CN102576389A

CN102576389A - 用于扩增反应的分析工具

Info

Publication number: CN102576389A
Application number: CN2010800473058A
Authority: CN
Inventors: J.A.H.M.卡尔曼; T.M.E.尼森; B.尹
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Koninklijke Philips NV
Priority date: 2009-10-21
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2030-10-14
Also published as: US8990059B2; WO2011048529A1; EP2491509B1; JP2013508848A; CN102576389B; JP5744038B2; US20120197610A1; BR112012009108A2; EP2491509A1

Abstract

本发明涉及一种方法和装置，该方法和装置用于通过定义描述扩增曲线并包含与影响所记录的信号的物理量相关的至少一个参数的至少一个模型函数，将所述模型函数拟合至该扩增曲线，并通过确认导致模型函数的最佳拟合的所述参数的值而获得关于所述物理量的信息，从而从一个或多个靶核酸序列的扩增曲线获得信息。

Description

用于扩增反应的分析工具

技术领域

本发明涉及借助于聚合酶链式反应(PCR)的核酸定量的领域。

背景技术

核酸的定量在从分子生物学和遗传研究到诊断和病原体检测的许多领域中是重要的。当存在足够量的核酸时，可以应用斑点(blot)技术用于定量。然而，这些技术的有限灵敏度妨碍了它们在许多情况中的使用。

不久前发展起来的定量PCR方法提供了在要求高得多的灵敏度情况下用于分析的工具。这些技术是基于以下事实：在PCR扩增期间产物的量以指数方式增长，并且因此，可以通过常规手段（例如，荧光检测）来检测在少量循环之后所获得的产物的量。另外，原则上，如果已知扩增循环的数目，则可以从扩增结束时获得的产物的量来确定初始（即，在扩增开始时）存在的产物的量。

在扩增反应进程上形成的PCR产物的典型曲线图揭露了扩增过程的四个不同阶段（见图1）：(1)基底阶段(GP)，其中荧光信号由背景荧光和噪声主导；(2)指数阶段（EP），其中来自PCR产物的信号上升超过基底水平并以指数形式增加；(3)对数线性阶段（LP），其中由于由诸如PCR试剂消耗和检测探针退化之类的因素引起的减小的扩增效率，信号以小于指数速率增加；(4)由于扩增反应的渐增的放缓和最终的停止而具有该信号的余量上升的平稳阶段（PP）。

然而目前没有可用的物理模型以逼真的形式描述在PCR过程期间被检测到的信号的发展。因此，当前的用于核酸定量的方法要求执行校准步骤，该校准步骤涉及对具有已知浓度的标准/或比较的核酸序列的参照样品执行同样的PCR反应。很多时候，用作标准的核酸序列是公知的看家基因(housekeeping gene)。简要地概述，在实践中，靶核酸序列以及标准和/或比较的样品在确定的反应条件下进行PCR，并且也称为扩增子的PCR产物的形成在扩增过程的进程上受到监控。例如，借助于荧光标记的杂交探针或借助于检测双链PCR产物的DNA插入荧光染料来实现PCR产物的检测。确定了为获得特定荧光阈值水平所需的扩增循环的数目，其被指定为C_t值，并将靶的C_t值与具有已知浓度稀释系列的核酸标准的样品的C_t值比较（绝对定量）。为确定靶的绝对量，根据标准样品的C_t值构建标准曲线并将该标准曲线用于确定靶的初始浓度。可替换地，将靶的C_t值与关心的单个比较核酸的C_t值比较（相对定量）。在该情况下，靶和比较样品的C_t值的比值被确定并用于评估靶和比较核酸序列的初始量的比值。

总体而言，核酸定量新方法的发展面临许多挑战，其中的某些挑战源于将在以下更详细地讨论的若干应用要求完全自动化的事实，并且其中的某些挑战与校准过程相关。

采用C_t值确定的用于核酸定量方法所要求的校准过程引入了许多潜在的限制。首先，标准样品的检查要求另外的实验努力和资源。其次，这些方法是基于标准和靶样品内的扩增效率相同的假设。重要的是，该假设通常是不正确的并因此提供了不准确的来源。

