KR20080091234A - 신장 질환의 진단 방법 및 이를 위한 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신장 질환의 진단, 특히, 감별 진단에 관한 것이다. 본 발명에서 특별한 관심의 대상인 신장 질환은 IgA-신장병증, 막 사구체신염(MGN), 미소변화 사구체신염(MCD), 국소 분절 사구체경화증(FSGS), 및 당뇨병성 신장병증이다.

신장 질환, 감별진단, 신장병증, 당뇨병.

Description

신장 질환의 진단 방법 및 이를 위한 마커{Method and markers for the diagnosis of renal diseases}

본 발명은 신장 질환의 진단, 특히 감별 진단(differential diagnosis)에 관한 것이다.

최근에 신장 질환을 앓는 환자들의 수가 증가되고 있다. 따라서, 신장 질환은 보건 시스템에 대해 점증하는 문제를 제시한다. 다수의 신장 질환은 비가역적이기 때문에, 따라서, 신장 질환의 조기 진단 및/또는 감별 진단이 중요하다. 조기 진단 및 각각의 특정한 질병에 따라 정확하게 맞춤화된 치료법은 투석을 필요로 하는 환자의 수를 감소시킬 수 있고, 또한 환자의 높은 심혈관 질환 위험을 감소시킬 수 있다.

현재, 정확한 진단 및/또는 감별 진단은 주로 신장 생검(kidney biopsy)에 의존적이다. 생검이 신장 진단에서 현재의 "금본위(gold standard)"로 기능하나, 생검은 침습적이고 따라서 선택된 환자들에만 수행된다는 단점을 갖는다.

소변 분석은 신장 질환을 진단하기 위한 상이한 접근방법이다. 그러나, 현재 소변의 일부 파라미터, 예를 들면, 크레아티닌, 우레아, 알부민, 혈액 세포(예를 들면, 백혈구 및 적혈구), 세균, 당, 우로빌리노겐, 빌리루빈 및 pH 값이 통상 적으로 측정된다. 이 분석들은 특히, 감별 진단을 위해 충분한 민감도 및/또는 선택성이 부족하기 때문에, 그들의 진단적 가치는 제한적이다.

소변에 함유된 단백질을 분석하기 위한 여러 시도들이 이루어졌다.

V. Thongboonkerd 등은 정상적인 인간 소변 단백질을 조사하기 위해 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-fiight) 질량 분석법과 조합된 2차원 폴리아크릴아미드 겔(2D-PAGE) 및 뒤이은 질량 지문술(mass fingerprinting)을 이용하였다. 47개의 고유한 단백질의 총 67개의 단백질 형태가 식별되었다(V. Thongboonkerd et al. (2001). Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney International, vol. 62, p. 1461-1469).

C.S. Spahr 등은 트립신으로 소변 시료에 함유된 단백질을 처리하고 액체 크로마토그래피-이중 질량 분석법(liquid chromatography-tandem mass spectrometry)에 의해 124개의 단백질로부터 751개의 펩티드를 식별하였다(C.S. Spahr et al. (2001). Towards defining the urinary proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. I. Profiling an unfractionated tryptic digest. Proteomics vol. 1, p. 93-107).

이 연구들은 건강한 개체들만을 대상으로 한 것이었다. 상기 연구들은 소변 폴리펩티드의 존재의 변화가 신장 질환의 진단 또는 감별 진단을 위해 이용될 수 있는지의 문제를 다루지 않았다.

막 사구체신염(MGN)의 진단을 위해 소변에서 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 이용하는 것이 제안되었다(von Neuhoff et al. (2004). Mass Spectrometry for the Detection of Differentially Expressed Proteins: A Comparison of Surface-Enhanced Laser Desorption/Tonization and Capillary Electrophoresis/Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol. 18: 149-156). 그러나, 상기 연구에서 단지 8명의 환자들의 시료를 이용하였고, 이는 주로 상이한 분석 방법의 비교에 관한 것이었다. 마커의 실질적인 진단 가치는 명확하지 않다.

결론적으로, 신장 질환의 진단, 특히, 감별 진단을 위한 신속하고 간단한 방법 및 수단에 대한 요구가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 신장 질환의 진단, 특히, 신장 질환의 감별 진단을 위한 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 가장 흔한 사구체병증(glomerulopathy)인 IgA-신장병증의 진단 및/또는 감별 진단을 위한 방법 및 수단을 제공하는 것이 본 발명의 특별한 목적이다.

본 발명의 제1양태에 따르면, 문제는 신장 질환의 진단, 바람직하게는 감별 진단을 위해 소변 시료에서 하나 이상의 폴리펩티드 마커의 존재의 사용에 의해 해결되며, 상기 폴리펩티드 마커는 표 1 내지 표 22에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택된다.

본 발명에서, 표 1 내지 표 22에 표시된 폴리펩티드 마커의 도움으로, 상이한 신장 질환을 각각 신뢰성 있게 또는 감별적으로 진단할 수 있다는 것이 확인되었다.

본 발명은 종래 기술에 비해 다수의 장점을 갖는다. 먼저, 소변 시료에서 본 발명에 따른 폴리펩티드 마커의 존재가 결정될 수 있다. 따라서, 생검을 받을 필요가 없다. 따라서, 본 발명은 신장 질환의 간소화되고 신속한 진단을 허용하여, 신장 질환의 존재에 대해 정기적으로 환자를 스크리닝하고 조기에 신장 질환을 진단할 수 있게 한다. 또한, 본 발명에 따른 폴리펩티드 마커는 상이한 신장 질환 간의 감별 진단을 위해 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 식별된 다수의 마커는 단일 마커 또는 소수의 마커의 이용에 비해 진단의 특이성 및 민감도를 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 항체 또는 앱타머(aptamer)와 같은 특이적 리간드의 이용 없이 상기 폴리펩티드 마커를 측정할 수 있게 하는 방법을 제공한다.

전술된 표에 표시된 폴리펩티드 마커는 CE-MS(capillary electrophoresis-mass spectrometry)라 불리는 방법에 의해 식별되었으며, 하기에서 더 설명될 것이다. 또한, 상기 방법은 von Neuhoff 등(2004)(Mass Spectrometry for the Detection of Differentially Expressed Proteins: A Comparison of Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization and Capillary Electrophoresis/Mass Spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol. 18: 149-156)에 상세하게 설명되었다. 폴리펩티드 마커를 정의하는 파라미터로부터 출발하여, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 상응하는 폴리펩티드의 서열을 식별하고 예를 들면, 단백질 합성 또는 적합한 세포에서 상응하는 유전자의 발현에 의해, 상응하는 폴리펩티드를 합성 또는 생산할 수 있다.

마커들은 CE(Capillary Electrophoresis)에서의 그들의 질량(mass) 및 이동시간(migration time), 특히, 실시예 1에 따라 수득된 질량 및 그들의 이동 시간에 의해 정의된다. CE 이동 시간은 일반적으로 5분의 범위, 보다 일반적으로 3분의 범위 내에서 변할 수 있은 것으로 알려져 있다. 그러나, 용출되는 마커들의 순서는 각각의 적용된 CE 시스템에 대해 동일하거나 또는 매우 유사하다. 상기 시스템은 거의 모든 소변 시료에 존재하는 폴리펩티드, 예를 들면, 표 23 또는 24에 주어진 폴리펩티드의 이용에 의해 보정(calibrate)될 수 있다. 또한, 서열번호 1 내지 서열번호 5로 표시된 폴리펩티드가 보정을 위해 기능할 수 있다.

측정간 또는 상이한 질량 분석계(mass spectrometer)간 질량의 변이는 비교적 작고, 일반적으로 ±0.05%의 범위이다.

표 1에, 건강한 개체와 신장 질환, 특히, 사구체신염 또는 사구체병증을 앓는 개체 간의 식별을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 2에, FSGS와 건강한 상태 간의 식별을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 3에, FSGS와 MCD 간의 감별 진단을 위해 사용될 수 있는 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 4에, FSGS와 MGN 간의 감별 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 5에, FSGS와 MCD 또는 MGN 간의 감별 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 6에, 건강한 상태 대비 MCD의 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 7에, MCD와 MGN 간의 감별 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 8에, MCD와 FSGS 또는 MGN 간의 감별 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 9에, 건강한 상태 대비 MGN의 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 10에, MGN과 FSGS, 또는 MCD 간의 감별 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 11에, 건강한 상태 대비, IgA-신장병증 또는 MGN의 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 12에, 건강한 상태 대비, IgA-신장병증의 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 13에, IgA-신장병증과 MGN 간의 감별 진단을 위해 바람직한 폴리펩티드 마커들이 열거된다.

