CN109811037B - 一种dna甲基化过程的连续在线检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种DNA甲基化过程的连续在线检测方法。该方法包括如下步骤：(1)将荧光标记的羟甲基化DNA杂交链和过饱和的DNA去甲基化酶加入到溶剂中，并进行荧光信号检测，记录初始信号值F0；再将获得的混合溶液进行温浴，并检测温浴后的混合溶液的荧光信号，记录信号值F1；(2)将目标DNA杂交链、甲基转移酶底物和甲基转移酶加入至温浴后的混合溶液中进行甲基化反应，再按相同时间间隔，抽取混合溶液进行荧光信号检测，记录不同时间的信号值F2；(3)分别计算不同时间的信号值F2与信号值F0(或信号值F1)的差值或比率，进行DNA甲基化动态过程分析。本发明方法保证了反应的连续性，具有快速、便捷和自动化等特点。
Description
技术领域
本发明属于DNA甲基化检测方法领域，特别涉及一种DNA甲基化过程的连续在线检测方法。
背景技术
DNA甲基化是一种典型的表观遗传学修饰方式。在甲基转移酶(Dnmt)的作用下，底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被催化，并转移一个甲基至胞嘧啶的C5位置，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。DNA甲基化与基因遗传和胚胎发育密切相关，也是肿瘤等疾病的潜在标志物。DNA甲基化效率与Dnmt的活性和作用方式密切相关，因此，研究DNA甲基化生成机制和过程，对于分析Dnmt功能特性，理解表观遗传机制，探究细胞生长过程，以及诊断重大疾病具有重要意义。
常规的DNA甲基化检测方法主要包括甲基化特异性PCR、甲基化敏感性单核苷酸引物扩增、重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法、甲基化敏感性斑点分析、限制性标记基因组扫描、甲基化免疫沉淀等。这些方法主要针对DNA甲基化的整体水平和特异位点进行检测，并被广泛用于基础和临床研究。然而，此类方法只能测定静态的DNA甲基化产物，对于动态的DNA甲基化过程缺乏有效的监测能力，这对于深入理解甲基化机制，精确研究甲基转移酶活性，有效筛选酶抑制剂等产生了一定的阻碍。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种DNA甲基化过程的连续在线检测方法。本发明基于甲基转移酶Dnmt3a和去甲基化酶TET2对不同状态的甲基化DNA的敏感度，设计“平衡-反应-再平衡”的循环反应体系，并结合能量转移(ET)效应(ET即两种相聚较近的相同荧光基团，受到激发光刺激，转而发射出同频荧光能量，此同频荧光能量以DNA双链间π电子云为传导途径进行连接，产生1+1>2的信号效果)，建立一种快速、简便的DNA甲基化动态过程连续在线检测方法；当目标DNA被甲基化后，TET2会取代Dnmt3a结合于其上，此过程打破反应体系的静态平衡，引发连锁反应，产生荧光信号；通过持续检测各反应阶段的荧光信号，实现DNA甲基化过程的在线检测。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种DNA甲基化过程的连续在线检测方法，包括如下步骤：
(1)将荧光标记的羟甲基化DNA杂交链和过饱和的DNA去甲基化酶加入到溶剂中，混合均匀，得到混合溶液I，然后检测混合溶液I的荧光信号，记录信号值F0；再将混合溶液I置于恒温环境中温浴，并检测温浴后的混合溶液I的荧光信号，记录信号值F1；
(2)将目标DNA杂交链、甲基转移酶底物和甲基转移酶加入至温浴后的混合溶液I中，得到混合溶液II；然后将混合溶液II置于恒温环境中进行甲基化反应，再按相同时间间隔，抽取混合溶液II进行荧光信号检测，直至信号强度进入平台期，记录不同时间的信号值F2；
(3)①分别计算不同时间的信号值F2与信号值F0的差值或比率，进行DNA甲基化动态过程分析；
或者是：
②分别计算不同时间的信号值F2与信号值F1的差值或比率，进行DNA甲基化动态过程分析。
步骤(1)中所述的荧光标记优选为采用6-FAM(6-羧基荧光素)进行标记。
步骤(1)中所述的荧光标记的羟甲基化DNA杂交链优选为通过如下步骤制备得到：以一段含有羟甲基化位点的DNA为探针DNA，在其羟甲基化位点旁(在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上)进行荧光标记，得到荧光标记的探针DNA；然后设计其互补序列，并在3’端进行荧光标记，得到荧光标记的探针DNA的互补链；最后将荧光标记的探针DNA及其互补链杂交，得到荧光标记的羟甲基化DNA杂交链。
所述的在羟甲基化位点旁和在3’端这两处标记的荧光相同；优选为6-FAM。
