CN102399859A - 基于荧光共振能量转移的甲基化dna检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤如下：步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA；步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，设计并合成正向引物，标记有报告荧光团和淬灭荧光团的反向引物；步骤3，进行PCR扩增反应；步骤4，检测特定报告荧光团发射波长的荧光信号，并判定待测DNA样品中是否存在甲基化DNA。本发明具有灵敏度高、特异性好、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

Description

基于荧光共振能量转移的甲基化DNA检测方法

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，尤其涉及一种甲基化DNA序列特异性DNA聚合酶介导的荧光共振能量转移PCR检测技术。

背景技术

DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶（C）残基的5’碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG二核苷酸的胞嘧啶残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化的改变可以有助于肿瘤的早期发现。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。

CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法（methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern，MSRE- Southern）是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法（Methylation Specific PCR，MSP）及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有高灵敏度的同时，假阳性率也很高。

发明内容

本发明提供一种甲基化DNA检测方法。其特征在于有效地排除非甲基化DNA的影响，使样品中的甲基化DNA得以富集，用以解决现有技术检测灵敏度低、方法复杂、容易被干扰等缺点。

本发明甲基化DNA检测方法，步骤如下：

步骤1，用亚硫酸盐处理并纯化待测DNA样品、标准甲基化DNA样品和标准非甲基化DNA样品；

步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，使所选的这一段序列中至少有一个CpG位点，且在这一段序列的中部或靠近3’端的位置，而不出现除CpG位点以外的C；以所选连续序列或所选序列5’端的一部分作为PCR正向引物；以所选连续序列的下游区域且紧邻所选连续序列的一段序列的互补序列作为反向PCR引物，并使所述反向引物的3’端的最后一个碱基正好位于对应的CpG位点的C的位置；将所述反向引物3’端最后一个碱基用A替代，作为A引物；同时，将所述反向引物3’端最后一个碱基用G替代，作为G引物；并在反向引物A或G上标记有淬灭荧光团，在靠近3’端的一个碱基上标记报告荧光团；

步骤3，加入具有3’~5’外切酶活性DNA聚合酶，用上述引物在实时定量PCR仪中，对处理过的待测DNA样品进行PCR扩增反应；并用标准的非甲基化DNA和甲基化DNA作为对照；

步骤4，检测PCR扩增信号，并与标准甲基化DNA样品的PCR扩增信号对照，如果待测样品中出现反向引物A的PCR扩增信号，且甲基化DNA标准品也出现反向引物A的PCR扩增信号，而非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中存在甲基化DNA；如果待测样品中仅出现反向引物G的PCR扩增的信号,而不出现反向引物A的PCR扩增的信号，且甲基化DNA标准品出现反向引物A的PCR扩增信号，同时非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中不存在甲基化DNA。

所述步骤1中，亚硫酸盐优选为亚硫酸钠。所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

所述步骤2中，所选连续序列优选为大于8个碱基，并在所述反向引物靠近3’端位置的一个碱基上标记一个荧光团分子，在所述反向引物3’端最后一个碱基上标记一个淬灭荧光团。

其中，CpG指的是胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和连接二者的磷酸酯键（p）组成位点； A指的是腺嘌呤。

所述步骤3中，PCR扩增所用具有3’~5’DNA外切酶活性DNA聚合酶，可以是耐热古核菌属来源的DNA聚合酶的一种或多种。进一步优选为pfu DNA聚合酶。

所述待测DNA样品为人体DNA样品，所述标准DNA样品为与待测DNA样品相匹配的人类DNA样品。其中，所述标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA为于待测DNA相匹配的、已确定的纯的非甲基化人类基因组DNA和已确定的纯的甲基化人类基因组DNA。如：

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。

亚硫酸盐处理DNA样品，使得DNA链上的非甲基化胞嘧啶(C)脱氨基转变为尿嘧啶（U），而DNA链上的甲基化胞嘧啶(C)维持不变。耐热性古核菌属来源的DNA聚合酶不能识别DNA链上的U，同时具有3’-5’外切酶活性，可以切除DNA链3’末端最后一个不匹配的碱基。利用这些特性而设计合成的引物，并标记有报告荧光团，使得甲基化DNA在PCR扩增时能够检测到荧光。

综上所述，本发明一种甲基化DNA检测方法，具有适用范围大、方法简单、需要样本量小、不易被干扰、适用混合样本等优点。在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

附图说明

图1为本发明甲基化DNA检测方法流程图。

具体实施方式

参照图1，对本发明甲基化DNA检测方法具体描述如下：

实施方式（一）

步骤1，采用亚硫酸盐处理并纯化已知的标准非甲基化DNA和甲基化DNA。将一定量的亚硫酸钠处理过的标准非甲基化DNA，与梯度稀释的亚硫酸钠处理过的标准甲基化DNA混合，作为待测样品。

