고 22의 Collision energy에서 최적화된 Fragmentation을 보이는 LLFAPNLLLDR 펩타이드의 정량화된 수치가 면역조직화학으로 구분된 ER 단백질 발현 등급 시료군 사이에서 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.0001의 유의한 차이를 보였다 (도 8).

AR 단백질의 1개 표적 펩타이드의 경우, 657.3295 m/z의 질량대전하량을 가지며 2가 양전하를 띠고 18의 Collision energy에서 최적화된 Fragmentation을 보이는 GC[+57.0]VPEPGAAVAASK 펩타이드의 정량화된 수치가 면역조직화학으로 구분된 AR 단백질 발현 등급 시료군 사이에서 Mann-Whiteney U-test p-value < 0.05의 유의한 차이를 보였다 (도 8).

각 마커별 펩타이드를 이용한 발현 분류는 다음 표 4와 같다.

[표 4]

유방암은 HER2 과발현, Luminal A, Luminal B, Basal, 및 Normal-like 등의 5가지 아형으로 나눌 수 있다. 예를 들면 본원 펩타이드 검출법을 이용해 상기 네 가지 단백질의 발현 정도를 판정하여 그 결과를 유방암 아형과 연관시킬 수 있다. 일례로, 어떤 유방암 조직 내 HER2가 2-positive (2+)이고 PR, ER, AR이 negative라면 HER2 과발현 아형으로 판정할 수 있으며, 이에 따라 치료 계획도 수립할 수 있게 된다. 또 다른 예로, HER2가 negative, ER이 positive, PR이 positive인 경우, Luminal A 아형으로 분류할 수 있다. 또 다른 예로 Luminal B 아형은 ER이 positive, PR이 positive인 경우이면서 HER2가 positive인 경우에 분류된다. 또한 Basal subtype은 HER, ER, PR 모두가 negative 인 경우이며, 마지막으로 Normal-like subtype은 어떤 아형에도 해당되지 않는 경우를 말한다.

실시예 5. PRM-MS assay가 면역조직화학법의 결과에 대해 갖는 장점 분석

PRM-MS assay는 초고성능 액체 크로마토그래피와 고분해능 질량분석기를 이용하기 때문에 다중 표적 물질을 약 60분 이내의 분석 한 회로도 정량화할 수 있다.

이는 조직 슬라이드 하나 당 하나의 항체로 염색 실험을 수행해야하는 기존 면역조직화학법에서는 불가능한 일로, PRM-MS assay는 기존 방법에 비해 단축된 분석 시간을 가진다. 도 4의 결과를 얻기 위해, 면역조직화학법은 총 4번의 독립된 실험을 수행해야하지만 PRM-MS는 1회의 분석으로 충분하다 (도 4).

예로써, 7명의 유방암 환자의 조직 검체를 이용해 7회의 PRM-MS 분석을 수행하면 도 9의 결과처럼 4개 단백질 마커의 발현량이 수치화되어 나타나게 된다 (도 9). 예를 들면 단백질 발현량을 나타내는 수치는 Log2(L/H ratio)이다. 이 수치의 차이는 곧 시료 내 해당 단백질의 발현량 차이를 나타내며, 수치의 그룹 간 통계 검정 결과 유의한 차이를 나타냈다. 실제 임상 적용시에는 고순도의 표준물을 사용하여 본 방법을 통해 Log2(L/H ratio)를 정확한 농도 수치 (nmol/ng 등) 변환할 수 있다. 그 후 HER2 status, ER, PR, AR 단백질 발현의 음성 및 양성을 구분짓는 임계값을 Youden 지수(J 지수)가 최대가 되는 수치 (J 지수 = 민감도 + 특이도 - 1)로 결정할 수 있다. HER2 상태에 따른 임계값 결정, 임계값 이하는 음성, 임계값 이상은 양성으로 판단할 수 있다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Mass spectrometry-based method of quantifying receptor proteins used for breast cancer subtyping <130> DP202003003P <150> KR 10-2019-0150937 <151> 2019-11-22 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HER2 <400> 1 Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(21) <223> HER2 <400> 2 Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp 1 5 10 15 Ser Thr Phe Tyr Arg 20 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> HER2 <400> 3 Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(8) <223> HER2 <400> 4 Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> HER2 <400> 5 Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> HER2 <400> 6 Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> HER2 <400> 7 Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> ER <400> 8 Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> PR <400> 9 Gln Leu Leu Ser Val Val Lys 1 5 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(16) <223> PR <400> 10 Thr Gln Asp Gln Gln Ser Leu Ser Asp Val Glu Gly Ala Tyr Ser Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> PR <400> 11 Ala Glu Gly Ala Pro Pro Gln Gln Gly Pro Phe Ala Pro Pro Pro Cys 1 5 10 15 Lys <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> PR <400> 12 Val Leu Leu Leu Leu Asn Thr Ile Pro Leu Glu Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(14) <223> AR <400> 13 Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys 1 5 10

Claims (9)

1. 유방암 아형 분류에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
   유방암 조직 시료로부터 단백질 분해물을 제조하는 단계;
   상기 유방암 조직시료에서 유방암 아형 분류 마커로서 HER2 (Human Epidermal growth factor Eeceptor 2), ER(Estrogen Receptor), PR(Progesteron Receptor) 및 AR(Androgen Receptor) 단백질의 발현량을 질량분석법으로 결정하는 단계; 및
   상기 발현량을 상기 각 마커의 발현상태로서, HER2는 0 (음성), 1+ (음성), 2+ (경계선) 또는 3+ (양성 또는 과발현), 상기 ER, PR 및 AR의 각각의 발현 상태는 양성 또는 음성으로 연관시키는 단계를 포함하며,
   상기 질량분석법에 사용되는 상기 각 단백질의 펩타이드는 하기 표와 같으며, 상기 HER 및 PR은 하나 이상의 펩타이드가 사용되는 것이며,
   상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하며, 그리고
   상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 병렬 반응 모니터링(Parallel Reaction Monitoring, PRM) 인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법:
   

   

   
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 조직 시료는 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 단백질 분해물은 트립신 분해물인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 방법은 상기 단백질 분해물을 정량하기 전에 분획하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 분획하는 단계는 액체 크로마토그래피로 수행되는 것인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법.
   
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 각 단백질의 발현 상태는 상기 각 펩타이드에서 단편화되어 나온 프러덕트 하기 이온 5개의 피크의 면적으로 결정되는 것인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법:
   

   

   
   
9. 제 1 항, 제 2 항 및 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 각 단백질의 발현 상태를 유방암의 아형 분류와 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 유방암 아형 분류 마커의 발현 상태 결정방법.

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