步骤(1)中所述的DNA去甲基化酶为TET酶；优选为TET2(TET2只是作为一个荧光降低的媒介，不作为去甲基化的工具；当TET酶和Dnmt3a同时存在时，Dnmt3a完成DNA甲基化时，TET2会立即介入，替换Dnmt3a，进行接下来的反应)。
步骤(1)中所述的溶剂优选为NE Buffer 2溶液。
步骤(1)中所述的混合溶液I中荧光标记的羟甲基化DNA杂交链的浓度为1μM，DNA去甲基化酶的浓度为100～400nM(优选为200～400nM)。
步骤(1)中所述的温浴的条件为：35～40℃温浴45～60分钟；优选为：37℃温浴60分钟。
步骤(1)和(2)中所述的荧光信号的检测条件优选为：EX(激发波长):488nm，EM(发射波长):500～640nm。
步骤(2)中所述的甲基转移酶底物为S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。
步骤(2)中所述的目标DNA杂交链通过如下方法制备得到：以一段可被甲基化的DNA为待测DNA，设计其互补序列，并使它们杂交，得到目标DNA杂交链。
步骤(2)中所述的甲基转移酶为Dnmt3a，MspI，Dnmt1，Dnmt2，Dnmt3b，Dnmt3L或MspII；其中，从头甲基化酶可选用Dnmt3a或MspI；对于只需要半甲基化的目标物(即DNA双链中已有一条链甲基化，要让另一条链甲基化)可选用Dnmt1，Dnmt2，Dnmt3b，或MspII；优选为Dnmt3a。
步骤(2)中所述的混合溶液II还可以通过如下方法制备得到：将目标DNA杂交链、甲基转移酶底物和甲基转移酶加入到溶剂中，混合均匀，得到混合溶液A；然后将步骤(1)中温浴后的混合溶液I和混合溶液A按等体积混合均匀，得到混合溶液II。
所述的混合溶液A中目标DNA杂交链的浓度为200nM～1μM(优选为1μM)；甲基转移酶的浓度为100nM～350nM(优选为250nM)；甲基转移酶底物的浓度为2μM。
所述的溶剂优选为NE Buffer 2溶液。
步骤(2)中所述的混合溶液II中DNA去甲基化酶的浓度为50～200nM；优选为100～200nM；更优选为200nM。
步骤(2)中所述的混合溶液II中甲基转移酶的浓度为50～175μM；优选为125nM。
步骤(2)中所述的混合溶液II中荧光标记的羟甲基化DNA杂交链的浓度为500nM，目标DNA杂交链的浓度为500nM，甲基转移酶底物的浓度为1μM。
步骤(2)中所述的恒温环境的温度为35～40℃；优选为37℃。
步骤(2)中所述的甲基化反应的时间为60～120分钟；优选为60～100分钟。
步骤(2)中所述的时间间隔为7～15；优选为10分钟。
步骤(3)①中所述的计算不同时间的信号值F2与信号值F0的差值或比率的适用条件为：当信号值F2比信号值F0的信号低20％(即F2/F0≤0.8)时，计算信号值F2与信号值F0的差值；反之，计算信号值F2与信号值F0的比率。
本发明的实验原理：
Dnmt3a对DNA的解离常数(Km)为68nM，对甲基化DNA无亲和度。TET2对DNA、甲基化DNA和羟甲基化DNA的解离常数分别为540、990、410nM。解离常数越小，表明对目标物的亲和度越强。因此，Dnmt3a会先于TET2与DNA结合，当DNA被甲基化后，TET2会取代Dnmt3a结合于其上。设计荧光基团标记的探针DNA作为信号指示物，并使其与TET2结合，抑制荧光信号。混和Dnmt3a和目标DNA，进行甲基化反应。当DNA逐渐被甲基化后，TET2开始从探针DNA上脱附，并逐步取代Dnmt3a。此时，探针DNA的荧光信号恢复。通过持续测定探针DNA的荧光信号，可实现DNA甲基化过程的在线检测。
基于此，本发明以一段含有羟甲基化位点的DNA为探针DNA，在其羟甲基化位点旁标记6-羧基荧光基团(6-FAM)。设计其互补序列，并在3’端标记6-FAM。这两条标记6-FAM的探针DNA链杂交后，发生能量转移(ET)效应，获得初始信号(F0)。以一段可被甲基化的DNA为待测DNA，设计其互补序列，并使它们杂交。以NE Buffer2为溶剂，将一定浓度的标记6-FAM的探针DNA杂交链和待测DNA杂交链与过量的TET2和足量的Dnmt3a混合。Dnmt3a对待测DNA的亲和度更强，而TET2对探针DNA的亲和度更强，因此，Dnmt3a会吸附于待测DNA上，开始甲基化反应；TET2会吸附于探针DNA上，但由于溶液中不含戊二酮和抗坏血酸钠，因此TET2不会与探针DNA反应。吸附于探针DNA上的TET2抑制了ET，多余的TET2游离于溶液中。此时，溶液体系处于静态平衡，并获得荧光信号(F1)，其与信号(F0)的差值可以反映TET2的吸附量。当待测DNA被逐步甲基化后，游离的TET2会立刻取代Dnmt3a，此时，溶液体系的静态平衡被打破。由于补偿效应，吸附于探针DNA上的TET2脱附，分散游离于溶液中，致使探针DNA的信号得到恢复。