CN105389479A - 用于分析核酸扩增反应的分析方法和系统 - Google Patents
用于分析核酸扩增反应的分析方法和系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以在较宽范围的分析物浓度里改善通过实时核酸扩增反应RNR(诸如聚合酶链式反应PCR)量化的线性(精确性和/或准确性)和/或限制存在干扰性物质的效应为目的的分析方法，其通过以与增长曲线与包含至少两个不同阈值水平的在RNR循环范围里的组合阈值函数(CTF)的交叉对应的循环数目测定RNR的量化循环数目(Cq)进行，所述量化循环数目(Cq)指示增长曲线的定量和/或定性分析结果，所述增长曲线指示RNR循环范围里对于RNR的每个扩增反应循环，分析物的荧光发射强度。
Description
发明领域
本发明涉及用于实时核酸扩增反应RNR(诸如聚合酶链式反应PCR)的分析方法和用于分析分析物的核酸扩增反应(诸如用于通过核酸扩增反应在样品中检测分析物的存在和/或测量分析物的量)的系统。
发明背景
体外核酸扩增技术包括许多基于不同办法的方法。一种办法包括倍增DNA或RNA序列，如此使得它对于各种规程或测试可更容易检出的方法。例如，可以使用下列一种方法完成核酸的体外扩增：聚合酶链式反应PCR、连接酶链式反应(LCR)、或等温转录介导的扩增(TMA)方法。在所有上文提及的办法中，核酸经受重复扩增循环。
一种经常用于各种医学、生物学或工业应用的技术是PCR技术。此技术依赖于热循环，包括用于核酸的酶促复制的重复加热和冷却的循环以扩增核酸链的特定区域。随着PCR进展，生成的DNA自身用作复制的模板，从而启动链式反应，其中DNA模板被指数扩增，随每个反应循环加倍(至少在理论上)。
核酸扩增技术包括许多变型。这些变型之一称作实时核酸RNR，并且基于扩增样品中的核酸并同时检测其存在以及另外为了量化其在样品中的浓度。
定量核酸扩增中有几种已知的用于检测产物的方法。根据这些方法之一，为了间接测量RNR期间的核酸量，获得分析物的荧光发射强度，并且创建增长曲线(growthcurve)，所述增长曲线指示RNR循环范围里的荧光发射强度。使用高于最初固定基线(initiallystationarybaseline)的增长曲线信号增加来测定每个反应中的量化循环Cq(quantificationcycleCq)。
使用各种CT法基于增长曲线测定量化循环Cq是多项发明申请的主题：
EP2719770A1披露了一种通过PCR及相应的分析仪在样品中检测分析物的存在和/或测量分析物的数量(quantity)的方法。特别地，披露了考虑信号的最大增长数值的增长曲线信号标准化。
US7788039B2披露了一种用于测定样品中的靶核酸量的方法。使用初始量的标准品、靶物和标准品增长曲线数值根据校准等式计算靶物的初始量，其中校准等式是非线性等式。
EP1798652B1披露了一种用于从测量数据创建增长信号的数学算法。
EP1798542A1显示了一种用于测定样品中的核酸存在的方法，其中根据增长信号选择数字值，并且通过比较选择的数字值与校准的数字值测定核酸的存在。
“Analyzingreal-timePCRdatabythecomparativeCTmethod”,ThomasDSchmittgen等,NatureProtocols3,-1101-1108(2008)提供了用于定量基因表达研究的比较CT法的概述。
核酸扩增系统是从各个厂家商业上可购得的，其基于各种核酸扩增法并且用于医学应用，诸如检测传染病。因此，核酸扩增法的可靠性和精确性是最有意义的。
因此，本发明的实施方案旨在提供使用核酸扩增和相应系统的改善的分析方法，其实现核酸扩增分析的改善的稳健性(robustness)、精确性、准确性、线性和定性辨别力(discrimination)。
发明概述
根据本发明的实施方案，提供了用于实时聚合酶链式反应的分析方法，用于在样品中检测分析物的存在和/或测量分析物的量，如权利要求1中要求保护的。此外，根据权利要求13，提供了用于分析分析物的核酸扩增反应的系统。在从属权利要求中给出本发明的别的实施方案。
本发明的实施方案涉及用于实时核酸扩增RNR的分析方法，其使用RNR循环范围(RNRcyclerange)里的组合阈值函数(combinedthresholdfunction)CTF进行，所述CTF包含至少两个不同阈值水平(thresholdlevel)。基于至少两个不同阈值水平通过计算获得CTF。
