CN102206708A - 一种检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于医学肿瘤学领域的一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及其检测方法。该标志物为肝癌细胞特异性表达降低的基因ASS基因或ASL基因，其启动子区和第一外显子区包含至少一个被甲基化的CpG岛。该试剂盒包括针对ASS基因和ASL基因的各5条特异性专用引物，通过甲基化特异性PCR方法检测ASS基因和ASL基因甲基化情况，进而推测待检样品中是否含有转移肝癌细胞。该方法具有专一性强，反应灵敏的特点，对于了解并掌握如何早期发现肝癌意义重大。

Description

一种检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及方法
技术领域
本发明属于医学肿瘤学领域，具体涉及一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒、标志物及其检测方法。
背景技术
原发性肝癌是世界上恶性成度极高，且预后极差的恶性肿瘤之一，全世界每年约100万人死于肝癌。据统计中国乙肝病毒携带者约一亿多人，而每年新增加肝癌患者约45万，在城市发病率仅次于肺癌，是威胁人们生命的第二大恶性肿瘤“杀手”。肝癌是一种恶性肿瘤，癌细胞转移是它的特性之一。肝癌的转移有四种途径，即血路、淋巴道、直接蔓延、浸润或种植。其中以血行转移最为重要。肝内血行转移发生最早，也最常见，肝细胞型肝癌以血行转移多见，通过血行转移至全身各部，以肺、肾上腺、骨、肾、脑等器官较为常见。大量临床实践证明，恶性肿瘤的预测，关键在于是否能做到早发现、早诊断，而目前肿瘤只有争取早期治疗，才有可能被彻底治愈。早期发现肝癌意义重大，了解并掌握如何早期发现肝癌对肝癌的治疗、预后及降低病死率、延长寿命等方面可谓发挥着很关键的作用。
肝脏是鸟氨酸循环的重要器官。鸟氨酸循环又称“尿素循环”，是机体对氨的一种解毒方式。它的重要生物学意义是将体内蛋白质代谢产生的较高毒性的氨转化为低毒的尿素，从而排出体外。肝脏是哺乳类动物生成尿素的主要器官，由于精氨酸酶的作用使精氨酸水解为鸟氨酸及尿素。而精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)是鸟氨酸循环的关键酶。临床氨基酸分析121例肝癌患者血清和85例正常血清，发现肝癌患者血清精氨酸含量为(41.29±12.25μmol/mL)，正常人血清精氨酸含量为(107.38±11.61μmol/mL)，数据显示两者差异明显(P＜0.05)，表明肝癌患者精氨酸合成障碍。免疫组化和Western blot的方法研究肝癌与精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)及精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)之间的关联，结果显示精氨酸代琥珀酸合成酶(ASS)和精氨酸代琥珀酸裂解酶(ASL)在肝癌组织中的表达与正常组织相比明显下调。
通过进一步的研究发现肝癌ASS基因和ASL基因的启动子区域CpG岛呈高度甲基化状态，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人基因组中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的失活，这是癌症发生的一个重要机制。一些基因的过甲基化成为肿瘤乃至癌细胞形成的标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒。
本发明的目的还在于提供一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的标志物。
本发明的目的还在于一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的方法。
一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，包括dNTP、10xPCR buffer、MgCl2、ddH2O，其特征在于，还包括标准血液DNA、热启动TaqDNA聚合酶、引物F 1、引物B1、引物F2、引物B2、引物B3、引物R1、引物L1、引物R2、引物L2、引物L3；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为：
引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，用于检测ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化情况；
引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，用于检测ASL基因(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)甲基化情况。
所述标准血液DNA为取自无肝癌健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。
引物F 1具有序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，引物B3具有序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，引物R1具有序列表中SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，引物L1具有序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，引物R2具有序列表中SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，引物L2具有序列表中SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，引物L3具有序列表中SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
所述标志物包括肝癌特异性低调控基因ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)或ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)的甲基化的第一外显子和启动子区域；所述ASS(GeneBankNG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)基因甲基化的第一外显子和启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)基因的甲基化的第一外显子和启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.3表示。
包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.3表示的检测血液中转移肝癌细胞的标志物，衍生于肝癌特异性表达降低的基因ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)。
检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.4表示。
检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.5表示。
