JP5744038B2 - 増幅反応の解析ツール - Google Patents
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Description
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸定量化の分野に関する。
核酸定量化は、分子生物学及び遺伝学的リサーチから診断及び病原体検出にまで及ぶ多くの分野において重要である。充分な量の核酸が存在する場合、ブロット（blot）技法が定量化のために適用されることができる。しかしながら、これらの技法の制限された感度が、多くのケースにおいてそれらの使用を妨げている。
近年開発された定量ＰＣＲ方法は、はるかに高い感度が必要とされるケースでの解析ツールを提供した。これらの技法は、ＰＣＲ増幅の最中に生成物の量が指数的に増大し、従って、少数のサイクル後に得られる生成物の量が、従来の手段（例えば蛍光検出）によって検出可能であるということに基づく。更に、原則的には、増幅サイクル数が知られている場合、最初にすなわち増幅の開始時に存在していた生成物の量が、増幅終了時に得られる生成物の量から決定されることができる。
増幅反応の過程において形成されたＰＣＲ生成物の一般的なプロットは、増幅プロセスの４つの異なるフェーズを表す（図１を参照）：（１）バックグラウンド蛍光及びノイズによって蛍光信号が支配される基底フェーズ（ground phase、ＧＰ）；（２）ＰＣＲ生成物からの信号が基底レベルを上回り、指数的に増大する指数フェーズ（exponential phase、ＥＰ）；（３）ＰＣＲ試薬の消費及び検出プローブの劣化のようなファクタによって引き起こされる増幅効率の低下のため、信号が指数レートより低いレートで増大する対数線形フェーズ（log-linear phase、ＬＰ）（４）増幅反応の減速の増進及び最終的な停止のため、信号のわずかな上昇を伴うプラトーフェーズ（plateau phase、ＰＰ）。
しかしながら、今日、ＰＣＲプロセスの最中に検出される信号の展開を現実的に記述する物理的モデルは利用可能でない。従って、核酸定量化の今日の方法は、既知の濃度の標準の又は比較される核酸配列をもつ基準サンプルに対して同じＰＣＲ反応を実施することを含む較正ステップを実施することを必要とする。多くの場合、標準として使用される核酸配列は、良く知られているハウスキーピング遺伝子である。簡単に述べると、実際、ターゲット核酸配列並びに標準の及び／又は比較されるサンプルが、規定された反応条件下でＰＣＲを適用され、アンプリコンとも呼ばれるＰＣＲ生成物の形成が、増幅プロセスの過程において監視される。ＰＣＲ生成物の検出は、例えば蛍光標識化されたハイブリダイゼーションプローブによって、又は二本鎖ＰＣＲ生成物を検出するＤＮＡインターカレート蛍光染料によって、達成される。Ｃｔ値とも呼ばれる特定の蛍光閾値レベルを得るために必要な増幅サイクルの数が決定され、ターゲットのＣｔ値が、既知の濃度をもつ核酸標準の希釈系列のサンプルのＣｔ値と比較される（絶対定量化）。ターゲットの絶対量を決定するために、標準曲線が、標準サンプルのＣｔ値から構築され、ターゲットの初期濃度を決定するために使用される。代替として、ターゲットのＣｔ値は、関心のある単一の比較される核酸のＣｔ値と比較される（相対定量化）。この場合、ターゲットサンプル及び比較サンプルのＣｔ値の比率が決定され、ターゲット核酸配列及び比較核酸配列の初期量の比率を評価するために使用される。
概して、核酸定量化の新しい方法の開発は、多くの課題に直面しており、ある課題は、いくつかのアプリケーションが後に詳しく述べられるように完全な自動化を必要とすることによるものであり、ある課題は、較正プロセスに関連する。
Ｃｔ値の判定を用いる核酸定量化の方法によって必要とされる較正プロセスは、多くの潜在的な制約をもたらす。まず第１に、標準サンプルの検査は、付加の実験努力及び資源を必要とする。第２に、これらの方法は、標準サンプル及びターゲットサンプルの増幅効率が同じであるという前提に基づく。重要なことには、この前提は、一般に正確ではなく、従って不正確のソースを提供する。
定量ＰＣＲの分野における更なる課題は、短い時間間隔で多数のサンプルを解析するニーズの増大に関連する。定量ＰＣＲに関するますます広範囲にわたるアプリケーションは、例えば臨床業務において、非常に多数のサンプルの高スループットの解析を要求するので、完全に自動化されることが可能であるとともに人間との対話をほとんど又は全く要求しない定量ＰＣＲ方法を開発する必要がある。これは、ある状況では極めて重要である。その理由は、（例えば臨床業務における）高スループットのアプリケーションは、人間との対話が必要とされるならば、要求される短い時間期間内に実施されることができなくなってしまうからである。
このような自動化された方法によって達成されることができる付加の利点は、非常に多様な定量ＰＣＲに関するラボプロトコルを現在用いているさまざまなラボ間での解析データの比較可能性が改善されることである。このことは、基本的なリサーチのために定量ＰＣＲ技法を使用するラボが増大しているという観点で極めて重要である。自動化された方法を定量化実験の目標基準として確立することは、ラボ間の整合性を高めることにより、それらのリサーチ努力に大きな利益を与える。
核酸定量化のために、Ｃｔ値判定を用いる２つの方法、具体的には二次導関数最大法及びシグモイドカーブフィッティング方法が利用可能であり、これらは、完全な自動化に原則的に適していると思われる。二次導関数最大法の場合、増幅曲線の二次導関数の最大値が、数値的に求められる。対応するサイクルは、指数増加フェーズの終了を表すものとされ、そこで、反応は減速し始めて、線形増加になる。このサイクル数が、Ｃｔと同様に、ターゲットの量を決定するために使用される。シグモイドカーブフィッティング方法の場合、シグモイド関数が、増幅曲線に対してモデル化される。曲線の変曲点に対応するサイクル数が、モデルから得られることができ、Ｃｔと同様に、ターゲットの量を決定するために使用される。しかしながら、二次導関数最大法及びシグモイドカーブフィッティング方法は、高い感度を要求するアプリケーションについて限定的に使用されることが分かっている（JD Durtschi et al., Analytical Biochemistry, 361 (2007), pp. 55-64)。更に、これらの方法は両方とも、較正ステップを必要とする。加えて、シグモイドカーブフィッティング方法を用いるプロセスにおいて増幅曲線に対しモデル化されるシグモイド関数は、非常に理想化されたものであり、ＰＣＲプロセスの最中に検出される信号の展開を記述する物理的モデルとして決して考えることができない。