표 14에, 폴리펩티드가 건강한 개체, FSGS, MCD 및 MGN 환자들에서의 개별적인 빈도와 함께 열거된다.

표 15에, 실시예 1에 따른 지지 벡터 기계(support vector machine)를 이용한, 건강한 개체와 신장병 환자 간의 감별 진단을 위해 이용되는 폴리펩티드들이 열거된다.

표 16에, 실시예 1에 따른 랜덤 포레스트 분석(random forest analysis)을 이용한, 건강한 개체, FSGS, MCD, 및 MGN 환자 간의 감별 진단을 위해 이용되는 폴리펩티드들이 열거된다.

표 17에, 실시예 1에 따른 지지 벡터 기계를 이용한, MCD 환자와 MGN 환자 간의 감별 진단을 위해 이용되는 폴리펩티드들이 열거된다.

표 18에, 실시예 1에 따른 지지 벡터 기계를 이용한, MCD 환자와 FSGS 환자 간의 감별 진단을 위해 이용되는 폴리펩티드들이 열거된다.

표 19에, 실시예 1에 따른 지지 벡터 기계를 이용한, MGN 환자와 FSGS 환자 간의 감별 진단을 위해 이용되는 폴리펩티드들이 열거된다.

표 20 및 21에, 앞서 인용된 von Neuhoff 등(2004)에서 확인된 폴리펩티드들이 열거된다.

표 22에, 당뇨병 및/또는 당뇨병성 신장병증의 진단을 위해 이용될 수 있는 폴리펩티들이 열거된다.

표 23에, CE-시간을 표준화하기 위한 내부 표준(internal standard)으로 바람직한 폴리펩티드들이 열거된다.

표 24에, 실시예 1에 따라 압력 방법(0.3 내지 1 psi)이 이용되는 경우, CE-시간을 표준화하기 위한 내부 표준으로 바람직한 폴리펩티드들이 열거된다. 이 표준들은 예를 들면, IgA-신장병증의 진단에서 내부 표준으로 바람직하다.

표 25에, 실시예 1에 따른 폴리펩티드 마커의 확인을 위해 시료로 이용된 신장 질환 환자들의 임상 데이터가 열거된다. 약어: CsA, 시클로스포린(Cyclosporin A); PS, 프레드니솔론(prednisolone); +, 빈번한 재발; -, 현재 면역억제(immunosuppression) 없음; *, MCD 또는 FSGS인지 임상적으로 불명확함.

소변 시료에서 본 발명에 따라 이용되는 폴리펩티드 마커가 식별될 수 있고 그들의 존재가 측정될 수 있다. 소변 시료는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 바와 같이 채취될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에서 중간뇨(midstream urine)가 이용된다.

본 발명에 따라 이용되는 폴리펩티드 마커는 단백질, 펩티드와 같은 유전자 발현 산물, 및 단백질 또는 펩티드의 단편 또는 기타 분해 산물일 수 있다. 그들은 예를 들면, 당화(glycosylation), 인산화(phosphorylation), 알킬화 또는 디술피드 결합과 같은 번역후 변형(posttranslational modification)에 의해 변형될 수 있다. 단편 및 분해 산물은 그들이 유래된 단백질 또는 펩티드와 상이한 진단적 가치 및/또는 생리학적 역할을 가질 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 상이한 질환에서, 상이한 단백질분해효소에 의한(proteolytic) 분해 산물 또는 단편이 발견될 수 있다. 또한, 소변 내에 함유된 폴리펩디드를 화학적으로 변형시키고 이 화학적으로 변형된 폴리펩티드 마커를 측정하기 위해 소변 시료가 전처리되는 경우 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 마커는 400 내지 20000 Da, 특히 700 내지 14000 Da, 보다 구체적으로 800 내지 11000 Da의 분자 질량을 갖는다.

본 발명에 따른 바람직한 폴리펩티드 마커는 표 1 내지 22, 구체적으로 표 1 내지 21, 보다 구체적으로 표 1 내지 13에 열거된다.

내부 기준으로 사용될 바람직한 폴리펩티드가 표 23 또는 24에 열거된다.

또한 표 1에 열거되나, 표 14 및/또는 15 및/또는 16 및/또는 17 및/또는 18 및/또는 19 및/또는 20 및/또는 21 및/또는 22에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 2에 열거되나, 표 14 및/또는 15 및/또는 16 및/또는 18에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 3에 열거되나, 표 14 및/또는 16 및/또는 18에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 4에 열거되나, 표 14 및/또는 16 및/또는 19에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 5에 열거되나, 표 14 및/또는 16 및/또는 18 및/또는 19에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 6에 열거되나, 표 14 및/또는 16에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 7에 열거되나, 표 14 및/또는 16 및/또는 17에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 8에 열거되나, 표 14 및/또는 16에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 9에 열거되나, 표 14 및/또는 16 및/또는 20 및/또는 21에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 10에 열거되나, 표 14 및/또는 16에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

또한 표 11에 열거되나, 표 14 및/또는 16에 열거되지 않은 폴리펩티드 마커가 바람직하다.

본 발명에 따른 신장 질환은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 신장 질환, 또는 신장 부전, 예를 들면, IgA-신장병증, MGN(membranous glomerulonephritis), MCD(minimal-change disease), FSGS(focal-segmental glomerulosclerosis), 또는 당뇨병성 신장병증에 관한 것이다. 구체적으로, 신장 질환은 IgA-신장병증, MGN, MCD, 또는 FSGS에 관한 것이다. 훨씬 더 구체적으로, 신장 질환은 IgA-신장병증, MCD, 또는 FSGS에 관한 것이다. 가장 구체적으로, 신장 질환은 IgA-신장병증에 관한 것이다.

사구체병증(glomerulopathy)은 신장 질환의 서브그룹이다. 사구체병증은 상이한 병인의 여러 질환들을 포함한다. 사구체병증은 말피기소체(malpighian corpuscle), 사구체, 및 보우만낭(Bowman's capsule)의 병리형태학적 (pathomorphological) 변화를 특징으로 한다. 이 변화들의 결과로, 네프론(nephron) 및 간극(interstice)의 다른 부분들에서 추가적인 병리형택적 변화가 나타날 수 있다.

IgA-신장병증은 또한 버거-신장염(Berger-Nephritis)으로 알려져 있다. IgA-신장병증은 가장 흔한 사구체병증이다. IgA-신장병증은 IgA의 증가된 혈장 농도를 갖는 헤노흐-쉔라인 자색반신장염(purpura Schoenlein-Henoch)(아나필릭시스 자반증으로도 알려짐)의 특이적, 신장-한정된 형태일 수 있다. 조직병리학적 소견은 모든 형태의 사구체 병변 및 사구체간질(mesangium)에서 IgA의 침착을 포함한다. 임상적으로, IgA 신장병증은 마이크로- 및 마크로-혈뇨(hematouria)로 발현된다. ACE 억제제 및 오메가-3 지방산에 의한 치료법이 시도될 수 있다. 상기 질병의 진행은 수년에 걸쳐 일어나며 진행성 신 부전(progressive renal insufficiency)으로의 이행을 포함한다.

MGN은 기저막(basal membrane)의 비후화 및 과립 상피하 IgG 침착을 특징으로 한다. MGN은 종종 40세와 50세 사이에 발현된다. MGN은 종종 약제, 예를 들면, 금, D-페니실라민, 또는 ACE 억제제에 의해 유발된다. 글루코코르티코이드 또는 시클로포스파미드에 의한 MGN의 치료법이 시도될 수 있다. MGN은 신 증후군(nephrotic syndrome)이고, 진행성 신부전으로의 이행은 수년이 걸릴 수 있다.

MCD는 또한 리포이드 신증(lipoid nephrosis)으로 알려져 있다. MCD는 소아에서 신증후군의 가장 일반적인 원인이다. MCD의 병인은 알려져 있지 않다. 조직학적으로, 매우 이산된(discrete) 변화만 관찰하거나, 또는 변화를 전혀 관찰할 수 없다. MCD의 치료법은 글루코코르티코이드, 시클로스포린 A, 또는 시클로포스파미드에 의한 치료를 포함할 수 있다. 소아에서, MCD는 90%는 자발적으로 치유되며, 성인의 경우 50%가 자발적으로 치유된다. FSGS로의 이행이 이루어질 수 있다.

