JP2009236908A - 乳癌の診断及び治療法 - Google Patents

Abstract

【課題】乳癌の診断及び治療法を提供する。
【解決手段】蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いてプロテオーム解析して同定したヒト乳癌細胞株で発現変動した特定のタンパク質を分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法、ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオドレキシン−１、あるいはアネキシン−２とＥＦ−Ｔｕ、あるいはペルオキシレドキシン−１とＲａｎＧＡＰ、を分子マーカーとして、及びガレクチン−１及び／又はアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアを分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
【効果】新しい乳癌の診断及び治療法を提供することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、乳癌の診断及び治療法に関するものであり、更に詳しくは、従来のプロテオーム解析法とは全く異なる新しいプロテオミクスアプローチである蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）による乳癌細胞の特異的発現タンパク質のプロテオーム解析により定量、同定された乳癌細胞株に特異的もしくは大過剰に発現するタンパク質、発現増加並びに発現低下を示すタンパク質を乳癌の診断及び治療マーカーとして利用して乳癌の診断及び治療を行う新規乳癌診断及び治療法に関するものである。

乳癌は、主に、老齢期における女性の死亡の主因となっているが、癌の病因は、明確に規定されておらず（非特許文献１）、診断及び治療のために使用される分子マーカーは、例えば、腫瘍によって分泌されるミルクムチン、発現エストロゲン受容体、及び癌遺伝子ｅｒｂＢ２など、わずかしかない。エストロゲン受容体を発現する乳癌細胞は、抗エストロゲン剤のタモキシフェンによって処置される（非特許文献２）。

しかし、全ての乳癌細胞が、エストロゲン受容体を発現するわけではなく、その治療法は、限定される。ミルクムチンのための血清検出マーカーＣＡ１５−３が遠隔転移のマーカーとして提案されたが、その信頼性不良のために、断念された（非特許文献３）。新たに単離された遺伝子の発現の検出及び定量化に続いて、乳癌のみが癌遺伝子ｅｒｂＢ２を発現するという知見に基づいて、ハーセプチンが導入され、現在、乳癌治療のために使用されている（非特許文献４）。

また、最近発見された腫瘍抑制遺伝子ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２もあり、治療のためのそれらの使用について、目下研究されているが、５％の乳癌のみが、本遺伝子に関係すると言われている（非特許文献５）。これらの背景を考慮すれば、特にプロテオームの観点から、乳癌中で発現する治療及び診断のための分子マーカーのその他の候補があると考えられる。

特異的プロテオーム分析は、通常、選ばれる唯一の方法である二次元電気泳動法（２Ｄ−ＰＡＧＥ）を使用して実施されている。しかし、２Ｄ−ＰＡＧＥ法は、得られたデータの再現性にいくつかの欠点を有しており、発現するタンパク質の癌細胞と正常細胞との間の微小な違いが失われる。

ごく最近、本発明者らは、極めて再現可能なプロテオミクスアプローチである蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を開発し（非特許文献６、７）、肝炎Ｃウィルスコアタンパク質遺伝子導入マウスの肝臓と、非遺伝子導入マウスの肝臓の間で、発現タンパク質のわずかな変化を識別して同定した（非特許文献８）。

Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｋ．Ａ．，Ｇｌｅｎｄｏｎ，Ｇ． ＆ Ｋｎｉｇｈｔ，Ｊ．Ａ．Ｐｕｔｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｓｋ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０，１４１−１４４（１９９９） Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｃ．Ｋ．Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３９，１６０９−１６１８（１９９８） Ｈｏｎｄｅｒｍａｒｃｋ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｆｏｒ ｍａｒｋｅｒ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１，１２１６−１２３２（２００１） Ｃｏｌｏｍｅ，Ｒ．，Ｓｈａｍｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｔｓａｉ，Ｍ．Ｓ． ＆ Ｌｕｐｕ，Ｒ．Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ：Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．１９，４９−５６（２００１） Ｈａｍａｎｎ，Ｕ．Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ：ｈｉｇｈ ｒｉｓｋ ｇｅｎｅｓ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．４６，４４７−４６１（２０００） Ｔｏｒｉｕｍｉ，Ｃ．＆ Ｉｍａｉ，Ｋ．Ａｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ，ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ａ ｄａｔａｂａｓｅ−ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７５，３７２５−３７３０（２００３） Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｔｏｒｉｕｍｉ，Ｃ．，Ｓａｎｔａ，Ｔ．＆ Ｉｍａｉ，Ｋ．Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６，７２８−７３５（２００４） Ｉｃｈｉｂａｎｇａｓｅ，Ｔ．，Ｍｏｒｉｙａ，Ｋ．，Ｋｏｉｋｅ，Ｋ．＆ Ｉｍａｉ，Ｋ．Ａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｌｉｖｅｒｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．６，２８４１−２８４９（２００７）

このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、ヒト乳癌細胞中で発現する、治療及び診断のための分子マーカーとして機能する特定のタンパク質を定量、同定し、当該分子マーカータンパク質を利用した新しい乳癌の診断法等を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、乳癌細胞株に特異的にもしくは大過剰に発現するタンパク質、発現増加並びに発現低下を示すタンパク質を定量、同定し、当該タンパク質を分子マーカーとする新しい乳癌の診断及び治療法を確立することに成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、乳癌細胞株に特異的にもしくは大過剰に発現するタンパク質、発現増加並びに発現低下を示すタンパク質を定量、同定し、当該タンパク質を分子マーカーとする新しい乳癌の診断及び治療法を提供することを目的とするものである。

上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いてプロテオーム解析して同定したヒト乳癌細胞株で発現変動した特定のタンパク質を分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
（２）乳癌細胞株と正常細胞株で発現変動したタンパク質を同時解析する、前記（１）に記載の乳癌の診断方法。
（３）上記乳癌細胞が、ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＡＵ５６５、又はＨＣＣ１４２８である、前記（１）又は（２）に記載の乳癌の診断方法。
（４）上記正常細胞として、正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を用いる、前記（２）に記載の乳癌の診断方法。
（５）診断が、転移乳癌の診断である、前記（１）から（４）のいずれか１項に記載の乳癌の診断方法。
（６）上記特定のタンパク質が、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ）、ペルオキシレドキシン−１、コフィン−１、Ｒａｆ−１キナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、プロフィリン−１、Ｒａｎ、チオレドキシン−１、Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害物質（ＲｈｏＧＤＩ）、ストラチフィン、ガレクチン−１、アネキシン−２、ＥＦ−Ｔｕ、トロポミオシン−１から選択される１種以上である、前記（１）から（４）のいずれか１項に記載の乳癌の診断方法。
（７）ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオドレキシン−１、あるいはアネキシン−２とＥＦ−Ｔｕ、あるいはペルオキシレドキシン−１とＲａｎＧＡＰ、を分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
（８）ガレクチン−１及び／又はアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアを分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
（９）前記（１）から（６）のいずれかに記載の乳癌の診断方法に使用する分子マーカーであって、ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオドレキシン−１、あるいはアネキシン−２とＥＦ−Ｔｕ、あるいはペルオキシレドキシン−１とＲａｎＧＡＰ、から構成されることを特徴とする分子マーカー。
（１０）前記（１）から（６）のいずれかに記載の乳癌の診断方法に使用する分子マーカーであって、ガレクチン−１及び／又はアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアから構成されることを特徴とする分子マーカー。

次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者らは、上述の課題を解決するために、蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を用いて、ヒト乳癌細胞中で発現する治療及び診断のための分子マーカータンパク質のその他の候補を同定することを目指し、そのために、７つの細胞系及び１つの正常細胞を選んだ（表１）。

特異的プロテオーム分析により、いくつかの発現増加されたタンパク質、Ｒａｆ−１キナーゼ阻害タンパク質、コフィリン−１、プロフィリン−１、チオレドキシン−１、Ｒａｎ、及びＲｈｏ ＧＤＰ解離阻害物質と共に、癌細胞中のペルオキシレドキシン−１、ＲａｎＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質の特異的発現を初めて実証した。

そして、また、発現低下されたタンパク質、ガレクチン−１、ＥＦ−Ｔｕ、ストラチフィン、アネキシン−２、及びトロポミオシン−１も実証した。また、例えば、ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオレドキシン−１、あるいはアネキシン−２とＥＦ−Ｔｕの発現間の顕著な相関も得られた。ガレクチン−１とアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアが、転移乳癌のための診断又は治療マーカーとして有用であることが示された。

本発明では、細胞系として、ＨＭＥＣを対照上皮細胞とする一方、受容体及び癌遺伝子の発現プロファイリングが異なる市販の７つの乳癌細胞系について調査した（表１）。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、転移性胸水に由来し、浸潤性及び転移性細胞移行のモデルとして広く使用されている。これは、ほとんどの上皮性マーカーと形質を失った高度に脱分化した間葉様系の代表例と考えられている。ＨＣＣ１４２８は、転移に関して、記録がない。