此时，获得荧光信号(F2)，其与信号(F1)的差值可以反映出现阶段待测DNA的甲基化状态。通过持续测定反应过程中的荧光信号值，分别计算它们与信号(F0或F1)的差值或比值，可获得不同阶段待测DNA的甲基化状态，实现DNA甲基化过程的检测。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用Dnmt3a和TET2两种酶对DNA、甲基化DNA和羟甲基化DNA的不同亲和度，构建“反应-平衡”体系，并在甲基化反应完成时，自动替换相关反应酶，促使能量转移效应恢复，荧光信号增强。该方法既保证了反应的连续性，也减少了非特异性干扰，具有快速、便捷、和自动化等特点，在DNA甲基化检测方面具有独特优势：(1)建立了无需人工干预或操作的连续在线检测方法，该方法操作简单，受实验环境影响小，无反应时滞现象；(2)建立了DNA甲基化过程的无损检测方法，该方法不涉及甲基化以外的任何反应，检测结果最接近待测物的真实状态；(3)建立了免限制性生物类识别物的检测方法，对特异位点的甲基化研究具有普适性。
附图说明
图1是本发明建立DNA甲基化过程的实验原理图(图中hmC Site表示羟甲基化位点)。
图2是甲基化DNA的“信号开关”效果图；其中，a→d表示a、b、c和d四个不同的荧光信号(a：羟甲基化DNA杂交链的荧光信号FS1’，b：加入甲基化DNA后的荧光信号FS3，c：TET2吸附在羟甲基化位点时的荧光信号FS2，d：羟甲基化DNA单链的荧光信号FS1)。
图3是不同的Dnmt3a浓度对DNA的ET信号影响图。
图4是不同的TET2浓度对羟甲基化DNA的ET信号影响图。
图5是不同过饱和浓度的TET2对不同浓度的甲基化DNA的响应结果图；其中，a→e表示a、b、c、d和e五个不同过饱和浓度的TET2(a：225nM TET2，b：200nM TET2，c：175nMTET2，d：150nM TET2，e：125nM TET2)。
图6是TET2对Dnmt3a的替换效果图(a：200nM TET2对不同浓度的甲基化DNA的响应；b：200nM TET2对经Dnmt3a作用而产生的不同浓度的甲基化DNA的响应)。
图7是DNA甲基化动态过程检测结果图(a：DNA甲基化的动态过程；b：空白对照)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备；除非特别说明，本发明所用试剂均可通过市售获得。
本发明建立DNA甲基化过程的实验原理图如图1所示，其构建过程和优化过程为：
1.1方法构建
(1)验证ET效果
将标记有6-FAM(6-羧基荧光素，6-羧基荧光基团)的探针DNA链和其互补链置于磷酸盐缓冲液中，并在荧光仪中进行荧光强度测试。之后将它们置于37℃下温浴2小时，进行DNA杂交反应。杂交完成后，在荧光仪中进行荧光强度测试。通过对比杂交前后荧光信号的强度变化，验证ET效果。
(2)验证甲基化DNA的“信号开关”效果
将标记有6-FAM的探针DNA杂交链和过量的TET2置于NE Buffer 2溶液中，并在37℃下温浴，每隔10分钟，在荧光仪中进行荧光强度测试，直至信号强度进入平台期，记录时间。在该溶液中加入一定量的甲基化DNA杂交链，并在荧光仪中进行荧光强度测试。通过对比甲基化DNA加入前后荧光信号的强度变化，验证其“信号开关”效果。
1.2条件优化
(1)优化Dnmt3a的反应浓度
将若干份标记有6-FAM的正常DNA杂交链分别置于NE Buffer 2溶液(NEB公司)中，并在荧光仪中进行荧光强度测试。之后，它们分别和不同浓度的Dnmt3a混合，置于37℃下温浴45分钟后，在荧光仪中进行荧光强度测试。通过对比每份正常DNA杂交链的荧光信号降低程度，确定最佳Dnmt3a浓度。
(2)优化TET2的反应浓度
将若干份标记有6-FAM的探针DNA杂交链分别置于NE Buffer 2溶液中，并在荧光仪中进行荧光强度测试。之后，它们分别和不同浓度的TET2混合，置于37℃下温浴45分钟后，在荧光仪中进行荧光强度测试。通过对比每份探针DNA杂交链的荧光信号降低程度，确定最佳TET2浓度。
(3)优化TET2的过饱和浓度
将若干份标记有6-FAM的探针DNA杂交链分别置于NE Buffer 2溶液中，并在荧光仪中进行荧光强度测试。之后，依照上述确定的最佳TET2浓度，分别配制不同过饱和浓度的TET2与探针DNA杂交链混合，将该混合液置于37℃下温浴45分钟后，在荧光仪中进行荧光强度测试。依次在每份混合液中加入不同浓度的甲基化DNA杂交链，在荧光仪中进行荧光强度测试。通过对比甲基化DNA加入前后荧光信号的强度变化，确定最佳TET2过饱和浓度。
1.3在线检测
(1)检测DNA甲基化过程