従って、本発明の目的は、高い感度を必要とするターゲット核酸配列の完全に自動化された定量化に適した方法を提供することである。更に、本発明の目的は、ターゲットサンプル及び標準サンプルの比較を必要としない方法、すなわち較正ステップを必要としない方法を提供することである。更に、本発明の目的は、増幅プロセスの最中に検出される信号の非常に詳細な解析を可能にする物理的モデルを提供することである。
本発明の一実施形態により、ターゲット核酸配列の増幅曲線から情報を得る方法であって、
（ａ）増幅曲線を記述し、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも１つのパラメータを含む少なくとも１つのモデル関数を規定するステップと、
（ｂ）前記増幅曲線に対し前記モデル関数をフィッティングするステップと、
（ｃ）前記モデル関数のベストフィットを与える前記パラメータの値を識別することによって、前記物理量に関する情報を得るステップと、
を含む方法が提供される。
（ａ）増幅曲線を記述し、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも１つのパラメータを含む少なくとも１つのモデル関数を規定するステップと、
（ｂ）前記増幅曲線に対し前記モデル関数をフィッティングするステップと、
（ｃ）前記モデル関数のベストフィットを与える前記パラメータの値を識別することによって、前記物理量に関する情報を得るステップと、
を含む方法が提供される。
図面について説明を補足する。図６Ａ及び図６Ｂは、２つのＰＣＲサンプルを用いて実施されたＰＣＲ反応の過程において得られた増幅曲線（Ｃ）と、モデル関数のベストフィット（Ａ）と、増幅効率（Ｂ）とを示しており、一方は、４９％の排泄物が加えられたものであり、他方は、排泄物が加えられなかったものである。実施例４に記述されるように、排泄物を含まないサンプルについて決定された増幅効率のプロット（図６Ａ）と、排泄物を含むサンプルのプロット（図６Ｂ）との比較は、排泄物の存在が増幅反応の効率に重大且つ不利益な影響を与えることを示す：図６Ａの増幅効率は１．０から始まり、図６Ｂの増幅効率は０．５１から始まる。
本発明のために利用できる核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び修飾されたバックボーン及び／又は塩基構造を有する核酸を含む。通常、増幅は、当業者に利用可能な方法及び計器を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施される。しかしながら、本発明の目的のために、ＰＣＲによって増幅されることができない核酸が、当業者に知られている手段によって、ＤＮＡに直接的に転写されなければならないこともある。ＲＮＡは、例えば逆転写酵素を使用する増幅の前に、ＤＮＡに転写されなければならないことがある。対応する核酸の当初の量の再構築を可能にするために、このような転写プロセスは、ＤＮＡに転写された核酸の量と転写の過程で生成されたＤＮＡとの比率に関する非常に良く作られた前提を可能にする条件下で、実施されなければならない。このタイプの反応条件は、当分野において良く知られている。
本発明を実践する過程の中で増幅される各々の核酸配列は、通常、選択的な態様で増幅される。ＰＣＲの最中の選択的な増幅を達成する１つの方法は、特異的配列プライマーの使用である。このようなプライマーの設計及び使用は、当業者に良く知られている。
本発明の目的のために、ＰＣＲによる核酸増幅、すなわちアンプリコンとしても知られる増幅反応による核酸の生成は、前記核酸配列の増幅に相関する信号を記録することによって検出される。これは、通常、蛍光レポータプローブ（本明細書において蛍光レポータ又はレポータプローブとも呼ばれる）によって達成される。このような蛍光レポータプローブは、当分野において良く知られている。本発明の一実施形態において、蛍光レポータプローブは、ハイブリダイゼーション条件下でターゲット核酸配列に特異的にバインドするとともに、その配列の一端に蛍光基をもち、その配列の他端に対応するクエンチャ基をもつオリゴヌクレオチドを含む。当該状態での蛍光基及びクエンチャ基の接近は、蛍光放出を妨げる。しかしながら、蛍光レポータプローブの中央のオリゴヌクレオチドが、次の増幅サイクルの途中に壊されると、フルオロフォア及びクエンチャの接近が失われ、その結果、蛍光放出を生じさせる。従って、増幅生成物、すなわちアンプリコンの量の増加は、蛍光の比例増加をもたらす。本発明の別の実施形態において、（TaqMan）蛍光レポータプローブは、ＦＲＥＴ（蛍光エネルギー移動）プローブである。本発明の一実施形態において、蛍光レポータプローブは、ＰＣＲプライマーの１つである。本発明の好適な実施形態において、核酸増幅は、蛍光レポータプローブを用いて検出される。
本発明によれば、核酸配列の増幅に相関する信号が、増幅反応の過程において記録される。増幅反応のサイクルの過程において記録された信号の表現が、増幅曲線として示される。通常、このような信号は、蛍光放出である；しかしながら、当分野において用いられる他の信号も同様に本発明に含まれる。蛍光放出は、蛍光染料によってリリースされることができ、それらのいくつかは、当分野において知られている。ある蛍光染料は、同じサンプル中の並列の検出を可能にするために充分に分離される吸収及び放出スペクトルを有する。増幅反応の過程における信号の記録は、チャンバ内の異なるカラーチャネル間の光学クロストークによって乱されることがあり、これは、理想には及ばない光学フィルタ及びフルオロフォアの結果である。更に、実験装置の外部コンポーネントの自己蛍光が、信号の記録を乱すことがあり、例えば、反応のために使用されるプラスチックコンテナが、励起波長に応答し、蛍光を放出することがある。本発明の好適な実施形態において、光学クロストーク及び自己蛍光に起因する外乱が、当分野において知られている方法によって低減される。本発明の好適な実施形態において、光学クロストーク及び自己蛍光に起因する外乱の低減後の、増幅反応のサイクルの過程において記録された信号の表現が、増幅曲線として示される。自己蛍光に起因する外乱を低減するための簡素なやり方は、コンテナは存在するが増幅反応のために使用される試薬はないという状況で、実験装置の信号オフセットを決定することである。増幅反応の間に記録された信号が、このオフセットについて補正される。光学クロストークに起因する外乱を低減するための簡素なやり方は、既知の濃度の非消光(unquenched)フルオロフォアを測定することによって、それぞれ異なるカラーチャネル間のクロストークを記述するクロストークマトリックスを決定することである。このクロストークマトリックスは、増幅反応の間に記録された信号を補正するために使用されることができる。