次に、乳癌細胞中で発現するタンパク質の蛍光誘導体化、液体クロマトグラフィー、及び同定については、実験手順に従って、７つの乳癌細胞及び１つの正常上皮細胞からの全タンパク質のそれぞれ４０μｇに相当する全ての抽出サンプルを、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化し、蛍光検出器（５０５ｎｍでの蛍光及び３９５ｎｍでの励起）付きＨＰＬＣの対象とした。各細胞系について、８．０μｇの注入タンパク質に相当する典型的なクロマトグラムを作成した（図１）。

アクチン標準物質（分子量４３０００）のピーク信号対雑音比の計算に基づいて、本発明で使用するＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の検出限界（信号対雑音比、３）は、注入時４４０フェムトモルのタンパク質であった。したがって、各クロマトグラムにおいて、約５００個のタンパク質ピークが検出された。ピーク数は、マウス肝臓サンプルを処理した以前の論文で観察されたものと類似していた。

正常乳腺上皮細胞ＨＭＥＣと比べて、いくつかの異なって発現するタンパク質があった（図１）。図１では、タンパク質発現の順位は、各対応するピークのピーク高さ比（癌細胞−対−正常細胞）に従って、暫定的に決められた。無限大の比率は、極めて高度に発現増加されたタンパク質であり、５．０〜１０．０の比率は、高度に発現増加されたタンパク質であり、２．０〜５．０の比率は、中程度に発現増加されたタンパク質であり、０．２未満の比率は、高度に発現低下されたタンパク質である。

これらのタンパク質の対応するピーク画分を収集して、トリプシンで加水分解した。このようにして得られたペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ／ＭＳの対象とし、文献（非特許文献６〜８）に従って、タンパク質の同定を実施した。異なって発現するタンパク質の名称を表２にまとめた。更に、癌細胞中の発現タンパク質間の相関、及び発現タンパク質と発現する受容体との関係性を計算し、データを作表した（図２）。

次に、乳癌細胞中の極めて高度に発現増加されたタンパク質について説明すると、本発明では、調べた全ての乳癌細胞中における、ペルオキシレドキシン−１及びＲａｎ ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ、別名Ｒａｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）の特異的発現を初めて実証した。チオレドキシンペルオキシダーゼ−１として知られているペルオキシレドキシン−１は、還元当量源としてチオレドキシン−１を使用して過酸化水素を除去する。これは、チオレドキシン−１で形質移入されたＭＣＦ７細胞中で増大し、ペルオキシレドキシン−１発現中で増大して、過酸化水素損傷からの細胞保護に寄与する。

Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ）は、核膜孔複合体の細胞質領域に局在し、ＲａｎＧＴＰ加水分解を制御して、核原形質の輸送に必須である核膜を横切るＲａｎＧＴＰの急激な濃度勾配を発生させるのに寄与する。

ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のオス生殖細胞系における野生型ＲａｎＧＡＰの過剰発現が、核ＲａｎＧＡＰのレベルの上昇をもたらすことを考えれば、乳癌細胞系におけるＲａｎＧＡＰの過剰発現は、核中ＲａｎＧＡＰの増大を引き起こして、核ＲａｎＧＴＰ濃度の低下をもたらすと考えられる。ＲａｎＧＴＰ／ＲａｎＧＤＰの不均衡は、高分子の核原形質輸送と有糸分裂紡錘体形成の双方に影響して、乳癌における発癌を促進すると考えられる。

次に、乳癌細胞中の高度に発現増加されたタンパク質について説明すると、Ｒａｆ−１キナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）は、Ｒａｆ／マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）／細胞外シグナル調節性キナーゼ（ＥＲＫ）経路の生理学的阻害物質である。ＥＲＫ経路は、乳癌中で過剰に活性化されることが多いので、ＲＫＩＰは、細胞及び動物モデルにおいて転移抑止タンパク質として認識されており、ＲＫＩＰの発現低下は、ヒト乳癌における転移と関連があると報告された。図２Ｆに示すように、ＲＫＩＰの発現は、ＥＲ陰性細胞よりもＥＲ陽性癌細胞中で顕著に高かった。コフィリンは、単量体及び繊維状アクチンの双方に結合できる遍在性タンパク質であり、アクチン動態の必須制御因子である。コフィリン経路の特定遺伝子の発現は、乳癌細胞中で改変される。

