CN102445539B - 一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片及试剂盒 - Google Patents
一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片及试剂盒，所述的应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片，包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述的癌症相关蛋白为HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF。所述的应用于肝癌的早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于，包含以HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF为检测对象的定量抗体芯片，含有HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的抗原标准品，以及HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的生物素化的检测抗体。本发明具有较高的准确率。
Description
技术领域
本发明涉及一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片及试剂盒，属于生物医学技术领域。
背景技术
肝细胞癌 (hepatocellular
carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿, 恶性程度高, 病死率高, 因此早期诊断对于提高患者的生存率至关重要。目前临床上主要运用甲胎蛋白 (alpha fetoprotein, AFP)结合影像学及病理学检查进行肝癌的早期诊断; 但是 AFP对于肝癌筛查的特异性及敏感性均不十分理想。随着分子生物学的不断发展,多种新的标志物被相继发现,这些标志物涉及肝癌的蛋白质抗原、酶和同工酶、细胞因子、相关基因等几个方面,故成为肝癌研究的热点,有望改变肝癌早期诊断和疗效监测的现状。
细胞因子促进细胞生长的特性早已为人们所熟知,其作用机制是具有生长刺激活性的细胞因子作为配基与细胞膜表面的相应受体结合,然后通过受体后信号传递途径使细胞出现分裂增殖。目前认为此过程发生改变所引起的细胞分裂增殖失控可能诱导肿瘤发生。目前发现某些肿瘤细胞可过度合成和释放促使细胞生长和分裂的细胞因子,同时又依赖于这些细胞因子进行持续地、不可控制地生长。提示某些细胞因子在特定肿瘤发展过程中起相当重要的作用。在肝癌的发生发展过程中存在多种细胞因子的特异性表达改变。转化生长因子1 ( transforming growth
factor beta1, TGFβ 1)是一个多潜能生长因子, 参与调节胚胎形成、细胞增殖和分化、伤口愈合和血管再生等。TGF-β1高表达于肿瘤细胞,抑制肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞及NK细胞的增殖, 促进肿瘤细胞生长。研究显示, TGFβ1在肝癌组织中的表达显著高于正常肝组织, 表达情况与肿瘤分化程度相关。TGFβ1和 TGFβ1mRNA可以作为合并HBV感染 HCC的敏感性诊断指标, 且当 TGFβ1>1.2 μg/L其诊断 HCC的敏感性和特异性分别为89.5%和 94.0 %。血管内皮生长因子 ( vascular endothelial
growth factor , VEGF)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子, 可在体内诱导血管生成。肿瘤血管生成对实体瘤的发生、发展和转移至关重要, VEGF是已知作用最强、最重要的血管生成刺激物,能直接作用于血管内皮细胞促进其增殖,诱导血管生成、 增加血管通透性。成年后 VEGF仅在肿瘤等病理状态下表达显著升高, 故其表达与肿瘤进展和预后密切相关。在肝癌出现前 VEGF即可显著升高, 随着肝癌的进一步发展, 其分布状态发生显著变化, 因此VEGF可用于肝癌的预测及早期诊断, 但其特异性较差,多用于与其他标志物联合检测。当肝细胞发生癌变时, 过量表达胰岛素样生长因子( insulin like growth
