KR102221206B1

KR102221206B1 - 유방암 샘플에서 질량분석법 의한 her2 정량 방법 및 이를 이용한 her2 상태 스코어링

Info

Publication number: KR102221206B1
Application number: KR1020190093135A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 유한석; 김현수; 도미솔
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-07-31
Publication date: 2021-03-02
Also published as: KR20200107731A

Abstract

본원은 유방암 조직 시료에서 질량분석법을 이용한 HER2 단백질의 정확한 정량 방법 및 이를 기초로한 HER2 스코어링 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 기존의 방법과 비교하여 정확하고, 재현성 있게 측정이 가능하여, 이에 따른 맞춤형 치료가 가능해지면 환자의 수명 연장은 물론, 범국가적으로도 사회경제적 비용을 획기적으로 낮출 수 있다.

Description

유방암 샘플에서 질량분석법 의한 HER2 정량 방법 및 이를 이용한 HER2 상태 스코어링 {Method of quantifying HER2 proteins in breast cancer sample using mass spectrometry and HER2 status scoring using the same}

본 발명은 유방암 조직 시료에서 질량분석기에 의한 HER2 단백질 정량 방법 및 이의 동반진단에서의 용도와 관련된 기술이다.

유방암은 우리나라에서 여성암 발생률 2위(14.8%)를 차지하며, 유방암 발생률은 여성 인구 10만명 당 52.1명으로 아시아 국가 중 1위를 기록하고 있다. 심사평가원 통계에 따르면 최근 5년간 국내 유방암 환자가 약 4만여명 증가하였으며, 유방암 관련 청구 건수 및 요양급여비용이 2013년 대비 2017년에 각각 123.2%, 151.4% 증가하였다.

HER2 수용체 양성 유방암 환자는 전체 유방암 환자의 15~20%를 차지한다. HER2 수용체 양성 유방암은 다른 종류의 유방암에 비해 공격성이 크며, 재발 가능성이 높아 예후가 좋지 않고, 그에 따라 생존율이 낮다. 따라서, 유방암 환자의 HER2 단백질의 발현 정도를 정확하게 측정하는 것이 HER2 수용체 양성 유방암 환자의 예후 및 치료 전략을 결정하는데 있어 매우 중요하다.

하지만, 현재까지 HER2 단백질 발현량을 정확하게 측정할 수 있는 유니버설 골드 스탠다드는 존재하지 않고 있다. IHC(Immuno Histo Chemistry 면역조직화학)를 이용한 HER2 단백질과 발현의 분석 평가 및 FISH(Fluorescent in situ Hybridization)을 이용한 HER2 유전자 증폭 평가는 FDA에서 승인한 방법으로 현재까지 HER2 양성 유방암과 음성 유방암을 판단하기 위해 사용되는 가장 중요한 기술이다.

그러나, IHC기술은 HER2 단백질 발현을 정량적으로 수치화할 수 없고, 단순히 병리학자가 HER2 단백질의 면역 염색 수준을 육안으로 판단하기 때문에 병리학자의 주관이 개입되어 위양성(false-positive) 또는 위음성(false-negative) 결과가 도출될 수 있으며 재현성 또한 낮다. IHC검사를 통해 HER2 2+ (equivocal)로 판명될 경우에, FISH를 이용하여 HER2 단백질의 과발현 정도를 더 세밀히 재평가하는데, FISH 기술은 까다로우며, 비용이 많이 드는 문제가 있다.

따라서, HER2 단백질 발현을 정확하게 정량화하여 수치화하는 기술 개발이 필요하다.

미국 특허출원공개공보 US2013/0302328호는 전장 HER2와 절단된 HER2를 정량하는 방법에 관한 것이다.

대한민국 특허출원공개공보 제2018-0036653호는 최적의 암 치료를 위한 HER2 단백질 정량에 관한 것이다. 하지만 상기 문헌은 환자별로, 또는 환자의 샘플별로 HER2 단백질 발현 정도에 차이가 나는 것을 보정할 수 있는 방법이 제시되어있지 않고 상피 세포 특이적 단백질의 펩타이드 서열 및 해당 서열에 해당하는 전구체 전하 상태 등이 개시되어 있지 않다.

본원은 유방암 시료에서 질량분석법을 이용하여 HER2 발현정도를 정확하게 결정하고 이를 기초로 HER2 스코어를 결정하는 방법을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 유방암 환자의 HER2 스코어링에 대한 정보를 제공하기 위해, 인비트로에서 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정 또는 결정하는 방법으로, 상기 방법은 환자 유래의 유방암 시료로부터 제조된 단백질 분해물 중의 특정 HER2 펩타이드 단편의 양, 및 표준화 인자로서 표 1로부터 선택되는 상피세포 발현 단백질의 펩타이드 단편 중 어느 하나의 단편의 양 또는 상기 유방암 시료의 일정 면적에 포함된 유방암 세포 수를 결정하는 단계; 및 상기 결정된 HER2 펩타이드 양을 상기 표준화 펩타이드 양 또는 상기 유방암 세포 수로 표준화하여 표준화된 HER2 펩타이드 양을 산출하는 단계를 포함하며, 상기 특정 HER2 펩타이드 단편은 VLQGLPR (서열번호 1) 또는 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR (서열번호 2) 이고, 상기 펩타이드 단편의 양은 질량분석법으로 결정된다.

본원에 따른 상기 HER2 펩타이드 서열 및 이의 농도를 표준화(Normalization) 하는 펩타이드 및 표준화 방법은 질량분석법에서 최적의 효과를 나타내는 것으로 종전에 전혀 개시된 바 없는 우수한 효과를 나타낸다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법의 유방암 시료는 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 질량 분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함한다.

다른 구현예에서는 본원에 따른 방법에 사용되는 질량 분석법 모드로서 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)이 사용된다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 단백질 분해물은 트립신 분해물을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 구현예에서 본원에 따른 방법에서 트립신 등과 같은 단백질 분해효소로 분해된 단백질 분해물은 정량하기 전에 분획하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 액체 크로마토그래피로 수행될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 상기 표준화된 HER2 단백질의 펩타이드는 VLQGLPR (서열번호 1) 또는 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR (서열번호 2) 이고, 상기 표준화 인자 펩타이드는 JAM1의 VTFLPTGITFK (서열번호 3)이 사용된다. 이 경우, 서열번호 1의 서열이 사용되는 경우 상기 표준화된 HER2 펩타이드의 양은 고유질량 값 391.7478++의 상기 펩타이드 VLQGLPR에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크 면적 비를 고유질량 값 612.3554++의 JAM1의 펩타이드 VTFLPTGITFK에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 나눈 것이다. 또는 서열번호 2의 서열이 사용되는 경우, 표준화된 HER2 펩타이드 양은 고유질량 값 790.0655+++의 상기 펩타이드 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1085.5262+; y8, 998.4942+; b10, 1115.5732+)의 피크 면적 비를 고유질량 값 612.3554++의 JAM1의 펩타이드 VTFLPTGITFK에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 나눈 것이다.

다른 양태에서 본원은 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법에 따라 산출된 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 유방암의 HER2 스코어: 0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 또는 3+와 연관시키는 단계를 포함하는, 유방암 시료의 HER2 스코어를 결정하는 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 연관시키는 단계는 대조군 시료로서, IHC(Immunohistochemistry) 및 FISH(Fluorescent In Situ Hybridization) 방법으로 HER2 스코어가 미리 결정된 유방암 시료를 이용하여 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 결정하고, 상기 대조군 시료에서 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 이용하여 각 HER2 스코어에 대한 임계값을 결정하고, 상기 유방암 시료에서 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 임계값과 비교하는 것을 포함한다.

일 구현예에서 상기 임계값은 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 이용한 ROC커브 분석에 의해 결정된 특이성 및 민감도를 이용한 Youden index (민감도 + 특이도 -1)를 이용하여 결정될 수 있다.

일 구현예에서 상기 연관시키는 단계는 상기 HER2 펩타이드로서 서열번호 1의 서열 및 표준화 인자로서 서열번호 3의 JAM1 펩타이드를 사용하여 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 각 스코어에 대하여 결정된 임계값과 비교하는 것을 포함하며, 상기 임계값으로 -3.4690 미만은 HER2 0, -3.4690 이상 -2.3603 미만은 HER2 1+, -2.3603 이상 -1.9241 미만은 HER2 2+FISH-, -1.9241 이상 -0.2897 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 -0.2897 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류하며, 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양은 상기 HER2 펩타이드와 상기 표준화 펩타이드 각각의 프러덕트 이온의 피크면적 비:

의 이항 로그 (log2) 값이다.