可以在获得荧光发射的强度及创建增长曲线之前或之后实施计算。例如，实施计算一次，并且在电子存储器(electronicmemory)中存储所得的CTF，从而在需要它来测定RNR的量化循环数目(quantificationcyclenumber)Cq时读出CTF。或者，在测定量化循环数目前，在获得荧光发射的强度后和/或创建增长曲线后计算CTF。
本发明的实施方案是特别有利的，因为将至少两个不同阈值水平组合成CTF实现在较宽范围的分析物浓度里RNR精确性的改善和/或限制存在干扰性物质的效应。
此外，本发明的实施方案是特别有利的，因为弱分析物浓度的假阴性和高分析物浓度的错误Cq值的发生得到阻止，如此提高RNR分析的可靠工作范围。
根据本发明的实施方案，至少一个CT阈值水平是RNR循环范围里的恒定值(constantvalue)。可以通过相对截取增加(relativeinterceptincrease)(RII法)、部分增长阈值(partialgrowththreshold)(PGT法)、高于基线的增长曲线标准偏差的倍数(multipleofstandarddeviationofthegrowthcurveabovethebaseline)、手动设置的阈值(manuallysetthreshold)或常数函数(constantfunction)给出恒定值。
根据本发明的实施方案，通过组合RNR循环范围里的阈值水平(诸如通过叠加(superposition)、线性或非线性组合)从至少两个不同阈值水平获得CTF。或者/另外，通过将RNR循环范围分成RNR循环间区cycleinterval)，并且使用至少两个不同阈值水平每间区计算分开的CTF每间区(calculatingaseparateCTFperintervalusingatleasttwodifferentthresholdlevelsperinterval)获得CTF，其中至少两个不同阈值水平可以在间区间变化。
根据本发明的实施方案，CTF是整个RNR循环范围里的两个阈值水平的组合(诸如线性组合)。阈值水平之一将主要贡献递送给在RNR早期反应循环(诸如对于低于10、15或20的循环数目)的CTF，而阈值水平之一将主要贡献递送给在RNR后期反应循环(诸如对于大于30、40或50的循环数目)的CTF(OneofthethresholdlevelsdeliversadominantcontributiontotheCTFatearlyreactioncyclesoftheRNR,suchasforcyclenumbersbelow10,15or20,whereasoneofthethresholdlevelsdeliversadominantcontributiontotheCTFatlatereactioncyclesoftheRNR,suchasforcyclenumbersgreaterthan30,40or50)。根据本发明的实施方案，CTF在RNR循环范围里从初始阈值水平转变为最终阈值水平。换言之，初始阈值水平对CTF的贡献对于RNR早期反应循环(对于循环数目0或1)可以是主要的，并且最终阈值水平对CTF的贡献可以实质上低于RNR早期反应循环(诸如对于循环数目0或1)的初始阈值水平(诸如0)的贡献。类似地，RNR后期反应循环的最终阈值水平对CTF的贡献可以实质上高于初始阈值水平的贡献。CTF在RNR循环范围里从初始阈值水平至最终阈值水平的转变可以是一步或多步转变(stepormulti-steptransition)、线性转变(lineartransition)、多项式转变(polynomialtransition)、指数转变(exponentialtransition)或其组合。
根据本发明的实施方案，初始阈值水平自身包含至少两个不同阈值水平的第一组合A。或者/另外，最终阈值水平自身包含至少两个不同阈值水平的第二组合B，其中组合成初始阈值水平的阈值水平可以是与组合成最终阈值水平的阈值水平相同或不同的阈值水平。
根据本发明的实施方案，初始和最终阈值水平之一不是阈值水平的组合而是单一阈值水平。
根据本发明的实施方案，初始阈值水平包含适合于精确测定强增长曲线(即对高分析物浓度和/或低浓度干扰性物质获得的增长曲线)的量化循环数目的至少一个阈值水平。