定量的PCR领域中的另外挑战与在短时间间隔内分析大量样品的增长的需求相关。由于定量PCR的日益增长的应用范围要求以高通量方式分析数量非常大的样品，例如在临床实践中，就需要发展能够完全自动化且需要非常少或无需人机交互的定量的PCR方法。这在某些情况下是至关重要的，因为如果要求人机交互，高通量应用（例如在临床实践中）就不能简单地在所要求的短时间段内进行。

使用这种自动化方法能够实现的另外的优点将是目前使用迥异的定量PCR实验室协议的不同实验室之间的分析数据改进的可比性。考虑到越来越多的实验室使用定量PCR技术用于基础研究，该问题具有至高的重要性。建立自动化方法作为定量实验的客观参照将通过增强实验室间的一致性而使这些研究努力极大地受益。

两种使用C_t值确定的方法目前可用于核酸定量，这两种方法原则上似乎适于完全自动化：二阶导数最大值方法和S形曲线(sigmoidal curve)拟合方法。对于二阶导数最大值方法，扩增曲线的二阶导数的最大值被数值地确定。相应的循环被假设为表示指数增长阶段的结束，在此反应开始放缓至线性增长。该循环数目与C_t类似地被用于确定靶的量。对于S形曲线拟合方法，在扩增曲线上对S形函数建模。对应于曲线拐点的循环数目可以从模型获得，并与C_t类似地被用于确定靶的量。然而，已经发现二阶导数最大值方法和S形曲线拟合方法对于要求高灵敏度的应用具有有限的用途（JD Durtschi等，Analytical Biochemistry，361 (2007)，第55-64页）。此外，这两种方法均要求校准步骤。另外，在使用S形曲线拟合方法的过程中在扩增曲线上建模的S形函数极为理想化，并且决不能被视为描述在PCR过程期间检测到的信号的发展的物理模型。

发明内容

因此，本发明的目的是提供适于要求高灵敏度的靶核酸序列的完全自动化定量的方法。另外，本发明的目的是提供不需要比较靶和标准样品的方法，即，不要求校准步骤的方法。此外，本发明的目的是提供一种物理模型，其允许在扩增过程期间非常详细地分析检测到的信号。

附图说明

图1示出了在扩增反应的进程上获得的典型扩增曲线，其揭露了扩增过程的不同阶段：GP=基底阶段，EP=指数阶段，LP=对数线性阶段，PP=平稳阶段。C表示循环的数目且I_C表示实验者使用的图像分析软件所记录的信号强度。许多这些软件程序是本领域人员公知的。

图2示出了用于为扩增曲线确定模型函数IF(n)拟合的方法的示意性表达。

图3示出了相对于根据本发明确定的结果(A)绘制的一系列样品中的靶DNA的绝对初始量(B)。分析的结果与最初呈现的靶DNA初始量相对应。

图4示出了对于一系列样品的相对于彼此绘制的根据本发明确定的参数E₀(E)和α(A)。圆形表示包含靶DNA的规则样品而正方形表示不包含靶DNA的样品。包括规则样品的数据点的不同簇的存在表明E₀和α可以用于识别并可能地排除具有不正常扩增反应的样品，否则其可能导致错误判断。

图5示出了对于一系列样品的相对于彼此绘制的根据本发明确定的参数E₀和ε。菱形表示包含靶DNA的规则样品而正方形表示不包含靶DNA的样品。包括每个样品类型的数据点的不同簇的存在表明E₀和ε可以用于识别并可能地排除具有不正常扩增反应的样品，否则其可能导致错误判断。