包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.4或SEQ ID No.5表示的检测血液中转移肝癌细胞的标志物，衍生于肝癌特异性表达降低的基因ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)。
一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从血液样品中提取基因组DNA；
(2)将基因组DNA经重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶；
(3)利用权利要求1所述试剂盒及引物配对方案，以ddH2O、标准血液DNA、经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板，进行甲基化特异性PCR反应；
(4)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如果以ddH2O、标准血液DNA为模板的PCR无扩增条带，而以经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板的PCR扩增有扩增条带，且扩增条带与预测的条带大小一致，则认为所检测的血液样品中含有转移肝癌细胞。
本发明的有益效果：采用本发明的试剂盒和方法，通过检测ASS基因和ASL基因的甲基化情况判断肝癌转移细胞的存在，具有专一性强，反应灵敏的特点，本发明对于了解并掌握如何早期发现肝癌意义重大，对肝癌的治疗、预后及降低病死率、延长寿命等方面起指导作用。
附图说明
图1为引物F1、B1配对扩增正常人血液、肝癌患者血液及7402肝癌细胞、HepG2肝癌细胞ASS基因MSP凝胶电泳图；
图中，M-100bp梯度DNA标准样品、1-ddH2O、2-正常血A、3-正常血B、4-肝癌血A、5-肝癌血B、6-HepG2肝癌细胞、7-7402肝癌细胞。
图2为引物R1、L1配对扩增正常人血液、肝癌患者血液及7402肝癌细胞、HepG2肝癌细胞ASL基因MSP凝胶电泳图；
图中，M-100bp梯度DNA标准样品、1-ddH2O、2-正常血、3-肝癌血A、4-肝癌血B、5-肝癌血C、6-HepG2肝癌细胞、7-7402肝癌细胞。
图3为引物R2、L3配对扩增正常人血液、肝癌患者血液及7402肝癌细胞、HepG2肝癌细胞ASL基因MSP凝胶电泳图；
图中，M-100bp梯度DNA标准样品、1-ddH2O、2-正常血、3-肝癌血A、4-肝癌血B、5-肝癌血C、6-HepG2肝癌细胞、7-7402肝癌细胞。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例未说明的实验步骤参照《分子克隆实验指南》第三版，或参照相应试剂盒的说明书。
实施例1设计用于检测血液中转移肝癌细胞的靶序列和特异性专一引物
(1)根据ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)和ASL基因(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)序列，登陆http://www.urogene.org/methprimer/indexl.html网站，根据网站上提供的方法，筛选出检测肝癌细胞的甲基化靶序列区域，其碱基序列如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示。
(2)根据SEQ ID No.1靶序列和特异性甲基化位点，筛选出适合于甲基化特异性PCR的核苷酸区段，为标志物，根据此序列设计PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，设计的检测血液中转移肝癌细胞ASS基因甲基化的5条特异性专用引物序列如下：
上游引物F1：5’-TCGGTATCGGATAGAAGTGAGTAC-3’(SEQ ID No.6)；
下游引物B1：5’-CAAAAAAAACGACAATAACTACGAC-3’(SEQ ID No.7)；
上游引物F2：5’-GTCGGTATCGGATAGAAGTGAGTAC-3’(SEQ ID No.8)；
下游引物B2：5’-CCAAAAAAAACGACAATAACTACGAC-3’(SEQ ID No.9)；
下游引物B3：5’-CCAAAAAAAACGACAATAACTACGACG-3’(SEQ ID No.10)；
PCR时，引物的配对方案为：引物F1、B1配对；引物F1、B2配对；引物F2、B1配对；引物F2、B3配对。
根据SEQ ID No.2靶序列和特异性甲基化位点，筛选出适合于甲基化特异性PCR的核苷酸区段，为标志物，根据此序列设计PCR引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，设计的检测血液中转移肝癌细胞ASL基因甲基化的5条特异性专用引物序列如下：
上游引物R1：5’-GAGGATGGAGGTAACGTTTATTTC-3’(SEQ ID No.11)；
下游引物L1：5’-CACTAACCAAAACTTTTCTAACCGA-3’(SEQ ID No.12)；
上游引物R2：5’-AGTGTTTAGAATTCGGAGTTAGTTC-3’(SEQ ID No.13)；
下游引物L2：5’-ACTAACCAAAACTTTTCTAACCGAA-3’(SEQ ID No.14)；
下游引物L3：5’-ATATTAAACGATTCCTCGTCGTC-3’(SEQ ID No.15)；
PCR时，引物的配对方案为：引物R1、L1配对；引物R1、L2配对；引物R2、L3配对。
实施例2血液样品中DNA的提取和重亚硫酸盐处理
抽取正常人血液(A、B)各200μL和肝癌患者(A、B、C)血液各200μL，按照《分子克隆实验指南》第三版所述DNA提取操作步骤提取血液样品DNA，将提取的DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。
取培养好的HepG2肝癌细胞(购买自上海超研生物科技有限公司)和7402肝癌细胞(购买自上海超研生物科技有限公司)各200uL，按照《分子克隆实验指南》第三版所述DNA提取操作步骤提取DNA，将提取的DNA经重亚硫酸盐处理使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶保持不变，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。
实施例3甲基化特异性PCR
以无肝癌健康人血液提取并经重亚硫酸盐处理的DNA和ddH2O为对照模板，肝癌患者血液、HepG2.7402肝癌细胞和7402肝癌细胞提取并经重亚硫酸盐处理的DNA为模板，采用下述引物配对方案做PCR：
引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，检测ASS基因的甲基化情况；
引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，检测检测ASL基因的甲基化情况。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0000052717210000071
PCR反应过程为：94℃，3min；然后94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec反应30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，如果以ddH2O及无肝癌健康人血DNA(经重亚硫酸盐处理)为模板的PCR扩增无扩增条带，而以肝癌患者血液、HepG2.7402肝癌细胞和7402细胞提取并经重亚硫酸盐处理的DNA为模板的PCR有扩增条带，且与预测序列一致，证明待测样品含有肝癌细胞。
