CN1769496A - 核酸扩增分析法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供核酸检测或分析方法,该方法能从含有二种或二种以上不同序列的起始靶核酸中分取与起始靶核酸的存在比成比例的靶核酸,并且该方法可信性高、具有重复性。本发明是关于从二种或二种以上各自具有一个或一个以上不同碱基的碱基序列的靶核酸试料中分取该靶核酸的一部分,并对分取的核酸试料进行检测或分析的方法,该方法包括以下工序:由起始靶核酸试料的核酸浓度计算出起始靶核酸试料的拷贝数的工序和由上述起始靶核酸试料中分取大于等于所规定数目的拷贝数的靶核酸的工序。
Description
技术领域
本发明涉及靶核酸中DNA含有的特定序列的扩增、检测、以及基因的多态性检测、单碱基多态分析等。
背景技术
作为分析基因多态的方法,包括Invader法(Lyamichev,et al:Science260:778-783(1993))、单链DNA构象多态性分析(SSCP法)。
Invader法是在二个不同等位基因上具有特异碱基序列的核酸片段上标记不同的荧光体,能够检测出与检查对象的等位基因完全一致的核酸片段的荧光标记的检测法。在第26届日本分子生物学会年会要点集p778 2PC-104中,成功实现了本方法中反应槽的微小化和分析反应的微量化,反应使用的基因组DNA的量为0.2纳克(约40拷贝)。
SSCP法是通过使扩增后的双链核酸片段发生变性而成为单链,再进行电泳,从而以一个碱基的差异作为高级结构的差异来进行分离、分析的方法。另外,使用SSCP法,能够测定含有基因多态的等位基因的量比、比较标准试料与检查对象的试料中的二个不同等位基因量比的测定结果、也能检测出染色体的缺失(LOH)。
另外,也可以使用单细胞提取系统(CLONIS/OL)(奥林巴斯公司)和LaserCapture Micro dissection(LCM)Systims(ビ-ェム仪器株式会社生产),分取微量的癌细胞,再对从该细胞中抽提的微量核酸的基因进行扩增和分析。
另外,在Slebos et al,Laboratory Investigation(2004)84,649-657中公开的以往技术表明,当分析微卫星多态的等位基因时,在分取核酸后,根据概率现象,分取的拷贝数越少,则抽取所致的离散越大,染色体增减的分析结果的重复性越低。在该以往技术中,作为解决方法,提出了使用能扩增低拷贝的核酸的实时-释放PCR,不用分取、分注微量核酸,而直接进行分析的方法。
发明内容
如果使用Slebos et al,Laboratory Investigation(2004)84,649-657公开的以往技术,确实有可能抑制分取、分注引起的重复性低下的诱因。但是,由于在此方法中不能抽取、分注,因而产生了如下问题:针对同样的待检体,难于对多个基因进行分析;不能使用相同检体进行再分析等。另外,本发明人通过实验和统计理论公式已经发现,不仅在微卫星多态的情况下,在所有从含有二种或二种以上不同核酸的溶液中抽取、分注,然后分析的情况下,这样的提取和分注造成的重复性下降都是会发生的问题。所以,本发明的课题是提供用于多个不同核酸的可信性高、具有重复性的核酸检测方法或核酸分析方法以及在这些方法中有用的计算机程序和装置。
针对上述问题,经过潜心研究,其结果是从统计学上证明了要解决上述课题,通过使从起始靶核酸试料中分取的靶核酸拷贝数大于等于统计学上确定的拷贝数,就可进行满足必要精度的分析,进而完成了本发明。即,本发明的基本组成是从含有二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料中分取一部分该靶核酸,再对抽取的靶核酸试料进行检测的方法,该方法包括以下工序:由起始靶核酸试料的核酸浓度计算出起始靶核酸试料的拷贝数的工序,和从上述起始靶核酸试料中分取大于等于规定数目的拷贝数的靶核酸的工序。
