JP5924587B2 - 血中hcv検出方法及び抗hcv治療の効果判定方法 - Google Patents
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Description
[1] 補体C4のHCV NS3/4Aプロテアーゼ切断により生成される、血液検体中のC4γ切断断片を検出することを含む、被験者の血液中のC型肝炎ウイルス(HCV)の検出方法。
[2] 前記C4γ切断断片が、配列番号1で示されるアミノ酸配列の1583位のシステインと1584位のセリンの間、又は1590位のシステインと1591位のアラニンの間のNS3/4Aプロテアーゼ切断によりC4γ鎖から生成される17kDa又は15kDaのタンパク質である、上記[1]に記載の方法。
[3] 被験者が、C型肝炎ウイルス感染者又は感染既往者である、上記[1]又は[2]に記載の方法。
[4] 被験者が、C型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス治療中又は抗ウイルス治療終了後の患者である、上記[3]記載の方法。
[5] 上記[3]又は[4]に記載の方法を用いてC型肝炎ウイルスを経時的に測定することを含む、被験者におけるC型肝炎ウイルス量のモニタリング方法。
[6] 上記[4]又は[5]に記載の方法を用いてC型肝炎ウイルスを測定し、その測定結果を抗ウイルス治療の効果の指標とすることを含む、抗ウイルス治療効果の判定方法。
[7] 補体C4のHCV NS3/4Aプロテアーゼ切断により生成されるC4γ切断断片に結合する抗体を含む、C型肝炎ウイルス検出試薬。
[8] 前記C4γ切断断片が、配列番号1で示されるアミノ酸配列の1583位のシステインと1584位のセリンの間、又は1590位のシステインと1591位のアラニンの間のNS3/4Aプロテアーゼ切断によりC4γ鎖から生成される17kDa又は15kDaのタンパク質である、上記[7]に記載のC型肝炎ウイルス検出試薬。
[9] 上記[7]又は[8]に記載のC型肝炎ウイルス検出試薬を含む、C型肝炎ウイルス検出用キット。
補体系は自然免疫の中心的役割を担っており、病原体の排除を補助する。補体系は血液中の多数の小タンパク質から構成され、古典経路、マンノース結合レクチン経路、副経路の3つの生化学的プロセスで活性化される。補体系を構成する成分の1つである補体C4は、古典経路及びマンノース結合レクチン経路で活性化される。C4は分子量19.8万の糖タンパク質であり、3本のポリペプチド鎖(α鎖、β鎖、γ鎖)がジスルフィド結合で架橋されたユニット構造をとっている(図2)。ヒトC4遺伝子によってコードされる1本の前駆体ポリペプチド(C4前駆体ポリペプチド)は翻訳後に切断され、補体C4β鎖、補体C4-Aα鎖(補体C4α鎖)、及び補体C4γ鎖が生成する。C4遺伝子にコードされる前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列は決定されている。例えばNCBI Proteinデータベース(UniProtKB/Swiss-Prot)でアクセッション番号P0C0L4(version: P0C0L4.1)の下で開示されるヒトのC4前駆体ポリペプチドの典型的アミノ酸配列(配列番号1)において、1〜19位はシグナルペプチド、20〜675位は補体C4β鎖、676〜679位はプロペプチド、680〜1446位は補体C4α鎖、1447〜1453位はプロペプチド、そして1454位〜1744位が補体C4γ鎖である。補体C4γ鎖に相当する、配列番号1の1454位〜1744位のアミノ酸配列を配列番号2に示す。
HCV非構造タンパク質であるNS3/4Aプロテアーゼが宿主免疫応答の一部を担う補体C4に対してどのような影響を及ぼすのかを検討するため、補体C4にHCV NS3/4Aプロテアーゼ、HCV Core又はHCV NS5を混合し、C4が切断されるか試験した。
NS3/4Aプロテアーゼ阻害剤が、NS3/4AプロテアーゼによるC4切断を抑制するかどうかを検討した。
まずHCV NS3/4Aプロテアーゼ阻害剤(VX-950)を、ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解後、各種濃度(0、1、10、100、及び500μM)になるように上記の30mM DTT含有アッセイバッファーで希釈し12μlとした。このHCV NS3/4Aプロテアーゼ阻害剤にNS3/4Aプロテアーゼ(4μl)を加えて30℃で30分プレインキュベートした後、C4(4μl)を加えて30℃で30分インキュベートした。インキュベートした混合溶液に5% 2-メルカプトエタノール含有Laemmliサンプルバッファー(Bio-Rad)(20μl)を混合し、その混合溶液25μlをAny kDTM ミニプロティアン(登録商標) TGXTM プレキャストゲル(Bio-Rad)を用いた一次元ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供してタンパク質を分離し、クーマシーブリリアントブルー(CBB)で染色した。コントロールのため、HCV NS3/4Aプロテアーゼ阻害剤VX-950をC4に添加せずに同様の実験を行った。