本实施例PCR结果分析如下：
PCR扩增产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，以ddH2O及无肝癌健康人血DNA(经重亚硫酸盐处理)为模板，以引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，做PCR扩增均无扩增条带，阴性对照模板良好。
以肝癌患者血液、HepG2.7402肝癌细胞和7402肝癌细胞提取并经重亚硫酸盐处理的DNA为模板，以引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，做PCR扩增均有扩增条带；引物F1、B1配对扩增片段长度为179bp(图1)，引物F1、B2配对扩增片段长度为180bp，引物F2、B1配对扩增片段长度为180bp，引物F2、B3配对扩增片段长度为182bp，引物R1、L1配对扩增片段长度为119bp(图2)，引物R1、L2配对扩增片段长度为119bp，引物R2、L3配对扩增片段长度为124bp(图3)，扩增片段长度与预测一致，肝癌患者血液、HepG2.7402肝癌细胞和7402肝癌细胞的ASS基因和ASL基因均被甲基化。
以上实施例说明本发明可以灵敏的检测血循环中转移的肝癌细胞，从而达到早期发现肝癌细胞的血行播散和对肝癌治疗的评估。
Figure IDA0000052717290000011
Figure IDA0000052717290000021
Figure IDA0000052717290000031
Figure IDA0000052717290000041
Figure IDA0000052717290000051
Figure IDA0000052717290000061
Figure IDA0000052717290000081

Claims (10)

1.一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，包括dNTP、10x PCR buffer、MgCl2、ddH2O，其特征在于，还包括标准血液DNA、热启动TaqDNA聚合酶、引物F 1、引物B1、引物F 2、引物B2、引物B3、引物R1、引物L1、引物R2、引物L2、引物L3；上述引物用于做甲基化特异性PCR，PCR时，引物的配对方案为：
引物F1、B1配对，引物F1、B2配对，引物F2、B1配对，引物F2、B3配对，用于检测ASS基因(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)甲基化情况；
引物R1、L1配对，引物R1、L2配对，引物R2、L3配对，用于检测ASL基因(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)甲基化情况。
2.根据权利要求1所述一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，其特征在于，所述标准血液DNA为取自无肝癌健康人血液提取的基因组DNA并经过重亚硫酸盐处理。
3.根据权利要求1所述一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的试剂盒，其特征在于，引物F 1具有序列表中SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，引物B1具有序列表中SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，引物F2具有序列表中SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，引物B2具有序列表中SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，引物B3具有序列表中SEQ ID No.10所示的核苷酸序列，引物R1具有序列表中SEQ IDNo.11所示的核苷酸序列，引物L1具有序列表中SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，引物R2具有序列表中SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，引物L2具有序列表中SEQ ID No.14所示的核苷酸序列，引物L3具有序列表中SEQ ID No.15所示的核苷酸序列。
4.一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括肝癌特异性低调控基因ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)或ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)的甲基化的第一外显子和启动子区域；所述ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)基因甲基化的第一外显子和启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；所述ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)基因的甲基化的第一外显子和启动子区域核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。
5.检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.3表示。
6.根据权利要求5所述检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，衍生于肝癌特异性表达降低的基因ASS(GeneBank NG_011542，精氨酸代琥珀酸合成酶基因)。
7.检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.4表示。
8.检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，所述标志物包括一个或多个甲基化的CpG岛并由SEQ ID No.5表示。
9.根据权利要求7-8任何一项所述检测血液中转移肝癌细胞的标志物，其特征在于，衍生于肝癌特异性表达降低的基因ASL(GeneBank NG_009288，精氨酸代琥珀酸裂解酶基因)。
10.一种利用甲基化原理检测血液中转移肝癌细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从血液样品中提取基因组DNA；
(2)将基因组DNA经重亚硫酸盐处理，使未甲基化的胞嘧啶全部转变为尿嘧啶；
(3)利用权利要求1所述试剂盒及引物配对方案，以ddH2O、标准血液DNA、经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板，进行甲基化特异性PCR反应；
(4)用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，如果以ddH2O、标准血液DNA为模板的PCR无扩增条带，而以经重亚硫酸盐处理的血液样品基因组DNA为模板的PCR扩增有扩增条带，且扩增条带与预测的条带大小一致，则认为所检测的血液样品中含有转移肝癌细胞。
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