다른 양태에서 상기 연관시키는 단계는 HER2 펩타이드로서 서열번호 2의 서열 및 표준화 인자로서 서열번호 3의 JAM1 펩타이드를 사용하여 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 각 스코어에 대하여 결정된 임계값과 비교하는 것을 포함하며, -1.8208 미만은 HER2 0, -1.8208 이상 -1.2673 미만은 HER2 1+, -1.2673 이상 -0.5299 미만은 HER2 2+FISH-, -0.5299 이상 0.9543 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 0.9543 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류하며, 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양은 상기 HER2 펩타이드와 상기 표준화 펩타이드 각각의 프러덕트 이온의 피크면적 비:

의 이항 로그 (log2) 값이다.

본 발명에 따른 방법은 유방암 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) 조직 시료에서 HER2 단백질의 정확한 정량을 통해 HER2 스코어링(0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 3+)을 기존의 방법보다 더 정확하고, 재현성 있게 측정이 가능하다. 특히 HER2의 스코어 중 FISH 방법에 의존해서만 분별이 가능했던 2+FISH-, 2+FISH+를 구분할 수 있어, 유방암 진단이 간편하고 더 정확해짐에 따라, 그에 따른 맞춤형 치료가 가능해지면 환자의 수명 연장은 물론, 범국가적으로도 사회경제적 비용을 획기적으로 낮출 수 있을 것이다.

도 1은 MRM-MS 기술 모식도이다.
도 2는 본원의 일 구현예에 따른 유방암 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded) 조직 절편 및 MRM-MS 분석을 이용한 HER2 및 표준화 펩타이드로 이용되는 JAM1 펩타이드 정량을 통해 HER2 상태 구분하는 과정을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본원의 일 구현예에 따른 HER2 (VLQGLPR, y5)와 JAM1 (VTFLPTGITFK, y7)에 대한 역교정커브(reverse calibration curve)를 나타낸다. 타겟 펩타이드에 대한 역교정커브를 통해 dynamic range가 넓은 프러덕트 이온을 선별하고, 프러덕트 이온의 검출 및 정량 한계(LOD, LOQ) 및 기타 변수(Linearity, LLOQ, ULOQ)를 결정한다.
도 4는 본원의 일 구현예에 따른 트립신 반응 시간에 따른 HER2 펩타이드 프러덕트 이온의 피크 면적 비(peak area ratio)를 나타낸다. 트립신 반응 시간에 따라 HER2 프러덕트 이온의 MRM-MS 분석 결과가 달라지므로, HER2 프러덕트 이온의 피크 면적 비를 최적으로 하는 트립신 반응 시간을 산출한다. 최적의 트립신 반응 시간은 4시간으로 도출되었다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 세포 수 당 추출된 단백질량에 대한 표준 곡선이다. 시료 마다 종양 부위의 크기가 각기 다르기 때문에, 동일한 단백질을 추출하기 위해 사용해야 할 FFPE 조직 슬라이드 수 또한 시료마다 다르다. 또한, 각 시료로부터 추출된 단백질 양의 차이가 클수록 시료 간의 펩타이드 수율 차이가 커진다. 따라서, 시료 간 추출되는 단백질 량을 비슷하게 맞추기 위해서는 종양 면적이 상대적으로 작은 시료의 경우 여러 개의 연속적인 조직 절편으로부터 단백질을 추출해야 한다. 이러한 맥락에서, 각 시료 마다 비슷한 량의 단백질을 추출하기 위해서는 각 시료 마다 몇 장의 슬라이드를 사용할 것인지에 대한 객관적인 기준이 필요하다. 이는 종양 영역 내에 존재하는 세포 수와 종양 영역에서 추출된 단백질간의 상관관계를 나타내는 표준 곡선을 이용하는 것으로 해결할 수 있다.
도 6은 본원의 일 구현예에 따른 6개의 HER2 펩타이드간의 Spearman rank correlation - 1을 나타낸다. 210례 개별 시료 및 Agilent 6400 series를 이용한 MRM-MS 분석을 수행 후, 6개의 펩타이드간 상관성을 스페어만 랭크 상관성( Spearman rank correlation)을 통해 도출한 결과, 6개의 HER2 펩타이드간 양의 방향으로 correlation이 있음을 확인하였다.
도 7은 본원의 일 구현예에 따른 6개의 HER2 펩타이드간의 Spearman rank correlation - 2를 나타낸다. 210례 개별 시료 및 Agilent 6400 series를 이용한 MRM-MS 분석을 수행 후, 6개의 펩타이드간 상관관계를 Spearman rank correlation을 통해 도출한 결과, 6개의 HER2 펩타이드간 양의 방향으로 상관성이 있음을 확인하였다.
도 8은 본원의 일 구현예에 따른 5가지 표준화인자로 HER2 정량분석 수치를 표준화 했을 때, HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹의 구분력을 ROC 커브를 이용하여 나타낸 결과이다. HER2 정량분석 수치를 종양 면적 내 세포 수, 펩타이드량, 단백질량, 종양 조직 면적, 상피세포 특이적 펩타이드 또는 하우스키핑 펩타이드의 정량분석 수치를 이용하여 나눈 값들을 이용하여, HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹에 대한 구분력이 가장 좋은 표준화인자를 선정하기 위한 과정이다. 상피세포 특이적 펩타이드 중 JAM1 펩타이드의 정량분석 수치를 이용하여 HER2 정량분석 수치를 표준화했을 때, 두 그룹에 대한 구분력이 가장 좋았으며, 0.908의 AUC value가 도출되었다.
도 9는 본원의 일 구현예에 따른 JAM1 펩타이드(VTFLPTGITFK)의 정량분석 수치로 표준화된 HER2 펩타이드(VLQGLPR) 정량분석 수치를 이용하여 HER2 2+FISH- 그룹(61례)와 HER2 2+FISH+ 그룹(59례)를 구분한 결과이다. 상피세포 특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 HER2 단백질의 펩타이드(VLQGLPR, 391.7478++)가 충돌 에너지 3.1 ~ 23.1의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크 면적 비를 표준화한 수치를 이용하여 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹 구분 시, 정확도 89.2%, AUC value 0.908로 2가지 HER2 그룹에 대한 구분력이 가장 좋았다. 기존 IHC로는 구분할 수 없는 두 개의 그룹을 MRM-MS 분석을 통해서는 구분할 수 있음을 보여주는 그림이다.
도 10은 본원의 일 구현예에 따른 JAM1 펩타이드의 정량분석 수치로 표준화된 HER2 펩타이드 정량분석수치를 이용한 전체 HER2 상태를 구분한 결과이다. 상피세포 특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 HER2 단백질의 펩타이드(VLQGLPR, 391.7478++)가 충돌 에너지 3.1 ~ 23.1의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크 면적 비를 표준화한 수치를 이용하여 전체 HER2 상태를 구분한 결과, HER2 0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 3+, 총 5가지의 HER2 상태를 p-value < 0.01 또는 p-value < 0.001의 유의성을 보이며 구분할 수 있음을 확인하였다. 표준화된 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 바탕으로 HER2 스코어링을 할 때 기준이 되는 컷오프 수치는 표준화된 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 이항 로그(log2)로 치환한 후에, 인접한 HER2 스코어를 구분하는 ROC 곡선을 그려서 Youden-지수(J-지수)가 최대가 되는 수치(J-지수 = 민감도 + 특이도- 1)로 결정하였다. 그 결과, 표준화된 HER2 펩타이드의 정량 분석 수치의 이항 로그 값이 -3.4690 이하의 값을 가지는 시료는 HER2 0, -3.4690 이상 -2.3603 미만은 HER2 1+, -2.3603 이상 -1.9241 미만은 HER2 2+FISH-, -1.9241 이상 -0.2897 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 -0.2897 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류될 수 있다.
도 11은 본원의 일 구현예에 따른 JAM1 펩타이드(VTFLPTGITFK)의 정량분석 수치로 표준화된 HER2 펩타이드(VLQGLPR) 정량분석 수치를 이용하여 HER2 음성 유방암 그룹(121례)와 HER2 양성 유방암 그룹(89례)를 구분한 결과이다. 상피세포 특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 HER2 단백질의 펩타이드(VLQGLPR, 391.7478++)가 충돌 에너지 3.1 ~ 23.1의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크 면적 비를 표준화한 수치를 이용하여 HER2 음성 유방암 그룹과 HER2 양성 유방암 그룹 구분 시, 정확도 92.9%, AUC value 0.960으로 상당한 구분력을 보임을 알 수 있다.
도 12는 본원에 따른 MRM-MS 분석을 통한 HER2 상태 구분 방법을 모식적으로 나타낸 것이다. 기존의 HER2 상태 구분 전략인 IHC와 우리의 발명에서 제시하는 MRM-MS 분석을 통한 HER2 상태 구분 전략의 차이가 존재한다. 우리의 발명을 통해 기존의 방법인 IHC로는 구분할 수 없는 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹을 구분할 수 있으며, 이로 인해 equivocal HER2 2+의 수를 현저하게 줄일 수 있다. 이는 FISH를 수행해야만 하는 시료의 절대적인 수를 줄임으로써 FISH 수행에 드는 비용 및 시간적 절감을 기대할 수 있으며, 종합적으로 HER2 상태 구분에 대한 전체적인 비용 및 시간적 절감을 기대할 수 있다.