FSGS는 또한 IgM-신장병증으로 알려져 있다. FSGS는 통상적으로 사구체간질에서 IgM 및 C3의 침착을 특징으로 한다. 임상적으로, FSGS는 신 증후군으로 발현된다. FSGS의 치료법은 글루코코르티코이드, 시클로스포린 A, 또는 시클로포스파미드에 의한 치료를 포함할 수 있다. 진행은 부진하고 진행성 신부전으로의 이행을 포함한다.

당뇨병성 신장병증은 또한 당뇨병성 사구체경화증으로 알려져 있다. 당뇨병성 신장병증은 투석 치료의 요구를 초래하는 가장 일반적인 원인이다.

요약하면, 신장 질환은 상당히 유사한 조직학적 특징을 보일 수 있는 다양한 질환을 포함한다. 그러나, 병인, 치료, 및 예후는 각 질환별로 상당이 상이할 수 있다. 예를 들면, IgA-신장병증은 전술된 다른 사구체병증과 상이한 치료를 요구한다: IgA-신장병증에서, ACE 억제제에 의한 치료가 시도될 수 있고, 이는 MGN의 경우에는 권고되지 않는다. 따라서, 신속하고 신뢰할 수 있는 진단이 치료를 위해 매우 중요하다.

본 발명에서, 진단은 개별적인 환자에 대해 각 질환을 가질 확률이 결정되는 것을 의미한다.

진단은 또한 예비 진단, 특히, 상이한 방법에 의해 정립된 예비 진단을 확인하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 진단은 "감별 진단(differential diagnosis)"에 관한 것이다. 용어 "감별 진단"은 두 개의 상이한 질환을 구별하는 것, 즉, 개별 환자에 대해 특정한 제2 질환을 가질 확률 대비 특정한 제1 질환을 가질 확률을 결정하는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 감별 진단은 IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 신장 질환을 구별하는 것에 관한 것이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 신장 질환을 감별 진단하는 방법으로서, 상기 방법은:

a) 소변 시료에서 표 1 내지 표 22에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계, 및

b) 질병 환자에서의 상기 마커의 존재 확률을 대조구 환자에서의 상기 마커의 존재 확률과 비교하는 단계를 포함하고,

cl) 질병 환자에서의 상기 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서의 상기 마커의 존재 확률보다 더 높은 경우, 상기 마커의 존재는 대조구 상태보다 상기 질병을 가질 보다 높은 확률을 나타내거나, 또는

c2) 질병 환자에서의 상기 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서의 상기 마커의 존재 확률보다 더 낮은 경우, 상기 마커의 부재는 대조구 상태보다 상기 질병을 가질 보다 높은 확률을 나타내는 것인 방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 단계 b)에 따른 개별적인 확률들은 표에 표시된 바와 같다.

본 발명에 따른 용어 "측정(measuring)"은 목적 폴리펩티드(polypeptide of interest) 또는 다른 목적 물질의 존재를 결정하는 것을 의미한다.

폴리펩티드 마커가 존재하는지 또는 부재하는지 여부의 결정은 적합한 역치(threshold value)의 정의에 의존적일 수 있다. 역치는 측정 방법의 민감도를 통해 정의되거나, 또는 원하는 대로 정의될 수 있다. 본 발명에서 실시예 1에 따라 질량 분석기에 주입된 시료에서 역치는 25 fmol/㎕이다. 그러나, 이 역치는 다른 방법이 사용되는 경우에도 동일할 수 있다. 이 역치는 통상적인 질량 분석기의 검출 역치와 일치한다. 이 역치는 대략 소변 시료 내의 50-5000 pmol/l의 폴리펩티드 마커의 농도에 해당한다. 상이한 역치가 사용되는 경우(예를 들면, 다른 검출 방법을 이용하는 경우), 상응하는 확률이 다를 수 있으나, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 수립될 수 있다.

본 발명에 따른 "질병 환자(disease patient)"는 신장 질환을 앓는다. 구체적으로, 상기 질병은 IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터의 하나 이상의 질병이다.

"대조구 환자(control patient)"는 건강하거나 또는 질병 환자가 앓고 있는 질병과 상이한 질병을 앓을 수 있고, 즉, 대조구 환자는 건강한 상태 또는 질병 또는 질병의 군을 대표할 수 있다. 구체적으로, 상기 대표된 질병은 PIgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터의 하나 이상의 질병이다.

표 1 내지 14, 16, 20, 21, 및 22는 주어진 폴리펩티드 마커가 건강한 대조구 환자 또는 특정한 질환을 앓는 대조구 환자의 소변 시료에 존재할 확률(또한 "빈도(frequency)"로 표시함)을 열거한다. 식별 인자(discrimination factor)는 주어진 대조구 조건 대비 질병에서의 존재 확률의 차이를 나타낸다. 식별 인자는 개별적인 확률로부터 용이하게 계산될 수 있다. 식별 인자가 높을수록, 주어진 인자가 질병과 대조구 상태를 구별하는 능력이 더 우수하다. 0.40 이상의 식별 인자의 절대값이 바람직하다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 단독으로 폴리펩티드 마커에 대한 유사한 표를 수립하고 및/또는 예를 들면, 추가적인 환자 데이터에 근거하여 및/또는 폴리펩티드 마커의 존재에 대한 상이한 역치에 따라 표에 포함된 데이터를 재정립할 수 있다.

진단을 위해, 질병 환자에서의 폴리펩티드 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서의 이 마커의 존재 확률과 비교되며, 개별적인 확률은 표에 표시된 바와 같다. 질병 환자에서 이 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서 이 마커의 존재 확률보다 높은 경우, 시료에서 이 마커의 존재는 상기 시료가 유래된 환자가 대조구 상태보다 상기 질환을 가질 더 높은 확률을 갖는다는 것을 나타낸다. 질병 환자에서 이 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서 이 마커의 존재 확률보다 더 낮은 경우, 시료에서 이 마커의 부재는 상기 시료가 유래된 환자가 대조구 상태보다 상기 질환을 가질 더 높은 확률을 갖는다는 것을 나타낸다.

예를 들면, 주어진 마커는 IgA-신장병증을 나타내는 대조구에 존재할 73%의 확률을 가지나, 건강한 상태를 나타내는 대조구에 존재할 0%의 확률을 가질 수 있다. 이 마커가 시료에 존재하는 경우, 개체는 건강한 개체 대비 IgA-신경병증을 앓을 73%의 확률을 갖는 것으로 진단된다. 이 마커가 시료에 존재하지 않는 경우, 개체는 IgA-신경병증을 앓는 대신 건강할 73%의 확률을 갖는 것으로 진단된다.

따라서, 진단은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 통계적 방법에 따라 수립될 수 있다.

본 발명은 단 하나의 폴리펩티드 마커를 이용하거나 또는 복수 개의 폴리펩티드 마커를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 복수 개의 폴리펩티드의 마커의 존재가 측정된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 3개 이상의 마커, 보다 바람직하게는 10개 이상의 마커, 훨씬 더 바람직하게는 20개 이상의 마커, 가장 바람직하게는 50개 이상의 마커가 측정된다.

본 발명의 장점은 본 발명이 복수 개의 적합한 마커들을 제공한다는 것이다. 복수 개의 마커를 측정하는 것은 진단의 민감도 및 선택성을 모두 증가시킬 수 있다. 따라서, 질병과 대조구 간의 낮은 식별 인자를 보이는 마커도 그들이 다른 마커들과 조합되는 경우 진단을 위해 이용될 수 있다.

복수 개의 폴리펩티드 마커가 이용되는 경우, 측정되는 각 마커의 존재에 대한 정보를 포함하는 "패턴(pattern)"이 생성된다. 그 후, 이 패턴은 질병 환자 또는 대조구 환자에서 폴리펩티드 마커의 존재의 확률의 패턴과 비교될 수 있다. 각 표는 특정한 질병 환자와 대조구 환자에서 주어진 폴리펩티드 마커를 발견할 확률의 패턴을 나타낸다.