另一方面，最终阈值水平包含适合于精确测定后期增长(即，低分析物浓度和/或高浓度的干扰性物质)的量化循环数目的至少一个阈值水平。由于CTF在RNR循环范围里从初始阈值水平至最终阈值水平的转变，对于早期和后期信号增加都实现量化循环数目的精确测定。
根据本发明的实施方案，初始阈值水平具有起始点，所述起始点具有的y-坐标低于最终阈值水平的终点的y-坐标，产生具有正斜率的增加组合阈值函数或者初始阈值水平具有起始点，所述起始点具有的y-坐标高于最终阈值水平的终点的y-坐标，产生具有降低的组合阈值函数，即在RNR循环范围里具有负斜率的组合阈值函数(theinitialthresholdlevelhasastartingpointwithay-coordinatebeloway-coordinateofanendpointofthefinalthresholdlevelresultinginanincreasingcombinedthresholdfunctionwithapositiveslopeortheinitialthresholdlevelhasastartingpointwithay-coordinateaboveay-coordinateofanendpointofthefinalthresholdlevelresultinginadecreasingcombinedthresholdfunction,i.e.inacombinedthresholdfunctionthathasanegativeslopeovertheRNRcyclerange)。
根据本发明的实施方案，使用起始点的y-坐标和终点的y-坐标通过两个y-坐标之间的线性、多项式、指数、对数或其它转变计算组合阈值函数。例如，将两个y-坐标在电子存储器中存储，并且从电子存储器读取，从而依靠两个y-坐标间的线性插值(interpolation)计算组合阈值函数。
根据本发明的实施方案，CTF是RNR循环范围里的一个常数(constant)。例如，每个阈值水平提供一个常数，并且组合阈值函数以两个常数的线性组合(诸如两个常数的平均值或加权平均值)计算。例如，阈值水平之一适合于精确测定早期信号增加的量化循环数目，而两个阈值水平中的另一个可以适合于精确测定后期信号增加的量化循环数目，因此适合于RNR后期反应循环的CT测定。
根据本发明的另一个方面，提供了用于分析分析物的核酸扩增反应的系统，所述系统包含：检测系统，其配置为对RNR的每个扩增反应循环获得分析物的荧光发射强度，和处理单元，其配置为：创建增长曲线，所述增长曲线指示RNR的反应循环范围里的荧光发射强度，提供包含至少两个不同阈值水平的组合阈值函数CTF；并测定RNR的量化循环数目Cq，所述量化循环数目Cq指示增长曲线的定量和/或定性分析结果为与所述增长曲线与组合阈值函数的交叉对应的循环数目(thesystemcomprising:adetectionsystemconfiguredtoacquiretheintensityoffluorescenceemissionoftheanalyteforeachamplificationreactioncycleoftheRNRandaprocessingunitconfiguredto:createagrowthcurveindicativeoftheintensityofthefluorescentemissionoverarangeofreactioncyclesoftheRNR,provideacombinedthresholdfunctionCTFcomprisingatleasttwodifferentthresholdlevels；anddetermineaquantificationcyclenumberCqoftheRNR,thequantificationcyclenumberCqbeingindicativeofaquantitativeand/orqualitativeanalysisresultofthegrowthcurveasthecyclenumbercorrespondingtoanintersectionofthegrowthcurvewiththecombinedthresholdfunction)。