图6A和6B示出了在使用两个PCR样品（一个添加有49%的渣滓(feces)且另一个没有添加渣滓）执行的PCR反应循环的进程上获得的扩增曲线（C）、模型函数的最佳拟合（A）以及扩增效率（B）的曲线图。如实例4中所描述的，对于没有渣滓的样品（图6A）和具有渣滓的样品（图6B）所确定的扩增效率的曲线图比较示出了渣滓的存在对于扩增反应的效率具有显著且不利的影响：图6A中的扩增效率在1.0处开始，而图6B中的扩增效率在0.51处开始。

具体实施方式

遵从本发明的核酸包括DNA、RNA以及具有改性的主链和/或基础结构的核酸。通常通过各种方法并且借助于本领域技术人员可获得的仪器由聚合酶链式反应(PCR)执行扩增。然而，为了本发明的目的，无法直接由PCR扩增的核酸可能必须借助于本领域技术人员已知的方法转录成DNA。例如，RNA可能必须在扩增前使用逆转录酶转录成DNA。为了允许重构原始量的相应核酸，这种转录过程必须在使能进行理由充分的假设的条件下执行，该假设涉及被转录成DNA的核酸与在转录进程中产生的DNA的量的比率。该类型的反应条件在本领域中是公知的。

实践本发明的进程中扩增的每个核酸序列通常以有选择性的方式来扩增。在PCR期间获得选择性扩增的一种方式是使用特定序列引物。这种引物的设计和使用对于本领域技术人员来说是公知的。

为了本发明的目的，通过PCR的核酸扩增，即通过扩增反应的核酸的产生，又称为扩增子，是通过记录与所述核酸序列的扩增相关的信号来检测。这通常借助于荧光指示探针（此处也指定为荧光指示体或指示探针）来实现。这种荧光指示探针在本领域中是共知的。在本发明的一个实施例中，荧光指示探针包括寡核苷酸，该寡核苷酸在杂交条件下特异地结合至靶核酸序列，并在其序列的一端上携带有荧光基团且在其序列的另一端上携带有相应的猝灭基团。在该状态下的荧光基团和猝灭基团的紧邻防止了荧光的发射。然而，当荧光指示探针的中央寡核苷酸在下一个扩增循环的进程中被打破时，荧光团和猝灭剂的接近不复存在，导致荧光发射。扩增产物量即扩增子的增加因此产生了荧光的成比例增加。在本发明另一个实施例中，荧光指示探针是FRET(荧光能量转移)探针。在本发明一个实施例（TaqMan）中，荧光指示探针是PCR引物之一。在本发明优选实施例中，借助于荧光指示探针检测核酸扩增。

根据本发明，在扩增反应的进程上记录与核酸序列的扩增相关联的信号。在扩增反应循环的进程上记录的信号的表达被表示为扩增曲线。通常这种信号是荧光发射；然而，本发明也包括本领域中使用的其它信号。可以由荧光染料释放荧光发射，若干所述荧光染料在本领域中是已知的。某些荧光染料具有足够分开的吸收和发射光谱以允许在同一样品中的并行检测。在扩增反应进程上的信号记录可能被腔室中不同颜色通道之间的光学串扰干扰，该光学串扰是低于理想的光学过滤器和荧光团的结果。此外实验装置的外部组件的自动荧光能够干扰信号的记录，例如，用于反应的塑料容器可能响应于激发波长并发射荧光。在本发明的优选实施例中，通过本领域公知的方法减少由光学串扰和自动荧光所导致的干扰。在本发明的优选实施例中，在减少由光学串扰和自动荧光所导致的干扰之后的扩增反应循环进程上所记录信号的表达被表示为扩增曲线。减少由自动荧光导致的干扰的简单方法是在存在容器但不存在用于扩增反应的试剂的情况下确定实验装置的信号偏移。然后，针对该偏移校正扩增反应期间记录的信号。减少由光学串扰导致的干扰的简单方法是通过测量未猝灭荧光团的已知浓度来确定描述不同颜色通道之间串扰的串扰矩阵。该串扰矩阵可以用于校正在扩增反应期间记录的信号。