따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 신장 질환의 감별 진단 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다:

a) 표 1 내지 표 22에 표시된 폴리펩티드 마커들의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리펩티드 마커인 복수 개의 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재의 패턴을 수립하는 단계, 및

b) 질병 환자에서 이 패턴을 발견할 확률을 대조구 환자에서 이 패턴을 발견할 확률을 비교하고,

cl) 질병 환자에서 상기 패턴을 발견할 확률이 대조구 환자에서 상기 패턴을 발견할 확률보다 높은 경우, 상기 패턴을 발견하는 것은 대조구 상태보다 상기 질병을 가질 보다 높은 확률을 나타내는 것이거나, 또는

c2) 질병 환자에서 상기 패턴을 발견할 확률이 대조구 환자에서 상기 패턴을 발견할 확률보다 낮은 경우, 상기 패턴을 발견하는 것은 대조구 상태보다 상기 질병을 가질 보다 낮은 확률을 나타내는 것인 단계를 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)에 따른 상기 하나 이상의 폴리펩티드 마커에 대한 개별적인 확률은 표들에 표시된 바와 같다.

질병 환자 또는 대조구 환자에서 상기 패턴을 발견할 확률과 발견된 패턴의 비교는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 통계적 방법에 따라 수행될 수 있다. 바람직하게는, 자동화된 방법, 예를 들면, CART-분석, 랜덤 포레스트 분석, 및 지지 벡터 기계(SVM, Xiong. M., et al. (2001) Biomarker identification by feature wrappers. Genome Research vol. 11, p. 1878-1887 참조)가 이용된다. 또한 수 개의 상이한 패턴 및 그들을 발견할 확률에 대해 비교가 동시에 수행될 수 있다.

따라서, 측정된 패턴은 통상적으로 둘 이상의 상태에서 상기 패턴을 발견할 확률에 비교된다. 이 방법에 따른 신장 질환의 진단 및 감별 진단의 예가 도 3에 도시된다.

필요한 경우, 소변 시료를 폴리펩티드 마커의 측정 전에 전-처리할 수 있다. 특히, 여과, 원심분리, 또는 클로로포름/페놀 추출과 같은 추출 방법을 포함한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 시료로부터 지질, 핵산 또는 폴리펩티드가 정제될 수 있다.

폴리펩티드 마커의 존재를 측정하는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직한 방법은 레이저 탈착/이온화 질량 분석법(laser desorption/ionization mass spectrometry), SELDI-TOF MS(surface enhanced laser desorption/ionization time-of flight mass spectrometry) 및 CE-MS와 같은 기체상 이온 분광분석법(gas phase spectrometry)을 포함한다. 이 분광분석 방법들은 항체 또는 앱타머와 같은 리간드에 대한 요구 없이 폴리펩티드 마커를 측정할 수 있게 한다.

소변 시료는 일반적으로 매우 복잡하고, 즉, 그들은 다수의 폴리펩티드를 포함한다. 높은 복잡성의 경우, 분광분석이 어려워진다. 시료의 복잡성을 감소시키기 위해, 시료에 함유된 폴리펩티드는 적합한 수단, 예를 들면, 전기영동 분리, 친화도-기반 분리, 또는 이온 교환 크로마토그래피에 기반한 분리에 의해 분리될 수 있다. 구체적인 예는 겔 전기영동, 이차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(2D-PAGE), 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), 금속-친화도 크로마토크래피, 고정화된 금속-친화도 크로마토그래피(IMAC), 렉틴에 기반한 친화도 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, HPLC(High Pressure Liquid Chromatography), 및 역상 HPLC, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 선택적 결합 표면(예를 들면, SELDI-TOF에서 이용된 표면, 하기 참조)을 포함한다.

2D-PAGE는 일반적으로 폴리펩티드 분리를 위해 이용되고 질량 분석법(MS)과 결합되어 개별적인 폴리펩티드의 확인을 가져온다. 2D-PAGE로 1000개 이상의 단백질 스팟이 식별될 수 있다. 그러나, 각각의 단일 스팟은 확인을 위해 MS/MS에 의해 별개로 분석되어야 한다.

현재 SELDI-TOF(surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight) 질량분석법이 다수의 생물의학 분야에서 적용된다.

SELDI 시스템에서, ProteinChip Array가 가장 중요한 요소이다. 그들은 표면 상에 1열에 8개 또는 16개의 스팟을 갖는 좁은 금속 스트립이다. 분석대상 시료는 지지 유닛(supporting unit)인 "바이오프로세서(bioprocessor)"라 불리는 시료 홀더(sample holder)를 이용하여 일정한 분량(standing drop)으로 또는 500 ㎕ 이하의 용량으로 스팟에 직접 적용된다. 그들은 인큐베이션 및 세척 단계 동안 어레이에 배치되고 그 후 다시 제거된다. 상이한 종류의 어레이들은 두 개의 주요한 시리즈에 속한다: 소수성, 친수성, 양이온-교환, 음이온-교환 또는 고정화된 금속 이온 친화도-표면을 제시하는 크로마토그래피 어레이, 및 단백질의 공유결합을 가능하게 하는 화학 작용기를 갖는 미리 활성화된(preactivated) 어레이. 바람직하게는, 양이온-교환 표면을 갖는 칩이 이용된다. ProteinChip Arrays가 시료를 지지하지 않으나, 특이적으로 생체분자들과 상호작용하기 때문에, 분석물의 조성은 사용된 어레이 타입 및 적용된 세척 조건에 의존적이다. 이는 SELDI-방법이 전통적인 MALDI(matrix assisted laser desorption/ionization)-기법의 추가적인 발달로 정의될 수 있는 이유를 설명한다. SELDI-방법에서, 칩 표면에 실질적으로 결합하는 폴리펩티드들만 측정된다.

시료 단백질의 결합 후에, 각 스팟에 에너지 흡수 매트릭스(energy absorbing matrix)가 적용된다. 상기 매트릭스는 신속하게 결정화되고 즉시 분석이 개시될 수 있다.

ProteinChip Arrays는 분석을 위해 ProteinChip Reader에 배치된다. 상기 판독기는 단백질이 탈착되고 레이저 빔에 의해 이온화되는 것인 TOF(time-of-flight) 질량 분석기이다. 결정화된 단백질은 스팟 표면상에 균일하게 분포되기 때문에, 이온화 레이저 빔은 항상 분석물 내의 대표적인 평균 분자를 맞추어(hit), 정량적 계산을 가능하게 한다. 이온화 후, 검출기에 도달하기 전에, 단백질은 비행 튜브(flight tube)를 떨어뜨리기(fly down) 위해 전기장에 의해 가속된다. 어레이 표면을 강타하는 레이저와 비행 튜브의 말단에 있는 검출기에 도달하는 분자 간의 비행 시간은 시스템이 시료 내에 존재하는 단백질 종의 질량을 정확하게 결정할 수 있게 한다(상기 방법에 대한 보다 상세한 정보를 위해서, 하기의 검토를 참조한다: Merchant M and Weinberger SR (2000). Recent advancements in surface-enhanced laser desorption / ionization - time of flight mass spectrometry. Electrophoresis vol. 212, p. 1164-1177).

그러나, 가장 바람직한 방법은 모세관 전기영동(CE)이 질량 분석법(MS)과 결합된 것인 CE-MS이다. CE-MS는 다른 문헌에 상세하게 기재된다(예를 들면, 독일 특허출원 DE 100 21 737, 및 Kaiser, T., et al., Capillary Electrophoresis coupled mass spectrometry to establish polypeptide patterns in dialysis fluids. J Chromatogr A, vol. 1013, p. 157-171(2003) 참조).

CE는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다. 요약하면, 시료가 전기영동 모세관 상에 적재되고, 50 kV 이하, 일반적으로 30 kV 이하의 전압이 적용된다. 통상적인 모세관은 용융 실리카(fused silica) 모세관, 즉, 기계적 지지체(mechanical support)인 외부 집(outer sheath) 및 기계적 유연성을 개선하기 위해, 예를 들면, 열가소성 물질로 제조된 집을 포함하는 유리 모세관이다. 통상적으로, 모세관은 처리되지 않으며, 즉, 그 내부에 히드록시기를 보인다. 그러나, 상기 모세관은 또한, 내면이 코팅될 수 있다. 예를 들면, 식별력(discriminatory power)을 제고하기 위해 소수성 코팅이 이용될 수 있다. 전압 외에, 일반적으로 0 내지 1 psi의 범위의 압력이 적용될 수 있다. 상기 압력은 또한 전개(run) 동안 적용되거나 또는 증가될 수 있다.

식별력을 개선하기 위해, 시료의 적재 시, 스택킹 프로토콜(stacking protocol)이 적용될 수 있다: 시료의 적재 전에, 염기(base)가 적재되고, 시료가 적재되고, 그 후 산이 적재된다. 원칙은 염기와 산 사이에 분석물 이온을 포획(capture)하는 것이다. 전압이 인가되면, 양으로 하전된 분석물 이온이 염기를 향해 이동한다. 염기에서 그들이 음으로 하전되어 산을 행해 반대 방향으로 이동하고, 거기에서 양으로 하전된다. 이 스택킹은 산과 염기가 중화될 때까지 반복된다. 그 후, 잘 농축된 시료로부터 분리가 개시된다.