한 양태에서 본원은 유방암 샘플에서 질량분석법을 이용하여 HER2 발현정도 또는 발현량을 결정하는 방법 및 이를 이용하여 HER2 스코어를 매기는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법은 유방암 환자의 HER2 스코어링에 대한 정보를 제공하기 위해, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법으로, 상기 방법은 유방암 시료로부터 제조된 단백질 분해물 중의 특정 HER2 펩타이드 단편의 양, 및 표준화 인자로서 하기 표로부터 선택되는 상피세포 발현 단백질의 펩타이드 단편 중 어느 하나의 단편의 양 또는 상기 유방암 시료의 일정 면적에 포함된 유방암 세포 수를 결정하는 단계; 및 상기 결정된 HER2 펩타이드 양을 상기 표준화 펩타이드 양 또는 상기 유방암 세포 수로 표준화하여 표준화된 HER2 펩타이드 양을 산출하는 단계를 포함하며, 상기 특정 HER2 펩타이드 단편은 VLQGLPR; 또는 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR 이고, 상기 펩타이드 단편의 양은 질량분석법으로 결정되는 것이다.

본원에 따른 방법에 사용되는 질량분석법은 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 및/또는 비행시간 질량 분석법을 포함할 수 있다. 이때 사용되는 질량 분석법 모드는, 예를 들어 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM), 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM) 일 수 있다.

일 구현예에서는 특히 MRM 모드가 사용된다. MRM 질량분석법의 원리는 선정된 타겟 단백질들을 모두 펩타이드로 가수분해 시킨 후에, 각 타겟 단백질들에 특이적인 mass to charge (m/z)를 가지는 펩타이드(precursor ion, MS1)를 선택한다. 이 특이적인 펩타이드를 충돌시켰을 때(Quadruple 2, Q2), 발생하는 파편들 중에서 특징적인 m/z를 가지는 특이적 질량을 가진 단편(fragmentation ion, MS2)을 선택한다. MS1/MS2에서 각각 얻어지는 precursor ion/fragment ion의 쌍을 타겟 단백질의 특이적 transition(타겟 단백질의 특이적 질량 지문)이라 명명하며, 이 transition들을 모든 타겟 단백질(300 단백질 이상)에 대해서 측정하면 시료에 있는 모든 타겟 단백질의 양을 동시에 상대 혹은 절대 정량할 수 있다. 상대 혹은 절대 정량을 위해서는 SIS (동위원소 치환된 동일 아미노산 순서의) 펩타이드를 표준 물질로 사용하는데, 측정 시료의 input 표준 물질 (SIS 펩타이드) 양을 알고 있기 때문에 타겟 펩타이드 양을 비례적으로 계산할 수 있는 원리이다. MS2를 통과한 transition은 검출기에서 digital signal로 전환되어 peak chromatogram으로 전환되며 peak 면적을 계산하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다.

HER2 단백질은 상피 세포에서 발현되는 신호 수용체 단백질이며, 일반적으로 HER2 수용체는 건강한 세포의 성장, 분열 및 이의 복구 방법을 제어하는데 도움을 준다. 그러나, 일부 암에서는 과량의 HER2 단백질이 과발현되고, 이는 HER2 유전자 증폭을 또한 수반한다. HER2가 과발현되는 경우 이에 특화된 치료제를 선택할 수 있기 때문에, 정확한 발현 상태를 결정하는 것이 중요하다. 현재 사용되는 방법은 IHC(Immuno Histo Chemistry 면역조직화학)와 FISH(Fluorescent in situ Hybridization)을 이용하는 것이나, 그 과정이 복잡하고 특히 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다. 먼저 IHC 검사 결과에 따라 HER2 스코어가 0 (음성), 1+ (음성), 2+ (경계선) 또는 3+ (양성-Her2 단백질 과발현)로 표시된다. FISH는 HER2 유전자의 증폭여부를 검사하여, 증폭 양성 또는 증폭 음성으로 표시된다. FISH는 경계선에 있는 2+로 분류된 샘플에 대하여 수행되고, FISH 양성 (2+FISH+), 3+인 경우 항 HER2 치료제에 반응한다.

본원에 따른 방법은 FISH를 수행하지 않고도 HER2의 상태를 정확하게 결정할 수 있다. 본원에서는 HER2 스코어의 정확한 구분에 특히 HER2 단백질의 VLQGLPR (서열번호 1) 또는 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR (서열번호 2) 펩타이드와 표준 펩타이드로서 하기 표 1의 단백질 유래의 서열이 높은 민감도와 특이도로 HER2의 스코어 중 FISH 방법에 의존해서만 분별이 가능했던 2+FISH-, 2+FISH+를 구분할 수 있음을 발견하였다. 표 1의 단백질 전체 서열은 UniProt DB (www.uniprot.org)에서 표에 기재된 ID로 검색가능하다.

하기 각 펩타이드와 해당 m/z, 프러덕트 이온과 해당 m/z, 충돌 에너지의 범위는 본원 실시예를 참조할 수 있다.

[표 1]

일 구현예에서 유방암 환자에서 유래한 FFPE 조직 시료와 Agilent 6400 series를 이용한 MRM-MS 분석을 통해 HER2 펩타이드(VLQGLPR, 391.7478++)가 충돌 에너지 3.1 ~ 23.1의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 peak 및 종양 함유량(tumor content)을 대변하는 표준화 인자로서 사용될 상피세포특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 peak을 정량분석하여 두 단백질의 피크면적 비를 기준으로 HER2 단백질 발현량을 산출한다. 이를 통해 HER2 상태를 0 ~ 3+까지 판단할 수 있으며, 전통적인 방법으로는 구분할 수 없는 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹 또한 구분이 가능하다. HER2 정량분석 수치를 바탕으로 HER2 양성 유방암 또는 HER2 음성 유방암을 구분하여, 허셉틴(트라스주맙) 투여 유무를 결정하는 치료 방침 설정에 기여를 할 수 있다.

다른 구현예에서 유방암 환자에서 유래한 FFPE 조직 시료와 Agilent 6400 series를 이용한 MRM-MS 분석을 통해 HER2 펩타이드(FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR, 790.0655+++)가 충돌 에너지 3.6 ~ 23.6의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(9, 1085.5262+; y8, 998.4942+; b10, 1115.5732+)의 peak 및 종양 함유량(tumor content)을 대변하는 표준화 인자로서 사용될 상피세포특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 peak을 정량분석하여 두 단백질의 피크면적 비를 기준으로 HER2 단백질 발현량을 산출한다.

이를 통해 HER2 상태를 0 ~ 3+까지 판단할 수 있으며, 전통적인 방법으로는 구분할 수 없는 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹 또한 구분이 가능하다. HER2 정량분석 수치를 바탕으로 HER2 양성 유방암 또는 HER2 음성 유방암을 구분하여, 허셉틴(트라스주맙) 투여 유무를 결정하는 치료 방침 설정에 기여를 할 수 있다.

또한, 표준화 인자로서 유방암 시료의 일정 면적에 포함된 유방암 세포수를 측정하여 종양 면적이 각기 다른 개별 시료의 단백질 추출량을 비슷하게 맞추어 주기 위해 세포 수 당 추출된 단백질량에 대한 standard curve를 제작하여, 해당 standard curve의 추세선 식에 종양 면적 내의 세포수를 대입하여 특정 종양 면적에서 추출된 단백질량을 미리 추정 한 후 분석에 사용되는 샘플 슬라이드의 개수를 결정하여 보다 정확한 정량 분석이 가능하다.

다른 양태에서 본원은 또한 상기 분석결과를 이용하여 유방암 샘플의 HER2 스코어: 0, 1+, 2+FISH-, 2+ FISH+, 또는 3+를 결정하는 방법에 대한 것이다.

일 구현예에 따르면 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 유방암의 HER2 스코어: 0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 또는 3+와 연관시키는 단계를 포함하며, 상기 연관시키는 단계는 대조군 시료로서, 기존의 IHC 및 FISH 방법으로 HER2 스코어가 미리 결정된 시료로부터 표준화된 HER2 펩타이드 양을 결정하고, 상기 대조군 시료의 표준화된 HER2 펩타이드 양을 이용하여 각 HER2 스코어에 대한 임계값을 결정하고, 상기 유방암 시료의 HER2 펩타이드 양을 상기 임계값과 비교하여 달성될 수 있다.

일 구현예에서는 도 10에서와 같이 기준이 되는 임계값은 표준화된 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 이항 로그(log2)로 치환한 후에, 인접한 HER2 스코어를 구분하는 ROC 곡선을 그려서 Youden 지수(Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430)(J 지수)가 최대가 되는 수치(J 지수 = 민감도 + 특이도 - 1)로 결정할 수 있다.