本発明の方法を実施する過程において、増幅曲線を記述するモデルであって、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも１つのパラメータを含むモデルが、規定される。モデルは、１又は複数のモデル関数を含むことができる。好適な実施形態において、モデルは、幾つかのモデル関数を含む。
記録される信号に影響を与える物理量は、増幅反応自体に関連する量、又は測定装置に関連する量でありうる。好適な実施形態において、物理量は、増幅プロセスの最中の信号ノイズの生成に関連する。別の好適な実施形態において、物理量は、増幅プロセスの抑制に関連する。別の好適な実施形態において、物理量は、増幅プロセスの最中のフルオロフォアの非自己消光（非自然消光、spontaneous unquenching）に関連する。別の好適な実施形態において、物理量は、（ｉ）ターゲット核酸配列の絶対的な初期量、（ｉｉ）ターゲット核酸配列の初期増幅効率、（ｉｉｉ）増幅反応の抑制の程度、（ｉｖ）増幅プロセスのために使用される反応コンテナによる信号吸収の程度、から選択される。
本発明の方法を実施する過程において、少なくとも１つのモデル関数を含むモデルが、増幅曲線に対してフィッティングされる。このようなモデルのベストフィットを決定する方法は、当分野において知られており、使用されるモデルに従って選択される。好適な実施形態において、このようなモデルのベストフィットは、以下のように決定される：最初に、例えば二乗フィッティング誤差のような費用関数が規定される。この費用関数は、例えばＣｔ付近のデータポイントである、曲線の特定部分を強調するように重み付けされることができる。反復的なニュートンラプソン最小法、可変ステップサイズ方法が、費用関数を最小にするために使用される。
本発明の方法を実施する過程において、パラメータ値が、モデルのベストフィットについて識別される。対応する値は、これらのパラメータが関連する物理量に関する情報を含む。
本発明の好適な実施形態において、例えばTaqMaｎ蛍光レポータプローブを使用する状況において、増幅曲線を記述する以下のモデル関数ＩＦ（ｎ）が規定される；ターゲット核酸配列の絶対的な初期量Ｎ０及びパラメータＥ０、α、ε、γのような、記録される信号に影響を与える物理量に関連するパラメータが選ばれる：
ここで、
ｎ＝サイクル数；
Ｎ（ｎ）＝サイクルｎにおけるターゲット核酸分子の数；
Ｎ０＝Ｎ（０）ターゲット核酸配列の絶対的な初期数；
Ｎｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉｕｑ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
Ｎｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける消光(quenched)蛍光レポータの数；
Ｉｑ＝消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
γ＝増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ；
Ｎｐ＝蛍光レポータプローブの初期数；
Ｎｓｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非自己消光（spontaneously unquenched）蛍光レポータの数；
β＝非自己消光蛍光レポータの割合；
Ｅ（ｎ）＝サイクルｎにおける増幅効率；
Ｅ０＝初期増幅効率；
α＝増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ；
ε＝ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ。
ｎ＝サイクル数；
Ｎ（ｎ）＝サイクルｎにおけるターゲット核酸分子の数；
Ｎ０＝Ｎ（０）ターゲット核酸配列の絶対的な初期数；
Ｎｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉｕｑ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
Ｎｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける消光(quenched)蛍光レポータの数；
Ｉｑ＝消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
γ＝増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ；
Ｎｐ＝蛍光レポータプローブの初期数；
Ｎｓｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非自己消光（spontaneously unquenched）蛍光レポータの数；
β＝非自己消光蛍光レポータの割合；
Ｅ（ｎ）＝サイクルｎにおける増幅効率；
Ｅ０＝初期増幅効率；
α＝増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ；
ε＝ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ。
増幅曲線に対するモデルのベストフィットを決定するために、以下の処理が、図２に示されるように実施される。