次に、乳癌細胞中の発現増加されたタンパク質について説明すると、プロフィリン−１は、Ｇ−アクチンモノマーに結合すると、ＡＴＰのＡＤＰによる交換を加速することでアクチン重合を制御する。プロフィリン−１発現の損失は、ヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に運動性及び浸潤性の増大を与えた。アクチン細胞骨格動態中のコフィリン、プロフィリン、及びアクチン間の濃度均衡の重要性が示唆された。

チオレドキシン−１は、酸化還元−活性ジスルフィド／ジチオールを含有する多官能性タンパク質である。チオレドキシン−１の発現は、いくつかの癌において、対応する正常組織と比べて顕著に増大する。チオレドキシン−１発現の増大は、腫瘍血管新生の増強と共に、癌細胞における低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）レベルの増大と結びつけられる。

チオレドキシン−１の発現とガレクチン−１の発現とで、顕著な相関が観察された（図２Ｃ）。これは、乳癌細胞系におけるＲａｎの発現増加された発現の最初の例である。Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害物質（ＲｈｏＧＤＩ）は、ＲｈｏファミリーＧＴＰａｓｅとの相互作用を通じて、多様な細胞機能の制御において必須の役割を果たす。ＲｈｏＧＤＩの上昇は、また、ヒト乳癌細胞系及び乳腫瘍組織でも検出された。

次に、乳癌細胞中の高度に発現低下されたタンパク質について説明すると、アネキシン−２は、アクチンフィラメントと結びついてアクチン動態を制御する、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質である。細胞表面アネキシン−２は、プラスミン産生を調節し、それは、ＥＣＭ分解、細胞浸潤、及び転移を容易にする。

アネキシン−２が、卵巣癌及び腎細胞癌腫中で発現増加された以前の報告とは対照的に、発現レベルは非常に低かった（表２）。しかし、その発現は、ガレクチン−１、及びＥＦ−Ｔｕ、と顕著に相関していた（図２Ａ及び２Ｂ）。アネキシン−２の発現は、Ｈｅｒ２陽性細胞中よりもＨｅｒ２陰性癌細胞中で顕著に高かった（図２Ｄ）。

ＥＦ−Ｔｕは、ＧＴＰ又はＧＤＰのどちらかに結合して、アミノアシル−ｔＲＮＡとリボソームの受容体部位への結合を促進できるグアニンヌクレオチド結合タンパク質のスーパーファミリーの一員であり、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞の同質遺伝子型モデルを使用して、転移関連因子の１つとして同定された。生得及び適応免疫の双方で中心的役割を果たし、腫瘍のマウスモデルで治療効果を有するＩＬ−１２の発現を、それが顕著に増強することもまた実証された。

本発明では、癌細胞中のＥＦ−Ｔｕの発現は、非常に低レベルであるが、ＥＦ−Ｔｕとアネキシン−２との良好な相関が観察された。図２Ｅに示すように、ＥＦ−Ｔｕの発現は、Ｈｅｒ２陽性細胞中よりもＨｅｒ２陰性癌細胞中で顕著に高かった。

ガレクチン−１は、β−ガラクトシドへの親和性がある炭水化物結合タンパク質ファミリーの１つである。これは、生育、転移、Ｒａｓとの相互作用をはじめとする細胞シグナル伝達経路の調節、及びＴ細胞耐性と生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）恒常性の確立と維持に関連する。ガレクチン−１は、高度に転移性の乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５中で同定された。

ガレクチン−１は、神経膠腫細胞中で、運動性の増大と、アクチン重合及び脱重合を調節するＲｈｏシグナル経路中の重要な上流タンパク質であるＲｈｏの発現増大と結びついたアクチン細胞骨格の再構築とを引き起こす。ガレクチン−１の発現は、アネキシン−２又はチオレドキシン−１（図２Ｂ及び２Ｃ）と顕著に相関していた。

次に、正常細胞中のトロポミオシン−１の特異的発現について説明すると、トロポミオシンは、微小繊維を安定化してストレスファイバーを形成し、それらをＡＤＦ／コフィリン及びゲルゾリンなどのアクチン不安定化タンパク質の結合から保護する、アクチン結合タンパク質のファミリーである。トロポミオシン−１をはじめとする複数の高分子量トロポミオシンが、上皮性細胞中で発現する。その発現は、癌細胞中では皆無であるが（表２）、本データは、トロポミオシンが良性病変と比べて悪性乳腫瘍中で発現低下されて発現され、トロポミオシン−１の発現の損失がＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１中で観察されたという以前の観察を支持する。

ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法の高い再現性のために、定量的な特異的プロテオーム分析は、７つの乳癌細胞及び１つの正常細胞間におけるタンパク質発現レベルの容易な比較を達成した。得られた全ての新たな知見は、乳癌細胞における発現タンパク質の関係の概略マップの作成をもたらすことができる（図３）。データは、また、以下に示すように、ヒト乳癌の診断及び治療法に有用であることを示す。

乳癌細胞中で誘導されたトロポミオシン−１は、Ｆ−アクチンからストレスファイバーを復元し、細胞中のトロポミオシン−１発現後、ストレスファイバー形成のためにＭＤＡ−ＭＢ−２３１転移の欠落が観察された。本プロテオーム分析は、正常な上皮性細胞ＨＭＥＣが、トロポミオシン−１を発現しない浸潤性乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１よりも多くのガレクチン−１、及びアネキシン−２を発現することを実証した。

ＨＭＥＣ中では、Ｆ−アクチンがガレクチン−１及びアネキシン−２による誘導で生じれば、Ｆ−アクチンからストレスファイバーを復元するよう、トロポミオシン−１が作用できるのに対し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１中では、ガレクチン−１及びアネキシン−２によって誘導されたＦ−アクチンは、トロポミオシン不在のためにストレスファイバーに形質転換されることができず、アクチン代謝回転を受けることが示唆される。

したがって、トロポミオシン−１生成の活性化は、Ｓｍａｄ３，４又はｐ３８ＭＡＰＫの生合成などの刺激、又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｒ−２１）の阻害を通じて、転移特性を低下させるので転移乳癌治療のために好ましい。

これは、抗ガレクチン−１化合物が大規模に検索される抗ガレクチン治療法とは対照的であり、更に、本発明で実証されたように、ガレクチン−１は、転移乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比べて、正常な乳腺上皮性細胞中で高度に発現したので、抗ガレクチン−１治療法は、奨励されない。しかし、診断については、組織中にガレクチン−１及びアネキシン−２が同時に存在し、トロポミオシン−１が不在することが、転移乳癌の診断マーカーになり得る。

図２Ｆ中の相関データを考えると、高いＲＫＩＰを発現する乳癌は、タモキシフェンに対して陽性であると考えられる。低レベルのＥＦ−Ｔｕ（図２Ｅ）、アネキシン−２（図２Ｄ）を発現する乳癌についても、ハーセプチンに対してそうであると考えられる。この概念は、乳癌組織中で、これらのタンパク質を検出した後の治療のために有用と考えられる。

ＲａｎＧＡＰは、全癌細胞中で検出されたが、正常細胞には検出されず、存在する場合は、その阻害剤又は抑止剤が、乳癌の治療薬になることが示された。図２Ａ−Ｃに列挙される発現間の顕著な相関は、図３に示すような癌細胞中の事象を理解する手がかりになり得るし、追加的データもまた役に立つ。ペルオキシレドキシン−１及びチオレドキシン−１の双方の発現増加は、酸化ストレス条件下での乳癌細胞の生存に役立つと考えられる。プロフィリン及びコフィリンの発現増加は、持続性の浸潤活性に寄与すると考えられる。

本発明では、蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて、乳癌細胞（ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＡＵ５６５、及びＨＣＣ１４２８）及び正常細胞（ＨＭＥＣ）について、特異的プロテオーム分析を実施した。

その結果、癌細胞中に、特異的発現タンパク質である、ＲａｎＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質及びペルオキシレドキシン−１と、過剰発現されるＲａｆ−１キナーゼ阻害タンパク質、コフィリン−１、プロフィリン−１、チオレドキシン−１、Ｒａｎ、及びＲｈｏ ＧＤＰ解離阻害物質と、発現低下しているＥＦ−Ｔｕ、ストラチフィン、アネキシン−２、トロポミオシン−１及びガレクチン−１とを実証した。

得られた発現間の以下の顕著な相関は、癌細胞中の事象を理解する手がかりになる。ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオレドキシン−１、アネキシン−２とＥＦ−Ｔｕ、ペルオキシレドキシン−１とＲａｎＧＡＰ、ガレクチン−１ないしアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアが、転移乳癌の診断又は治療マーカーとして有用であることが示された。定量的な特異的プロテオーム分析は、生物医学的科学における研究のための強力なツールとなることが示された。