factor ,IGF) , 通过自分泌或旁分泌生长刺激机制, 促进癌前期肝细胞的异常增生和分化,增加癌前肝细胞的突变概率,并在一定条件下加速其恶化, 形成肿瘤。 IGF在HCC患者血清中表达增高, 但其敏感度、特异性和准确性均不及 AFP , 因此这一指标的临床应用前景尚待探索。细胞因子白介素10 (interleukin10, IL10)是一种强有力的肿瘤抑制因子及协同刺激分子, 可影响肿瘤发生发展。
肿瘤血清标志物作为诊断肿瘤的辅助性指标在临床上已得到广泛应用，其在肝癌的诊断中具有重要参考价值，尽管为肿瘤的诊断和疗效观察起了很大的作用，但在应用过程中仅靠单一指标进行测定，其敏感性和特异性均有限，特别是对早期肿瘤的阳性检出率较低，为了弥补单指标检测的不足，提高诊断肿瘤的准确性，临床上采用多指标肿瘤标志物联合检测某一肿瘤。 蛋白芯片是一种高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质分析技术，抗体微阵列（Antibody Microarray）是蛋白质芯片的一种，是检测生物样品中蛋白表达模式的新方法。本研究采用硝酸纤维素膜基片构建多重抗体芯片定量肿瘤标志物，并与传统ELISA结果对比。根据双抗体夹心免疫分析原理研制了能同时定量测定8项指标(即AFP, HGF, IGF, IL-6,
IL-8, IL10, TGFβ1, VEGF)的多重抗体芯片，评价了系统的检测范围、最低检测限、精密度、正常参考值范围、稳定性、灵敏度、特异度、准确度等，并与ELISA进行了临床血清标本检测结果的相关性比较。同时利用该多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统检测临床确诊肝癌组166例。通过检测这8种肿瘤标志物结果以及临床资料进行回顾性研究, 建立肿瘤判别诊断函数,获得受试者工作曲线（ROC）以及判别（Cut off）值，比较AFP和多重判别诊断函数对肝癌诊断的准确率差异。本发明适用于肝癌高发现场或者肝病人群大规模筛查，对于提高早期肝癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低肝癌病死率具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较高准确率的应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片及试剂盒。
为了达到上述目的，本发明提供了一种包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述的癌症相关蛋白包括HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF。
优选地，所述的癌症相关蛋白还包括AFP。
本发明还提供了一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于，包含定量抗体芯片，所述的定量抗体芯片的检测对象包括HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF；HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的抗原标准品；以及HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的生物素化的检测抗体。
优选地，所述的应用于肝癌的早期筛查和诊断的试剂盒还包含AFP的抗原标准品，AFP的生物素化的检测抗体，所述的定量抗体芯片的检测对象还包括AFP。
本发明的优点是：本发明首次采用了AFP、HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF作为一个组合应用于肝癌的早期筛查和诊断，具有较高的准确率。
附图说明
图1为多重抗体定量芯片构成以及双抗体夹心法原理示意图；（+ 阳性对照：生物素化BSA，-阴性对照：PBS缓冲液）；
图2为交叉反应示意图；
图3a为AFP检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3b为IL-8检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3c为HGF检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3d为IL10检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3e为IGF检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3f为TGF检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3g为IL-6检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图3h为VEGF检测标准曲线；横坐标为各标准品浓度单位 ng/ml，纵坐标为荧光信号值-背景荧光值；