準備フェーズにおいて、パラメータ空間が、Ｎ０、α、Ｅ０、ε、γのパラメータの各々について規定され、ステップｋ１乃至ｋ５に分割される。すなわち、Ｎ０に関して［Ｎ０＿１，Ｎ０＿２，...，Ｎ０＿ｋ１］が規定され、αに関して［α＿１，α＿２，...，α＿ｋ２］が規定され、Ｅ０に関して［Ｅ０＿１，Ｅ０＿２，...，Ｅ０＿ｋ３］が規定され、εに関して［ε＿１，ε＿２，...，ε＿ｋ４］が規定され、γに関して［γ＿１， γ＿２，...，γ＿ｋ５］が規定される。それぞれ異なるパラメータのｋ１乃至ｋ５のステップ数は、同じである必要はないが、正確さ及び計算努力のバランスをとるために適切に選択されることができる。各パラメータによってカバーされるパラメータ空間は、期待されるバリエーションに従って規定される。
更に、Ｉｑ、Ｉｕｑ及びβの値が、以下のように推定される：Ｉｑの推定値を得るために、増幅曲線の最初の数サイクルについての信号強度の値（例えば最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０サイクルからの値）が平均され、蛍光レポータプローブＮｐの初期数によって除算され、これによりＩｑの推定値を与える。Ｉｕｑの推定値は、既に推定されたＩｑ及び文献（例えばSAE Marras et al. Nucleic Acids Research 2002, Vol. 30, Nr. 21, e122）に記載される消光（クエンチング）効率ηＱＥを使用して、Ｉｕｑ＝Ｉｑ／（１−ηＱＥ）に従って決定される。増幅曲線の最初の正の傾きは、フルオロフォアの非自己消光を示す；従って、一連の始めのサイクル（例えばサイクル１乃至３、１乃至５、１乃至１０、３乃至１０又は５乃至１０）の最中の増幅曲線の正の傾きが、βの推定値として使用されることができる。
更に、最大サイクル数ｎｍａｘが、フィッティング間隔の上限として規定され、すなわち、増幅曲線は、サイクル０乃至ｎｍａｘの間でＩＦ（ｎ）とフィッティングされる。ｎｍａｘは、例えば、増幅プロセスの最後のサイクルとして規定されることができ、又は代替として、固定の数のサイクルとして、例えばｎｍａｘ＝２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４又は３５として規定されることができる。代替として、ｎｍａｘは、特異的な増幅曲線のＣｔ値の後の固定数のサイクル（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５）に続くサイクルとして規定されることができる。この場合、Ｃｔ値は、当分野において記述される任意の方法によって決定されることができる。代替として、ｎｍａｘは、増幅曲線がその最大値の規定された割合より下にある最後のサイクルとして規定されることができる。本発明の好適な実施形態において、ｎｍａｘは、増幅曲線がその最大値のＸ％より下にある最後のサイクルとして規定される。この場合、Ｘは、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５のグループから選択される。本発明の別の好適な実施形態において、ｎｍａｘは、二次導関数最大法によって決定されるＣｔ値の後の１０サイクルに続くサイクルとして規定される。
開始フェーズでは、複数のパラメータの開始値が規定される。サイクル数ｎはｎ＝０にセットされる。パラメータＮ０、α、Ｅ０、ε、γは、それらの対応するパラメータ空間からの値を割り当てられる。Ｎｐは、増幅プロセスのために使用された蛍光レポータプローブの初期数として規定される。Ｉｑ、Ｉｕｑ及びβは、既に実施された推定に従って規定される。Ｎｓｕｑ（０）は、Ｎｓｕｑ（０）＝０にセットされる。Ｎｕｑ（０）は、Ｎｕｑ（０）＝０にセットされる。Ｎｑ（０）は、Ｎｑ（０）＝Ｎｐ−Ｎｕｑ（０）にセットされる。Ｉ０は、
にセットされる。
次いで、サイクル数がｎ＝１にセットされ、次の反復プロセスが実施される：
効率Ｅ（ｎ）を求める：
ターゲット核酸配列Ｎ（ｎ）の数を求める：
Ｎ［ｎ］＝Ｎ［ｎ−１］（１＋Ｅ［ｎ］）
Ｎ［ｎ］＝Ｎ［ｎ−１］（１＋Ｅ［ｎ］）
非自己消光蛍光レポータの数Ｎｓｕｑ（ｎ）を求める：
Ｎｓｕｑ（ｎ）＝Ｎｓｕｑ［ｎ−１］＋β・Ｎｑ［ｎ−１］
Ｎｓｕｑ（ｎ）＝Ｎｓｕｑ［ｎ−１］＋β・Ｎｑ［ｎ−１］
非消光蛍光レポータＮｕｑ（ｎ）の数を求める：
Ｎｕｑ［ｎ］＝Ｎ［ｎ］＋Ｎｓｕｑ［ｎ］
Ｎｕｑ［ｎ］＝Ｎ［ｎ］＋Ｎｓｕｑ［ｎ］
消光蛍光レポータＮｑ（ｎ）の数を求める：
Ｎｑ［ｎ］＝Ｎｐ−Ｎｕｑ［ｎ］
Ｎｑ［ｎ］＝Ｎｐ−Ｎｕｑ［ｎ］
蛍光強度Ｉ（ｎ）を求める：
ｎ＞ｎｍａｘを評価する；はい＝＞フィッティング誤差を計算し、Ｎ０、α、Ｅ０、ε、γのパラメータ値の次の組に進む；いいえ＝＞ｎ＝ｎ＋１をセットする。
ＮＰ＞Ｎ（ｎ−１）を評価する；はい＝＞ステップ（ａ）に進む；いいえ＝＞Ｅ（ｎ）＝０をセットし、ステップ（ｂ）に進む。
フィッティング誤差ｆｉｔ＿ｅｒｒが、フィット関数ＩＦ（ｎ）と増幅曲線との間の差の尺度として計算される。ｆｉｔ＿ｅｒｒは、当分野において知られている任意の方法によって計算されることができる。例えば、フィッティング誤差ｆｉｔ＿ｅｒｒは、以下のように計算されることができる：
ここで、ＡＣ（ｎ）は、サイクルｎにおける増幅曲線の信号強度値である。
このプロセスは、パラメータ空間が充分にカバーされるまで、パラメータＮ０、α、Ｅ０、ε、γの値のそれぞれ異なる組に関して繰り返される。当分野において知られているパラメータ空間の充分なカバレッジを効率的に得るようにパラメータ値を選択する任意の方法が、適用されることができる。好適な実施形態において、開始フェーズの間に規定されるパラメータ値のすべての組み合わせが、計算される。
特異的な増幅曲線の最小フィッティング誤差を与える関数ＩＦ（ｎ）が、ベストフィットとして選択され、対応するパラメータ値Ｎ０ ＃、α＃、Ｅ０ ＃、ε＃、γ＃が識別される。
Ｎ０ ＃は、決定されたターゲット核酸配列の絶対的な初期数を表す。Ｎ０ ＃は、解析の前にサンプルに存在していた実際の分子数を表し、物質量の表現を得るためにアボガドロ数の割合として表現されることができる。
パラメータα＃は、増幅プロセスの抑制に関する情報を提供する。
パラメータＥ０ ＃は、増幅反応の効率に関する情報を与え、すなわち、低い効率を有するＰＣＲが、Ｅ０ ＃の低い値に基づいて、容易に識別されることができる。