将标记有6-FAM的探针DNA杂交链和已优化浓度的过饱和TET2混合，置于NEBuffer 2溶液中，并在荧光仪中进行荧光强度测试。在37℃下温浴45分钟，待TET2完全吸附在探针DNA上后，在荧光仪中进行荧光强度测试。之后，按照已优化的浓度加入Dnmt3a(DNA甲基转移酶3A)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)和待测DNA杂交链，进行甲基化反应。每隔10分钟，在荧光仪中进行荧光强度测试，直至信号强度进入平台期。通过测定每个时间段的荧光信号强度，分析待测DNA的甲基化过程。
2.1、本发明实施例中以NE Buffer2为溶剂，NE Buffer 2溶液是作为Dnmt3a对DNA进行甲基化时的缓冲液，因此，所有涉及Dnmt3a和TET2的测试中，采用的均为NE Buffer2缓冲液。在初始阶段，由于只探究DNA杂交前后荧光信号变化，不需要Dnmt3a参与，因此采用的是磷酸盐缓冲液。
2.2、本发明实施例中，选择的所有的DNA序列均相同，均为从网站NCBI中所获的一段DNA片段，该DNA片段和在其上的荧光基团、甲基化和羟甲基化等修饰，由上海生工生物有限公司完成。试验中，杂交链均是指相应的探针链和互补链经杂交反应后所得的双链。
实施例1
1、分析甲基化DNA对ET的“信号开关”效果
以DNA甲基化转移酶DNMT3a作用甲基化位点5’-CCGG-3’为例：
(1)配制200μL样本溶液(S1)，其含有500nM标记6-FAM的羟甲基化DNA探针链(在羟甲基化DNA探针链的羟甲基化位点旁标记6-羧基荧光基团)、500nM标记6-FAM的羟甲基化DNA互补链(标记在3’端)和0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)；其中，标记6-FAM的羟甲基化DNA探针链和其互补链通过如下方法获得：
以部分P53肿瘤DNA序列【登录NCBI，登录号为：22059(Trp53基因)；在第721～780序列段中(tgctctgatg gtgacggcctggctcctccc caacatctta tccgggtgga aggaaatccg)选取部分序列，下同】为模板，自行设计含羟甲基化位点的DNA探针链(序列：5’-TCCGGGTGGAAG-3’，CG中的C碱基被羟甲基化，T碱基上标记6-FAM荧光基团)和其互补链(序列：3’-AGGCCCACCTTC-5’，GC中的C碱基被羟甲基化，3’端标记6-FAM荧光基团)，并委托上海生工生物技术服务有限公司进行链的合成及荧光基团的标记。
(2)抽取50μL S1至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm，EM:500～640nm)，记录信号值(FS1)。
(3)将S1置于37℃的恒温环境中温浴2小时，进行杂交反应。抽取50μL S1至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm，EM:500～640nm)，记录信号值(FS1’)。
(4)参照步骤“(1)～(3)”配制100μL样本溶液，其含有1μM标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链(标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链为先按上述方法获得标记6-FAM的羟甲基化DNA探针链和互补链，然后使它们杂交得到杂交链)。然后加入100μL含300nM TET2(DNA去甲基化酶TET2)的溶液，混合成溶液S2。将S2置于37℃的恒温环境中温浴1小时，再抽取50μL S2至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm，EM:500～640nm)，记录信号值(FS2)。
(5)配制100μL样本溶液A，其含有1μM甲基化DNA目标链、1μM该甲基化DNA互补链和0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)。将该样本溶液置于37℃的恒温环境中温浴1小时，进行杂交反应。同时，参照步骤“(1)～(4)”配制100μL样本溶液B，其含有1μM标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链和300nM TET2。将其置于37℃的恒温环境中温浴1小时。将100μL样本溶液A和100μL样本溶液B混合成溶液S3，抽取50μL S3至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS3)；其中，甲基化DNA目标链及其互补链通过如下方法获得：
以部分P53肿瘤DNA序列为模板(获得方法同上)，自行设计含甲基化位点的DNA目标链(序列：5’-TCCGGGTGGAAG-3’，CG中的C碱基被甲基化)和其互补链(序列：3’-AGGCCCACCTTC-5’，GC中的C碱基被甲基化)，并委托上海生工生物技术服务有限公司进行链的合成。