本发明的核酸检测或分析方法进一步提供包括,当从上述起始靶核酸试料中分取的靶核酸拷贝数超过所规定的数目时,稀释上述起始靶核酸试料,而当该拷贝数未达到所规定数目时,浓缩上述起始靶核酸试料的工序。上述核酸检测或分析方法还可以进一步包括在后面的工序中不使用提取的靶核酸拷贝数不能调整至所规定范围的核酸试料,或者是即便使用也不采用其结果,或在结果附加表示警告的标记或记号的工序。
本发明还提供在分取靶核酸后,下一步工序是进行核酸扩增反应或分析反应的核酸检测或分析方法。所述起始核酸试料是含有人基因组或植物基因组等基因组DNA时,本发明尤其有效。
本发明特别优选利用采用了二项分布的统计方法,由起始靶核酸的拷贝数确定应分取的的靶核酸拷贝数。但是,因为使用二项分布常常需要复杂而且庞大的准备和演算,所以实际中是使用近似二项分布的计算式确定拷贝数。关于此计算式在后面进行说明。
本发明是一种核酸检测或分析方法,该方法使用二种或二种以上针对一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位的特异性引物或二种或二种以上各自针对不同的碱基序列部位的特异性引物,同时扩增二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料,并分析该靶核酸中靶基因部位的扩增核酸量的比率,其包括以下工序:
a)使用含有上述靶核酸的扩增反应液进行核酸扩增的工序,
b)由核酸扩增量或核酸扩增过程推测出扩增反应液中的靶核酸拷贝数和起始靶核酸拷贝数的工序,
c)利用采用了二项分布的统计方法或近似二项分布的公式,由推测的起始靶核酸拷贝数确定扩增反应液中必要的靶核酸拷贝数浓度的工序,
d)比较所确定的必要的拷贝数与所推测的扩增反应液中的靶核酸拷贝数的工序。
在上述方法中可以包括,分析上述靶核酸中靶基因部位的扩增核酸量的比率,比较作为标准试料进行分析的靶核酸和作为检查对象进行分析的靶核酸的存在比率,以预先设定的阈值为基础,判断峰比率的变化是否存在差别的工序。在上述方法中利用采用泊松分布(Poisson Distribution)的统计方法由起始靶核酸拷贝数确定扩增反应液中的靶核酸拷贝数。
在上述方法中可以使用单链DNA构象多态性分析(SSCP法)。另外,在二种或二种以上不同靶核酸上,分别标记二种不同荧光,可以使用二色荧光微阵列作为通过这些荧光的发光量的差分析靶核酸扩增量差异的方法。
利用上述方法,能从含有二种或二种以上不同序列的起始靶核酸试料中分取与起始靶核酸的存在比成比例的靶核酸。还能确定在为了准确检测出起始靶核酸试料中含有的微量核酸而进行的分析中使用的靶核酸的拷贝数。而且,对分析结果,通过求得统计学上的可信区间,能够以更高精度判定分析结果。
附图说明
图1是表示本发明核酸检测或分析法的主要部分的流程图。
图2是表示计算起始核酸拷贝数的方法的流程图。
图3是表示由靶核酸确定要提取的拷贝数的方法的流程图。
图4是表示起始核酸拷贝数的调整方法的流程图。
图5是表示本发明适用的核酸检测或分析装置的构成的概略图。
图6是表示本发明适用的核酸检测或分析装置的控制、解析部和其他结构的概略图。
其中,
1样品分注臂部、2臂可动部、3浓度测定部、4基因扩增部、5原液样品保持部、6调整试剂保持部、7分析用样品保持部、9检测部、10控制和解析部
具体实施方式
下面参照附图对上述以及其他的本发明的新型特征和效果进行说明。
首先,对本发明的概略进行说明。图1是本发明的具有代表性的实施方式。如图1的流程图所示,测定起始核酸浓度,由其结果计算出或推测出起始核酸拷贝数,确定应分取的核酸拷贝数。在确定要抽取的拷贝数后,若起始核酸试料中的拷贝数大于所规定的值,则进行稀释,若拷贝数小于所规定的值,则进行浓缩,以调整至利于抽取的浓度。从这样调整过的试料中只分取所规定的拷贝数。将其添加到反应液中,调配反应液,扩增反应有必要时,进行扩增反应,没有必要时,进行核酸检测反应。利用反应得到的试料进行核酸检测或分析。
图2是表示计算起始核酸试料中的核酸拷贝数的方法,求得试料中的双链核酸的长度(碱基数)、核酸浓度、核酸的总重量,按照图2所示的要领计算起始核酸的拷贝数。