パラメータε＃は、ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関連する。
パラメータγ＃は、増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関する情報を与える。
別の実施形態において、本発明の方法は、充分に自動化された形で、大きな正確さ及びロバストネスを伴って、Ｃｔ値を得るために使用されることができる。ターゲット核酸配列の絶対的な初期数及び／又は他のパラメータに代わって、Ｃｔ値が結果として返されなければならないことを外部の制約が示す場合、この実施形態による方法は有用である。この実施形態に従ってＣｔ値を得るために、付加のステップ（ｄ）が、前記増幅曲線のＣｔ値を決定するために前記モデル関数のベストフィットを使用することによって実施される。
モデル関数のベストフィットは、増幅曲線のＣｔ値を決定するために、当分野において知られている任意の方法によって使用されることができる。本発明の好適な実施形態において、Ｃｔ値は、二次導関数最大法を用いることによって、モデル関数のベストフィットから得られる。従って、本発明の好適な実施形態において、ベストフィットの二次導関数最大値が、Ｃｔ値として決定され、使用される。
本発明のコンテクストにおいて、得られる又は規定されるサイクル数（例えばＣｔ値）は、整数のサイクル数又は分数のサイクル数として理解されることができる。特定のコンテクストに依存して、どのタイプのサイクル数が用いられるべきかは、当業者には明らかである。本発明の好適な実施形態において、サイクル数は、整数のサイクル数として理解されることができる。
本発明は、核酸配列を解析する方法及び手段を含む。単一の解析が、サンプル中の単一の種のターゲット核酸配列又はサンプル中の２以上の種のターゲット核酸配列に向けられることができる。サンプル中の２以上のターゲット核酸配列が解析を受ける場合、各々のターゲット核酸配列の増幅を監視するために記録される信号は、識別可能な信号でなければならず、すなわち同時に別個に記録されることができる信号でなければならない。このような信号を実現するための方法及び手段は、当分野において良く知られている。例えば充分に分離される吸収及び放出スペクトルを示す蛍光染料が、それらの蛍光信号の同時平行の記録を可能にする。従って、本発明は、サンプル中のいくつかのターゲット配列の同時のマルチプレックス解析を含む。
本発明は、自動化された形で、すなわち人間との対話なしに又は人間との最小の対話のみで、本発明の方法を実施する方法及び手段を含む。好適な実施形態において、本発明は、人間との対話なしに本発明の方法を実施する方法及び手段に向けられる。本発明は、当業者が、人間との対話なしに又は人間との最小の対話のみで本発明の方法を実施するために、当分野で利用可能な機器を使用することを可能にする。好適な実施形態において、本発明は、当業者が、人間との対話なしに本発明の方法を実施するために当分野で利用可能な機器を使用することを可能にする。
本発明は、本発明の方法を実施するための命令を記憶した機械可読媒体を含む。
本発明は更に、本発明の方法を実施するための情報を含む機械可読のメモリ手段を有する核酸サンプルの解析装置を含む。
本発明は更に、核酸配列の相対定量化の方法に関する。本発明による核酸配列の相対定量化は、ＰＣＲ反応が始まる前のサンプル中の対応するターゲット核酸配列の量の比率の定量的な尺度を得ることをいう。
本発明により、比較される核酸標準が、ターゲット核酸配列の相対定量化のための基準値を決定するために使用されることができる。サンプル中の１又は複数のこのような比較される核酸配列が、本発明により使用されることができる。ＰＣＲ反応が開始する前のサンプル中の比較される核酸配列の絶対量は、知られている必要はない。例えば、細胞内のハウスキーピング遺伝子の伝令ＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）が、比較される核酸標準として使用されることができる。ＰＣＲによって増幅されるために、ｍＲＮＡは、通常、当分野において知られている技法によって、事前にＤＮＡに転写される。
本発明は更に、核酸配列の絶対定量化の方法に関する。本発明による１又は複数の核酸配列の絶対定量化は、ＰＣＲ反応が開始する前に存在していたサンプル中の１又は核酸配列の量の絶対的な尺度及び／又はその後の解析を得ることをさす。その後の解析は、とりわけ、例えばターゲット核酸配列のコピー数を決定することを含みうる。
実施例：
実施例１
本発明の方法の信頼性を調べるために、既知の濃度を有するＤＮＡサンプルが解析され、その結果が、使用されたＤＮＡ濃度と比較された。
実施例１
本発明の方法の信頼性を調べるために、既知の濃度を有するＤＮＡサンプルが解析され、その結果が、使用されたＤＮＡ濃度と比較された。
黄色ブドウ球菌ATCC-25923からクローニングされたpCR2.1-TOPO中の442 Sau3Alゲノム断片の５'部位からのターゲット核酸配列（２５６塩基対）を含む黄色ブドウ球菌のＤＮＡサンプルの２５μｌボリュームが、希釈によって得られた２５μｌ当たり１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１のコピー濃度について、ABI 7099HTバージョン２．３リアルタイムＰＣＲサイクラの別個のバイアル内でＰＣＲの４０サイクルにより増幅された。ＰＣＲ反応のために、ABI社のTaqman Universal ＰＣＲマスターミックス及びTaqmanプローブFAM-Black Hole Quencher 1が使用された。増幅曲線が記録された。
モデル関数ＩＦ（ｎ）が、以下のように規定され、記録される信号に影響を与える物理量に関連するパラメータが、ターゲット核酸配列の絶対的な初期量Ｎ０及びパラメータＥ０、α、ε及びγとして選ばれた。
ｎ＝サイクル数；
Ｎ（ｎ）＝サイクルｎにおけるターゲット核酸分子の数；
Ｎ０＝Ｎ（０）ターゲット核酸配列の絶対的な初期数；
Ｎｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉｕｑ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
Ｎｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉｑ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
γ＝増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ；
Ｎｐ＝蛍光レポータプローブの初期数；
Ｎｓｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非自己消光蛍光レポータの数；
β＝非自己消光蛍光レポータの割合；
Ｅ（ｎ）＝サイクルｎにおける増幅効率；
Ｅ０＝初期増幅効率；
α＝増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ；
ε＝ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ。
Ｎ（ｎ）＝サイクルｎにおけるターゲット核酸分子の数；
Ｎ０＝Ｎ（０）ターゲット核酸配列の絶対的な初期数；
Ｎｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉｕｑ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
Ｎｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉｑ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
γ＝増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ；
Ｎｐ＝蛍光レポータプローブの初期数；
Ｎｓｕｑ（ｎ）＝サイクルｎにおける非自己消光蛍光レポータの数；
β＝非自己消光蛍光レポータの割合；
Ｅ（ｎ）＝サイクルｎにおける増幅効率；
Ｅ０＝初期増幅効率；
α＝増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ；
ε＝ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ。
増幅曲線に対するモデルのベストフィットを決定するために、以下の処理が実施された：
最初に、パラメータ空間が、パラメータＮ０、α、Ｅ０、ε、γの各々について規定され、各ステップに分割された。すなわち、Ｎ０：１００．５のステップサイズで１００から１０１０まで規定され、α：０．１のステップサイズで１から２まで規定され、Ｅ０：０．１のステップサイズで０から１まで規定され、ε：０．０５のステップサイズで０．１から０．５まで規定され、γは０と規定された。
更に、Ｉｑ、Ｉｕｑ及びβの値が以下のように推定された：線形回帰が、増幅曲線のサイクル５から１０まで実施され、結果的に得られたフィットされたラインを消光フルオロフォアの数Ｎｐで除したものの切片が、Ｉｑの推定値として使用された。Ｎｐは、Np=NAvogadro * creporter probe * Vと計算された。Ｉｕｑは、ηＱＥ＝０．８として、Ｉｕｑ＝Ｉｑ／（１―ηＱＥ）と推定された。βは、増幅曲線のサイクル５から１０までの線形回帰の傾きとして推定された。
フィッティング間隔の上限として規定される最大サイクル数ｎｍａｘが、増幅曲線がその最大値の９０％を下回る最後のサイクルとして規定された。
次いで、開始値が、複数のパラメータについて規定された。サイクル数ｎは、ｎ＝０にセットされた。パラメータＮ０、α、Ｅ０、ε、γは、それらの対応するパラメータ空間からの値を割り当てられた。Ｎｐは、増幅プロセスに使用される蛍光レポータプローブの初期数として、Np=NAvogadro * creporter probe * Vと規定された。
Ｉｑ、Ｉｕｑ及びβが、既に実施された推定に従って規定された。Ｎｓｕｑ（０）は、Ｎｓｕｑ（０）＝０にセットされた。Ｎｕｑ（０）は、Ｎｕｑ（０）＝０にセットされた。Ｎｑ（０）は、Ｎｑ（０）＝Ｎｐ−Ｎｕｑ（０）にセットされた。Ｉ０は、
にセットされた。
次いで、サイクル数がｎ＝１にセットされ、次の反復プロセスが実施された：
効率Ｅ（ｎ）を求める：
ターゲット核酸配列Ｎ（ｎ）の数を求める：
Ｎ［ｎ］＝Ｎ［ｎ−１］（１＋Ｅ［ｎ］）
Ｎ［ｎ］＝Ｎ［ｎ−１］（１＋Ｅ［ｎ］）
非自己消光蛍光レポータＮｓｕｑ（ｎ）の数を求める：
Ｎｓｕｑ［ｎ］＝Ｎｓｕｑ［ｎ−１］＋β・Ｎｑ［ｎ−１］
Ｎｓｕｑ［ｎ］＝Ｎｓｕｑ［ｎ−１］＋β・Ｎｑ［ｎ−１］
非消光蛍光レポータＮｕｑ（ｎ）の数を求める：
Ｎｕｑ［ｎ］＝Ｎ［ｎ］＋Ｎｓｕｑ［ｎ］
Ｎｕｑ［ｎ］＝Ｎ［ｎ］＋Ｎｓｕｑ［ｎ］
消光蛍光レポータＮｑ（ｎ）の数を求める：
Ｎｑ［ｎ］＝Ｎｐ−Ｎｕｑ［ｎ］
Ｎｑ［ｎ］＝Ｎｐ−Ｎｕｑ［ｎ］
蛍光強度Ｉ（ｎ）を求める：
ｎ＞ｎｍａｘを評価する；はい＝＞フィッティング誤差を計算し、Ｎ０、α、Ｅ０、ε、γのパラメータ値の次の組に進む；いいえ＝＞ｎ＝ｎ＋１をセットする。
ＮＰ＞Ｎ（ｎ−１）を評価する；はい＝＞ステップ（ａ）に進む；いいえ＝＞Ｅ（ｎ）＝０をセットし、ステップ（ｂ）に進む。
フィッティング誤差ｆｉｔ＿ｅｒｒが、適当な関数ＩＦ（ｎ）と増幅曲線との間の差の尺度として、以下のように計算された。
ここで、ＡＣ（ｎ）は、サイクルｎにおける増幅曲線の信号強度値である。
このプロセスは、初期フェーズの間に規定されたパラメータ値のすべての組み合わせが計算されるまで、パラメータＮ０、α、Ｅ０、ε、γの異なる値の組に関して繰り返された。
特異的な増幅曲線の最小フィッティング誤差を与えた関数ＩＦ（ｎ）が、ベストフィットとして選択され、対応するパラメータ値Ｎ０ ＃、α＃、Ｅ０ ＃、ε＃、γ＃が識別された。
図３は、使用されたターゲットＤＮＡの実際量（Ｂ）と比較される解析結果（Ａ）を示す。データポイントは、Ｒ２＝０．９６２９のピアソン係数に関するＹ＝１．０２７Ｘの線形グラフに収束し、これは、解析結果が、ＰＣＲ反応に最初に使用されたＤＮＡ量とぴったり一致することを示す。
実施例２
本発明の方法により得られるパラメータは、増幅プロセスの品質を評価するために使用されることができる。以下の実施例において、本発明の方法により得られたパラメータＥ０対αのプロットは、低い増幅品質を有するサンプルを識別した。これは、これらのサンプルについて得られた例えば初期のターゲット核酸配列濃度のようなデータが、グループ内の他のサンプルのデータと比較できないことを示す。更に、これらのパラメータは、信頼できる増幅曲線と増幅反応が行われなかった曲線とを区別するために使用されることもできる。