HCV NS3/4AプロテアーゼによるC4切断の生理的意義を解析するため、溶血素に感作されたヒツジ赤血球(Ab-sensitized sheep erythrocyte;EA)に補体を順に混合して古典経路による補体活性化を再現し、赤血球溶血試験により、HCV NS3/4Aプロテアーゼの補体機能への影響を以下のように試験した。感作ヒツジ赤血球と補体の結合に基づく赤血球溶血試験は、既報に従った(Krych-Goldberg M., et al., J. Biol. Chem., (1999);274(44):31160-31168;Avirutnan P., et. al., J. Exp. Med., (2010);207(4):793-806)。赤血球や補体の希釈には2%ゼラチン含有ベロナール緩衝液(GVB)を使用した。また、すべての操作は氷上で行った。
溶血度= (被験試料OD415 - GVB OD415) / (蒸留水添加試料OD415 - GVB OD415)
12.5μg/mlに希釈したNS3/4Aプロテアーゼ(10μl)を100μMのNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤VX950(6mM DTT含有GVBで希釈)5μlと混合し、30℃で30分インキュベートした後、6.3μg/mlに希釈したC4(5μl)と混合して30℃で30分インキュベートした。次いで、実施例3と同様にして調製したEAC1 100μlと混合し、30℃で15分インキュベートして補体中間体EAC1-C4を調製した。GVBで2回洗浄後、C2(0.1 mg/ml)を1μl加え、室温で4分インキュベートしてEAC1-C4-C2を調製した。さらに、GVBで2回洗浄後、EAC1-C4-C2 30μlに80倍希釈したC4dGPS 150μlを加え、37℃で30分インキュベートした。得られた反応液を遠心し、上清を415nmで吸光度測定し、溶血度を上記式に従って計算した。コントロールとして、NS3/4Aプロテアーゼ非存在下及びVX950非存在下でも同様の赤血球溶血試験を行った。
実施例1で見出された、NS3/4Aプロテアーゼによる補体C4の切断で生じるC4γ切断断片が、HCV感染者血清中に含まれるかどうかを検討した。
HCV陽性患者(HCV感染者)に抗ウイルス治療としてペグインターフェロン+リバビリン併用療法を実施しながら、治療経過中の血液を採取し、実施例5と同様の方法で血清中の17kDaタンパク質(C4γ切断断片)の検出を行った。また血清中のHCV-RNAをリアルタイムPCR法で定量した。
Claims (7)
- 補体C4のHCV NS3/4Aプロテアーゼ切断により生成される、血液検体中のC4γ切断断片を検出することを含む、被験者の血液中のC型肝炎ウイルス(HCV)の検出方法であって、前記C4γ切断断片が、配列番号1で示されるアミノ酸配列の1583位のシステインと1584位のセリンの間、又は1590位のシステインと1591位のアラニンの間のNS3/4Aプロテアーゼ切断によりC4γ鎖から生成される17kDa又は15kDaのタンパク質である、方法。
- 被験者が、C型肝炎ウイルス感染者又は感染既往者である、請求項1に記載の方法。
- 被験者が、C型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス治療中又は抗ウイルス治療終了後の患者である、請求項2記載の方法。
- 請求項2又は3に記載の方法を用いてC型肝炎ウイルスを経時的に測定することを含む、被験者におけるC型肝炎ウイルス量のモニタリング方法。
- 請求項3又は4に記載の方法を用いてC型肝炎ウイルスを測定し、その測定結果を抗ウイルス治療の効果の指標とすることを含む、抗ウイルス治療効果を判定するための指標を得る方法。
- 補体C4のHCV NS3/4Aプロテアーゼ切断により生成されるC4γ切断断片に結合する抗体を含む、C型肝炎ウイルス検出試薬であって、前記C4γ切断断片が、配列番号1で示されるアミノ酸配列の1583位のシステインと1584位のセリンの間、又は1590位のシステインと1591位のアラニンの間のNS3/4Aプロテアーゼ切断によりC4γ鎖から生成される17kDa又は15kDaのタンパク質である、C型肝炎ウイルス検出試薬。
- 請求項6に記載のC型肝炎ウイルス検出試薬を含む、C型肝炎ウイルス検出用キット。
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