本発明により、次のような効果が奏される。
（１）ヒト乳癌細胞株のプロテオーム解析を行い、ヒト乳癌細胞株で特異的、あるいは過剰発現又は発現低下している特定のタンパク質を乳癌診断の分子マーカーとして利用した新しい乳癌診断法を提供することができる。
（２）本発明により、高感度で再現性に優れた乳癌の診断及び治療を可能にする新しい乳癌の診断及び治療法を提供することができる。

ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化したヒト乳癌細胞及び正常ヒト乳線上皮性細胞（ＨＭＥＣ）タンパク質のクロマトグラムである。 乳癌細胞中の発現タンパク質間の相関、及び発現タンパク質と発現する受容体との関係性を計算し、作表したデータである。 ヒト乳癌細胞の浸潤、転移、及び増殖をもたらすタンパク質動態フローの概略図である。

次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。

（１）方法
細胞培養：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１などのヒト乳癌細胞系は、メリーランド州ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国微生物系統保存機関）から得られ、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びメリーランド州ゲーサーズバーグのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ））からの１％のＬ−グルタミンで栄養強化したＭＥＭ中で単層培養として、６％ＣＯ_２、３７℃で生育させた。

（２）サンプル調製及び総タンパク質測定
サンプルをかき集め、ＰＢＳで洗浄（３回）後、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ水中で均質化した。氷上で２０回ピペットを用いて吸引と吐出を繰り返した後に、４℃、２０，４００ｇで、１５分間遠心分離した。上清を収集して、総タンパク質を測定し、使用するまで、可溶性画分として−２０℃で保存した。

（３）ＦＤ及びＨＰＬＣ条件
条件は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる肝臓タンパク質のＦＤ手順を使用した。２０μＬの反応混合物（８．０μｇのタンパク質）を、ＨＰＬＣシステムに流速０．５５ｍＬ／分で注入した。全体的システムは、日立Ｌ−２０００シリーズＨＰＬＣシステム及び蛍光検出器（λｅｘ：３９５ｎｍ、λｅｍ：５０５ｎｍ）から構成された。

移動相は、（Ａ）９．０／１．０／９０及び（Ｂ）６９／１．０／３０のアセトニトリル／イソプロパノール／水中の０．１５％ＴＦＡから構成された。移動相（Ｃ）は、ＴＦＡが０．２０％であったこと以外は、（Ａ）と同一であった。

次の溶出で、勾配条件を確立した：５．０％のＢ及び１．０％のＣで、１５．０分間保持し、１５分かけて、３０％のＢ及び３５％のＣにして、次に、３５分間保持し、５０分かけて３５％のＢ及び３５％Ｃにし、次に、６０分かけて３８％のＢ及び３５％のＣにし、１２０分かけて４４％のＢ及び５５％のＣにして、次に、４０分間保持し、４０分かけて、４７％のＢ及び５３％のＣにし、１５０分かけて、６０％のＢ及び４０％のＣにし、４０分かけて、７０％のＢ及び３０％のＣにし、次に、５０分かけて、９０％のＢ及び１０％のＣにする。

（４）誘導体化タンパク質の同定
対象タンパク質の各溶出液を減圧下で５．０μＬに濃縮した。残留物を０．５０Ｕのトリプシン及び１０ｍＭの塩化カルシウムを含有する５０μＬの５０ｍＭアンモニウム炭酸水素塩溶液（ｐＨ７．８）で希釈し、得られた混合物を３７℃で２．０時間インキュベートした。ペプチド混合物を直接、ブルカー・ダルトニクス（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）からのナノ−ＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳ分光計（ＨＣＴ ｐｌｕｓ）の対象とした。

Ｕｌｔｉｍａｔｅ／Ｆａｍｏｓ／Ｓｗｉｔｃｈｏｓ ｓｕｉｔｅの装置を使用して、クロマトグラフィーを実施した。サンプルを注入ループ内のナノプレカラム（内径３００μｍｘ１．０ｍｍ、Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ）に装入して、２．０％アセトニトリル中の０．１０％ＴＦＡを使用し、Ｓｗｉｔｃｈｏｓポンプを使用して３０μＬ／分で洗浄した。

次に、ペプチドをナノフローカラム（内径７５μｍｘ１５ｃｍ、Ｃ１８ ＰｅｐＭａｐ）上で３５分間かけて、緩衝液Ｂ（８０％アセトニトリル中の０．１０％ギ酸）の５．０％から６０％への勾配を用いて、流速１７０μＬ／分で分離した（Ａ緩衝液：２．０％アセトニトリル中の０．１０％ギ酸）。１３００？１８００Ｖのキャピラリー電圧でイオン化後、各前駆物質イオンについて、３５０〜１２５０ｍ／ｚでイオンを観察し、ＭＳ／ＭＳスキャンを実施した。