本発明の方法により得られるパラメータは、増幅プロセスの品質を評価するために使用されることができる。以下の実施例において、本発明の方法により得られたパラメータＥ０対αのプロットは、低い増幅品質を有するサンプルを識別した。これは、これらのサンプルについて得られた例えば初期のターゲット核酸配列濃度のようなデータが、グループ内の他のサンプルのデータと比較できないことを示す。更に、これらのパラメータは、信頼できる増幅曲線と増幅反応が行われなかった曲線とを区別するために使用されることもできる。
３６のＰＣＲ反応が、TaqMan Universalマスターミックス（2×）：アプライドバイオシステムズ社(4304437)ロットK15898(01/31/10)及び黄色ブドウ球菌ＰＣＲプライマー及びプローブ：1033-001 Sa_442_PR1129F23 10μM, 1034-001 S.aur_442_R2 10μM 及び1035-001 S.aur_442_TQM2_FAM 10μMを使用して、ソフトウェアｖ１．１のBio-Rad CFXリアルタイムＰＣＲ機器において実施された：サンプルは、以下のように準備された：Ｔｏｐｏ１／黄色ブドウ球菌プラスミドＤＮＡが希釈され、それにより、０、１０２、１０４及び１０６コピーのサンプル（１０６コピーを有する１３のサンプル、１０４コピーを有する１１のサンプル、１０２のコピーを有する８のサンプル、及びターゲットＤＮＡを含まない４のサンプル（ＮＴＣ））が得られた。
モデル関数ＩＦ（ｎ）及びパラメータは、実施例１のように規定された。パラメータ空間が、パラメータの各々について規定された。すなわち、Ｎ０：１００．５のステップサイズで１００から１０１０まで規定され、α：０．２のステップサイズで１から３まで規定され、Ｅ０：０．０１のステップサイズで０から１まで規定され、ε：０．０５のステップサイズで０．１から０．７まで規定され、γは０と規定された。方法の残りの部分は、実施例１に説明したように実施された。
図４は、得られたＥ０の値（Ｅ）に対してプロットされたαの結果の値（Ａ）を示す。データポイントのほとんどは、グラフの右側に密集しており、すなわち、Ｅ０の高い値を示す。しかしながら、データポイントの幾つかは、Ｅ０のより低いレベルに、すなわち左側に位置する。興味深いことに、これらのデータポイントのすべては、ターゲットＤＮＡを全く含まなかったサンプルに対応する。これは、Ｅ０及びαが、更なる検査を受けるべきであるデータポイントを識別し、それらが測定アーチファクトの結果であるかどうかを判定するために使用されることができる。
実施例３
本発明の方法により得られるパラメータは、増幅プロセスの品質を評価するために使用されることができる。以下の実施例において、本発明の方法により得られたパラメータＥ０対εのプロットは、低い増幅品質をもつ増幅反応を識別した。これは、これらのサンプルについて得られた例えば初期の核酸配列ターゲット濃度のようなデータが、他のサンプルのデータと比較できないことを示す。
本発明の方法により得られるパラメータは、増幅プロセスの品質を評価するために使用されることができる。以下の実施例において、本発明の方法により得られたパラメータＥ０対εのプロットは、低い増幅品質をもつ増幅反応を識別した。これは、これらのサンプルについて得られた例えば初期の核酸配列ターゲット濃度のようなデータが、他のサンプルのデータと比較できないことを示す。
黄色ブドウ球菌ATCC-25923からクローニングされたpCR2.1-TOPO中の442 Sau3Alゲノム断片の５'部位（２５６塩基対）から得られたターゲット核酸配列を含む黄色ブドウ球菌のＤＮＡサンプルの２５μｌボリュームが、希釈によって得られた２５μｌ当たり１０６、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１のコピー濃度について、ABI 7099HTバージョン２．３リアルタイムＰＣＲサイクラの別個のバイアル内でＰＣＲの４０サイクルにより増幅された。ＰＣＲ反応のために、ABI社のTaqman Universal ＰＣＲマスターミックス及びTaqmanプローブFAM-Black Hole Quencher 1が、使用された。増幅曲線が記録された。
実験の残りの部分は、実施例１に説明したように、実施された。
図５は、得られたＥ０の値に対してプロットされたεの結果の値を示す。データポイントのほとんどは、グラフの右上角に密集している。しかしながら、データポイントの幾つかは、グラフの左下方に位置する。興味深いことに、これらのデータポイントの全ては、ターゲットＤＮＡを全く含まなかったサンプルに対応する。これは、Ｅ０及びεが、更なる検査を受けるべきであるデータポイントを識別し、それらが測定アーチファクトの結果であるかどうかを判定するために使用されることができる。
実施例４
ＰＣＲ反応が、２つのＰＣＲサンプルについて実施された。一方のサンプルは、４９％の排泄物が加えられたものであり、他方のサンプルは排泄物が加えられなかったものである。それぞれの増幅曲線が、上述の実施例に説明したように得られた。次いで、モデル関数ＩＦ（ｎ）のベストフィット及び対応するフィットパラメータが、上述の実施例に説明したように得られた。
ＰＣＲ反応が、２つのＰＣＲサンプルについて実施された。一方のサンプルは、４９％の排泄物が加えられたものであり、他方のサンプルは排泄物が加えられなかったものである。それぞれの増幅曲線が、上述の実施例に説明したように得られた。次いで、モデル関数ＩＦ（ｎ）のベストフィット及び対応するフィットパラメータが、上述の実施例に説明したように得られた。
図６Ａ及び図６Ｂは、各増幅反応のサイクルの過程において得られた増幅曲線のプロット（Ｃ）と、モデル関数のベストフィット（Ａ）と、増幅効率（Ｂ）と、を示す。排泄物を含まないサンプル（図６Ａ）及び排泄物を含むサンプル（図６Ｂ）について決定された増幅効率のプロットの比較は、排泄物の存在が、増幅反応の効率に重大且つ不利益な影響を及ぼすことを示した。図６Ａの増幅効率は１．０から始まり、図６Ｂの増幅効率は０．５１から始まる。本発明の方法により決定される増幅効率のプロットは、このような重大且つ不利益な効果を表すための有用なツールである。
Claims (9)