일 구현예에서 표준화된 HER2 펩타이드로서 서열번호 1의 서열을 이용한 경우 정량 분석 수치의 이항 로그 값이 -3.4690 이하의 값을 가지는 시료는 HER2 0, -3.4690 이상 -2.3603 미만은 HER2 1+, -2.3603 이상 -1.9241 미만은 HER2 2+FISH-, -1.9241 이상 -0.2897 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 -0.2897 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류될 수 있다. 또한 본 발명이 임상에서 쓰일 때는 세부적인 HER2 스코어링과 더불어서, 허셉틴(트라스주맙) 표적치료를 필요로 하는 그룹(HER2 양성 유방암 그룹)과 그렇지 않은 그룹(HER2 음성 유방암 그룹)을 구분하는 것이 중요하다. 도 11에서 보여주는 바와 같이 표준화된 HER2 펩타이드의 정량 분석 수치의 이항 로그 값 -1.9241을 기준으로 그 미만은 HER2 음성 유방암, 그 이상은 HER2 양성 유방암으로 분류할 수 있다.

다른 구현예에서 표준화된 HER2 펩타이드로서 서열번호 2의 서열을 이용한 경우 정량 분석 수치의 이항 로그 값이 -1.8208 미만은 HER2 0, -1.8208 이상 -1.2673 미만은 HER2 1+, -1.2673 이상 -0.5299 미만은 HER2 2+FISH-, -0.5299 이상 0.9543 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 0.9543 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류할 수 있다.

이에 당업자라면 본 발명에서 제시하는 HER2 펩타이드 및 JAM1 등과 같은 표준화 펩타이드의 MRM-MS 분석 기반 정량 분석을 수행한 후, 도 11에 제시된 것과 같은 임계값을 결정하여 이를 기준으로 허셉틴(트라스주맙) 표적 치료의 진단 방향을 결정할 수 있을 것이다. HER2 펩타이드와 표준화 펩타이드의 종류에 따라 상이할 수 있으며, 앞서 언급한 대로 임계값은 표준화된 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 이항 로그(log2)로 치환한 후에, 인접한 HER2 스코어를 구분하는 ROC 곡선을 그려서 Youden-지수(J-지수)가 최대가 되는 수치(J-지수 = 민감도 + 특이도- 1)로 결정할 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 시료는 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)이다. FFPE 조직 시료는 유방암 진단 및 표적항암치료제 적용 여부를 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 임상 시료 표본으로, 다양한 단계별 시료가 보관되어 있으며, 손쉽게 저비용으로 활용이 가능한 검체이다. 따라서, 유방암 환자 유래 FFPE 조직 시료를 이용한 MRM-MS 분석법을 통해 HER2 펩타이드 및 HER2 펩타이드의 정량수치 표준화를 위한 상피세포 특이적 펩타이드 정량을 통해 HER2 스코어링을 기존의 방법보다 더 정확하고, 재현성 있게 측정이 가능하다.

본원에 따른 방법에서 질량 분석에 사용하기 위한 단백질 분해물은 트립신 분해물이다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법에 사용되는 FFPE 조직시료는 약 4시간 동안 처리된 경우, 가장 정확한 결과를 수득하였다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 방법 및 재료

1. 시료 및 임상적 특징

본 발명에 사용된 FFPE 조직 시료는 유방절제술을 시행한 210명의 유방암 환자로부터 채취되었으며, 모든 환자로부터 서면 동의서를 제공받았다. 210례 시료의 구성은 HER2 상태에 따라 HER2 0 (30례), HER2 1+ (30례), HER2 2+FISH- (61례), HER2 2+FISH+ (59례), HER2 3+ (30례)로 구성되며, 각 시료에 대한 임상병리학적 정보는 표 2와 같다.

[표 2] 본 발명에 사용된 210례 시료에 대한 임상병리학적 정보

2. 유방암 조직 채취 및 FFPE 조직 블록 제작

유방절제술을 통해 절제한 유방암 병변 조직을 채취 후 조직 손상을 방지하고, 조직을 오랫동안 보관하기 위해 포르말린 용액에 조직을 두어 조직을 고정(fixation)시켰다. 이어 흐르는 물에 고정한 조직을 두어 씻어주는 과정을 통해 조직 겉면에 묻은 formalin 용액을 제거하였다. 이어 탈수 과정을 통해 조직 내 존재하는 수분을 제거(조직을 물 → 50% 에탄올 → 70% 에탄올 → 85% 에탄올 → 100% 에탄올 순으로 담가서 탈수)하였다. 다음으로 파라핀 침투가 용이하게 하기 위해 Xylene을 이용하여 탈수제를 제거하였다. 이러한 과정을 통해 조직 내 파라핀을 침투시켜서 굳혀 조직을 보호하고, 조직이 오랫동안 보관될 수 있는 상태로 만들어주었다.

(1) 유방암 FFPE 조직 절편 제작 및 H&E 염색

박절기(microtome)를 이용하여 10μm 두께로 FFPE tissue block을 박절(section)하여 FFPE 조직 절편을 얻었고, 각 시료마다 6장의 절편을 제작하였다. 6장의 FFPE 조직 절편 중 1장은 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 통해 세포의 핵 및 세포질 염색에 사용하였다. H&E 염색 한 FFPE 조직 절편을 이용하여 병리학자가 종양 형성 부위를 표기하였다.

(2) 유방암 FFPE 조직 절편의 파라핀 제거, 수화 및 단백질 변성

30mM Tris-Cl (pH8.5) 용액 210μL를 이용해서 1mg Rapigest를 녹여서 0.5% Rapigest로 만들었다. 유방암 FFPE 조직 절편에서 파라핀을 제거하고 다음과 같이 수화하였다(Xylene → Xylene → 100% 에탄올 → 100% 에탄올 → 85% 에탄올 → 70% 에탄올 → 50% 에탄올 → 물 순으로 3분씩 담가서 수행). 상기 과정이 완료된 FFPE 조직 절편에 30mM Tris-Cl (pH8.5) 용액을 200μL 씩 적셔서 조직이 마르는 것을 방지하였다. 에펜돌프 튜브에 100μL의 0.5% Rapigest를 넣고, 여기에 유방암 FFPE 조직 절편에서 종양 부분만을 scraper를 이용하여 긁어낸 유방암 조직을 넣고, 10초간 소니케이션 하였다. 이어 Thermomixer에 넣어 30분간 가열(1,000rpm, 95℃)하였다. 이를 상온에서 식힌 후, spin-down하여 모든 용액을 tube의 아래쪽으로 이동시켰다. 프로브 소니케이터를 이용해서 조직을 파쇄(Amplitude: 30%) 펄스 ON, OFF 각각 4초씩 20회 반복)하고 15,000rpm으로 30분간 원심분리(20℃ 유지)하였다. 원심분리 후 펠렛을 제외한 상층액 80μL를 새 에펜돌프 튜브로 옮기고, 나머지 상층액은 BCA 분석을 수행하기 위해 다른 에펜돌프 튜브로 옮겼다.

(3) 유방암 FFPE 조직 시료, 단백질 펩타이드화(Rapigest in-solution digestion)

200mM DTT 20μL를 80μL의 상층액이 들어있는 Eppendorf tube에 넣은 후, vortexing하여 변성된 단백질과 DTT가 잘 섞은 후 spin-down 하였다. 이어 Thermomixer에 넣어 1시간 가열(1,000rpm, 60℃)하였다. 240mM IAA 20μL를 넣은 후, vortexing 후 spin-down 하였다. 은박지로 싸서 빛을 차단한 후, 상온에서 1시간 두었다. 0.067μg/μL 트립신을 60μL 넣은 후(트립신:단백질 = 1:50), vortexing 후 spin-down하고, Thermomixer에서 4시간 두었다(1,000rpm, 37℃).

(4) Rapigest 제거 및 MRM-MS 분석할 시료 제작

트립신을 이용한 분해(digestion)가 끝난 시료에 30% 포름산을 20μL 넣은 후, 약하게 vortexing 후 CR paper를 이용하여 산성도 측정하였다. Thermimixer에서 30분 배양하고(1,000rpm, 37℃) 후, 1시간 원심분리(15,000rpm, 4℃) 하였다. 이어 펠렛을 제외한 상층액 200μL중, MRM-MS 분석을 위한 100μL는 새 Eppendorf tube로 옮기고, 나머지 100μL는 또 다른 새 Eppendorf tube로 옮겨서 Tryptophan fluorescence 분석을 통해 peptide yield 측정하였다.

MRM-MS 분석을 위한 100μL의 상층액 중 90μL를 유리 vial에 넣은 후, 150 fmol/ul의 SIS 펩타이드 혼합물을 10μL 넣어 총 100μL를 만들었다. 1분가량 vortexing한 후 spin-down 하였다.

3. 펩타이드 분리를 위한 Capillary liquid chromatography(액체 크로마토그래피)

MRM-MS 분석을 하기에 앞서, 6개의 HER2 펩타이드, 19개의 상피세포 특이적 펩타이드 및 30개의 하우스키핑 펩타이드를 액체 크로마토그래피(1260 Capillary-flow liquid chromatography system; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분리하였다.