根据本发明的实施方案，处理单元提供组合阈值函数，其通过读取描述组合阈值函数的来自系统的电子存储器的数据，并使用此数据和/或增长曲线计算组合阈值函数(CTF)。例如，电子存储器中存储的数据指示初始阈值水平的起始点和最终阈值水平的终点的y-坐标，并且依靠RNR循环范围里的y-坐标间的插值实施通过处理器的组合阈值函数计算。
本发明的实施方案可以是特别有利的，因为分析的准确性和精确性可以在较宽的分析物浓度范围里升高和/或针对干扰物的稳健性升高(astheaccuracyandprecisionoftheanalysismaybeincreasedoverawideconcentrationrangeoftheanalyteand/orrobustnessagainstinterferences)。
附图简述
在下文中，会参照附图仅举例而言更为详细地描述本发明的实施方案，其中：
图1是一幅框图，其显示了用于分析样品(诸如生物学样品)的RNA分析仪的示意图，
图2示意性显示对于每个RNR循环的分析物的RNR增长曲线，
图3A示意性显示两个不同RNR增长曲线、两个阈值水平和所得的CTF，
图3B示意性显示两个不同RNR增长曲线、两个阈值水平和所得的CTF，
图4显示了图3的增长曲线的备选CTF，
图5显示了由分析仪显示的具有负斜率的CTF(negativelyslopedCTF)的窗，
图6显示了由分析仪显示的具有负斜率的CTF的窗，所述CTF从作为初始阈值水平的RII转变至作为最终阈值水平的PGT。
图7显示了由分析仪显示的具有正斜率的CTF(positivelyslopedCTF)的窗，
图8显示了初始和最终阈值水平之间的线性、二次项(quadratic)和指数转变的例子，
图9显示了稀释系列的各种增长曲线，
图10显示了使用已知的阈值水平和发明性CTF获得的各种Cq值的比较，
图11显示了作为已知阈值水平和发明性CTF的浓度函数的Cq值的各种校准曲线(calibrationcurve)，
图12显示了干扰物的增长曲线，
图13显示了干扰物的阈值，及
图14显示了作为干扰物增长曲线的函数的Cq值。
发明详述
贯穿本发明实施方案的以下详细描述，以相同的参考数字指明相同或类似的要素。
术语“基线”指增长曲线中不显示信号增加的初始部分。
如本文中理解的，术语“截取”或“截取值”指在早期循环数目(即通过外推法(extrapolation)获得的0)时增长曲线的信号偏移值(signaloffsetvalue)。
术语“饱和线(saturationline)”指在指数增长阶段(其又称为指数扩增阶段)后且在平整阶段(levelingoffstage)后稳定区(plateauregion)中的增长曲线部分。
如本文中使用的，术语“阈值水平”涵盖增长曲线的阈值水平。
如本文中理解的，“组合阈值函数”或“CTF”涵盖由至少两个不同阈值水平构成的循环范围里的数学函数。根据一个实施方案，CTF可以是两个不同阈值水平的线性或对数组合。
在一个实施方案中，对于给定X-值(即循环数目)由CTF返回的Y-值(即阈值水平)可以从两个不同阈值水平之一转变成另一个。
根据一个实施方案，CTF可以从至少两个不同阈值水平的第一组合(例如线性或对数)转变成至少两个不同阈值水平的第二组合(例如线性或对数)。
如本文中理解的，术语“实时核酸扩增RNR循环范围”指为了获得强度数值以创建增长曲线而执行的循环数目的范围。例如，RNR循环范围可以是预先确定的固定数目，诸如30、40或50。设置RNR循环范围是用于分析核酸扩增反应的分析系统的通量(throughput)和用于测定弱信号的量化循环数目的分析系统的灵敏性之间的折衷(tradeoff)。
根据本发明的实施方案，以相对截取增加RII执行阈值法。例如，RII是高于基线的平行线(parallel)。
根据本发明的实施方案，RII可以具有以下形式：
y(x)＝B+r·I(1)
B：基线函数，通常为线性
I：截取外推至循环数目0
r：正百分比参数，例如50％。
根据本发明的实施方案，可以以部分增长阈值PGT执行阈值法，所述部分增长阈值PGT依赖于饱和线和基线之间的增长曲线信号差异，即从基线至饱和线的增长。PGT可以返回(return)整个循环数目范围里的恒定Y-值。
根据本发明的实施方案，PGT可以具有以下形式：
y(x)＝B+p·G＝B+p·(S-B)(2)
B：基线函数
S：饱和线
G：从基线增长至饱和线
p：优选介于0％和100％之间的参数，例如5％。