另外,图3是例示确定每次分取的拷贝数的方法。(4)式、(5)式、(8)式、(9)式与在详细说明中所示的相同,用这些公式表示在拷贝数不足100,000的情况下与大于等于100,000的情况下的计算方法。追求较为严谨的计算时,利用使用二项分布(1)式的方法进行计算。下面说明的(2)式~(14)式在本说明书中被定义为近似二项分布的公式。只要是基本上利用二项分布的思想,就可以,如果必要,也可以对(1)式~(14)式进行改动、修正。
图4是表示当起始靶核酸的拷贝数与应提取的拷贝数的差为正或负或没有差别时,与之相应的试料的调整方法如何进行。如果起始核酸试料中的拷贝数与应抽取的靶核酸的拷贝数几乎相同,则可直接分取,并进行反应液的调配。起始核酸试料中的拷贝数比应分取的拷贝数小时,浓缩起始试料。起始核酸试料中的拷贝数比应抽取的拷贝数大时,稀释起始靶核酸试料。
图5是表示本发明中使用的核酸检测或分析装置的装置构成的线条图,在控制、解析部实施的是对浓度测定部、样品臂注入臂部、基因扩增部和检测部的控制,并具有其他样品和试剂保持部。图6表示本发明的核酸检测或分析装置的控制、解析部与其他部件的关系,利用控制、解析部接收浓度测定部测定的起始靶核酸的测定值,以测定值为基础确定要分取靶核酸的拷贝数,操作样品分注臂部分取确定值的靶核酸。后面的工序是对基因扩增部和检测部进行控制。存储器是能够利用计算机进行读取的媒体,记忆后述的程序,通过计算机对一系列的操作进行控制。操作者从输入部输入必要的指令、条件,在显示部显示操作结果和现状、警告等。以这些结果为基础,利用检测部检测核酸,并显示必要的信息。所以,本发明提供一种核酸检测或分析装置,其包括以下部分:样品分注装置,测定试料中核酸浓度的装置,输入输出装置,核酸检测部,存储程序的记忆装置,以及读取上述记忆装置的程序、并控制检测或分析装置的计算机,和至少显示演算结果的显示装置;在检测二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料时,上述程序使电子计算机作为a)输入用于由起始核酸浓度确定拷贝数的靶核酸的长度、或核酸的来源作为起始条件的措施、b)作为以测定的起始核酸浓度结果为基础,计算出起始靶核酸中的拷贝数的措施、c)由计算出的起始靶核酸拷贝数确定分析反应液中必要的靶核酸拷贝数的措施发挥作用。
本发明的方法是使用二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料同时进行扩增,并分析该靶核酸中靶基因部位的扩增核酸量的比率,得到与起始靶核酸相同量比的扩增核酸量,该方法由图1所示的以下步骤构成。
1)测定上述靶核酸的浓度,
2)确定起始靶核酸拷贝数,
3)使用统计理论公式确定从起始靶核酸分取并加入到扩增反应液中的靶核酸拷贝数,
4)为了使扩增上述靶核酸时的反应液中的上述靶核酸拷贝数达到所规定的值,稀释或浓缩起始靶核酸,调整核酸扩增反应液,
5)进行核酸扩增,
6)分析核酸,并在低拷贝数的试料中附加表示警告的标记或记号。
所谓本发明中的起始靶核酸试料是指从生物试料抽提的核酸或由包含从生物试料抽提的核酸的目的区间在内的一部分复制得到的核酸或人工合成的核酸。所谓生物试料是指所有生物细胞、正常组织、血液和尿中的细胞、也包含肿瘤组织自身。肿瘤组织也可以通过手术和活体检查等获得。
靶核酸的抽提方法,没有特别限定,可以使用以往公知的方法,例如酚-氯仿抽提法或QIAamp DNA Blood小型试剂盒(キァゲン公司生产)等。另外,也可以从尿中存在的细胞抽提核酸,也可以从由其他检查对象的组织获得的细胞和尿中的细胞抽提核酸。若是从检查对象采集组织,则只要是含有来源于从检查对象本人获得的细胞的核酸的组织,任何组织都可以,例如,即便使用用于病理学检查的标本样品的一部分也可以。若是从检查对象采集尿,则只要是含有来源于排泄于尿的本人的细胞的核酸的物质,任何物质都可以,通常利用上述各种方法能有效抽提来源于排泄于尿的经过新陈代谢的正常细胞和/或癌细胞的核酸。
作为测定核酸拷贝数的装置,具体可以举出吸光波长测定装置、荧光波长测定装置、紫外可见波长测定装置等,只要能测定核酸拷贝数,任何装置都可以,并不限定于上述装置。