이를 위해 guard column(2.1 × 15.0 mm, 1.8 μm, 80 Å)을 이용하여 시료에 포함되어있는 불순물(여분의 rapigest 및 염(salt))을 제거하였으며, analytical column(0.5 × 35.0 mm, 3.5 μm, 80 Å)을 이용하여 펩타이드 분리를 수행하였다. 2개의 column으로 구성된 LC(liquid chromatography) 시스템상에서 용매 A(0.1% formic acid in water)와 용매 B(0.1% formic acid in acetonitrile)를 사용하였다. 3% solvent B를 40 μL/min의 유속으로 10분동안 흘려주면서 시료 40 μL가 guard column으로 주입되었고, 이 때 시료 속에 포함되어있던 불순물들이 제거되었다. 밸브 전환 후, guard column에 부착 되어있던 펩타이드들이 analytical column으로 이동하여 부착되었다. 용매 B를 3%에서 50%까지 40 μL/min의 유속으로 흘려주어, analytical column에 부착된 펩타이드들이 용리되게 하였다. 60% 용매 B를 40 μL/min의 유속으로 2분간 흘려주어 column 세척을 진행 후, 용매 B를 40 μL/min의 유속으로 1분간 60%에서 3%까지 떨어뜨려 column을 평형상태로 재조정하였다. 4분동안 equilibration 후에 밸브가 original position으로 바뀌며 10분간 guard column과 analytical column의 reconditioning이 동시에 일어나게 하였고, 총 시료 분석 시간은 70분이 소요되었다. 이어 LC 시스템으로 시료 주입 후, autosampler injector needle 및 튜브는 50% acetonitrile 수용액으로 세척하였다.

4. Online desalting 및 MRM-MS 분석

MRM-MS 정량 분석은 Agilent 6400 series를 이용하여 수행하였다. 이온화된 펩타이드는 Quadrupole 1(Q1)으로 유입되게 되며, Q1에서 특정 m/z(mass to charge ratio)를 가진 전구 이온이 선별된다. Q1 filter를 통과한 전구이온은 Quadrupole 2(Q2)에서 전기적 에너지에 의해 이온의 단편화가 일어나 프러덕트 이온으로 분해되었다. 프러덕트 이온은 Quadrupole 3(Q3)로 유입되고, 이 곳에서 특정 m/z를 가진 프러덕트 이온이 선별되어 검출기로 이동 후 디지털 신호로 전환되어 피크 크로마토그램으로 나타난다. 이 면적을 계산하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행하였다(도 1).

5. 가공전(raw) 파일 후 처리 및 통계분석

LC-MS/MS 분석을 통해 도출된 raw file의 후 처리를 위해 skyline 소프트웨어에 raw file을 삽입하였다. 6개의 HER2 펩타이드, 19개의 상피세포 특이적 펩타이드 및 30개의 하우스키핑 펩타이드에 대한 정량분석 수치를 산출하기 위해 해당 펩타이드 peak에 대한 peak integration을 진행(각 펩타이드의 retention time에 해당하는 peak을 지정해 주는 작업)하였다. retention time 내의 SIS peptide (Heavy peptide) 피크와 endogenous peptide (Light peptide) 피크의 면적비(peak area ratio)를 산출하였다. 통계분석은 IBM SPSS와 MedCalc 소프트웨어를 이용하여 Mann-Whitney test, area under the receiver operating curve, correlation analysis 등을 수행하였고, Prism 소프트웨어를 이용하여 시각화하였다.

6. HER2 단백질의 정량분석 수치를 표준화할 수 있는 표준화인자 선별

HER2 펩타이드의 정량 데이터를 표준화하기 위해 종양 함유량(tumor content)를 대변할 수 있는 5가지 표준화 인자(종양 조직 면적, 종양 조직 면적 내 세포 수, 전체 단백질량, 전체 펩타이드량, 19개 상피세포 특이적 펩타이드 및 30개 하우스키핑 펩타이드)를 선정하였다.

이 중 2가지 표준화 인자(종양 조직 면적 및 종양 조직 면적 내 세포 수)는 Aperio 소프트웨어에 H&E staining 조직 절편 이미지를 삽입하여 측정하였다. Aperio 소프트웨어는 펜 도구를 사용하여 종양 영역을 표시한 후, Nuclear counting 알고리즘을 이용하여 종양 조직 면적 및 종양 조직 면적 내 세포 수를 측정하였다.

세 번째 표준화 인자는 10 μm 두께 FFPE 조직 절편의 종양 영역에서 추출된 단백질의 총량이며, BCA 분석을 통해 농도 측정 후 단백질 총량을 산출하였다.

네 번째 표준화 인자는 트립신 처리 후의 최종 산물인 펩타이드 량이며, tryptophan fluorescence 분석을 통해 농도 측정 후 펩타이드 총량을 산출하였다.

마지막 표준화 인자는 MRM-MS 분석으로 정량된 19개의 상피세포 특이적 펩타이드와 30개의 하우스키핑 펩타이드의 피크면적 비(Light peptide의 면적/Heavy peptide의 면적)를 계산하였다.

표준화된 HER2 펩타이드 정량 수치는 HER2 펩타이드의 피크면적 비를 표준화인자로 나눈 값이며, 이 수치는 IHC 및 FISH 결과와 비교 분석되었다.

5가지 표준화인자로 표준화한 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 이용하여 (HER2 FISH-)그룹과 (HER2 FISH+)그룹을 구분했을 때의 Accuracy 및 AUC value를 산출하였다. 이중 Accuracy 및 AUC value가 가장 높은 표준화 인자 선별하였다. 최적의 표준화인자로 표준화된 HER2 펩타이드 수치를 이용하여 전체적인 HER2 상태를 모두 유의하게 (p<0.05) 구분할 수 있는지 확인하였다.

실시예 1. 임상 시료 및 MRM-MS 분석을 통한 HER2 상태 구분 플로우차트

MRM-MS 분석을 통한 HER2 스코어링을 위해 총 210례의 유방암 환자의 FFPE 조직 절편을 이용하였다. HER2 상태는 총 5가지로 구성 되며(0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 3+), HER2 상태에 따른 개별 시료의 개수는 상이하였다(표 3). IHC에 의해 HER2 2+ (HER2 equivocal)로 분류된 120례의 시료는 FISH 분석을 통해 최종적으로 HER2 음성 또는 양성 여부가 결정되었다.

[표 3] MRM-MS 분석에 이용된 유방암 FFPE 조직 절편의 HER2 상태 분포

이어 유방암 환자로부터 채취한 조직 절편을 FFPE 블록으로 만든 후, 10 μm 두께로 연속적으로 박절하고, 박절한 FFPE 조직 절편 중 하나는 H&E staining을 하여 해당 이미지를 이용, Aperio 소프트웨어의 Nuclear counting 알고리즘을 이용해 tumor region에 존재하는 세포의 수를 세었다. 이어 산출한 세포의 수를 ‘세포 수 당 추출된 단백질량에 대한 standard curve의 추세선 식에 대입하여 예상 추출 단백질량을 산출하였다. 산출된 단백질량을 바탕으로 150μg의 단백질을 얻기위한 FFPE 조직 슬라이드의 수를 결정하였다. FFPE 조직 절편을 파라핀 제거 및 수화한 후 단백질을 추출하고 트립신을 이용하여 펩타이드화 하였다. 이어 MRM-MS 분석을 통해 HER2 펩타이드 및 표준화 펩타이드 측정을 통해 최종적으로 HER2 상태를 구분함(도 2 플로우차트 참조).

실시예 2. 유방암 FFPE 조직 시료에서 검출 가능한 HER2 펩타이드, 상피세포 특이적 펩타이드 및 하우스키핑 펩타이드 선정

유방암 FFPE 조직시료에서 검출 가능한 상피세포 특이적 단백질 및 하우스키핑 단백질을 선정하기 위해 문헌 조사를 시행한 결과, 46개의 단백질이 유방암 FFPE 조직 시료에서 검출 가능한 표준화 단백질임인 것으로 확인하였다.

HER2 단백질 및 표준화 단백질 총 47개에 해당하는 123개 펩타이드가 질량분석기에서 검출 가능함을 National Institute of Standards and Technology (NIST)로 얻은 MS/MS 라이브러리와의 매칭 분석을 통해 확인하였다.

이어 MRM-MS 분석 시 재현성있게 검출되는 펩타이드를 선정하기 위해, HER2 3+에 해당하는 10례의 유방암 FFPE 조직이 풀링(pooling)된 시료를 이용하여 semi-quantitative MRM-MS 분석을 시행하였고 그 결과, 37개의 단백질(62 펩타이드)을 검출가능한 detectable peptide로 선정하였다.

이에 따라 62개의 SIS(unpurified stable-isotope-labeled standard) 펩타이드를 합성한 후, SIS 펩타이드 혼합물을 제작하였다.