根据本发明的实施方案，阈值法通过高于基线的增长曲线标准偏差给出，并且可以具有以下形式：
y(x)＝B+f·D(3)
B：基线函数
f：相乘因子参数(Multiplyingfactorparameter)，例如10
D：增长曲线的标准偏差
根据本发明的实施方案，通过由用户预先设置或手动输入的阈值数值给出阈值法。
根据本发明的实施方案，阈值法是一个在RNR循环范围里恒定的常数数值，例如：
y(x)＝C(4)
C：基于经验数据的预先限定的常数。
根据本发明的实施方案，从至少两个不同阈值水平之一(即初始阈值水平)至至少两个不同阈值水平的另一个(即最终阈值水平)的转变是通过一步或多步、线性、多项式和/或指数转变的，如图8中显示的。
例如，具有从初始阈值水平y1至最终阈值水平y2的线性转变的CTF可以具有以下形式：
其中：
x1：早期反应循环数目，诸如0或1；
x2：后期反应循环数目，诸如30、40或50；
y1：初始阈值水平；
y2：最终阈值水平。
根据本发明的实施方案，CTF可以具有用于执行多项式转变的下述形式：
其中：
p：固定多项式阶(Fixedpolynomialorder)，诸如2(对于二次多项式函数(quadraticpolynomialfunction))。
根据本发明的实施方案，CTF可以具有用于执行指数转变的下述形式：
图1显示了用于以实时扩增并同时量化分析物的RNR系统100的示意图。使用RNR法，在扩增过程期间创建并检测信号。一般地，信号代表扩增期间创建并且如此存在于样品中的任何分析物的量。样品是可以含有分析物和/或扩增反应的其它产物的液体。RNR系统包含热循环仪部件(thermalcyclerblock)120、激发光源110、用于以实时收集RNR信号的检测仪系统130、和数据处理系统140、和用于显示信号并且输出分析结果的单元170，所述数据处理系统140包含处理单元和用于存储RNR信号的存储器150和用于分析RNR信号的程序指令(programinstructions)160。
将分析物与荧光染料缀合，并且将样品加载到热循环仪部件120中。热循环仪部件120可以是常规设计样品部件，其包含96个孔，并且能够容纳多达96样品。用激发光源110照明样品，并且通过RNR检测仪系统130对每个RNR循环数目测量原始荧光数据。RNR检测仪130适合于收集由一种或多种荧光染料发射的RNR荧光信号。在数据处理系统存储器单元150中收集测量的数据，并且该测量的数据可以在显示单元(displayunit)170上以未标准化的(un-normalized)RNR增长曲线，或备选以标准化的RNR增长曲线显示。
图2显示了代表对每个RNR循环采集的RNR信号的增长曲线200的示意性例子。该图包括笛卡尔(Cartesian)坐标系统，其中横坐标以x-轴指明，并且纵座标以y-轴指明，且其中x是RNR的循环数目，并且y是荧光发射的强度。
图2还以点线显示了荧光强度数值205，其中已经通过对进行中的扩增反应实施荧光发射强度测量获得了每个强度数值205。使用数学增长曲线模型公式或另一种插值和/或插值对强度数值205建模(Theintensityvalues205aremodeledusingamathematicalgrowthcurvemodelformulaoranotherkindofinterpolationand/orinterpolation)。RNR信号在图2中以增长曲线200显示。在这里，截取数值210是当RNR循环数目是0时的RNR信号偏移数值。
基线240是RNR反应的初始循环期间的RNR信号(通常在循环1和15之间测量)，其中没有可检出的由RNR反应产物所致的荧光升高。基线240是基线函数B(参见等式1至3)。使用预先限定的阈值220来测定RNR信号超出RNR反应的基线240的循环数目，即存在有第一次可检出的显著荧光升高的循环，其在本文是约cq＝22。通过CTF给出阈值220(参见等式5至7)。
最大增长数值250是在平台区230的RNR信号的最大强度和基线240的RNR信号之间的差异。平台阶段230是RNR反应的最终循环期间的RNR信号。
在平台区230的RNR信号的强度是S，并且最大增长数值250是在上述等式2中的增长G。
图3A显示了具有增长曲线200.1和以虚线显示的另一个增长曲线200.2的图示的图。该图包括笛卡尔坐标系统，其中横坐标以x-轴指明，并且纵座标以与图2中显示的图类似的y-轴指明，其中x是RNR的循环数目，并且y是荧光发射的强度。