시료는 예를 들면, 인산염 완충액과 같이 폴리펩티드가 가용성인 적합한 완충액에 담긴다. CE-MS 결합(coupling)의 경우, 휘발성 용매를 이용하고 MS의 오염을 방지하기 위해 주로 염-불포함 조건에서 작업하는 것이 바람직하다. 예는 아세토니트릴, 이소프로판올, 메탄올, 및 등가물을 포함한다. 상기 용매는 또한 물 및 약산(예를 들면, 0.1% 포름산)과 조합될 수 있고, 약산은 분석물에 양자를 첨가한다. 시료 내의 폴리펩티드는 크기 및 전하에 따라 분리되고, 이는 모세관에서 전개 시간(run-time)을 결정한다. CE는 높은 분리력(separating power)과 짧은 분석 시간을 특징으로 한다.

후속 MS 분석을 위해, CE로부터 수집된 분획이 분리된 배치(batch)로서 분석되거나, 또는 바람직하게는 CE 시스템이 연속 흐름 분석(continuous flow analysis)을 가능하게 하기 위해 적합한 인터페이스를 통해 질량 분석기에 결합될 수 있다. 대안적으로, CE로부터의 흐름이 별개로 분석될 수 있는 연속적인 "분리 트랙(separation track)"을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 질량 분석기에서, 시료로부터 생성된 이온이 질량/전하(m/z) 비율에 따라 분석된다. 질량 분석기를 이용하여, ± 0.01%의 정확도로 10 fmol(즉, 10 kDa 폴리펩티드 0.1 ng)을 통상적으로 분석하는 것이 가능하다. 실험적으로, 0.1 fmol 미만까지 분석할 수 있다.

임의의 종류의 질량분석기가 이용될 수 있다. 질량 분석기에서, 이온-생성 장치가 적합한 분석기와 결합된다. 예를 들면, 전자분무 이온화(electrospray ionization: ESI) 인터페이스가 액체 시료로부터 이온을 생성하기 위해 가장 일반적으로 이용되고, MALDI는 개별적으로 가공된 시료로부터 이온을 생성하기 위해 가장 일반적으로 이용된다. 상이한 종류의 분석기, 예를 들면, 이온 트랩 분석기(ion trap analyzer), 또는 TOF(time-of-flight) 분석기가 이용가능하다. ESI 및 MALDI 모두 본질적으로 모든 종류의 질량 분석기와 조합될 수 있으나, ESI는 통상적으로 이온 트랩과 조합되고, MALDI는 통상적으로 TOF와 조합된다.

본 발명에 따른 바람직한 CE-MS 방법은 ESI를 통해 온라인으로 TOF 분석기에 연결된 모세관 전기영동을 포함한다.

CE-MS 기법은 높은 민감도로 소량으로 단시간에 수백 개의 폴리펩티드 마커의 존재를 측정할 수 있게 한다. 일단 폴리펩티드 마커의 존재가 측정되면, 측정된 폴리펩티드 마커의 패턴이 생성되고 전술된 임의의 방법에 의해 질병 패턴과 비교될 수 있다. 그러나, 다수의 경우에, 단 하나 또는 제한된 수의 마커를 측정하는 것이 진단을 위해 충분하다.

폴리펩티드 서열은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다(예를 들면, C.S. Spahr et al. (2001). Towards defining the urinary proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. I. Profiling an unfractionated tryptic digest. Proteomics vol. 1, p. 93-107 참조).

폴리펩티드 마커의 종류에 따라, 추가적인 수단에 의해 그의 존재 또는 부재를 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면, 폴리펩티드 마커가 생물학적 활성을 갖는 경우, 그의 존재는 세포적 분석 또는 효소 분석법에 의해 결정될 수 있다.

폴리펩티드의 존재는 리간드의 목적 폴리펩티드로의 결합의 이용에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 결합은 공유 결합 및 비-공유결합을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 리간드는 목적 폴리펩티드에 결합하는 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 핵산 또는 다른 물질일 수 있다. 인간 또는 동물 신체로부터 수득되거나 또는 정제된, 폴리펩티드는 예를 들면, 당화에 의해 변형될 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 적합한 리간드는 또한 그와 같은 부위를 통해 폴리펩티드를 결합할 수 있다.

바람직한 리간드는 항체, 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드, 및 앱타머, 예를 들면, 핵산 또는 펩티드 앱타머를 포함한다. 다수의 폴리펩티드에 대해, 적합한 리간드가 상업적으로 이용가능하다. 또한, 적합한 리간드를 생성하는 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 적합한 항체 또는 앱타머의 식별 및 제조가 또한 상업적 공급업체에 의해 제공된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체(antibody)"는 다중클론 항체 및 단일클론 항체, 및 항원 또는 합텐을 결합할 수 있는 Fv, Fab 및 F(ab)₂ 단편들과 같은 그들의 단편을 포함한다.

바람직하게는, 리간드는 측정대상 폴리펩티드에 특이적으로 결합해야 한다. 본 발명에 따른 "특이적 결합(secific binding)"은 리간드가 검사대상 시료에 존재하는 또 다른 폴리펩티드 또는 물질에 실질적으로 결합하지("교차-반응(cross-react)"하지) 않아야 한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 특이적으로 결합된 단백질 또는 이소형(isoform)은 다른 관련된 폴리펩티드보다 3배 이상, 보다 바람직하게는 10배 이상 및 훨씬 더 바람직하게는 50배 이상 강하게 결합해야 한다.

특히, 검사된 펩티드 또는 폴리펩티드가 예를 들면, 웨스턴 블롯에서 크기에 따라 또는 시료에서 상대적으로 더 높은 농도(abundance)에 의해 명확하게 구별되고 측정될 수 있는 경우, 비-특이적 결합은 허용될 수 있다(tolerable).

목적 폴리펩티드의 존재를 측정하는 방법은 (a) 폴리펩티드를 특이적으로 결합하는 리간드를 접촉시키는 단계, (b)(선택적으로) 비-결합(non-bound) 리간드를 제거하는 단계, (c) 결합된 리간드의 존재 또는 양을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

리간드의 결합은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다. 첫째, 리간드의 결합은 직접적으로, 예를 들면, NMR 또는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정될 수 있다. 둘째, 리간드는 목적 펩티드 또는 폴리펩티드의 효소 활성의 기질로서 작용하고, 효소 반응 산물이 측정될 수 있다(예를 들면, 절단된 기질의 양을 예를 들면, 웨스턴 블롯에 의해 측정하는 것에 의해 프로테아제의 존재가 측정될 수 있다). 셋째, 리간드는 표지에 공유결합 또는 비-공유결합에 의해 결합되어, 리간드의 검출 및 측정을 가능하게 할 수 있다.

표지화(labeling)는 직접적 방법 또는 간접적 방법에 의해 수행될 수 있다. 직접적인 표지화는 표지를 리간드에 (공유결합 또는 비-공유결합에 의해) 직접적으로 결합시키는 단계를 포함한다. 간접적 표지화는 2차 리간드를 1차 리간드에 (공유결합 또는 비-공유결합에 의해) 결합시키는 단계를 포함한다. 상기 2차 리간드는 상기 1차 리간드에 특이적으로 결합해야 한다. 상기 2차 리간드는 적합한 표지에 결합되고 및/또는 상기 2차 리간드로의 3차 리간드 결합의 표적(수용체)일 수 있다. 2차, 3차, 또는 훨씬 더 높은 차수의 리간드의 이용이 종종 신호를 증가시키기 위해 이용된다. 적합한 2차 및 그보다 높은 차수의 리간드는 항체, 이차 항체, 및 잘 알려진 스트렙타비딘-비오틴 시스템(Vector Laboratories, Inc.)을 포함할 수 있다.

리간드 또는 기질은 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 하나 이상의 택(tag)으로 "태깅(tag)"될 수 있다. 그와 같은 택은 보다 높은 차수의 리간드의 표적일 수 있다. 적합한 택은 비오틴, 디그옥시게닌(digoxygenin), His-Tag, 글루타티온-S-트랜스퍼라아제, FLAG, GFP, myc-tag, 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 말토오스 결합 단백질 및 그 등가물을 포함한다. 펩티드 또는 폴리펩티드의 경우, 택은 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단에 존재한다.