（５）統計学的分析
結果を平均±ＳＤとして表す。平均の差の有意性は、スチューデントの両側ｔ−検定によって判定した。

本発明では、以下の細胞系を使用した。表１に、本発明で採用した乳癌細胞系の特性を示す。
正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）
ＭＣＦ７（ＥＲ＋、ＰＲ−、ＥＧＦＲ−、Ｈｅｒ２±、ｐ５３±ｗｔ）
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＥＲ−、ＰＲ−、ＥＧＦＲ＋、Ｈｅｒ２−，ｐ５３＋ｍｔ）
ＨＣＣ１４２８（ＥＲ＋、ＰＲ−、ＥＧＦＲ＋、Ｈｅｒ２−、ｐ５３−）
ＡＵ５６５（ＥＲ−、ＰＲ−、ＥＧＦＲ＋、Ｈｅｒ２＋、ｐ５３＋ｗｔ）
ＢＴ−４７４（ＥＲ＋、ＰＲ＋、ＥＧＦＲ＋、Ｈｅｒ２＋、ｐ５３＋ｍｔ）
ＳＫ−ＢＲ−３（ＥＲ−、ＰＲ−、ＥＧＦＲ＋、Ｈｅｒ２＋、ｐ５３＋ｍｔ）
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＲ−、ＰＲ−、ＥＧＦＲ＋、Ｈｅｒ２±、ｐ５３＋ｍｔ）

表中の略号は以下の意味を有する。
ＥＲ：エストロゲン受容体、ＰＲ：プロゲステロン受容体、ＥＧＦＲ：表皮性成長因子受容体、Ｈｅｒ２：表皮性成長因子受容体２、ｗｔ：野性型、ｍｔ：突然変異体
ｎ．ｄ．：検出されず

表２に、乳癌細胞系及びＨＭＥＣ中の異なって発現されるタンパク質を示す。極めて高度に発現増加されたタンパク質は、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ）、ペルオキシレドキシン−１である。また、高度に発現増加されたタンパク質は、コフィリン−１、Ｒａｆ−１キナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）である。また、中程度に発現増加されたタンパク質は、プロフィリン−１、Ｒａｎ、チオレドキシン−１、Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害物質（ＲｈｏＧＤＩ）である。また、高度に発現低下されたタンパク質は、ストラチフィン（１４−３−３シグマ）、ガレクチン−１、アネキシン−２、ＥＦ−Ｔｕ、トロポミオシン−１である。

ＢＣ_ｓ／ＨＭＥＣ比率は、乳癌細胞中及びＨＭＥＣ中のタンパク質の量の比率である。各値は、各細胞あたり３〜９回の実験を行った値について、平均±ＳＤを表す。無限の比率は、極めて高度に発現増加されたタンパク質、５．０〜１０．０の比率は高度に発現増加されたタンパク質、２．０〜５．０の比率は中程度に発現増加されたタンパク質、０．２未満の比率は、高度に発現低下されたタンパク質を意味する。

図１は、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌで誘導体化したヒト乳癌細胞及び正常なヒト乳線上皮性細胞（ＨＭＥＣ）タンパク質（８．０μｇのタンパク質）のクロマトグラムである。図２は、乳癌細胞中の発現タンパク質間の相関、及び発現タンパク質と発現する受容体との関係性を計算し、作表したデータである。

図３は、本発明の知見に基づく、ヒト乳癌細胞の浸潤、転移、及び増殖をもたらすタンパク質動態フローの概略図である。最初に、乳癌細胞の高度な活動性に由来する酸化ストレスが、ガレクチン−１、アネキシン−２，チオレドキシン−１、ペルオキシレドキシン−１、プロフィリン−１、コフィリン−１及びＲａｎをはじめとする様々なタンパク質の発現に影響する（赤字は、ＨＭＥＣと比べて発現増加されたタンパク質、水色字は、癌細胞中の発現低下されたタンパク質、青字は、調べたいずれの癌細胞中にも検出されなかったことを示す）。

次に、ガレクチン−１及びアネキシン−２によって、Ｒｈｏシグナル経路の活性化が起き、それに続いて、プロフィリン−１の活性化がアクチンフィラメント（Ｆ−アクチン）生成の増大をもたらした。ホスホリパーゼＣγ（ＰＬＣγ）によって原形質膜から放出された活性コフィリン−１は、Ｆ−アクチンに、まとまりのない微小繊維を形成させて、樹状核形成及び突出を開始させた。プラスミノーゲン及び組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の細胞表面受容体であるアネキシン−２が、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を媒介した。