在执行本发明的方法的进程中，定义了模型，该模型描述了扩增曲线并包括与对所记录的信号有影响的物理量相关的至少一个参数。该模型可以包括一个或若干模型函数。在优选实施例中模型包括若干模型函数。

对记录的信号有影响的物理量可以是与扩增反应本身相关的量或是与测量装置有关的量。在优选的实施例中，物理量是与扩增过程期间信号噪声的产生相关的。在另一个优选的实施例中，物理量是与扩增过程的抑制相关的。在另一个优选的实施例中，物理量是与扩增过程期间荧光团的自发未猝灭相关的。在另一个优选的实施例中，物理量从下述选择：(i)靶核酸序列的绝对初始量，(ii)靶核酸序列的初始扩增效率，(iii)扩增反应的抑制程度，(iv)用于扩增过程的反应容器的信号吸收程度。

在执行本发明方法的进程中，包括至少一个模型函数的模型被拟合到扩增曲线。用于确定这种模型的最佳拟合的方法在本领域是已知的并依照所用的模型来选择。在优选的实施例中，这种模型的最佳拟合以如下方式来确定：首先定义成本函数，例如，拟合误差平方。该成本函数可以被加权从而强调曲线的特定部分，例如C_t周围的数据点。然后使用迭代的Newton Raphson极小化、变步长方法来最小化该成本函数。

在执行本发明方法的进程中，在模型的最佳拟合中确认参数值。相应的值包含这些参数关联到的物理量的信息。

在本发明优选的实施例中，例如，在使用TaqMan荧光指示探针的环境中，定义了描述扩增曲线的以下模型函数IF(n)；选择与对所记录的信号有影响的物理量相关的参数作为靶核酸序列的绝对初始量为N₀，以及参数E₀、α、ε和γ：

其中

，

并且其中，

并且其中

，

并且其中

，

并且其中

，

并且其中

，

其中：

n=循环数目；

N(n)=在循环n的靶核酸分子的数目；

N₀=N(0)靶核酸序列的绝对初始数目；

N_uq(n)=在循环n未猝灭的荧光指示体的数目；

I_uq=未猝灭的荧光指示体的荧光强度参数；

N_q(n)=在循环n猝灭的荧光指示体的数目；

I_q=猝灭的荧光指示体的荧光强度参数；

γ=与用于执行扩增过程的容器的吸收特性相关的参数；

N_p=荧光指示探针的初始数目；

N_suq(n)=在循环n自发未猝灭的荧光指示体的数目；

β=自发未猝灭的荧光指示体的分数；

E(n)=循环n的扩增效率；

E₀=初始扩增效率；

α=与扩增过程的抑制相关的比例因子；

ε=与扩增过程对PCR引物耗尽的灵敏度相关的参数。

为了确定模型到扩增曲线的最佳拟合，执行如图2所描绘的以下操作。

在准备阶段中，为每个参数N₀、α、E₀、ε、γ定义参数空间并将参数空间分成步进k1至k5，即，N₀的[N₀_1, N₀_2, …, N₀_k1]，α的[α_1, α_2, …, α_k2]，E₀的[E₀_1, E₀_2, …, E₀_k3]，ε的[ε_1, ε_2, …, ε_k4]，γ的[γ_1, γ_2, …, γ_k5]。步进k1至k5的数目对于不同参数不必是相同的，而可以适当地选择以平衡精确度和计算工作量。依照预期的变化来定义每个参数覆盖的参数空间。

此外，如以下方式估计I_q、I_uq和β的值：为获得I_q的估计，扩增曲线最初几个循环(例如，来自最初的1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9或10个循环)的信号强度值被平均并除以荧光指示探针的初始数目N_p，从而产生I_q的估计。然后使用先前估计的I_q以及如文献（例如，SAE Marras等Nucleic Acids Research 2002, Vol. 30, Nr. 21, e122）中描述的猝灭效率η_QE，根据I_uq=I_q/(1-η_QE)来确定I_uq的估计。扩增曲线开始处的正斜率指示了荧光团的自发未猝灭；因此一系列早期循环（例如，循环1至3、1至5、1至10、3至10、或5至10）期间扩增曲线的正斜率可以用作β的估计。