图4为七种细胞因子联合以及AFP+七种细胞因子构建ROC曲线。
具体实施方式
如图１所示，为多重抗体定量芯片构成以及双抗体夹心法原理示意图，本发明建立并优化多重定量抗体芯片检测系统（双抗体夹心法）。从文献报道中选择14种被选的肝癌相关标记物，HCCR，SCCA，GPC3，GP73，DCP，AFP-L3和AFU ELISA试剂盒分别定自ADL公司；IGF-I，TGFb1，VEGF ，IL-6， IL-10，IL-8，和HGF ELISA试剂盒分别定自R&D公司, HSP27以及HSP27-P的ELISA试剂盒购自 Bender公司。血清样本40例血清样本由广西医科大学检验科提供，其中20例肝硬化病人的血清标本，平均年龄 44岁（23-57岁），男性15人，女性5人；20例肝癌病人的血清标本，平均年龄46.5岁（30-71岁），男性18人，女性2人 ，均经临床确诊。通过ELISA验证每个分子在两组病人中的差异，最终选择AFP以及7个差异明显的血清细胞因子作为抗体芯片备选分子，八种肿瘤相关标记物在肝癌和肝硬化病人血清中的水平（P<0.5被认为差异显著）如下表所示：
| 肿瘤标记物（ng/ml) | 肝癌组（n=20） | 肝硬化组（n=20） | P（t test) |
| AFP | 57749.43±50199.89 | 35594.6 ±49066.2 | 0.0027 |
| HGF | 72170.83 ±26216.8 | 39686.97 ±64417.5 | 0.323 |
| IGF | 1119.172 ±876.56 | 1046.838 ±601.74 | 0.50 |
| IL-6 | 8654.383 ±19638.2 | 15680.47 ±33709.5 | 0.05 |
| IL-8 | 659313.1 ±256468.5 | 441746.1 ±672372.3 | 0.401 |
| IL-10 | 14.6035 ±1.335 | 14.3363 ±1.31 | 0.118 |
| TGFβ1 | 148105.5 ±191545.2 | 74280.57 ±56142.5 | 8.87E-08 |
| VEGF | 16822.79 ±29533.2 | 2092.779 ±56142.3 | 0.00014 |
本发明制备或购置相应检测抗原的标准品以及单克隆抗体，如图２所示，在8个相同的围栏中加入混合标准品，以及混合检测抗体，未见明显的非特异交叉反应，确立了双抗体夹心法对每一个蛋白的检测范围、最低检测限、精密度并建立了定量检测的函数式，成功构建了可用于临床血清样品筛查的多重抗体芯片定量检测系统。
下面结合实施例来具体说明本发明。
实施例
1、抗体芯片及其制备：
（1） 所用试剂：
| 抗体 | 生产厂家 | 货号 |
| AFP单克隆抗体 | R&D | MAB13691 |
| HGF单克隆抗体 | R&D | MAB694 |
| IGF单克隆抗体 | R&D | MAB291 |
| IL-6单克隆抗体 | R&D | MAB206 |
| IL-8单克隆抗体 | R&D | MAB208 |
| IL-10单克隆抗体 | R&D | MAB2172 |
| TGFβ1单克隆抗体 | R&D | MAB2461 |
| VEGF单克隆抗体 | R&D | MAB3045 |
| 生物素化TGFβ1多克隆抗体 | R&D | BAM2462 |
配制含30%甘油的PBS缓冲液（ｐＨ7.4）作为芯片点样液；
超薄硝酸纤维素膜PATHTM蛋白芯片购自美国的GenTel Biosurfaces公司；
（2） 制备方法：
点样：用芯片点样液分别稀释8种单克隆捕获体抗体至0.5mg/ml,基片分隔成14个亚阵列区域，在每个亚阵列中用芯片点样仪进行抗体阵列的制备，每种单克隆捕获抗体重复点制6个点；点制0.01g/L的生物素化TGFβ1多克隆抗体作为芯片的阳性对照点，芯片点样液作为阴性对照点，点制好的芯片置于湿度为50%，温度为20℃的封闭环境中，固定过夜。
（3） 封闭：将固定好的抗体芯片用封闭剂孵育过夜，除去封闭剂。
检测HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的抗体芯片采用类似制备方法，区别在于不使用AFP单克隆抗体。