得られたプラスミンが、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を活性化し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解を誘発して、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）をはじめとするマトリックス結合プロ成長因子を遊離して、活性形態にした。ガレクチン−１は、また、活性化Ｔ細胞中にアポトーシスを誘発することで、免疫回避に寄与した。これらの分子事象が統合されることで、乳癌細胞は、血管形成性／浸潤性／転移性表現型を得た。

他方、トロポミオシン−１が発現される場合、トロポミオシン−１は、コフィリン−１活性及びＦ−アクチンの樹状核形成に対抗して阻害し、細胞運動性の低下をもたらす。ＤＮＡメチル化、ヒストン脱アセチル化、及びｍｉｒ−２１過剰発現をはじめとする様々な因子によって引き起こされるトロポミオシン−１の発現低下は、乳癌細胞の細胞運動性に有利に働いた。

チオレドキシン−１の発現増加は、有毒な過酸化水素を無毒の水に転換するペルオキシレドキシン−１誘導と、アポトーシスシグナル制御性キナーゼ−１（ＡＳＫ−１）／ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を通じたストレス誘発性アポトーシスの阻害とによって、酸化ストレスからの乳癌細胞自身の防御に寄与した。

チオレドキシン−１は、核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）をはじめとするレドックス感受性転写因子を活性化して、発癌に関与する多数の遺伝子のトランス活性化をもたらした。過酸化水素は、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）経路の活性化を通じて、Ｒａｎを発現増加させた。

乳癌細胞中のＲａｎ及びＲａｎ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ）の発現増加は、レドックス感受性転写因子によるトランス活性化の増強に応じた、核細胞質輸送の促進をもたらした。これらの細胞事象は、酸化ストレス条件下における乳癌細胞の増殖能の獲得に寄与できると考えられる。

以上詳述したように、本発明は、乳癌の診断及び治療法に係るものであり、本発明は、ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による解析した乳癌細胞特異的発現タンパク質を利用した新しい乳癌診断及び治療法を提供するものとして有用である。

Claims (10)

1. 蛍光誘導体化−液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いてプロテオーム解析して同定したヒト乳癌細胞株で発現変動した特定のタンパク質を分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
2. 乳癌細胞株と正常細胞株で発現変動したタンパク質を同時解析する、請求項１に記載の乳癌の診断方法。
3. 上記乳癌細胞が、ＭＣＦ７、ＳＫ−ＢＲ−３、ＢＴ−４７４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＡＵ５６５、又はＨＣＣ１４２８である、請求項１又は２に記載の乳癌の診断方法。
4. 上記正常細胞として、正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を用いる、請求項２に記載の乳癌の診断方法。
5. 診断が、転移乳癌の診断である、請求項１から４のいずれか１項に記載の乳癌の診断方法。
6. 上記特定のタンパク質が、Ｒａｎ ＧＴＰａｓｅ−活性化タンパク質（ＲａｎＧＡＰ）、ペルオキシレドキシン−１、コフィン−１、Ｒａｆ−１キナーゼ阻害タンパク質（ＲＫＩＰ）、プロフィリン−１、Ｒａｎ、チオレドキシン−１、Ｒｈｏ ＧＤＰ解離阻害物質（ＲｈｏＧＤＩ）、ストラチフィン、ガレクチン−１、アネキシン−２、ＥＦ−Ｔｕ、トロポミオシン−１から選択される１種以上である、請求項１から４のいずれか１項に記載の乳癌の診断方法。
7. ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオドレキシン−１、あるいはアネキシン−２とＥＦ−Ｔｕ、あるいはペルオキシレドキシン−１とＲａｎＧＡＰ、を分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
8. ガレクチン−１及び／又はアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアを分子マーカーとして乳癌の診断を行うことを特徴とする乳癌の診断方法。
9. 請求項１から６のいずれかに記載の乳癌の診断方法に使用する分子マーカーであって、ガレクチン−１とアネキシン−２又はチオドレキシン−１、あるいはアネキシン−２とＥＦ−Ｔｕ、あるいはペルオキシレドキシン−１とＲａｎＧＡＰ、から構成されることを特徴とする分子マーカー。
10. 請求項１から６のいずれかに記載の乳癌の診断方法に使用する分子マーカーであって、ガレクチン−１及び／又はアネキシン−２とトロポミオシン−１のペアから構成されることを特徴とする分子マーカー。