作为扩增核酸的装置,在扩增方法使用聚合酶链反应(PCR)时,具体可以举出热循环仪,更具体的可以举出核酸扩增仪MJ Research(MJ Research公司生产),但只要能利用PCR法进行核酸扩增,任何装置都可以,并不限定于上述装置。在利用PCR法的核酸扩增仪时,对装满核酸扩增用试剂调整液的微小容器反复进行升温和冷却,扩增核酸。在使用恒温核酸扩增法时,具体可以举出加热器(thermoheater)、孵箱(incubator)等,但只要能进行核酸扩增,任何装置都可以,并不限定于上述装置。
下面对图1所示的流程图中的重要工序进行详细说明。
工序1)是测定起始靶核酸浓度,以起始靶核酸的长度为基础确定起始靶核酸的拷贝数。对于本工序,下面进行了详细讲述,但在本工序中只要能计算起始靶核酸拷贝数,并不限定后述的具体例子。
使用上述核酸测定仪测定起始靶核酸的浓度。作为测定方法,可以举出紫外吸光测定法、荧光测定法等。并不限于这些方法,只要能测定起始靶核酸的浓度,可以使用任何方法。
在工序2)中,作为利用测定所得的浓度计算拷贝数的方法,如果给出起始靶核酸的碱基数,可以利用生物实验说明3(バィオ実験ィラスレィテッド)(p26-33)中所示的公知方法计算。测定起始靶核酸的拷贝数有困难时,例如,特开2001-314194号公报中所示的,可以使用公知方法从核酸扩增的过程或核酸扩增后的核酸扩增量推断扩增前扩增反应液中的靶核酸拷贝数,但作为测定起始靶核酸拷贝数的方法,并不限定于这些例子,只要能测定起始靶核酸的拷贝数,可以使用任何方法。
工序3)是利用统计理论公式从起始靶核酸拷贝数确定分析反应或扩增反应中所必要的最低限度的拷贝数(决定应抽取的拷贝数)的工序。具体地说,是利用统计理论公式,使用由起始靶核酸测定的、或由上述的核酸扩增量或核酸扩增过程推断出的起始靶核酸拷贝数,确定扩增或分析反应中所必要的最低限度的上述靶核酸拷贝数。下面利用统计理论公式,对扩增或分析反应液中的靶核酸拷贝数的确定方法进行详细阐述。
本发明的原理是在抽取含有低拷贝数的二种或二种以上的靶核酸的溶液、调配扩增反应液时,利用分取或稀释来避免各靶核酸的存在比发生变化的情况。所以,在起始靶核酸中的核酸总量为1、用于核酸分析的核酸的存在比为p的情况下,其他核酸的比率用1-p表示,这遵循二项分布。由此,抽取n个拷贝时,抽取液中含有b个拷贝的概率P(b),可以用(1)式表示。
数1
P(b):抽取液中含有b个拷贝的概率
P:起始靶核酸中某一种靶核酸的比例
n:从起始靶核酸中抽取的拷贝数
b:抽取液中含有的供分析的核酸拷贝数
另外,当抽取核酸的拷贝数为n,且满足np>5并且n(1-p)>5时,近似遵循平均值p、离散度为p(1-p)/n的正态分布。因而,如下从统计学上能求出应分取的靶核酸的拷贝数值。
起始靶核酸N具有充分大的拷贝数,优选N>100,000拷贝数的多种靶核酸溶液含有以p比例存在的某一种靶核酸时,从该靶核酸溶液分取n个拷贝的情况下,抽取靶核酸中的某一种该靶基因的比例R,在统计学上满足np>5并且n(1-p)>5时,在某可信度的可信区间采用统计量T,能得到(2)式所表示的范围。优选采用95%的可信度,采用统计量T为1.96,更优选采用99%的可信度,采用的统计量T为2.58。另外,设定其他可信度的情况下,也能从正态分布表求出统计量T。
数2
P:起始靶核酸中某一种靶核酸的比例
n:从起始靶核酸中抽取的拷贝数
T:n取正态分布时的统计量
R:p的可信区间(能取的值的范围)
此外,不满足np>5并且n(1-p)>5时,R的可取区间使用t分布的统计量tn-1可以以(3)式表示,但更优选使用为二项分布的(1)式计算。
数3
p、n、R:与(2)式的定义相同
tn-1:n取t分布时的统计量
起始靶核酸充分大时,利用(2)和(3)式以95%的可信度将由拷贝数决定的R的可取值换算成%,如表1所示。
表1 95%可信区间内n值与可信区间的关系