所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

步骤2，设计并合成PCR引物。

在所要检测的基因序列中，选择一段序列作为目标检测序列，使这一段序列至少含有一个CpG位点，且这一个CpG位点位与这一段序列的中部或靠近3’端的位置。以这一段序列或以这一段序列5’端的一段序列作为PCR的正向引物，以这一段序列的3’端下游的一段序列的互补序列作为PCR的反向引物。

优选地，所选连续序列大于8个碱基，使所设计的反向PCR引物为18~32碱基长。在反向引物序列中所涉及CpG位点的“C”的位置，可以用G/A混合代替G；使所述反向引物的3’端的最后一个碱基正好位于一个CpG位点的C的位置；将所述反向引物3’端最后一个碱基用A替代，作为A引物；或将所述反向引物3’端最后一个碱基用G替代，作为G引物；并在反向引物最后一个碱基A或G上标记有淬灭荧光团，在靠近3’末端的一个碱基上标记报告荧光团。

步骤3， PCR扩增。

由步骤1所混合的待测DNA样品作为模板（Template），由步骤2所设计并合成的正向分别和A反向引物和G反向引物(primer)、PCR扩增缓冲液（Buffer）、四种三磷酸脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、以具有3’-5’外切活性且对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶，用实时定量PCR扩增仪进行PCR扩增，同时检测扩增信号；并用标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为对照；

其中对尿嘧啶敏感的DNA聚合酶为古核菌属来源的DNA聚合酶，具体为pfu DNA聚合酶。

步骤4，检测PCR扩增信号，并与标准甲基化DNA样品的PCR扩增信号对照

检测PCR扩增信号，并与标准甲基化DNA样品的PCR扩增信号对照，如果待测样品中出现反向引物A的PCR扩增信号，且甲基化DNA标准品也出现反向引物A的PCR扩增信号，而非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中存在甲基化DNA；如果待测样品中仅出现反向引物G的PCR扩增的信号,而不出现反向引物A的PCR扩增的信号，且甲基化DNA标准品出现反向引物A的PCR扩增信号，同时非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中不存在甲基化DNA。

    本发明一种甲基化DNA检测方法，通过上述步骤检验本发明的特异性和灵敏度。

实施方式（二）

在实施方式（一）的基础上，以实际临床样品提取的DNA为待测样品，在与上述实施方式（一）相同的条件下，检验本发明的实用性。

其中，与上述在实施方式（一）相同的条件，指的是除以实际临床样品提取的DNA为待测样品外，所有操作与上述在实施方式（一）相同。

所述临床提取的待测DNA样品，为人类正常和癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、各种体液DNA或各种排泄物DNA的样品。

所述癌细胞可以是肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；所述肿瘤组织可以是肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；所述各种体液可以是血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液等。

按照实施方式（一）所述的方法进行检测和判断。

实施方式（三）

在实施方式（一）和（二）的基础上，以P16基因转录启动区的序列为例，具体PCR引物设计如下：

P16基因转录启动区的甲基化是肺癌等多种癌症细胞具有的特征。P16基因转录启动区的序列如下，有下划线的部分为所选的要检测的区域。

Homo sapiens p16 protein（CDKN2A）gene，CpG island and partial cds，DQ325544.1

CGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGCTCGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCCCAACGCACCGAATAGTTACGGTCGGAGGCCG

甲基化DNA序列，下划线部分为所选择的检测区域，粗体U为非甲基化的“C”经亚硫酸钠处理转变为的尿嘧啶

UGGAUUGCGTGCGCTUGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCUTTUGGCTGAUTGGCTGGCUAUGGCUGCGGCUUGGGCTUGGGTAGAGGAGGTGCGGGCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTGCUUAAUGCAUUGAATAGTTAUGGTUGGAGGCUG

非甲基化DNA序列，下划线部分为所选择的检测区域，粗体U为非甲基化的“C”经亚硫酸钠处理转变为的尿嘧啶

UGGAUUGUGTGUGUTUGGUGGUTGUGGAGAGGGGGAGAGUAGGUAGUGGGUGGUGGGGAGUAGUATGGAGUGGGUGGUGGGGAGUAGUATGGAGUUTTUGGUTGAUTGGUTGGUUAUGGUUGUGGUUUGGGUTUGGGTAGAGGAGGTGUGGGUGUTGUTGGAGGUGGGGGUGUTGUUUAAUGUAUUGAATAGTTAUGGTUGGAGGUUG