另外，最大循环数目n_max被定义为拟合区间的上限，即，扩增曲线在循环0和n_max之间用IF(n)拟合。n_max可以例如定义为扩增过程的最后循环，或者可替换地定义为具有固定数目的循环，例如定义为n_max=21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35。可替换地，n_max可定义为特定扩增曲线的C_t值之后跟随固定数目循环（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15）的循环，从而可以由本领域中描述的任意方法来确定C_t值。可替换地，n_max可定义为最后的循环，其中扩增曲线保持低于其最大值的定义的分数。在本发明优选的实施例中，n_max定义为最后的循环，其中扩增曲线保持低于其最大值的X%，其中X从50、55、60、65、70、75、80、85、90或95的组中选择。在本发明另一优选实施例中，n_max定义为在由二阶导数最大值方法确定的C_t值之后跟随10个循环的循环。

在初始阶段，为多个参数定义开始值。循环数目被设为n=0。参数N₀、α、E₀、ε、γ被分配来自它们对应的参数空间的值。N_p定义为用于扩增过程的荧光指示探针的初始数目。根据先前执行的估计来定义I_q、I_uq和β。N_suq(0)被设为N_suq(0)=0。N_uq(0)被设为N_uq(0)=0。N_q(0)被设为N_q(0)=N_p-N_uq(0)。I₀被设为

。

随后循环数目被设为n=1并执行下述迭代过程：

确定效率E(n)：

，

确定靶核酸序列的数目N(n)：

，

确定自发未猝灭的荧光指示体的数目N_suq(n)：

，

确定未猝灭的荧光指示体的数目N_uq(n)：

，

确定猝灭的荧光指示体的数目N_q(n)：

，

确定荧光强度I(n)：

。

评估n>n_max；是=>计算拟合误差并以N₀、α、E₀、ε、γ的下一组参数值继续进行；否=>设置n=n+1。

评估N_P>N(n-1)；是=>以步骤(a)继续进行；否=>设置E(n)=0且以步骤(b)继续进行。

拟合误差fit_err被计算为拟合函数IF(n)和扩增曲线之间差异的度量。可以通过本领域已知的任何方法来计算fit_err。例如，拟合误差fit_err可以计算为：

fit_err(N₀_k1, α_k2, E₀_k3, ε_k4, γ_k5)=，

其中AC(n)是在循环n扩增曲线的信号强度值。

使用参数N₀、α、E₀、ε、γ的不同组值重复该过程直至参数空间被充分覆盖。可以应用本领域已知的选择参数值的任何方法从而有效获得参数空间的充分覆盖。在优选的实施例中，计算初始阶段期间定义的参数值的所有组合。

然后，选择对于特定扩增曲线产生最小拟合误差的函数IF(n)作为最佳拟合，并确认对应的参数值N₀ ^#、α^#、E₀ ^#、ε^#、γ^#。

N₀ ^#代表所确定的靶核酸序列的绝对初始数目。N₀ ^#代表分析前存在于样品中的分子的实际数目，它可以表达为阿佛加德罗数的分数以获得物质量的表达。

参数α^#提供关于扩增过程的抑制的信息。

参数E₀ ^#产生关于扩增反应效率的信息，即，可以根据低值的E₀ ^#容易地确认具有低效率的PCR。

参数ε^#与扩增过程对于PCR引物耗尽的灵敏度相关。

参数γ^#产生关于用于执行扩增过程的容器的吸收特性的信息。

在另一个实施例中，本发明的方法可以用于以完全自动化的方式并具有极好的精确度和鲁棒性获得C_t值。根据该实施例的方法在下述情况下是有用的：外部限制限定了C_t值必须返回作为结果，代替靶核酸序列的绝对初始数目和/或其它参数。为了获得C_t值，根据该实施例，通过使用所述模型函数的最佳拟合以确定所述扩增曲线的C_t值，执行另外的步骤（d）。