(6)对比FS1和FS1’，验证ET效果。对比FS1’、FS2和FS3，分析甲基化DNA的“信号开关”效果。
结果如图2所示：图2显示，DNA杂交后的荧光信号明显大于未杂交时的信号。此现象表明DNA探针链和互补连杂交后，形成了碱基间的π电子云堆积，促成了ET效应。同时，加入TET2后，信号降低约30％，表明TET2在羟甲基化位点上的吸附对ET效应具有一定的阻碍作用。加入甲基化DNA后，信号回升，表明游离的TET2对甲基化DNA产生吸附，同时，随着溶液补偿效应，部分在羟甲基化位点上的TET2发生脱附。
2.优化DNMT3a和TET2的反应浓度
2.1优化DNMT3a对目标DNA的反应浓度
(1)配制500μL样本溶液，其含有2μM标记有6-FAM的DNA目标链、2μM标记有6-FAM的DNA互补链和0.2M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)。将该样本溶液置于37℃的恒温环境中温浴1小时，进行杂交反应。取250μL该样本溶液，混合于250μL含4μM酶底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的NE Buffer2缓冲液，形成混合液S4。抽取50μL S4，与50μL NE Buffer2缓冲液混合，形成样本液S4-0。抽取50μL S4-0于比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS4-0)。其中，标记有6-FAM的DNA目标链及其互补链通过如下方法获得：
以部分P53肿瘤DNA序列为模板(获得方法同上)，自行设计DNA目标链(序列：5’-TCCGGGTGGAAG-3’，T碱基上标记6-FAM荧光基团)和其互补链(序列：3’-AGGCCCACCTTC-5’，3’端标记6-FAM荧光基团)，并委托上海生工生物技术服务有限公司进行链的合成及荧光基团的标记。
(2)抽取6份50μL S4，分别与6份50μL含不同浓度(100nM、150nM、200nM、250nM、300nM和350nM)的Dnmt3a的NE Buffer2缓冲液混合。将它们置于37℃的恒温环境中温浴1小时，并在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS4- 1......FS4-6)。
(3)分别计算FS4-1......FS4-6与FS4-0的降低率，确定最佳Dnmt3a反应浓度。
结果如图3所示：图3显示，Dnmt3a的浓度和信号降低率成正比。随着Dnmt3a浓度的增加，其在DNA上的吸附程度逐渐增高，对ET产生了明显的阻碍作用，使得标记6-FAM的DNA杂交链的荧光信号逐步降低。当Dnmt3a的终浓度达到125nM以上时，信号不再变化，因此，Dnmt3a的最佳反应浓度确定为125nM。
2.2优化TET2对羟甲基化DNA的反应浓度
(1)配制500μL样本溶液(S5)，其含有1μM标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链(制备方法同1(4))。抽取50μL S5至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS5)。
(2)抽取6份50μL S5，分别与6份50μL含不同浓度(100nM、150nM、200nM、250nM、300nM和350nM)的TET2溶液混合。将它们置于37℃的恒温环境中温浴75分钟，并在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS5-1......FS5-6)。
(3)分别计算FS5-1......FS5-6与FS5的降低率，确定最佳TET2反应浓度。
结果如图4所示：图4显示，TET2的浓度和信号降低率成正比。随着TET2浓度的增加，其在羟甲基化DNA上的吸附程度逐渐增高，对ET产生了明显的阻碍作用，使得标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链的荧光信号逐步降低。当TET2的终浓度达到100nM以上时，信号不再变化，因此，TET2的最佳反应浓度确定为100nM。
3.优化TET2在反应体系中的过饱和浓度
(1)配制5份500μL样本溶液，它们分别含有1μM标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链(制备方法同1(4))，以及250nM TET2(S6-1)，300nM TET2(S6-2)，350nM TET2(S6-3)，400nMTET2(S6-4)，或450nM TET2(S6-5)。将它们置于37℃的恒温环境中温浴1小时，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS6-1......FS6-5)。