该图显示了第一阈值水平y1和第二阈值水平y2。
阈值y1可以通过输入(entering)起始点T1(x1,y1)限定；同样地，阈值水平y2可以通过输入终点T2(x2,y2)限定。
在本文考虑的实施方案中，决定阈值水平y1的起始点T1的y-坐标大于终点T2的y2的相应坐标，从而y1高于另一个阈值水平y2，如图3A中显示的。
增长曲线200.1源自RNR动态范围(dynamicrange)的上端(upperend)的样品浓度，而增长曲线200.2的样品浓度在动态范围的下端(lowerend)。因此，增长曲线200.1的指数阶段在低得多的循环数目范围中发生，增长曲线200.2就是如此，如图3A中显示的(theexponentialphaseofthegrowthcurve200.1occursinamuchlowercyclenumberrangethatisthecaseforthegrowthcurve200.2asillustratedinFig.3A)。
仅仅应用阈值水平y1来测定增长曲线200.1和200.2的cq会导致仅对于增长曲线200.1检出cq，但是会不能检出增长曲线200.2的cq值(或者导致非常晚的检出)，因为后者太弱以至于在RNR循环范围内的其指数阶段和/或平台区中不能达到强度y1。
另一方面，仅使用阈值水平y2会导致增长曲线200.2的cq值的检测，但是就增长曲线200.1的cq值的检测而言会是不可靠的，因为y2接近基线，使得变化会导致增长曲线200.1的不精确Cq检测。
此情况通过组合阈值水平y1和y2(这提供组合阈值函数CTF(x))来补救。在本文考虑的例子中，CTF符合上述等式5，使得CTF具有x-坐标范围x1至x2里从y1至y2的线性转变，如图3A中显示的。这具有有益的效果，即CTF与增长曲线200.1和200.2两者在其相应的指数增长阶段内相交，导致相应量化循环数目cq1和cq2的可靠且精确检测。
因此，通过组合阈值水平y1和y2计算组合阈值函数CTF(x)。在本文考虑的实施方案中，这是一种提供沿着x-轴从T1至T2的线性转变的线性组合。在本文考虑的实施方案中，RNR循环范围可以设置为等于x-坐标范围x1至x2，因为高于循环x2的额外RNR循环不会对量化循环数目测定提供显著贡献，而是仅仅降低系统通量。
可以通过RNR系统100(参见图1)实施CTF的计算。例如，在存储器150中存储点T1至T2的坐标。通过执行程序指令160，从存储器150读取T1至T2，并且计算组合阈值函数CTF，诸如根据等式5、6或7。或者，依靠描述CTF(诸如以表格形式)的数据在存储器150中存储组合阈值函数CTF。
在图3A中例示的例子中，CTF从初始阈值水平y1转变成最终阈值水平y2。在本文考虑的例子中，转变是线性的，并且导致负斜率的CTF，由此初始阈值水平y1提供循环数目x1＝0时的初始起始点T1，并且最终阈值水平y2提供循环数目x2时CTF的终点T2。
图3B显示了水平y1和y2的备选选择。在本文考虑的例子中，仅使用阈值水平y1不会导致假阴性，图3例子就会如此。然而，增长曲线200.2与CTF阈值水平y1的交叉点仅在后期循环数目Cq2，即在x＝48而非x＝40(即比Cq1晚大约log2106＝19.93≌20个循环，其对应于第一与第二分析物浓度之间比率106)。这是不利的，因为不得不为了定性结果而执行相对大量的循环，从而降低分析系统的通量。另一个缺点是CT阈值水平y1和增长曲线200.2之间的交叉点可以在增长曲线200.2的指数增长阶段后出现，其中RNR方法在其平整阶段中(即核酸的量在每个循环时不再加倍)，导致假Cq值。此情况通过使用源自y1和y2的组合的CTF改善，因为增长曲线200.2的交叉点及因此Cq移向x＝40。
或者，CTF(x)可以符合上述等式6或7或者它可以是另一种单调或阶梯函数(monotonousorstep-function)。
根据本发明的实施方案，阈值水平y1符合等式2，如此考虑到平台阶段中饱和线的信号水平S，而阈值水平y2符合等式1，其考虑到截取数值I而非S。
图4显示了依靠线性组合来组合阈值y1和y2的备选实施方案，所述线性组合诸如