可以通过本领域已知的任何方法使用模型函数的最佳拟合以确定扩增曲线的C_t值。在本发明优选的实施例中，通过使用二阶导数最大值方法从模型函数的最佳拟合获得C_t值。因此在本发明优选的实施例中，确定最佳拟合的二阶导数最大值并将其用作C_t值。

在本发明的环境中，可以将所获得或定义的循环数目(例如，C_t值)理解为整数循环数目或分数循环数目。取决于特定的环境，本领域技术人员清楚应当使用哪种类型的循环数目。在本发明优选的优选实施例中，将循环数目理解为整数循环数目。

本发明包括用于分析核酸序列的方法和装置。单一分析可涉及样品中单一种类的靶核酸序列或者样品中多于一种的靶核酸序列。在样品中多于一个靶核酸序列进行分析的情况下，被记录以监测每个靶核酸序列的扩增的信号必须是可分辨的信号，即，能够同时单独地记录的信号。得到这种信号的方法和装置是本领域公知的。例如展示出足够分离的吸收和发射光谱的某些荧光染料允许同时地并行记录它们的荧光信号。因此，本发明包括同时对样品中若干靶序列的多路分析。

本发明包括以自动化方式执行本发明方法的方法和装置，即，无需或具有最少的人机交互。在优选实施例中，本发明涉及执行本发明方法而无需人机交互的方法和装置。本发明使得本领域技术人员能够使用本领域可获得的仪器来执行本发明方法而无需或具有最少的人机交互。在优选的实施例中，本发明使得本领域技术人员能够使用本领域可获得的仪器来执行本发明方法而无需人机交互。

本发明包括在其上存储了用于实施本发明方法的指令的机器可读介质。

本发明进一步包括用于核酸样品分析的设备，该设备包括包含用于实施本发明方法的信息的机器可读存储器装置。

本发明还涉及核酸序列的相对定量的方法。根据本发明的核酸序列的相对定量是指在PCR反应开始前获得样品中相应靶核酸序列的量的比率的定量度量。

根据本发明，可以使用比较核酸标准来确定靶核酸序列的相对定量的参照值。根据本发明，可以使用样品中的一个或若干这种比较核酸序列。在PCR反应开始前样品中比较核酸序列的绝对量不必是已知的。细胞中看家基因的信使RNA（mRNA）可以例如用作比较核酸标准。为了通过PCR被扩增，通常通过本领域已知的技术事先将mRNA转录为DNA。

本发明还涉及核酸序列绝对定量的方法。根据本发明，一个或多个核酸序列的绝对定量是指在PCR反应开始和/或随后对其的分析前，获得样品中一个或多个核酸序列的量的绝对度量。随后的分析可以包括确定例如靶核酸序列的拷贝数目等。

实例：

实例1

为了检查本发明方法的可靠性，分析了具有已知浓度的DNA样品并将结果与所使用的DNA浓度比较。

在单独的瓶中在ABI 7099HT版本2.3实时PCR循环仪上通过40个PCR循环而扩增金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的DNA样品，该DNA样品包括从金黄色葡萄球菌ATCC-25923中克隆的体积为25μl且浓度为通过稀释获得的10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝每25μl的pCR2.1-TOPO中的，来自442 Sau3Al基因组片段的5’部分，256个碱基对的靶核酸序列。对于PCR反应，使用ABI的Taqman Universal PCR mastermix和Taqman探针FAM-Black Hole Quencher 1。记录了扩增曲线。