적합한 표지는 적합한 검출 방법에 의해 검출가능한 임의의 표지이다. 통상적인 표지는 금 입자, 라텍스 비드, 아크리딘 에스테르, 루비놀, 루네튬, 효소적 활성 표지(enzymatically active label), 방사성 표지, 자기 표지(예를 들면, 상자성(paramagnetic) 및 초상자성(superparamagnetic) 표지를 포함한 "자성 비드"), 및 형광 표지를 포함한다.

효소적 활성 표지는 예를 들면, 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 루시페라아제 및 그들의 유도체를 포함한다. 검출을 위한 적합한 기질은 디-아미노-벤지딘(DAB), 3,3'-5,5'-테트라메틸벤지미드, NBT-BCIP(Roche Diagnostics로부터 즉시 사용가능한 스톡 용액(ready-made stock solution)으로 구입가능한, 4-니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트), CDP-Star™(Amersham Biosciences), ECF™(Amersham Biosciences)을 포함한다. 적합한 효소-기질 조합은 착색된 반응 산물, 형광 또는 화학적 발광으로 초래할 수 있고, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다.

통상적인 형광 표지는 형광 단백질(예를 들면, GFP 및 그의 유도체), Cy3, Cy5, 텍사스 레드, 플로오레신(Fluorescein), 알렉사 염료(예를 들면, Alexa 568), 및 양자 점(quantum dot)을 포함한다.

통상적인 방사성 표지는 ³⁵S, ¹²⁵I, ³²P, ³³P, 및 그 등가물을 포함한다.

따라서, 본 발명에 따른 적합한 측정 방법은 또한 침전(특히, 면역침전), 전기화학발광(전기-생성 화학발광(electro-generated chemiluminescence)), RIA(radioimmunoassay), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 샌드위치 효소 면역 테스트(sandwich enzyme immune test), ECLIA(electrochemiluminescence sandwich immunoassay), DELFIA(dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay), SPA(scintillation proximity assay), 비탁법(turbidimetry), 혼탁측정법(nephelometry), 라텍스-강화(latex-enhanced) 비탁법 또는 혼탁측정법, 또는 고체상 면역 테스트(solid phase immune test)를 포함한다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려진 추가적인 방법(예를 들면, 겔 전기영동, 2D 겔 전기영동, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 웨스턴 블롯팅)이 단독으로, 또는 전술된 바와 같은 표지화 또는 다른 검출 방법과 함께 조합되어 이용될 수 있다.

리간드가 또한 어레이 상에 존재할 수 있다. 상기 어레이는 목적 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 작용할 수 있는 하나 이상의 추가적인 리간드를 포함한다. 또한 본 발명에서 상기 추가적인 리간드는 특정한 목적이 아닌 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 작용하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 5개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20개 이상의 본 발명에 따른 폴리펩티드 마커에 대한 리간드가 상기 어레이 상에 포함된다.

본 발명에 따라, 용어 "어레이(array)"는 그 위에 두 개 이상의 화합물이 일차원-, 이차원- 또는 삼차원 배열로 부착되거나 또는 결합된 고체상 또는 겔-유사 담체를 의미한다. 그와 같은 어레이("유전자 칩", "단백질 칩", 항체 어레이 및 그 등가물)가 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 알려져 있고 통상적으로 유리 현미경 슬라이드, 다가양이온-, 니트로셀룰로오스- 또는 비오틴-코팅된 슬라이드와 같은 특이적으로 코팅된 유리 슬라이드, 커버 슬립, 및 예를 들면, 니트로셀룰로오스 또는 나일론에 기반한 막과 같은 막 상에 생성된다.

어레이는 결합된 리간드 또는 각각 하나 이상의 리간드를 발현하는 두 개 이상의 세포를 포함할 수 있다.

"현탁 어레이(suspension array)"를 본 발명에 따른 어레이로 이용하는 것이 고려된다(Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat- array paradigm. Trends Biotechnol. vol. 20(1), p. 9-12). 그와 같은 현탁 어레이에서, 담체, 예를 들면, 미세비드(microbead) 또는 미세소포(microsphere)는 현탁액으로 존재한다. 어레이는 상이한 미세비드 또는 미세소포로 구성되며, 상기 미세비드 또는 미세소포는 가능하게는 표지되며, 상이한 리간드를 운반한다.

본 발명은 또한 다른 리간드 외에 하나 이상의 리간드가 담체 물질에 결합된 것인, 전술된 바와 같은 어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

그와 같은 어레이, 예를 들면, 고체상 화학 및 광-분해(photo-labile) 보호기에 기반한 어레이를 제조하는 방법이 일반적으로 알려져 있다(US 5,744,305). 그와 같은 어레이는 또한 물질 또는 물질 라이브러리와 접촉되고 상호작용, 예를 들면, 결합 또는 구조 변화(change of conformation)에 대해 테스트된다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 마커를 포함하는 어레이는 상기 펩티드 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 리간드를 식별하기 위해 이용될 수 있다.

폴리펩티드의 서열을 결정하기 위해, 폴리펩티드는 달성가능한 최고 수준까지 정제되어야 한다. 그러나, 폴리펩티드가 완전히 분리되지 않아도 된다. 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔에서 쿠마시-염색 밴드(coomassie-stained band)로 검출가능한 폴리펩티드를 갖는 것으로 충분하다. 그 후, 상응하는 겔 조각이 절제되고 후속 식별 단계를 위해 이용될 수 있다. 폴리펩티드의 정제 후에, 상기 폴리펩티드를 트립신으로 효소에 의해 소화시키고 결과물인 단편의 분자량을 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 질량 분석법에 의해 결정할 수 있다. 질량 분석법을 이용하여, 각 폴리펩티드는 단편들의 특징적인 "지문(fingerprint)"를 보여서 데이터베이스 검색에 의한 식별을 가능하게 한다. 식별대상 폴리펩티드가 데이터베이스에 존재하지 않는 경우, 또는 연구자가 임의의 이유로 인해 보다 상세한 특성규명을 원하는 경우, 폴리펩티드 단편들은 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 서열결정될 수 있다.

CE-MS는 폴리펩티드 서열의 특히 용이한 결정을 가능하게 한다. 각 마커에 대한 모세관 전기영동 용출 시간이 표에 열거된다. 따라서, 비교적 높은 순도로 폴리펩티드를 포함하는 분획을 회수하는 것이 가능하다. 단일 분획이 불충분한 물질을 포함하는 경우, 하나 이상의 실험의 분획들이 합쳐질 수 있다.

일부 폴리펩티드 마커의 서열들이 서열번호 1 내지 5로 열거된다. CE-MS에 의해 측정된 질량 및 그들의 개별적인 서열들은 하기와 같다:

도 1. 가공되지 않은 CE-MS 분석(A)으로부터의 정보가 삼차원 컨투어 플롯(contour plot)(좌측)으로 도시된다. 건강한 지원자로부터 유래된 소변의 컨투어 플롯이 잔류 시간(분)(X축) 대비 Y축 상의 전하당 질량(mass per charge), 코딩 된 신호 강도 색상을 보여준다. 그 후, 신호 대 잡음(signal to noise)이 계산되고, 잡음이 제거되어, 실제 신호만 남는다(B). 소프트웨어는 동위원소 분포(isotopic distribution) 및 컨쥬게이션된 질량(conjugated mass)에 근거하여 실제 질량(C)을 계산한다. 이는 질량 및 잔류 시간을 통해 정의된 최대 1500 개의 폴리펩티드의 표를 생성한다. 예로서, 우측 하단은 시료에서 확인된 17개의 폴리펩티드를 보여준다. CE-t, CE-시간(이동 시간);int., 강도(intensity); m.p.c, 전하 당 질량(mass per charge), cal. m., 계산된 질량(calculated mass).

도 2. 건강한 개체(NC) 및 FSGS(focal-segmental glomerulosclerosis), MCD(minimal-change disease) 및 MGN(membranous glomerulonephritis)을 가진 환자에 대한 폴리펩티드(실제 질량)의 컨투어 플롯이 도시된다. 각 플롯의 질량 상한(즉, X-축에 따른 최대값)이 각 플롯의 좌측 상단에 표시된다. 명백하게 나타난 바와 같이, 컨투어 플롯은 건강한 개체와 신장 환자군 간에 상당히 상이하다.