CTF(x)＝0.5y1+0.5y2，其是一个常量，并且如此在此情况中没有CTF转变，其中阈值水平y1对于RNR早期反应循环是适当的(adequate)，而阈值水平y2对于RNR后期反应循环是适当的，它们的组合导致在较宽的循环范围里适当的CTF。例如，y1和y2的适当选择是选择y1和y2，使得y1>y2，如图4中例示的。
图4中显示了所得的CTF以及定量(quantitation)循环数目Cq，如此其对于增长曲线200.1和200.2被检出。
图5显示了作为在显示器170(参见图1)上具有CTF的输出的窗，所述CTF具有与图3的实施方案类似的用于检测cq1和cq2的负斜率(negativeslope)。
图6显示了与图3A和图3B的实施方案类似的别的实施方案，其中初始阈值水平y1(其是根据上述等式1的RII)根据上述等式5线性转变成最终阈值水平y2(其是根据上述等式2的PGT)。
图7显示了CTF具有正斜率(positiveslope)的实施方案。
图8显示了对于分别根据等式5、6和7的线性、二次项(p＝2)和指数转变，阈值y1和y2对CTF的贡献的转变。
图9显示了稀释系列的增长曲线200.1至200.7，其中对最高分析物浓度获得增长曲线200.1，并且对于降低的分析物浓度获得连续增长曲线200.2、200.3等，其中分析物浓度从一个增长曲线到下一个降低了一个数量级，这例示了分析仪(参见图1的RNR系统100)的动态范围。
图10显示了对于三种情况从增长曲线200.1至200.7获得的cq-值：
i.曲线300显示了在根据等式1在r＝50％的情况下使用单独的RII时获得的cq值。
ii.曲线302显示了在根据等式2在p＝0.1的情况下使用单独的PGT时获得的cq值。
iii.曲线304在使用下述CTF时获得，所述CTF组合这些RII和PGT(例如根据等式5、6或7)，从而对稀释系列产生大致等距离的cq值。
如可以在图10中观察到的，使用具有固定阈值高度(例如RII0.5)的标准CT法由于不太急剧的增加(lesssteepincrease)而导致低浓度曲线的相对Cq延迟。另一方面，使用增长相关CT法(如PGT)可以过度补偿通过早期检测Cq值得到的不太显著增长的效果。
在上述情况iii.中获得的等距离的Cq值反映了与作为结果的增长曲线200.1至200.7对应的相应分析物的恒定相对浓度(即对于连续曲线为一个数量级)，这是由于如下实情所致，即CTF与相应增长曲线的交叉点总是在指数增长阶段内，不管在极宽的浓度范围里分析物的稀释程度如何。这继而暗示了Cq测定的精确性由于如下的实情而与上述情况i.和ii.相比实质上增加：增长曲线在指数增长阶段里具有最低的噪音量，并且如此产生最准确的结果。
图11显示了在单独使用RII或PGT时以及对于组合CTF曲线的图10数据的校准曲线，所述组合CTF曲线提供几乎完美的线性校准曲线，如从图11看明显的。若使用单一阈值法(诸如单独的RII或PGT)，则校准曲线与按对数标度将Cq值与样品的初始分析物浓度关联的理论线性法则有显著的偏差，如从图11看明显的。
图12显示了对于相同浓度的分析物但不同浓度的影响RNR反应的干扰物质的三种增长曲线200.1、200.2和200.3。
图13显示了若使用平阈值法(flatthresholdmethod)RII且在使用具有负斜率的CTF(诸如根据等式5、6或7)时对图12的增长曲线200.1至200.3获得的所得cq值。
如从图13看明显的，若使用单独的阈值法RII，则对三种增长曲线200.1、200.2和200.3获得的Cq值在30和32之间变化，导致相应的大误差。比较而言，如也在图13中显示的，使用负斜率的CTF对这些曲线获得的Cq值对所有三个曲线产生几乎相同的Cq值，如此大大改善精确性，即使样品中存在各个浓度的干扰物质。这也显示于图14，其以干扰物浓度的函数显示了相同样品浓度的cq值。
参考数字列表
100RNR系统
110激发源
120热循环仪部件
130检测系统
140数据处理系统
145处理单元
150存储器
160程序指令(programinstruction)
170显示器
200增长曲线
205强度值
210截取值
220阈值
230平台区
240基线
250最大增长曲线
300曲线
302曲线
304曲线
Claims (16)
1.一种用于实时核酸扩增反应RNR的分析方法，该方法包括：
-对所述RNR的每个扩增反应循环获得分析物的荧光发射强度；
-创建增长曲线(200)，所述增长曲线(200)指示RNR循环范围里的荧光发射强度，