如下定义模型函数IF(n)，选择与对所记录信号有影响的物理量相关的参数作为靶核酸序列的绝对初始量N₀，以及参数E₀、α、ε和γ：

，

其中

，

并且其中

，

并且其中

，

并且其中

，

并且其中，

其中：

n=循环数目；

N(n)=在循环n的靶核酸分子的数目；

N₀=N(0)靶核酸序列的绝对初始数目；

N_uq(n)=在循环n未猝灭的荧光指示体的数目；

I_uq=未猝灭的荧光指示体的荧光强度参数；

N_q(n)=在循环n猝灭的荧光指示体的数目；

I_q=猝灭的荧光指示体的荧光强度参数；

γ=与用于执行扩增过程的容器的吸收特性相关的参数；

N_p=荧光指示探针的初始数目；

N_suq(n)=在循环n自发未猝灭的荧光指示体的数目；

β=自发未猝灭的荧光指示体的分数；

E(n)=循环n的扩增效率；

E₀=初始扩增效率；

α=与扩增过程的抑制相关的比例因子；

ε=与扩增过程对PCR引物耗尽的灵敏度相关的参数。

为了确定模型到扩增曲线的最佳拟合，执行以下操作：

首先为每个参数N₀、α、E₀、ε、γ定义参数空间并将参数空间分成若干步进，即，N₀：以步长10^0.5从10⁰至10¹⁰，α：以步长0.1从1至2，E₀：以步长0.1从0至1，ε：以步长0.05从0.1至0.5，γ被定义为0。

此外，以如下方式估计I_q、I_uq和β的值：对于扩增曲线的循环5至10执行线性回归，并且得到的拟合线的截距除以猝灭的磷光团数目Np被用作Iq的估计。N_p被计算为Np=N_{阿伏加德罗}*c_指示探针*V。使用η_QE=0.8将I_uq估计为I_uq=I_q/(1–η_QE)。β被估计为扩增曲线的循环5至10的线性回归的斜率。

定义为拟合区间上限的最大循环数目n_max被定义为扩增曲线低于其最大值的90%的最后循环。

随后为多个参数定义开始值。循环数目n被设为n=0。参数N₀、α、E₀、ε、γ被分配来自它们对应的参数空间的值。N_p定义为用于扩增过程的荧光指示探针的初始数目，Np=N_{阿伏加德罗}*c_指示探针*V。根据先前执行的估计来定义I_q、I_uq和β。N_suq(0)被设为N_suq(0)=0。N_uq(0)被设为N_uq(0)=0。N_q(0)被设为N_q(0)=N_p-N_uq(0)。I₀被设为

。

随后循环数目被设为n=1并执行下述迭代过程：

确定效率E(n)：

，

确定靶核酸序列的数目N(n)：

，

确定自发未猝灭的荧光指示体的数目N_suq(n)：

，

确定未猝灭的荧光指示体的数目N_uq(n)：

，

确定猝灭的荧光指示体的数目N_q(n)：

，

确定荧光强度I(n)：

。

拟合误差fit_err被计算为拟合函数IF(n)和扩增曲线之间差异的度量，被计算为

fit_err(N₀_k1, α_k2, E₀_k3, ε_k4, γ_k5)=

，

其中AC(n)是在循环n扩增曲线的信号强度值。

使用参数N₀、α、E₀、ε、γ的不同组值重复该过程直至初始阶段期间定义的参数值的所有组合均已被计算。

然后，对于特定扩增曲线产生最小拟合误差的函数IF(n)被选作最佳拟合，并确认对应的参数值N₀ ^#、α^#、E₀ ^#、ε^#、γ^#。

图3示出了与使用的靶DNA的实际量（B）比较的分析结果（A）。数据点收敛在皮尔逊(Pearson)系数R²=0.9629的线形图Y=1.027X上，指示分析结果与在PCR反应中最初使用的DNA量是紧密对应的。