(2)抽取5份50μL S6-1，分别与5份50μL含不同浓度(200nM、400nM、600nM、800nM和1μM)的甲基化DNA溶液混合，并在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS6-1-1......FS6-1-5)。
(3)参照步骤“(2)”，依次抽取5份50μL S6-2，S6-3，S6-4和S6-5，分别与5份50μL含不同浓度(200nM、400nM、600nM、800nM和1μM)的甲基化DNA溶液混合，并在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS6-2-1......FS6-2-5，FS6-3-1......FS6-3-5，FS6-4-1......FS6-4-5和FS6-5-1......FS6-5-5)。
(4)分别计算FS6-1-1......FS6-1-5与FS6-1的比率，FS6-2-1......FS6-2-5与FS6-2的比率，FS6-3-1......FS6-3-5与FS6-3的比率，FS6-4-1......FS6-4-5与FS6-4的比率，以及FS6-5-1......FS6-5-5与FS6-5的比率，确定最佳TET2过饱和浓度。
结果如图5所示：图5显示了不同过饱和浓度的TET2对不同浓度的甲基化DNA的响应程度。过饱和的TET2存在一定量的游离态TET2，当加入甲基化DNA时，游离的TET2会对其进行识别，并吸附于其上。游离的TET2对甲基化DNA的响应程度和吸附效率与其游离量成正比。同时，由于溶液补偿效应，当游离的TET2量减少至一定程度时，吸附在羟甲基化DNA上的TET2会发生脱附，进入游离状态，并使得羟甲基化DNA的荧光信号回升。羟甲基化DNA的信号回升程度与TET2的脱附效率和游离的TET2减少量成正比。根据图5中荧光信号比率可知，TET2的过饱和浓度越高，对甲基化DNA的响应程度越高。当TET2的终浓度达到200nM以上时，其游离的部分对甲基化DNA的响应程度接近平台期。因此，反应体系中TET2的最佳过饱和浓度确定为200nM。
4.分析TET2替换Dnmt3a的效果
(1)配制100μL样本溶液(S7)，其含有1μM标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链(制备方法同1(4))，以及400nM TET2。抽取50μL混合液至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS7-0)。之后，将S7置于37℃的恒温环境中温浴1小时，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS7-0’)。
(2)配制100μL样本溶液(S8)，其含有1μM目标DNA杂交链(以一段可被甲基化的DNA为待测DNA，设计其互补序列，并使它们杂交，得到目标DNA杂交链；这里选择的待测DNA的序列为：5’-TCCGGGTGGAAG-3’；互补链的序列为：3’-AGGCCCACCTTC-5’)和2μM酶底物SAM，以及250nM Dnmt3a。将其置于37℃的恒温环境中温浴75分钟。将S7和S8等体积混合。抽取50μL混合液至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS7-1)。
(3)参照步骤“(2)”，配制4份100μL样本溶液，它们分别含有250nM Dnmt3a和2μM酶底物SAM，以及800nM目标DNA杂交链(S8-2)，600nM目标DNA杂交链(S8-3)，400nM目标DNA杂交链(S8-4)，以及200nM目标DNA杂交链(S8-5)。将它们置于37℃的恒温环境中温浴75分钟。将S7分别和S8-2......S8-5等体积混合。分别抽取50μL混合液至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS7-2......FS7-5)。
(2)计算FS7-1......FS7-5与FS7-0的比率，并对比FS6-4-1......FS6-4-5与FS6-4的比率，分析TET2替换Dnmt3a的效果。