도 3. 신장 질환의 진단 및 감별 진단의 플로우 쉬트(예). Samp., 시료(sample); MS-dat, MS-데이터(data); Disea., 질병(disease); Y, yes; N, no; n.d., 무 질환(no disease); d.n., 당뇨병성 신장병증(diabetic nephropathy), FSGS, FSGS; MGN, MGN; MCD, MCD; IgA, IgA-신장병증(IgA-nephropathy), diff, 감별 진단(differential diagnosis)

본 발명은 하기의 실시예에 의해 더 예시된다:

실시예 1

참가자:

지역 윤리 위원회(Ethics Committee)의 허가 후에, 모든 참가자들로부터 사전 동의(informed consent)를 받았다. 본 발명자들은 CE-MS로 정상적인 소변 단백질 패턴을 수립하기 위해 정상적인 신장 기능을 갖는 57명의 건강한 개인들의 군을 검사하였다. 또한, 본 발명자들은 생검으로 입증된 미소병변 신증(n = 16; MCD), 막 사구체신염(n = 18; MGN), 및 국소-분절 사구체경화증(n = 10; FSGS)을 갖는 44명의 환자들을 검사하였다(표 1).

CE - MS 분석:

최초 소변을 배설한 후 오전에 모든 참가자들로부터 스팟 소변 시료(spot urine sample)를 채취하였다. 다른 문헌에 상세하게 기재된 바와 같이 시료를 준비하였다(Wittke S, Fliser D, Haubitz M, et al: Determination of peptides and proteins in human urine with CE-MS - suitable tool for the establishment of new diagnostic markers. J Chromatogr A 1013:173-181, 2003). 앞서 기재된 바와 같이(Kaiser T5 Hermann A, Kielstein JT, et al: Capillary Electrophoresis coupled mass spectrometry to establish polypeptide patterns in dialysis fluids. J Chromatogr A 1013: 157-171, 2003), Mariner TOF 질량 분석기(ABI)에 연결된 Beckman Coulter PAC/E 시스템을 이용하여 CE-MS 분석을 정립하였다. CE 모세관은 ID/OD 75/360 ㎛이고 길이가 90 cm로, Beckman 제품이었다. 이용된 이동상(mobile phase)은 물에 담긴 30% 메탄올 및 0.5% 포름산을 포함했다. 동일한 액체를 2 ㎕/분으로 적용된, 집 흐름(sheath flow)을 위해 이용하였다. 시료 주입은 압력으로 수행하였다: 20초 동안 1 psi. 이 조건들 하에서, 약 100 nl의 시료를 주입할 수 있었다. 시료 스택킹(sample stacking)을 위해, 하기 프로토콜을 적용하였다: 7초 동안 1M NH₃의 주입, 시료의 주입, 5초 동안 2M 포름산의 주입. 뒤이은 CE-MS 전개는 하기 압력의 순서로 +30 kV에서 수행하였다: 0 psi에서 40분, 0.1 psi에서 2분, 0.2 psi에서 2분, 0.3 psi에서 2분, 0.4 psi에서 2분, 0.5 psi에서 80분. IgA-신장병증의 진단을 위해, 하기의 압력 순서를 이용하였다: 0.3 psi에서 40분, 0.4 psi에서 2분, 0.6 psi에서 2분, 0.8 psi에서 2분, 1 psi에서 80분. 각 전개 후에, CE 모세관을 0.1M NaOH로 5분 동안 세정하고, 뒤이어 물로 5분 동안 및 전개 완충액(running buffer)으로 5분간 세정하였다.

통계적 분석:

건강한 개체와 신장 질환을 갖는 환자들의 상이한 군들 간의 식별을 위해, 본 발명자들은 랜덤 포레스트(Random Forests) 방법 및 상응하는 S-Plus 프로그램 버전 6/2002 Breiman L: Random Forests를 이용하였다 .(http://oz.berkeley.edu/users/breiman/randomforest2001.pdf). 이 절차에서, 모든 후보 PP로부터 일정한 크기(fixed size)의 일련의 PP 서브셋트가 임의적으로 선택된다. 각 서브셋트에 대해, CART(Classification and Regression Tree) 분석에서 설명된 바와 같은 분류 트리(classification tree)가 생성되어(Steinberg D, Colla P: CART - Classification and Regression trees. San Diego, CA, Salford Systems 1997), 분류 규칙(classification rule)이 수립된다. 포레스트 예측은 가중치가 없는(unweight) 복수 개의 일련의 분류 규칙의 클래스 투표(class vote)이다. 다수의 서브셋트 선택 때문에 과-적합(over-fitting)은 생성되지 않는다. 추정된 일반화 오류(estimated genralisation error)는 "oob(out of bag)" 추정 방법 때문에 편향되지 않는다: 각 트리는 학습 시료(learning sample) 케이스들의 부트스트랩(bootstrap) 시료 상에서 생장되고 검증(validation)은 부트스트랩 시료에서 선택되지 않은 케이스들에 근거하여 추정된다.

또한, 지지 벡터 기계(support vector machine)을 이용하여 그룹간 식별을 수행하였다. 이 도구는 고차원 파라미터 공간(high dimensional parameter space)에서 데이터를 식별하는 장점을 갖는다. 그의 신속하고 안정적인 알고리즘은 임상적 마커의 평가(Dieterle F, Muller-Hagedorn S, Liebich HM, Gauglitz G: Urinary nucleosides as potential tumor markers evaluated by learning vector quantization. Artif Intell Med 28:265-279, 2003) 및 DNA 어레이와 같은 생물학적 분석의 상이한 영역(Brown MP, Grundy WN, Lin D, et al: Knowledge-based analysis of microarray gene expression data by using support vector machines. Proc Natl Acad Sd USA 97:262-267, 2000)에서 우수한 성능을 보였다.

CE-MS로 분석된 정상 소변 폴리펩티드 패턴:

통상적인 시료의 그래프 도시(컨투어 플롯)가 도 1에 제시된다(가공되지 않 은 데이터). 하나의 개별적인 시료에서 800 내지 30.000 달톤의 분자량을 갖는 900 내지 2400개의 PP를 검출하였다. CE를 위해 이용된 조건 하에서, 보다 높은 분자량을 갖는 폴리펩티드는 침전되는 경향이 있다. 따라서, 일부(예를 들면, 알부민)는 시각화될 수 있으나, 일반적으로 보다 높은 단백질은 검출될 수 없다. 시료 비교가능성(comparability)을 보장하기 위해 내부 표준으로 선택된 높은 확률로 존재하는 폴리펩티드의 목록이 표 23에 표시된다. IgA-신장병증 의심 환자로부터의 시료와 같은 단백질-풍부 시료의 분석의 경우, 보다 높은 압력을 적용하였으며, 표 24에 따른 폴리펩티드가 내부 표준으로 바람직했다. 동일한 시료의 반복 분석은 개별적인 시료에 대한 CE-MS 전개의 동일한 조건 하에서 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.

하나의 예로서, 뒤이은 전산적 데이터 조작이 도 1에 요약된다. 각 전개는 도 1의 상부에 도시된 조 스펙트럼(crude spectrum)을 가져오며, 3초 간격으로 생성된 단일 스펙트럼(도 1 확대)으로 구성된다. 1차 데이터 분석 전개에서 CE-MS 피크를 검출하였다(도 1A). 그 후, 동위원소 분포 및 컨쥬게이션된 피크를 이용하여 각 피크의 전하를 확인하였다(도 1B). 도 1C에 도시된 바와 같이, 결과로, 컨쥬게이션된 피크들이 하나의 피크로 요약되고 실제 질량이 계산되었다. 먼저, 시료에 공지된 질량의 외부 표준을 첨가하였다(spike). 이는 뒤이어 소변 시료에서 높은 확률로 존재하는 PP의 내부 표준의 정의를 가능하게 했다. 따라서, CE-시간을 내부 표준으로 정규화시킬 수 있었다. 이 기법을 표준 소변 시료에 적용하여, 약 1000 개의 PP를 검출하고, 두 개의 파라미터, 질량과 CE-이동 시간에 의해 설명 /확인할 수 있었다.

건강한 개체로부터 수득된 소변의 검사는 각 개체에 대한 검출된 PP의 실제 질량 및 CE-시간에 의해 정의된 피크들, 소위 피크 목록 및 컨투어 플롯의 수립을 가져왔다. 개별적인 피크 목록을 MS-Access 데이터베이스에 저장하고 각각의 PP가 하나의 시료에서 나타날 확률을 계산하였다. 173개의 PP가 검사된 대조구 시료의 90% 이상에 존재했다. 또한, 75% 이상의 시료에 156개의 PP가 존재했고, 건강한 개체로부터의 시료의 50% 이상에서 추가적인 361개의 PP를 확인했다. 건강한 개체로부터 수득된 모든 시료의 50% 이상에서 이 690개의 PP를 확인하여 "정상 PP 패턴(normal PP pattern)"을 수립하기 위해 이용했다.