实例2

由本发明的方法获得的某些参数可以用于评估扩增过程的质量。在以下实例中，通过本发明的方法获得的参数E₀相对于α的曲线图确认了具有不良扩增质量的样品，表明对于这些样品所获得的数据（例如初始靶核酸序列浓度）可能无法与组中其它样品的数据相比较。此外，这些参数可以用于在可靠的扩增曲线和没有发生扩增反应的曲线之间进行辨别。

使用TaqMan Universal master mix (2x)：Applied Biosystems (4304437)批次K15898 (01/31/10)以及金黄色葡萄球菌PCR引物和探针：1033-001 Sa_442_PR1129F23 10μM、1034-001 S.aur_442_R2 10μM和1035-001 S.aur_442_TQM2_FAM 10μM，在具有软件v1.1的Bio-Rad CFX实时PCR仪器上执行三十六个PCR反应。以如下方式制备样品：Topo1/金黄色葡萄球菌质粒DNA被稀释，以便获得0、10²、10⁴和10⁶个拷贝的样品(13个样品具有10⁶个拷贝，11个样品具有10⁴个拷贝，8个样品具有10²个拷贝且4个样品没有靶DNA(NTC))。

如在实例1中一样定义模型函数IF(n)和参数。为每个参数定义参数空间，即，N₀：以步长10^0.5从10⁰至10¹⁰，α：以步长0.2从1至3，E₀：以步长0.01从0至1，ε：以步长0.05从0.1至0.7，γ被定义为0。如实例1中所述来执行该方法的其余部分。

图4示出了相对于所获得的E₀的值(E)绘制的所得到的α值(A)。大部分数据点群聚在图的右侧上，即，显示E₀的高值。然而几个数据点较远地位于左侧上，即处于E₀的低水平。有趣的是，所有这些数据点对应于完全不包含靶DNA的样品。这暗示可以用E₀和α来确认应当进行进一步检查从而判定它们是否是测量假象的结果的数据点。

实例3

通过本发明的方法获得的某些参数可用于评估扩增过程的质量。在以下的实例中，通过本发明的方法获得的参数E₀相对于ε的曲线图确认了扩增反应具有不良扩增质量，暗示对于这些样品所获得的数据，例如初始核酸序列靶浓度，可能无法与其它样品的数据相比较。

在单独的瓶中在ABI 7099HT版本2.3实时PCR循环仪上通过40个PCR循环而扩增金黄色葡萄球菌的DNA样品，在该DNA样品中，靶核酸序列是来自从金黄色葡萄球菌ATCC-25923中克隆的体积为25μl且浓度为通过稀释获得的10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹个拷贝每25μl的pCR2.1-TOPO中的442 Sau3Al基因组片段的5’部分，256个碱基对。对于PCR反应，使用ABI的Taqman Universal PCR mastermix和Taqman探针FAM-Black Hole Quencher 1。记录了扩增曲线。

如实例1中所述来执行该实验的其余部分。

图5示出了相对于所获得的E₀的值绘制的所得到的ε的值。大部分数据点群聚在图的右上角内。然而几个数据点位于图的左下侧上。有趣的是，所有这些数据点对应于完全不包含靶DNA的样品。这暗示可以用E₀和ε来确认应当进行进一步检查以判定它们是否是测量假象的结果的数据点。

实例4

使用两个PCR样品执行PCR反应，一个添加有49%的渣滓，另一个没有添加渣滓，并且如先前实例所述获得扩增曲线。随后，如先前实例所述获得模型函数IF(n)的最佳拟合以及对应的拟合参数。

图6A和6B示出了每个扩增反应的循环进程上获得的扩增曲线（C）、模型函数的最佳拟合（A）以及扩增效率（B）的曲线图。对于没有渣滓的样品（图6A）和有渣滓的样品（图6B）所确定的扩增效率的曲线图比较示出了渣滓的存在对于扩增反应的效率具有显著且不利的影响。图6A中的扩增效率在1.0开始，而图6B中的扩增效率在0.51开始。因此，由本发明的方法确定的扩增效率的曲线图是揭露这种显著且不利影响的有用工具。