JP2013508848A - 増幅反応の解析ツール - Google Patents
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Abstract
Description
(a)増幅曲線を記述し、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも1つのパラメータを含む少なくとも1つのモデル関数を規定するステップと、
(b)前記増幅曲線に対し前記モデル関数をフィッティングするステップと、
(c)前記モデル関数のベストフィットを与える前記パラメータの値を識別することによって、前記物理量に関する情報を得るステップと、
を含む方法が提供される。
ここで、
n=サイクル数;
N(n)=サイクルnにおけるターゲット核酸分子の数;
N0=N(0)ターゲット核酸配列の絶対的な初期数;
Nuq(n)=サイクルnにおける非消光蛍光レポータの数;
Iuq=非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ;
Nq(n)=サイクルnにおける消光(quenched)蛍光レポータの数;
Iq=消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ;
γ=増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ;
Np=蛍光レポータプローブの初期数;
Nsuq(n)=サイクルnにおける非自己消光(spontaneously unquenched)蛍光レポータの数;
β=非自己消光蛍光レポータの割合;
E(n)=サイクルnにおける増幅効率;
E0=初期増幅効率;
α=増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ;
ε=PCRプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ。
にセットされる。
N[n]=N[n−1](1+E[n])
Nsuq(n)=Nsuq[n−1]+β・Nq[n−1]
Nuq[n]=N[n]+Nsuq[n]
Nq[n]=Np−Nuq[n]
ここで、AC(n)は、サイクルnにおける増幅曲線の信号強度値である。
実施例1
本発明の方法の信頼性を調べるために、既知の濃度を有するDNAサンプルが解析され、その結果が、使用されたDNA濃度と比較された。
n=サイクル数;
N(n)=サイクルnにおけるターゲット核酸分子の数;
N0=N(0)ターゲット核酸配列の絶対的な初期数;
Nuq(n)=サイクルnにおける非消光蛍光レポータの数;
Iuq=非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ;
Nq(n)=サイクルnにおける非消光蛍光レポータの数;
Iq=非消光蛍光レポータの蛍光強度パラメータ;
γ=増幅プロセスを実施するために使用されるコンテナの吸収特性に関するパラメータ;
Np=蛍光レポータプローブの初期数;
Nsuq(n)=サイクルnにおける非自己消光蛍光レポータの数;
β=非自己消光蛍光レポータの割合;
E(n)=サイクルnにおける増幅効率;
E0=初期増幅効率;
α=増幅プロセスの抑制に関するスケーリングファクタ;
ε=PCRプライマー枯渇に対する増幅プロセスの感度に関するパラメータ。
にセットされた。
N[n]=N[n−1](1+E[n])
Nsuq[n]=Nsuq[n−1]+β・Nq[n−1]
Nuq[n]=N[n]+Nsuq[n]
Nq[n]=Np−Nuq[n]
本発明の方法により得られるパラメータは、増幅プロセスの品質を評価するために使用されることができる。以下の実施例において、本発明の方法により得られたパラメータE0対αのプロットは、低い増幅品質を有するサンプルを識別した。これは、これらのサンプルについて得られた例えば初期のターゲット核酸配列濃度のようなデータが、グループ内の他のサンプルのデータと比較できないことを示す。更に、これらのパラメータは、信頼できる増幅曲線と増幅反応が行われなかった曲線とを区別するために使用されることもできる。
本発明の方法により得られるパラメータは、増幅プロセスの品質を評価するために使用されることができる。以下の実施例において、本発明の方法により得られたパラメータE0対εのプロットは、低い増幅品質をもつ増幅反応を識別した。これは、これらのサンプルについて得られた例えば初期の核酸配列ターゲット濃度のようなデータが、他のサンプルのデータと比較できないことを示す。
PCR反応が、2つのPCRサンプルについて実施された。一方のサンプルは、49%の排泄物が加えられたものであり、他方のサンプルは排泄物が加えられなかったものである。それぞれの増幅曲線が、上述の実施例に説明したように得られた。次いで、モデル関数IF(n)のベストフィット及び対応するフィットパラメータが、上述の実施例に説明したように得られた。
Claims (11)
- ターゲット核酸配列の増幅曲線から情報を得る方法であって、
(a)増幅曲線を記述し、記録される信号に影響を与える物理量に関連する少なくとも1つのパラメータを含む少なくとも1つのモデル関数を規定するステップと、
(b)前記増幅曲線に対し前記モデル関数をフィッティングするステップと、
(c)前記モデル関数のベストフィットを与える前記パラメータの値を識別することによって、前記物理量に関する情報を得るステップと、
を含む方法。 - 前記物理量は、増幅プロセスの間の信号ノイズの生成に関連する物理量と、前記増幅プロセスの抑制に関連する物理量と、前記増幅プロセスの間のフルオロフォアの非自己消光に関連する物理量と、から選択される物理量である、請求項1に記載の方法。
- 前記物理量は、前記ターゲット核酸配列の絶対的な初期量と、前記ターゲット核酸配列の初期増幅効率と、増幅反応の抑制の程度と、増幅プロセスに使用される反応コンテナによる信号吸収の程度と、から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅曲線から得られる前記情報が前記増幅曲線のCt値であり、前記方法が、
(d)前記増幅曲線の前記Ct値を決定するために前記モデル関数の前記ベストフィットを使用するステップ、
を更に含む、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。 - サンプル中の1つのターゲット核酸配列が同時に解析される、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- サンプル中の2以上のターゲット核酸配列が同時に解析される、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 光学クロストーク及び自己蛍光から生じる外乱を低減した後の、増幅反応のサイクルの過程において記録された信号の表現が、前記増幅曲線として使用される、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- すべての前記ステップは、前記PCRプロセスの最中の人間との対話なしに、完全に自動化された態様で実施される、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法を実施するための命令を記憶した機械可読媒体。
- 請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法を実施するための情報を含む機械可読のメモリ手段を有する核酸サンプルの解析装置。
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2010
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