2、试剂盒组成：
（1） 步骤１中所得的抗体芯片；
（2） 八种抗原（AFP，HGF,IGF,IL-6,IL-8,IL-10,TGFβ1和VEGF）标准品和与之配对生物素化的检测抗体，荧光染料strepavidin-Cy3如下：
| 抗体 | 生产厂家 | 货号 |
| AFP标准品 | Abnova | H00000174-P01 |
| HGF标准品 | R&D | 294-HG |
| IGF标准品 | R&D | 291-G1 |
| IL-6标准品 | R&D | 206-IL |
| IL-8标准品 | R&D | 208-IL |
| IL-10标准品 | R&D | 1064-IL |
| TGFβ1标准品 | R&D | 246-LP |
| VEGF标准品 | R&D | 293-VE-010/CF |
| 生物素化AFP多克隆抗体 | R&D | CBLC01 |
| 生物素化HGF多克隆抗体 | R&D | BAF294 |
| 生物素化IGF多克隆抗体 | R&D | BAF291 |
| 生物素化IL-6多克隆抗体 | R&D | BAF206 |
| 生物素化IL-8多克隆抗体 | R&D | BAF208 |
| 生物素化IL-10多克隆抗体 | R&D | BAF217 |
| 生物素化TGFβ1多克隆抗体 | R&D | BAM2462 |
| 生物素化VEGF多克隆抗体 | R&D | BAF293 |
| strepavidin-Cy3 | invitrogen | 43-4315 |
（3） 超薄硝酸纤维素膜PATHTM蛋白芯片配套的封闭剂、洗脱液、清洗液购自美国的GenTel Biosurfaces公司。
（4） 配制得到的1g/L BSA(溶剂为10 mmol/L、pH7.4 PBS缓冲液)、1g/L BSA(溶剂为含0.01%吐温-20的ｐＨ7.4 TBS缓冲液)、1:20稀释的streptavidin-Cy3（稀释液为含10%山羊血清的10 mmol/L、pH7.4PBS缓冲液）。
检测HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的试剂盒类似于上述试剂盒，区别在于不包含AFP的抗原标准品以及AFP的生物素化的检测抗体，所述的定量抗体芯片的检测对象不包括AFP。
3、所用仪器：
美国GeneMachine公司的OmniGrid 100型芯片点样仪；
北京博奥生物有限公司的晶芯® LuxScan™10K 微阵列及图像数据处理的高分辨激光共聚焦芯片扫描仪。
4、 抗体芯片和试剂盒的使用方法：（除孵育温度为37℃，加样、封闭和洗涤过程都在室温下进行，加样体积均为100ul）
（1）加样：在抗体芯片上加入8种用1g/L BSA(溶剂为10 mmol/L、pH7.4的PBS缓冲液)稀释的混合标准品，最高浓度为AFP 200ng/ml、HGF 8ng/ml、IGF100 ng/ml、IL-6 10ng/ml、IL-8 2ng/ml、IL-10 100ng/ml、TGF 100ng/ml、VEGF 20ng/ml，做6个亚阵列的对倍浓度梯度稀释，一个亚阵列的阴性对照，其余亚阵列加入病人血清。
（2）孵育：把芯片置于湿盒中，37℃孵育1h；
（3）洗涤：彻底清除标准品和血清，芯片用洗脱液洗涤3次，每次２min。
（4）加入检测抗体：彻底清除洗脱液，加入用1g/L BSA(溶剂为含0.01%吐温-20的ｐＨ7.4 TBS缓冲液)稀释的生物素化标记的检测抗体，除TGF和VEGF的检测抗体浓度为1ug/ml，其余检测抗体浓度均为0.5ug/ml。湿盒孵育37℃。
（5）洗涤：彻底清除检测抗体，芯片用洗脱液洗涤3次，每次２min。
（6）加荧光染料：彻底清除洗脱液，加入1:20稀释的strepavidin-Cy3（稀释液为含10%山羊血清的10 mmol/L、pH7.4PBS缓冲液），避光，湿盒孵育1h。
（7）洗涤：彻底清除荧光染料，芯片用洗脱液洗涤3次，每次２min。最后，用清洗液轻轻冲洗芯片表面。室温晾干。
（8）芯片检测：晾干后的芯片，用荧光芯片扫描仪进行检测，仪器参数设置为激光强度95%，光电倍增系数850。
（9）绘制标准曲线如图3a-图3f所示，得出病人血清中８种抗原的表达水平。
检测HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF的试剂盒的使用方法类似于上述试剂盒，区别在于不使用AFP的抗原标准品以及AFP的生物素化的检测抗体，所述的定量抗体芯片的检测对象不包括AFP。