이어 상기 SIS 펩타이드 혼합물을 풀링된 유방암 FFPE 조직 시료에 스파이킹 한 후, MRM-MS을 3회 반복하여 분석 수행하였고, 그 결과를 이용하여 AuDIT(Automated detection of inaccurate and imprecise transitions) 분석을 수행하여 잘못 검출된 이온들을 제거하고, 각 펩타이드에서 재현성있게 높은 강도로 검출된 트랜지션(transition)을 최대 3개씩 선정하였다.

그 결과, 최종적으로 31개의 단백질(55개의 펩타이드)가 유방암 FFPE 조직 시료에서 MRM-MS 분석을 통해 검출 가능한 최종 타겟으로 선정되었다. 이 중에는 30개의 표준화 단백질(49개의 펩타이드)이 포함된다(표 4).

[표 4] 유방암 FFPE 조직 시료에서 검출 가능한 19개 상피세포 특이적 펩타이드 및 30개의 하우스키핑 펩타이드

실시예 3. MRM-MS 분석법 개발

MRM-MS 분석을 위한 펩타이드의 검출 및 정량 한계(LOD, LOQ) 및 기타 변수(Linearity, LLOQ, ULOQ)들을 결정하기 위해 풀링된 18례의 HER2 3+ FFPE 조직 시료를 이용하여 reverse 교정 커브를 생성하였다(도 3). 상기 교정 커브상의 각 포인트는 MRM-MS 3반복 분석을 수행한 것이다. HER2 단백질의 VLQGLPR 펩타이드의 y5 프러덕트 이온과 JAM1 단백질의 VTFLPTGITFK 펩타이드의 y7 프러덕트 이온에 대한 reverse 교정 커브를 통해 Linearity, LOD (Limit of detection), LOQ (Limit of quantification), LLOQ (Lower limit of quantification), 및 ULOQ (Upper limit of quantification)를 다음과 같이 도출하였다(도 3).

HER2 단백질의 VLQGLPR 펩타이드의 y5 프러덕트 이온의 LOD = 0.904 fmol, LOQ = 2.234 fmol, LLOQ = 1.465 fmol, ULOQ = 3000 fmol, 교정 커브에 대한 추세선 식 Y=1.029X - 5.948의 linear regression value (R2) = 0.999.

JAM1 단백질의 VTFLPTGITFK 펩타이드의 y7 프러덕트 이온의 LOD = 4.976 fmol, LOQ = 11.251 fmol, LLOQ = 5.859 fmol, ULOQ = 3000 fmol, 교정 커브에 대한 추세선 식 Y=1.113X - 5.086의 linear regression value (R2) = 0.998.

HER2 단백질의 VLQGLPR 펩타이드의 y5 프러덕트 이온의 교정 커브상의 3반복 분석 CV 범위는 4.02%에서 19.21%였으며, JAM1 단백질의 VTFLPTGITFK 펩타이드의 y7 프러덕트 이온의 교정 커브상의 3반복 분석 CV 범위는 4.91%에서 23.45%인 것으로 나타났다(표 5).

[표 5] HER2 (VLQGLPR, y5)와 JAM1 (VTFLPTGITFK, y7)에 대한 역 교정 커브의 각 칼리브레이션 포인트

실시예 4. 트립신 반응 시간 결정

트립신 반응 시간에 따라 HER2 펩타이드의 MRM-MS 분석 결과가 달라지므로, HER2 펩타이드의 강도를 최적으로 하는 트립신 반응 시간을 산출하기 위해 트립신 반응 시간 테스트를 다음과 같이 진행하였다.

8 포인트로 트립신 반응 시간을 설정(1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간)하고, 각 포인트 당 적어도 100μg의 단백질이 필요하므로, 조직 면적이 큰 HER2 3+ FFPE 조직 시료(약 200μg의 단백질이 추출 가능) 6례를 각 1장씩 이용하여 0.5% rapigest in solution digestion 수행하였다. Digestion 진행 후 각 시료를 10μL씩 동일하게 풀링한 후 BCA 분석을 통해 농도를 측정하였다. 각 6례 시료의 상층액 80μL를 이용하여 DTT 및 IAA와 순차적으로 반응시킨 후, 0.067μg/μL 트립신을 60μL 넣고(트립신:단백질 = 1:50), vortexing 후 spin-down하였다. 6례의 시료를 하나의 에펜돌프 튜브에 풀링 후 8개의 에펜돌프 튜브에 동일한 부피로 분주하였다. 8개의 시료 마다 트립신 반응 시간(1, 2, 4, 8. 12, 16, 20, 24시간)을 다르게 설정하여, 설정된 시간마다 트립신 반응을 멈춘 후, formic acid를 최종 3%가 되도록 첨가하여 rapigest 제거하였다. 8개의 시료를 SIS peptide와 혼합(시료 90μL + SIS peptide 10μL)하고, 이를 10μL씩 풀링하여 시료를 제작하였다. 이는 풀링된 시료 분석을 통해 retention time을 설정하여, 트립신 반응 시간에 따른 시료는 scheduled MRM-MS로 분석하기 위함이다.

풀링된 시료를 unscheduled MRM-MS로 1회 분석하였다. Skyline에 raw file 삽입 후 peak integration 수행하여 각 펩타이드별 retention time 설정하였다. Scheduled MRM-MS 분석을 위한 method file 제작 후 트립신 반응 시간에 따른 8개의 개별 시료를 scheduled MRM-MS 분석(2회 분석)하였다. 6개의 HER2 펩타이드의 프러덕트 이온 중, 각 peptide별로 detection이 잘 된 하나 또는 두개의 프러덕트 이온 선정 후 피크면적 비(L/H) 수치 산출하였다. 트립신 반응 시간별 비교 후, 최종 트립신 반응 시간은 4시간으로 결정하였다(도 4).

실시예 5. 세포 수 당 추출된 단백질 량에 대한 표준커브 작성

시료 마다 종양 부위의 크기가 각기 다르기 때문에, 동일한 단백질을 추출하기 위해 사용해야 할 FFPE 조직 슬라이드 수 또한 시료 마다 다르다. 또한, 각 시료로부터 추출된 단백질 양의 차이가 클수록 시료 간의 펩타이드 수율 차이가 커진다. 따라서, 시료 간 추출되는 단백질 량을 비슷하게 맞추기 위해서는 종양 면적이 상대적으로 작은 시료의 경우 여러 개의 연속적인 조직 절편으로부터 단백질을 추출해야 한다.

이러한 맥락에서, 각 시료 마다 비슷한 량의 단백질을 추출하기 위해서는 각 시료 마다 몇 장의 슬라이드를 사용할 것인지에 대한 객관적인 기준이 필요하다. 이는 종양 영역 내에 존재하는 세포 수와 종양 영역에서 추출된 단백질간의 상관관계를 나타내는 standard curve를 이용하는 것으로 해결하였다.

이에 추출된 단백질량이 세포 수에 비례한다는 가설에 근거하여, 종양 영역 내의 세포 수가 다른 개별 시료 10례, 각 3장씩(3 replicates)의 FFPE 조직 슬라이드로부터 단백질 추출하였다. 개별 FFPE 조직 시료의 종양 면적 내 세포 수는 Aperio 소프트웨어에 H&E staining 조직 절편 이미지를 삽입하여 측정하였으며, 이는 펜 도구를 사용하여 종양 영역을 표시 한 후, Nuclear counting 알고리즘을 이용하여 종양 조직 면적 내 세포 수를 산출하였다.

이어 BCA 분석을 이용한 농도 측정을 통해 총 30례 시료의 단백질량 산출하였다. 그 결과, 세포 수 당 추출된 단백질량이 선형성이 있음을 확인하였으며(R2= 0.9916), 10 포인트의 3 레플리카간 CV가 모두 20% 미만인 것으로 나타났다(표 6, 도 5).

[표 6] 표준(Standard) 커드 상에 존재하는 10 포인트의 3 technical replicates에서 추출된 단백질량에 대한 평균, 표준편차 및 변이계수

실시예 6. 210례 개별시료에서 HER2 펩타이드, 상피세포 특이적 펩타이드, 하우스키핑 펩타이드 MRM-MS 분석 결과

210례 개별시료 및 Agilent 6400 series를 이용한 MRM-MS 분석을 통해 앞선 실시예에서 선정된 6개 HER2 펩타이드, 19개 상피세포 특이적 펩타이드 및 30개 하우스키핑 펩타이드를 정량 분석하였다.