结果如图6所示：图6显示了TET2对Dnmt3a的替换效果。Dnmt3a甲基化DNA后，其不再对这些甲基化产物敏感，并会适时离去。此时，游离的TET2会与Dnmt3a产生竞争，并结合于已被甲基化的DNA上。当游离的TET2量减少至一定程度时，吸附于标记有6-FAM的羟甲基化DNA上的TET2会发生脱附，进入游离状态。TET2的脱附，造成羟甲基化DNA的荧光信号恢复。体系中，羟甲基化DNA的荧光信号恢复程度与其位点上的TET2脱附量，游离的TET2减少量和甲基化DNA的生成量成正比。根据图6中荧光信号比率可知，TET2替换Dnmt3a吸附于甲基化DNA上所造成的荧光信号恢复效率与TET2直接吸附于甲基化DNA上所造成的荧光信号恢复效率相似，表明在体系中，当DNA甲基化后，TET2可以有效替换Dnmt3a。
5.在线检测DNA甲基化过程
(1)配制500μL样本溶液(S9)，其含有1μM标记6-FAM的羟甲基化DNA杂交链(制备方法同1(4))，以及400nM TET2。抽取50μL S9至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS9-0)。之后，将S9置于37℃的恒温环境中温浴1小时，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS9-0’)。
(2)配制500μL样本溶液(S10)，其含有1μM目标DNA杂交链(制备方法同4(2))和2μM酶底物SAM，以及250nM Dnmt3a。其与在37℃的恒温环境中温浴1小时后的S9等体积混合，置于37℃的恒温环境中。每隔10分钟，抽取50μL该混合液至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS9-1......FS9-N)。
(3)计算FS9-1......FS9-N与FS9-0的比率，分析DNA甲基化动态过程。同时以空白样本为对照，空白样本即为无目标DNA的样本，具体为：配制500μL样本溶液(S11)，其含有2μM酶底物SAM和250nM Dnmt3a。其与在37℃的恒温环境中温浴1小时后的S9等体积混合，置于37℃的恒温环境中。每隔10分钟，抽取50μL该混合液至比色皿，在荧光仪中检测荧光信号(EX:488nm,EM:500～640nm)，记录信号值(FS9-1’......FS9-N’)。
结果如图7所示：图7显示了目标DNA的甲基化过程。体系中，羟甲基化DNA的荧光信号恢复程度与甲基化DNA的生成量成正比。根据图7中荧光信号比率可知，在反应前60分钟内，羟甲基化DNA的荧光信号未有恢复，目标DNA尚处于甲基化初始期。在反应第60至100分钟时，羟甲基化DNA的荧光信号正在逐步恢复，目标DNA处于甲基化活跃期。在反应第100分钟后，羟甲基化DNA的荧光信号不再变化，目标DNA的甲基化进入末期。羟甲基化荧光信号最终并未恢复至原有程度，是因为TET2对甲基化DNA的吸附量和TET2在羟甲基化DNA上的脱附量不成等比例关系，当甲基化的目标DNA被完全识别和吸附之后，羟甲基化DNA上仍吸附有一定量的TET2。由于目标DNA的甲基化生成量是通过荧光信号的相对变化量进行测算的，因此，在羟甲基化DNA上剩余的TET2不会对检测结果产生影响。空白对照中，由于无目标DNA存在，荧光信号FS9-1’......FS9-N’与FS9-0的比率基本不变。
结果说明：
信号比率问题：从上述实验中可知，羟甲基化DNA的荧光信号有个初始值(FS9-0)，其随着TET2的吸附而降低，最终达到一个恒定值(即最低值，FS9-0’)。随着目标DNA甲基化的增加，TET2逐步脱附，羟甲基化DNA的荧光信号逐渐增高，最终达到一个恒定值(即最高值，FS9-N)。FS9-0’与FS9-0的比值可以表示此时的信号降低程度(即信号的最低程度)；FS9-1、FS9-2、FS9-3与FS9-0的比值可以表示在该特定时间下信号水平(其与信号初始值FS9-0存在一定差距，但比最低值FS9-0’要高)；FS9-N表示TET2完全脱离荧光羟甲基化DNA时的信号程度，FS9-N与FS9-0理论上应当相等，但是由于反应体系中的蛋白的非可控性，出现了数值上的一定差异，但此数值差异不影响信号整体变化趋势的判断。如令FS9-0为1，FS9-1～FS9-N以比率形式(小数形式)被计算出。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种DNA甲基化过程的连续在线检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> Trp53基因
<400> 1
tgctctgatg gtgacggcct ggctcctccc caacatctta tccgggtgga aggaaatccg 60
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DNA序列
<400> 2
tccgggtgga ag 12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 互补链
<400> 3
aggcccacct tc 12
Claims (9)