设计的正向引物   5’-GCGCTGCTGGAGGCGGGGGCGCTG-3’

设计的G反向引物(R=G/A)   5’-CCAACCATAACTATTCAATRCATTAAG-3’

设计的A反向引物(R=G/A)   5’-CCAACCATAACTATTCAATRCATTAAA-3’

在A反向引物和G反向引物上标记报告荧光基团和淬灭荧光基团。优选地，在反向引物靠近3’端位置的一个碱基上标记一个荧光团分子，在所述反向引物3’端最后一个碱基上标记一个淬灭荧光团

然后，按照实施方式（一）所述的方法，进行检测。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (9)

1.一种基于荧光共振能量转移的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1，用亚硫酸盐处理待测DNA样品、标准甲基化DNA样品和标准非甲基化DNA样品；

步骤2，在要检测的目标区域内，选择一段连续的序列，使所选的这一段序列中至少有一个CpG位点，且在这一段序列的中部或靠近3’端的位置，而不出现除CpG位点以外的C；以所选连续序列或所选序列5’端的一部分作为PCR正向引物；以所选连续序列的下游区域且紧邻所选连续序列的一段序列的互补序列作为反向PCR引物，并使所述反向引物的3’端的最后一个碱基正好位于对应的CpG位点的C的位置；将所述反向引物3’端最后一个碱基用A替代，作为A引物；同时，将所述反向引物3’端最后一个碱基用G替代，作为G引物；并在反向引物A或G上标记有淬灭荧光团，在靠近3’端的一个碱基上标记报告荧光团；

步骤3，加入具有3’～5’ 外切酶活性的DNA聚合酶，用上述引物在实时定量PCR仪中，对处理过的待测DNA样品进行PCR扩增反应；并用标准的非甲基化DNA和甲基化DNA作为对照；

步骤4，检测PCR扩增信号，并与标准甲基化DNA样品的PCR扩增信号对照，如果待测样品中出现反向引物A的PCR扩增信号，且甲基化DNA标准品也出现反向引物A的PCR扩增信号，而非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中存在甲基化DNA；如果待测样品中仅出现反向引物G的PCR扩增的信号而不出现反向引物A的PCR扩增的信号，且甲基化DNA标准品出现反向引物A的PCR扩增信号，同时非甲基化DNA标准品出现反向引物G的PCR扩增信号，表明待测样品中不存在甲基化DNA。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤1中所述亚硫酸盐具体为亚硫酸钠；亚硫酸盐处理的待测DNA可以具体为人类基因组基因，

所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理步骤为，以0.3M NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌、pH5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2中，所选连续序列大于8个碱基；以所选连续序列或所选序列5’端的一部分作为PCR正向引物；

以所选连续序列的下游区域且紧邻所选连续序列的一段序列的互补序列作为反向PCR引物，并使所述反向引物的3’端的最后一个碱基正好位于对应的CpG位点的C的位置；将所述反向引物3’端最后一个碱基用A替代，作为A引物； 

在所述反向引物靠近3’端位置的一个碱基上标记一个报告荧光团分子，在所述反向引物3’端最后一个碱基上标记一个淬灭荧光团。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2中，所选连续序列大于8个碱基；以所选连续序列或所选序列5’端的一部分作为PCR正向引物；

以所选连续序列的下游区域且紧邻所选连续序列的一段序列的互补序列作为反向PCR引物，并使所述反向引物的3’端的最后一个碱基正好位于对应的CpG位点的C的位置；将所述反向引物3’端最后一个碱基用G替代，作为G引物； 

在所述反向引物靠近3’端位置的一个碱基上标记一个报告荧光团分子，在所述反向引物3’端最后一个碱基上标记一个淬灭荧光团。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤3中，所述具有3’～5’DNA外切酶活性DNA聚合酶为耐热古核菌属来源的DNA聚合酶的一种或多种。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为pfu DNA聚合酶。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人体DNA样品，所述标准DNA样品为与待测DNA样品相匹配的人类DNA样品。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样品为人类正常细胞DNA、癌细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、血细胞DNA、血清DNA、体液DNA或排泄物DNA的样品。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，

所述癌细胞为肺癌细胞、胃癌细胞、结肠癌细胞、直肠癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、淋巴癌细胞、膀胱癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞或胰腺癌细胞；

所述肿瘤组织为肺癌组织、胃癌组织、结肠癌组织、直肠癌组织、肝癌组织、乳腺癌组织、淋巴癌组织、膀胱癌组织、卵巢癌组织、肾癌组织或胰腺癌组织；

所述体液包括血液、脑脊髓液、胃液及各种消化液、精液、唾液、泪液、汗液、尿液、阴道分泌液。

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