6개의 HER2 peptide 간의 correlation을 Spearman rank correlation을 통해 도출한 결과, 6개의 HER2 peptide 간 양의 방향으로 correlation이 있음을 확인하였다(도 6, 도 7). 펩타이드 LLDIDETEYHADGGK와 펩타이드 ELVSEFSR에서 최저 스페어만 상관성 계수(ρ), 0.596을 보였다. 펩타이드 VLQGLPR, GLQSLPTHDPSPLQR 및 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR에서 0.8 이상의 높은 Spearman correlation coefficient(ρ)을 나타냈다. 6개의 펩타이드는 모두 동일한 HER2 단백질에서 유래한 것으로서, 이론적으로는 MRM-MS 분석 후 정량된 펩타이드간의 정량 분석 결과값이 비슷해야 한다. 따라서, 본 발명의 6개의 HER2 펩타이드 정량 분석 결과값 간의 correlation을 Spearman correlation coefficient로 나타내었고, correlation이 모두 양의 값을 가지므로 펩타이드간의 정량 분석 결과값이 서로 비슷함을 알 수 있다. 상기 결과는 본원에서 분석한 210례의 시료에서 정량된 HER2 펩타이드간의 correlation 결과를 나타낸 것이다. 이론적으로는 6개의 펩타이드간 correlation coefficient = 1.000에 가까워야 하나 각 펩타이드의 특성이 다르기 때문에 MRM-MS 분석 시 정량된 값의 correlation이 이론적으로 예상한 1.000이 되지 않을 수 있다. 도 6을 보면, ELVSEFSR 펩타이드의 경우, 다른 5개의 펩타이드와의 correlation이 비교적 낮은 것으로 나타났다. 이는 ELVSEFSR 펩타이드가 sample preparation 과정 중 다른 5개의 펩타이드와는 수율 차이가 생겼거나(예를 들면, ELVSEFSR 펩타이드가 다른 5개의 펩타이드보다 수율이 낮음), ELVSEFSR 펩타이드의 MRM-MS 분석 시, 다른 5개의 펩타이드와는 다른 이온화 정도를 가진다는 것 예를 들면, ELVSEFSR 펩타이드가 다른 5개의 펩타이드보다 시료 전처리 시 펩타이드 수율이 낮고, MRM-MS 분석 시 이온화가 잘 되지않아, 분석 시 detection 효율이 낮아지는 것을 의미하므로, HER2 정량 분석을 통해 HER2 스코어링을 해야 함에 적합하지 않은 펩타이드로 선정하였다. 반면, VLQGLPR 펩타이드는 GLQSLPTHDPSPLQR 및 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR과 0.8 이상의 높은 스페어만 상관성 계수(ρ)를 나타내며, 나머지 3개의 펩타이드와도 비교적 높은 스페어만 상관성 계수(ρ)를 나타내어 HER2 분석 펩타이드로 선정하였다.

실시예 7. IHC & FISH 데이터와 MRM 데이터 간의 일치율 확인

종양 함유량(tumor content)을 대변할 수 있는 4종류의 표준화인자 및 MRM-MS 분석을 통해 도출된 펩타이드의 피크면적 비(L/H) (상피세포 특이적 펩타이드 및 하우스키핑 펩타이드의 피크면적 비(L/H))까지, 6개의 HER2 펩타이드의 정량 수치를 총 5 종류의 표준화인자로 나누어 6개 HER2 펩타이드의 정량 수치를 표준화(normalization) 하였다.

이어 표준화된 HER2 펩타이드 정량 수치를 이용하여 5가지 HER2 상태 중, 기존의 방법(IHC를 통한 HER2 상태 스코어링)으로는 구분할 수 없는 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹을 구분 가능한지에 대하여 통계 분석을 수행하여, 본 발명의 정확도(Accuracy) 및 AUC 값을 산출하였다.

6개 HER2 펩타이드의 MRM-MS 분석 정량 분석 수치(펩타이드의 MRM 분석 값) 각각을 53개의 표준화인자(종양 면적 내 세포 수, 종양 조직 면적, 단백질량, 펩타이드량, 49개 상피세포 특이적 펩타이드 및 하우스키핑 펩타이드)로 나눈 값을 이용하여, 총 318개 조합에 대한 Accuracy 및 AUC value 산출하였다. 이러한 318개 조합 중 AUC value 0.800 이상인 상위 30개의 조합을 표 6에 나타냈다.

318개 조합에 대한 AUC value는 0.617 ~ 0.908이었으며, HER2 펩타이드의 정량 분석 수치를 표준화 했을 때, 상피세포 특이적 펩타이드 및 하우스키핑 펩타이드, 종양 면적 내 세포 수, 펩타이드량, 단백질량, 종양 조직 면적 순으로 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹을 구분하는 능력이 우수한 것으로 나타났다(도 8).

이 중, 특히 상피세포특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 고유질량값 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 HER2 단백질의 펩타이드(VLQGLPR, 고유질량값 391.7478++)가 충돌 에너지 3.1 ~ 23.1의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크 면적 비를 표준화한 수치를 이용하여 HER2 2+FISH- 그룹과 HER2 2+FISH+ 그룹 구분 시, Accuracy 89.2%, AUC value 0.908로 2가지 HER2 그룹에 대한 구분력이 가장 우수한 것으로 나타났다(도 9).

[표 7]

실시예 8. 질량분석법으로 결정된 표준화한 HER2 펩타이드 정량 분석수치를 이용한 HER2 상태 구분

HER2 단백질의 펩타이드(VLQGLPR, 391.7478++)가 충돌 에너지 3.1 ~ 23.1의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크면적 비를 상피세포특이적 단백질 JAM1의 펩타이드(VTFLPTGITFK, 612.3554++)가 충돌 에너지 10 ~ 30의 범위에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크면적 비로 나눈 표준화된 수치를 Mann Whitney U test 통계분석을 통해 전체 시료의 HER2 상태를 구분하였다.

표준화된 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 바탕으로 HER2 스코어링을 할 때, 기준이 되는 컷오프 수치는 표준화된 HER2 펩타이드 정량 분석 수치를 이항 로그(log2)로 치환한 후에, 인접한 HER2 스코어를 구분하는 ROC 곡선을 작성하여 특이도 및 민감도를 구하고 이를 Youden’s J statistic (Ruopp et al. Biom J. 2008 Jun; 50(3): 419-430)를 이용하여 Youden 지수(J 지수)가 최대가 되는 수치 (J 지수 = 민감도 + 특이도 - 1)로 결정하였다. 그 결과, 표준화된 HER2 펩타이드의 정량 분석 수치의 이항 로그 값이 -3.4690 이하의 값을 가지는 시료는 HER2 0, -3.4690 이상 -2.3603 미만은 HER2 1+, -2.3603 이상 -1.9241 미만은 HER2 2+FISH-, -1.9241 이상 -0.2897 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 -0.2897 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류될 수 있다.

그 결과 HER2 0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 3+, 총 5가지의 HER2 상태를 p-value < 0.05의 유의성을 보이며 구분할 수 있음을 확인하였다(도 10). 본원에서 사용된 210례의 시료는 IHC 및 FISH 분석을 통해 각각 HER2 0, 1+, 2+FISH, 2+FISH+, 3+로 스코어가 결정된 것으로, 본원에 따른 방법으로 결정된 스코어는 기존의 방법으로 결정된 수치와 완전히 일치하는 것으로 나타났다.

또한 실제 본 발명이 임상에 적용시는 세부적인 HER2 스코어링과 더불어서, 허셉틴(트라스주맙) 표적치료를 필요로 하는 그룹(HER2 양성 유방암 그룹)과 그렇지 않은 그룹(HER2 음성 유방암 그룹)을 구분하는 것이 중요하다. 본원에 따른 방법은 표준화된 HER2 정량분석 수치는 HER2 negative 그룹(HER2 0, 1+, 2+FISH-)과 HER2 positive 그룹(HER2 2+FISH+, 3+)을 유의적으로(p-value < 0.05) 구분할 수 있는 것으로 나타났다(도 11). 도 11에서 보여주는 바와 같이 표준화된 HER2 펩타이드의 정량 분석 수치의 이항 로그 값 -1.9241을 기준으로 그 미만은 HER2 음성 유방암, 그 이상은 HER2 양성 유방암으로 분류할 수 있다.

이러한 결과는 본 발명이 임상에서 HER2 펩타이드 및 JAM1 펩타이드의 MRM-MS 분석 기반 정량 분석을 수행한 후, 도 10 및 도 11에 제시된 것과 같은 컷오프 수치를 계산하여 HER2 스코어를 결정하고, 허셉틴(트라스주맙) 표적 치료의 진단 방향을 결정하는데 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

기존의 HER2 상태 구분 전략과 본 발명에서 제시하는 HER2 상태 구분 전략의 차이가 존재하는 것으로 나타났다. 본원 발명은 기존의 방법인 IHC로는 구분할 수 없는 HER2 2+FISH-와 HER2 2+FISH+를 정확하게 구분할 수 있으며, 이로 인해 HER2 2+ equivocal의 수를 현저하게 줄일 수 있다. 이는 FISH를 수행해야만 하는 시료의 절대적인 수를 줄임으로써 FISH에 드는 비용 및 시간적 절감을 기대할 수 있으며, 종합적으로 HER2 상태 구분에 대한 전체적인 비용 및 시간적 절감을 기대할 수 있다(도 12).