- ターゲット核酸配列の増幅曲線から情報を得るためにコンピュータに、
（ａ）増幅曲線を記述し、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも１つのパラメータを含む少なくとも１つのモデル関数を規定するステップと、
（ｂ）前記増幅曲線に対し前記モデル関数をフィッティングするステップと、
（ｃ）前記モデル関数のベストフィットを与える前記パラメータの値を識別することによって、前記物理量に関する情報を得るステップと、
を実行させるための命令を記憶した機械可読媒体であって、
前記パラメータは、前記ターゲット核酸配列の絶対的な初期量Ｎ ０ 及びパラメータＥ ０ 、α、ε及びγであり、前記モデル関数はＩＦ（ｎ）と規定され、
であり、
ｎ＝サイクル数；
Ｎ（ｎ）＝サイクルｎにおけるターゲット核酸分子の数；
Ｎ ０ ＝Ｎ（０）ターゲット核酸配列の絶対的な初期数；
Ｎ ｕｑ （ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉ ｕｑ ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
Ｎ ｑ （ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉ ｑ ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
γ＝増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ；
Ｎ ｐ ＝蛍光レポータプローブの初期数；
Ｎ ｓｕｑ （ｎ）＝サイクルｎにおける非自己消光蛍光レポータの数；
β＝非自己消光蛍光レポータの割合；
Ｅ（ｎ）＝サイクルｎにおける増幅効率；
Ｅ ０ ＝初期増幅効率；
α＝増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ；
ε＝ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ
である、
機械可読媒体。 - 前記物理量は、増幅プロセスの間の信号ノイズの生成に関連する物理量と、前記増幅プロセスの抑制に関連する物理量と、前記増幅プロセスの間のフルオロフォアの非自己消光に関連する物理量と、から選択される物理量である、請求項１に記載の機械可読媒体。
- 前記物理量は、前記ターゲット核酸配列の絶対的な初期量と、前記ターゲット核酸配列の初期増幅効率と、増幅反応の抑制の程度と、増幅プロセスに使用される反応コンテナによる信号吸収の程度と、から選択される、請求項１に記載の機械可読媒体。
- 前記増幅曲線から得られる前記情報が前記増幅曲線のＣｔ値であり、前記コンピュータに、
（ｄ）前記増幅曲線の前記Ｃｔ値を決定するために前記モデル関数の前記ベストフィットを使用するステップ、
を実行させるための命令を更に含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の機械可読媒体。 - サンプル中の１つのターゲット核酸配列が同時に解析される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の機械可読媒体。
- サンプル中の２以上のターゲット核酸配列が同時に解析される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の機械可読媒体。
- 光学クロストーク及び自己蛍光から生じる外乱を低減した後の、増幅反応のサイクルの過程において記録された信号の表現が、前記増幅曲線として使用される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の機械可読媒体。
- すべての前記ステップは、ＰＣＲプロセスの最中の人間との対話なしに、完全に自動化された態様で実施される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の機械可読媒体。
- 核酸サンプルの解析装置であって、
ターゲット核酸配列の増幅曲線から情報を得るために、
（ａ）増幅曲線を記述し、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも１つのパラメータを含む少なくとも１つのモデル関数を規定するステップと、
（ｂ）前記増幅曲線に対し前記モデル関数をフィッティングするステップと、
（ｃ）前記モデル関数のベストフィットを与える前記パラメータの値を識別することによって、前記物理量に関する情報を得るステップと、
を実行するためのプログラムを含む機械可読のメモリ手段を有する、拡散サンプルの解析装置において、
前記パラメータは、前記ターゲット核酸配列の絶対的な初期量Ｎ ０ 及びパラメータＥ ０ 、α、ε及びγであり、前記モデル関数はＩＦ（ｎ）と規定され、
であり、
ｎ＝サイクル数；
Ｎ（ｎ）＝サイクルｎにおけるターゲット核酸分子の数；
Ｎ ０ ＝Ｎ（０）ターゲット核酸配列の絶対的な初期数；
Ｎ ｕｑ （ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉ ｕｑ ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
Ｎ ｑ （ｎ）＝サイクルｎにおける非消光蛍光レポータの数；
Ｉ ｑ ＝非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ；
γ＝増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ；
Ｎ ｐ ＝蛍光レポータプローブの初期数；
Ｎ ｓｕｑ （ｎ）＝サイクルｎにおける非自己消光蛍光レポータの数；
β＝非自己消光蛍光レポータの割合；
Ｅ（ｎ）＝サイクルｎにおける増幅効率；
Ｅ ０ ＝初期増幅効率；
α＝増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ；
ε＝ＰＣＲプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ
である、
核酸サンプルの解析装置。
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