CE - MS 로 분석된 신장 질환 환자로부터의 소변:

44명의 환자의 개별적인 전개로부터의 데이터를 3개의 질병 그룹으로 서브-그룹핑하고 분석하였다. 뒤이어, 전형적인 PP 패턴을 나타내는, 이 데이터베이스로부터의 값들을 비교하였다. 각 환자군으로부터의 소변 시료에 존재하는 단백질 패턴의 유의성 있는 상동성을 군들 내에서 확인하였다. MCD, FSGS, 및 MGN을 갖는 환자들로부터의 소변 PP 패턴의 전형적인 예가 도 2에 도시된다. 각 질병은 500개 이상의 PP를 도시하는 전형적인 컨투어 플롯을 제시한다. 뒤이어, 상기 세 개의 군으로부터의 데이터를 건강한 개체로부터 수득된 데이터와 비교하였다. 표 16은 95% 이상의 건강한 개체의 소변에서 확인된 124개의 PP를 표시하고 MCD, FSGS, 및 MGN을 갖는 환자들과의 차이를 보여준다.

CE-MS 데이터를 이용하여 건강한 개체와 신장 질환을 가진 환자들의 식별을 위한 통계적 분석을 적용하였다. 질병 군에서 50% 이상의 확률로 존재하는 800개의 PP의 목록을 랜덤 포레스트 분석을 위해 선택하였다. 건강한 개체와 신장병 환자들 간의 식별에 대한 정확한 분류율(classification rate)은 하기 목록에 표시된 바와 같이, 96.5%였다:

분류	건강한 개체(n=57)	신장병 환자(n=44)	분류 오류[%]
건강한 개체로 분류됨	56	2	3.5
환자로 분류됨	1	42	2.3

교차-검증(cross-validation) 후에, 81.3%의 선택성 및 94.3%의 특이성을 수득할 수 있었다. 학습 시료에서 질병군의 식별을 달성하였다. 그러나, 소수의 FSGS 환자 때문에, 이들은 교차-검증을 적용하는 경우, MCD로부터 식별되지 않았다. 따라서, FSGS와 MCD를 하나의 군으로 결합했다. 건강한 개체, MCD/FSGS 및 MGN 간의 식별을 위해, 네개의 PP를 5개의 말단 노드(terminal node)로 분류 트리를 수립하기 위해 목록으로부터 CART를 선택하였다(표 15). 학습 시료에서 정확한 분류율은 94.1%였다. 교차-검증 후에, 이는 84.3%(건강한 대조구의 경우 93.8%, MCD/FSGS의 경우 71.4% 및 MGN의 경우 92.9%)로 감소되었다.

대안적으로, 동일한 데이터에 대해 지지 벡터 기계를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다; 표 16은 이 분석에서 사용된 PP를 보여준다. 이 PP를 이용하여, 완전한 교차-검증 후에, 정확한 분류는 98.0%였다. 표 17은 MCD와 MGN을 식별하기 위해 이용될 수 있는 PP를 보여준다. 따라서, 완전한 교차 검증 후, 정확한 분류는 94.1%였다. 또한, MCD 및 FSGS를 갖는 환자와 MGN 및 FSGS를 갖는 환자를 각각 92.3% 및 89.3%의 (교차-검증된) 분류율로 구별할 수 있었다. 이 결과들은 제한된 수의 환자를 분류하기 위해 지지 벡터 기계를 이용한 제1 접근방식으로 평가될 수 있다. 환자 데이터의 증가와 함께, 분류는 더 개선되고 더 안정해질 것이다. 결과는 또한 안정적인 분류를 위해, 적용가능한 변수(폴리펩티드)의 수는 케이스(환자)의 수에 의존적이고, 따라서, 환자의 증가는 분류를 위해 훨씬 더 많은 PP를 이용할 수 있게 할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> MOSAIQUES DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS AG <120> METHOD AND MARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF RENAL DISEASES <130> 060215wo <140> PCT/EP2006/050327 <141> 2006-01-20 <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fragment of human albumin, C-terminus, amino acids 531-609 <400> 1 Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln 1 5 10 15 Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys 20 25 30 Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe 35 40 45 Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu 50 55 60 Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 65 70 75 <210> 2 <211> 90 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fragment of human albumin, C-terminus, amino acids 520-609 <400> 2 Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala 1 5 10 15 Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr 20 25 30 Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln 35 40 45 Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys 50 55 60 Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu 65 70 75 80 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 85 90 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fragment of Salivary proline-rich protein <400> 3 Gly Gly Arg Pro Ser Arg Pro Pro Gln 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fragment of alpha fibrinogen <400> 4 Gly Phe Arg His Arg His Pro Asp Glu Ala Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:fragment of olfactory receptor 8B4 <400> 5 Gly Leu Ile Thr Leu Ile Gly Ile Asn Pro Ser Leu His Thr 1 5 10

Claims (18)

1. 신장 질환의 진단을 위한 소변 시료 내의 하나 이상의 폴리펩티드 마커의 존재의 용도로서, 상기 폴리펩티드 마커는 표 1 내지 22에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
2. 제1항에 있어서, 상기 신장 질환은 IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
3. 제1항에 있어서, 상기 신장 질환은 IgA-신장병증인 것인 용도.
4. 제1항에 있어서, 상기 진단은 IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 질병 간의 감별 진단(differential diagnosis)인 것인 용도.
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드 마커는 표 1 내지 표 13에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
6. 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드 마커는 표 11 내지 표 13에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택되는 것인 용도.
7. 신장 질환을 진단하는 방법으로서, 상기 방법은:

   a) 소변 시료에서 표 1 내지 표 22에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택된 폴리펩티드 마커의 존재 또는 부재를 측정하는 단계, 및

   b) 질병 환자에서의 상기 마커의 존재 확률을 대조구 환자에서의 상기 마커의 존재 확률과 비교하고,

   cl) 질병 환자에서의 상기 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서의 상기 마커의 존재 확률보다 더 높은 경우, 상기 마커의 존재는 대조구 상태보다 상기 질병을 가질 보다 높은 확률을 나타내거나, 또는

   c2) 질병 환자에서의 상기 마커의 존재 확률이 대조구 환자에서의 상기 마커의 존재 확률보다 더 낮은 경우, 상기 마커의 부재는 대조구 상태보다 상기 질병을 가질 보다 높은 확률을 나타내는 것인 단계를 포함하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 단계 b)에서 개별적인 확률은 표에 표시된 바와 같은 것인 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 대조구는 건강한 상태를 나타내는 것인 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 대조구는 신장 질환, 특히, IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된 신장 질환인 것인 방 법.
11. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩티드 마커는 표 11 내지 표 13에 표시된 폴리펩티드 마커의 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
12. 제7항에 있어서, 상기 방법은 복수 개의 상기 폴리펩티드 마커, 바람직하게는 3개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 가장 바람직하게는 50개 이상의 상기 폴리펩티드 마커를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
13. 제7항에 있어서, 상기 마커 또는 마커들의 존재를 검출하기 위해 ELISA, 정량적 웨스턴 블롯(quantitative Western Blot), 방사선 면역분석법(radioimmunoassay), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 어레이(array), 겔 전기영동, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis), 기체상 이온 분광분석법(gas phase ion spectrometry), 또는 질량 분석법(mass spectrometry)이 이용되는 것인 방법.
14. 제7항에 있어서, 상기 시료 내의 폴리펩티드 마커는 측정 전에 모세관 전기영동에 의해 분리되는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 마커 또는 마커들의 존재를 검출하기 위해 질량 분석 법이 이용되는 것인 방법.
16. 인 비트로에서 신장 질환의 진단, 특히, 감별 진단을 위한 모세관 전기영동-질량 분석법의 용도.
17. 제16항에 있어서, 상기 신장 질환은 IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된 신장 질환인 것인 용도.
18. IgA-신장병증, MGN, MCD, FSGS, 및 당뇨병성 신장병증으로 구성된 군으로부터 선택된 둘 이상의 신장 질환 간의 감별 진단을 위한 모세관 전기영동-질량 분석법의 용도.

Images