5、 利用上述抗体芯片系统检测218例血清样本，其中58例肝硬化病人的血清标本，平均年龄 46.7岁（23-68岁），男性46人，女性12人；160例肝癌病人的血清标本，平均年龄46.5岁（22-71岁），男性128人，女性32人 ，均经临床确诊。
通过检测8种常见肿瘤标志物结果（七种细胞因子以及AFP）和对临床资料进行回顾性研究，使用软件spss11.5建立肿瘤判别诊断函数，获得受试者工作曲线（ROC）以及判别值（Cut off value），比较AFP和多重判别诊断函数对肝癌诊断的准确性和特异性。
七种细胞因子+AFP建立的肿瘤辨别诊断模型如下：
P=K/1+K
其中， K=e(b0+b1 × AFP+b2 × HGF+b3 × IGF+b4 × IL6+b5 × IL8+b6 × IL10+b7 × TGF+b8 × VEGF) ，b0,b1,b2,b3,b4,b5,b6,b7,b8为常数,分别为17.927，1.464e-006，0.000232，0.000167，1.288e-005，2.597e-007，-1.038，1.045，0.00982。cut off 值=0.34。
七种细胞因子建立的肿瘤辨别诊断函数如下：
P=K/1+K，其中 K=e(b0+b1 × HGF+b2 × IGF+b3 × IL6+b4 × IL8+b5 × IL10+b6 × TGF+b7 × VEGF) ，b0,b1,b2,b3,b4,b5,b6,b7为常数,分别为15.150，1.758，0.00011，0.000167，1.288e-005，2.597e-007，-0.894，0.845，0.00473。 cut off 值=0.15。
利用该系统下AFP浓度（cut off value=80ng/ml）作为诊断标准，在肝硬化组的诊断准确率为0% , 肿瘤患者的诊断准确率为100% ,总准确性74.4% ；而根据七种细胞因子建立的肿瘤辨别诊断函数对肝硬化者的诊断准确率为68.2%，对肿瘤患者诊断准确率为86.5%，总准确性81.4%；根据七种细胞因子+AFP建立的肿瘤辨别诊断模型对肝硬化者的诊断准确率为77.3% ,对HCC患者诊断准确率为89%，总准确性86%。多重定量抗体芯片检测系统具有较高灵敏度和特异度,对肝癌的早期诊断具有重要临床价值。多种因子判别函数可提高肝癌早期诊断的准确性。
Claims (2)
1.一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的抗体芯片，包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体、阳性对照和阴性对照，其特征在于，所述的癌症相关蛋白为HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1、VEGF和AFP，肿瘤辨别诊断模型如下：P=K/1+K，其中， K=e(b0+b1 ×AFP+b2×HGF+b3×IGF+b4×IL6+b5×IL8+b6×IL10+b7×TGF+b8×VEGF) ，b0,b1,b2,b3,b4,b5,b6,b7,b8为常数,分别为17.927，1.464e-006，0.000232，0.000167，1.288e-005，2.597e-007，-1.038，1.045和0.00982，cut off 值=0.34。
2.一种应用于肝癌的早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于，包含定量抗体芯片，所述的定量抗体芯片的检测对象为HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1和VEGF；HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1、VEGF和AFP的抗原标准品；以及HGF、IGF、IL-6、IL-8、IL10、TGFβ1、VEGF和AFP的生物素化的检测抗体，肿瘤辨别诊断模型如下：P=K/1+K，其中， K=e(b0+b1 ×AFP+b2×HGF+b3×IGF+b4×IL6+b5×IL8+b6×IL10+b7×TGF+b8×VEGF) ，b0,b1,b2,b3,b4,b5,b6,b7,b8为常数,分别为17.927，1.464e-006，0.000232，0.000167，1.288e-005，2.597e-007，-1.038，1.045和0.00982，cut off 值=0.34。
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