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method of quantifying HER2 proteins in breast cancer sample using mass spectrometry and HER2 status scoring using the same <130> DP201903004 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 peptide <400> 1 Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg 1 5 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HER2 peptide <400> 2 Phe Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp 1 5 10 15 Ser Thr Phe Tyr Arg 20 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> JAM1 peptide <400> 3 Val Thr Phe Leu Pro Thr Gly Ile Thr Phe Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TBB5 peptide <400> 4 Ala Leu Thr Val Pro Glu Leu Thr Gln Gln Val Phe Asp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TBB5 peptide <400> 5 Ile Ser Val Tyr Tyr Asn Glu Ala Thr Gly Gly Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VINC peptide <400> 6 Ser Leu Gly Glu Ile Ser Ala Leu Thr Ser Lys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VINC peptide <400> 7 Glu Leu Thr Pro Gln Val Val Ser Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VINC peptide <400> 8 Ala Ile Pro Asp Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala Val Gln Ala Ala Val 1 5 10 15 Ser Asn Leu Val Arg 20 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VINC peptide <400> 9 Ala Gln Gln Val Ser Gln Gly Leu Asp Val Leu Thr Ala Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTND1 peptide <400> 10 Gly Tyr Glu Leu Leu Phe Gln Pro Glu Val Val Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB7A peptide <400> 11 Val Ile Ile Leu Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys 1 5 10 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB7A peptide <400> 12 Glu Ala Ile Asn Val Glu Gln Ala Phe Gln Thr Ile Ala Arg 1 5 10 <210> 13 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDIA6 peptide <400> 13 Thr Gly Glu Ala Ile Val Asp Ala Ala Leu Ser Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PDIA6 peptide <400> 14 Glu Leu Ser Phe Gly Arg 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RL30 peptide <400> 15 Ser Leu Glu Ser Ile Asn Ser Arg 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RL30 peptide <400> 16 Leu Val Ile Leu Ala Asn Asn Cys Pro Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RAN peptide <400> 17 Phe Asn Val Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Lys 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GELS peptide <400> 18 His Val Val Pro Asn Glu Val Val Val Gln Arg 1 5 10 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GELS peptide <400> 19 Thr Gly Ala Gln Glu Leu Leu Arg 1 5 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TERA peptide <400> 20 Trp Ala Leu Ser Gln Ser Asn Pro Ser Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RS17 peptide <400> 21 Val Cys Glu Glu Ile Ala Ile Ile Pro Ser Lys 1 5 10 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> COF1 peptide <400> 22 Asn Ile Ile Leu Glu Glu Gly Lys 1 5 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RL22 peptide <400> 23 Ala Gly Asn Leu Gly Gly Gly Val Val Thr Ile Glu Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RS13 peptide <400> 24 Leu Ile Leu Ile Glu Ser Arg 1 5 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G3P peptide <400> 25 Gly Ala Leu Gln Asn Ile Ile Pro Ala Ser Thr Gly Ala Ala Lys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LDHA peptide <400> 26 Val Thr Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ala Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DESP peptide <400> 27 Ala Glu Leu Ile Val Gln Pro Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RL32 peptide <400> 28 Ala Ala Gln Leu Ala Ile Arg 1 5

Claims

유방암 환자의 HER2 스코어링에 대한 정보를 제공하기 위해, 인비트로에서 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법으로, 상기 방법은
유방암 시료로부터 제조된 단백질 분해물 중의 특정 HER2 펩타이드 단편의 양, 및 표준화 인자로서 하기 표로부터 선택되는 상피세포 발현 단백질의 펩타이드 단편 중 어느 하나의 단편의 양을 결정하는 단계; 및
상기 결정된 HER2 펩타이드 양을 상기 표준화 펩타이드 양으로 표준화하여 표준화된 HER2 펩타이드 양을 산출하는 단계를 포함하며,
상기 특정 HER2 펩타이드 단편은 VLQGLPR (서열번호 1) 또는 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR (서열번호 2) 이고, 상기 펩타이드 단편의 양은 질량분석법으로 결정되는 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법:
제 1 항에 있어서,
상기 시료는 FFPE(Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded)인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 질량 분석법이 탠덤 질량 분석법, 이온 트랩 질량 분석법, 삼중사극 질량 분석법, 하이브리드 이온 트랩/쿼드러폴 질량 분석법 또는 비행시간 질량 분석법을 포함하는 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 질량 분석법에 사용되는 모드는 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring, SRM) 또는 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring, MRM)인 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질 분해물은 트립신 분해물인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 상기 단백질 분해물을 정량하기 전에 분획하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 분획하는 단계는 액체 크로마토그래피로 수행되는 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 표준화된 HER2 단백질의 펩타이드는 VLQGLPR (서열번호 1) 또는 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR (서열번호 2) 이고, 상기 표준화 인자 펩타이드는 JAM1의 VTFLPTGITFK (서열번호 3)인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 방법은 MRM 모드로 수행되며,
상기 표준화된 HER2 펩타이드의 양은 고유질량 값 391.7478++의 상기 펩타이드 VLQGLPR에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y6, 683.4199+; y5, 570.3358+; y4, 442.2772+)의 피크 면적 비를 고유질량 값 612.3554++의 JAM1의 펩타이드 VTFLPTGITFK에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 나눈 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 8 항에 있어서,
상기 방법은 MRM 모드로 수행되며,
상기 표준화된 HER2 펩타이드 양은 고유질량 값 790.0655+++의 상기 펩타이드 FVVIQNEDLGPASPLDSTFYR에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1085.5262+; y8, 998.4942+; b10, 1115.5732+)의 피크 면적 비를 고유질량 값 612.3554++의 JAM1의 펩타이드 VTFLPTGITFK에서 단편화되어 나온 프러덕트 이온 3개(y9, 1023.5873+; y8, 876.5189+; y7, 763.4349+)의 피크 면적 비로 나눈 것인, 유방암 시료의 HER2 단백질의 발현량을 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용한, 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 유방암의 HER2 스코어: 0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 또는 3+와 연관시키는 단계를 포함하는, 유방암 시료의 HER2 스코어를 결정하는 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 연관시키는 단계는 대조군 시료로서, IHC(Immunohistochemistry) 및 FISH(Fluorescent In Situ Hybridization) 방법으로 HER2 스코어가 미리 결정된 유방암 시료를 이용하여 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 결정하고,
상기 대조군 시료에서 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 이용하여 각 HER2 스코어에 대한 임계값을 결정하고, 상기 유방암 시료에서 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 임계값과 비교하는 것인, 유방암 시료의 HER2 스코어를 결정하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 임계값은 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 이용한 ROC커브 분석에 의해 결정된 특이성 및 민감도를 이용한 Youden index (민감도 + 특이도 -1)를 이용하여 결정된 것인, 유방암 시료의 HER2 스코어를 결정하는 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용한 상기 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 유방암의 HER2 스코어: 0, 1+, 2+FISH-, 2+FISH+, 또는 3+와 연관시키는 단계를 포함하는, 유방암 시료의 HER2 스코어를 결정하는 방법으로,
상기 연관시키는 단계는
(i) 상기 HER2 펩타이드로서 서열번호 1의 서열 및 표준화 펩타이드로서 서열번호 3의 JAM1 펩타이드 서열을 사용하여 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 각 스코어에 대하여 결정된 임계값과 비교하는 것을 포함하며,
상기 임계값으로 -3.4690 미만은 HER2 0, -3.4690 이상 -2.3603 미만은 HER2 1+, -2.3603 이상 -1.9241 미만은 HER2 2+FISH-, -1.9241 이상 -0.2897 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 -0.2897 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류하며,
상기 표준화된 HER2 펩타이드 양은 상기 HER2 펩타이드의 프러덕트 이온의 피크면적 비를 상기 표준화 펩타이드의 프러덕트 이온의 피크면적 비로 나눈 것:

의 이항 로그 (log2) 값이고; 또는
(ii) 상기 HER2 펩타이드로서 서열번호 2의 서열 및 표준화 펩타이드로서 서열번호 3의 JAM1 펩타이드 서열을 사용하여 결정된 표준화된 HER2 펩타이드 양을 상기 각 스코어에 대하여 결정된 임계값과 비교하는 것을 포함하며,
상기 임계값으로 -1.8208 미만은 HER2 0, -1.8208 이상 -1.2673 미만은 HER2 1+, -1.2673 이상 -0.5299 미만은 HER2 2+FISH-, -0.5299 이상 0.9543 미만은 HER2 2+FISH+, 그리고 0.9543 이상의 값을 가지는 시료는 HER2 3+로 분류하며,
상기 표준화된 HER2 펩타이드 양은 상기 HER2 펩타이드의 프러덕트 이온의 피크면적 비를 상기 표준화 펩타이드의 프러덕트 이온의 피크면적 비로 나눈 것:

의 이항 로그 (log2) 값인, 방법.
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