1.一种DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将荧光标记的羟甲基化DNA杂交链和过饱和的DNA去甲基化酶加入到溶剂中，混合均匀，得到混合溶液I，然后检测混合溶液I的荧光信号，记录信号值F0；再将混合溶液I置于恒温环境中温浴，并检测温浴后的混合溶液I的荧光信号，记录信号值F1；
(2)将目标DNA杂交链、甲基转移酶底物和甲基转移酶加入至温浴后的混合溶液I中，得到混合溶液II；然后将混合溶液II置于恒温环境中进行甲基化反应，再按相同时间间隔，抽取混合溶液II进行荧光信号检测，直至信号强度进入平台期，记录不同时间的信号值F2；
(3)①分别计算不同时间的信号值F2与信号值F0的差值或比率，进行DNA甲基化动态过程分析；
或者是：
②分别计算不同时间的信号值F2与信号值F1的差值或比率，进行DNA甲基化动态过程分析；
步骤(1)中所述的溶剂为NE Buffer 2溶液；
步骤(1)中所述的温浴的条件为：35～40℃温浴45～60分钟；
步骤(2)中所述的恒温环境的温度为35～40℃；
步骤(2)中所述的时间间隔为7～15分钟；
步骤(3)①中所述的计算不同时间的信号值F2与信号值F0的差值或比率的适用条件为：当信号值F2比信号值F0的信号低20％时，计算信号值F2与信号值F0的差值；反之，计算信号值F2与信号值F0的比率。
2.根据权利要求1所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的混合溶液I中荧光标记的羟甲基化DNA杂交链的浓度为1μM，DNA去甲基化酶的浓度为100～400nM；
步骤(2)中所述的混合溶液II中DNA去甲基化酶的浓度为50～200nM；
步骤(2)中所述的混合溶液II中甲基转移酶的浓度为50～175μM；
步骤(2)中所述的混合溶液II中荧光标记的羟甲基化DNA杂交链的浓度为500nM，目标DNA杂交链的浓度为500nM，甲基转移酶底物的浓度为1μM。
3.根据权利要求2所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的混合溶液II中DNA去甲基化酶的浓度为100～200nM；
步骤(2)中所述的混合溶液II中甲基转移酶的浓度为125nM。
4.根据权利要求1所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的DNA去甲基化酶为TET酶；
步骤(2)中所述的甲基转移酶为Dnmt3a，MspI，Dnmt1，Dnmt2，Dnmt3b，Dnmt3L或MspII。
5.根据权利要求4所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的DNA去甲基化酶为TET2；
步骤(2)中所述的甲基转移酶为Dnmt3a。
6.根据权利要求1所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的荧光标记为采用6-FAM进行标记；
步骤(2)中所述的甲基转移酶底物为S-腺苷甲硫氨酸。
7.根据权利要求1所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的荧光标记的羟甲基化DNA杂交链通过如下步骤制备得到：以一段含有羟甲基化位点的DNA为探针DNA，在其羟甲基化位点旁进行荧光标记，得到荧光标记的探针DNA；然后设计其互补序列，并在3’端进行荧光标记，得到荧光标记的探针DNA的互补链；最后将荧光标记的探针DNA及其互补链杂交，得到荧光标记的羟甲基化DNA杂交链；
步骤(2)中所述的目标DNA杂交链通过如下方法制备得到：以一段可被甲基化的DNA为待测DNA，设计其互补序列，并使它们杂交，得到目标DNA杂交链。
8.根据权利要求1所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)和(2)中所述的荧光信号的检测条件为：EX:488nm，EM:500～640nm；
步骤(2)中所述的甲基化反应的时间为60～120分钟。
9.根据权利要求1所述的DNA甲基化过程的连续在线检测方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的温浴的条件为：37℃温浴60分钟；
步骤(2)中所述的甲基化反应的时间为60～100分钟；
步骤(2)中所述的时间间隔为10分钟。
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| 基于特异性溴衍生化反应的DNA甲基化动态过程在线检测研究;张立 等;《中国化学会第十三届全国分析化学年会》;20180614;摘要 * |
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