-计算所述RNR循环范围里的组合阈值函数(CTF)，所述组合阈值函数(CTF)包含至少两个不同阈值水平；
-测定所述RNR的量化循环数目(Cq)，所述量化循环数目(Cq)指示增长曲线(200)的定量和/或定性分析结果为与所述增长曲线(200)与所述组合阈值函数(CTF)的交叉对应的循环数目。
2.根据权利要求1的分析方法，其中基于下述一个或多个阈值方法，所述组合阈值函数(CTF)包含两个或更多个不同阈值水平：
-高于基线RII的相对截取增加；
-高于基线阈值PGT的部分增长；
-高于基线的标准偏差的倍数；
-手动设置的阈值水平；
-恒定的阈值水平。
3.根据权利要求1或2的分析方法，其中所述组合阈值函数(CTF)依赖于所述RNR的循环数目，所述组合阈值函数(CTF)从初始阈值水平(y1)转变成最终阈值水平(y2)，所述初始阈值水平(y1)不同于所述最终阈值水平(y2)。
4.根据权利要求3的分析方法，其中所述组合阈值函数(CTF)从所述初始阈值水平(y1)至所述最终阈值水平(y2)的转变是：
-线性转变；
-多项式转变；
-指数转变；
-一步或多步转变；
或其组合。
5.根据权利要求3或4的分析方法，其中：
-所述初始阈值水平(y1)包含至少两个不同阈值水平的第一组合(A)；和/或
-所述最终阈值水平(y2)包含至少两个不同阈值水平的第二组合(B)。
6.根据权利要求5的分析方法，其中所述第一组合(A)是与至少两个不同阈值水平的第二组合(B)不同的至少两个不同阈值水平的组合。
7.根据权利要求3至6中一项的分析方法，其中：
-所述初始阈值水平(y1)包含至少一个对于所述RNR的早期反应循环适当的方法；和/或
-所述最终阈值水平(y2)包含至少一个对于所述RNR的后期反应循环适当的方法。
8.根据权利要求3至7中一项的分析方法，其中：
-所述初始阈值水平(y1)具有起始点(T1)，所述起始点(T1)具有的y-坐标低于所述最终阈值水平(y2)的终点(T2)的y-坐标，产生增加的组合阈值函数(CTF)；或
-所述初始阈值水平(y1)具有起始点(T1)，所述起始点(T1)具有的y-坐标高于所述最终阈值水平(y2)的终点(T2)的y-坐标，产生减少的组合阈值函数(CTF)。
9.根据权利要求3-8中一项的分析方法，其中所述初始阈值水平(y1)或所述最终阈值水平(y2)设置于0。
10.根据权利要求1或2的分析方法，其中所述至少两个不同阈值水平的组合在所述RNR循环范围里是恒定的，并且基于下述两个或更多个方法，所述CTF包含两个或更多个不同阈值水平：
-高于基线RII的相对截取增加；
-高于基线阈值PGT的部分增长；
-高于基线的标准偏差的倍数；
-手动设置的阈值水平；
-恒定的阈值水平。
11.根据权利要求10的分析方法，其中所述组合包含至少一个对于所述RNR的早期反应循环适当的阈值水平和至少一个对于所述RNR的后期反应循环适当的阈值水平。
12.根据权利要求5、6、10或11的分析方法，其中所述组合是：
-至少两个不同阈值水平的线性组合，诸如加法或减法；
-至少两个不同阈值水平的对数组合，
-或其组合。
13.根据前述权利要求中一项的分析方法，其中所述实时核酸扩增反应RNR是实时聚合酶链式反应PCR。
14.一种用于分析分析物的实时核酸扩增反应RNR的系统，所述系统包含：
-检测系统(130)，其配置为对所述RNR的每个扩增反应循环获得分析物的荧光发射强度；
-处理单元(145)，其配置为：
●创建增长曲线(200)，所述增长曲线(200)指示RNR的反应循环范围里的荧光发射强度；
●提供所述RNR循环范围里的组合阈值函数(CTF)，所述组合阈值函数(CTF)包含至少两个不同阈值水平；及
●测定所述RNR的量化循环数目(Cq)，所述量化循环数目(Cq)指示增长曲线(200)的定量和/或定性分析结果为与所述增长曲线(200)与所述组合阈值函数(CTF)的交叉对应的循环数目。
15.权利要求14的系统，其中由所述处理单元通过读取描述所述组合阈值函数(CTF)的来自所述系统的电子存储器的数据和/或指令和/或通过计算所述组合阈值函数(CTF)来提供所述组合阈值函数(CTF)。
16.根据权利要求14或15的系统，其中所述实时核酸扩增反应RNR是实时聚合酶链式反应PCR。
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