表1显示在95%的可信度中,上、下限之间的区间在统计学上不可能找到有统计学意义的差异。因此,此区间越窄,得到与起始靶核酸相同量比的扩增核酸的统计学上的概率就越高。由此,在某可信度的可信区间,满足np>5并且n(1-p)>5时,经常允许只k比例的可信区间时,所规定的值n,如果用统计量T,则可用(4)表示。优选使用可信度为95%、统计量T为1.96,较优选使用可信度为99%、统计量T为2.58。另外,设定其他可信度的情况下,也能从正态分布表查出统计量T。
数4
p、n、T:与(2)式的定义相同
k:提取液中允许的靶核酸比率的可信区间
另外,不满足np>5并且n(1-p)>5时,采用t分布的统计量tn-1优选用(5)式表示,更优选使用(1)式计算,(1)式是二项分布。
数5
p、n:与(2)式的定义相同
tn-1:与(3)式的定义相同
k:与(4)式的定义相同
另外,起始靶核酸的拷贝数少的情况下,如果此起始靶核酸的拷贝数用N表示,则用(2)和(3)乘以有限母集团修正项,从而(2)式可以用(6)式表示,(3)式可以用(7)式表示。
数6
p、n、T、R:与(2)式的定义相同
tn-1:与(3)式的定义相同
N:起始靶核酸的拷贝数
因此,起始靶核酸的拷贝数为统计学意义上的小、优选小于100,000时,如果起始靶核酸的拷贝数用N表示,在某可信度的可信区间,满足np>5并且n(1-p)>5时,本发明中所规定的值n可以用下面的(8)式表示,其中X表示(4)式中所示的右边。优选使用可信度为95%、统计量T为1.96,更优选使用可信度为99%、统计量T为2.58。另外,设定其他可信度的情况下,也能从正态分布表查出统计量T。
数7
X:(4)式的右边
N:与(6)式、(7)式的定义相同
在某可信度的可信区间,不满足np>5并且n(1-p)>5时,如果将(5)式中所示的右边用Xt表示,则可以用下面的(9)式表示,但更优选使用二项分布(1)式计算。
数8
Xt:(5)式的右边
N:与(6)式、(7)式的定义相同
另外,也可以计算出确实扩增靶核酸中存在比率小的靶基因所需的最低拷贝数。例如,根据表1,扩增以10%的比例存在于具有大于等于100,000拷贝数的多种靶核酸中的某一种靶基因的情况下,在统计学上,在95%的可信度时,拷贝数不足35时有可能不能检出。所以,在某一可信度的可信区间,为了确实扩增以p比例存在的靶核酸所应分取的规定值n,希望用泊松分布的(10)式进行推导,其中,p(b)表示分取液中含有b拷贝的概率。
数9
p(b)、p、n、b:与(1)式的定义相同
e:自然对数的底数
但是,由于(10)式复杂而且难解,因而,将二项分布近似为正态分布,在某一可信度的可信区间,能确实扩增以p比例存在的靶核酸的规定值n,可以用统计量T以(11)式表示。优选使用可信度为95%、统计量T为1.96,更优选使用可信度为99%、统计量T为2.58。另外,设定其他可信度的情况下,能从正态分布表查出统计量T,但更优选使用泊松分布。
数10
p、n、T:与(2)式的定义相同
另外,不满足np>5并且n(1-p)>5时,使用t分布的统计量tn-1优选用(12)式表示,更优选使用泊松分布。
数11
p、n、T:与(2)式的定义相同
起始靶核酸的拷贝数小的情况下,若此起始靶核酸的拷贝数用N表示,(11)式中所示的右边用Y表示,则可以用下面的(13)式表示。
数12
Y:(11)式的右边
N:与(6)式、(7)式的定义相同
另外,不满足np>5并且n(1-p)>5时,如果将(12)式中所示的右边用Yt表示,则可以用下面的(14)式表示,但较优选使用泊松分布。
数13
Yt:(12)式的右边
N:与(6)式、(7)式的定义相同
优选使用可信度为95%、统计量T为1.96,更优选使用可信度为99%、统计量T为2.58。另外,设定其他可信度的情况下,能从正态分布表查出统计量T。
在使用引物同时扩增二种或二种以上具有各自一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸时,利用上面的方法,能得到与该靶核酸量成比例的扩增核酸量。另外,本发明(4)、(5)、(8)、(9)式中的p值和k值,根据本发明适用的检测法或检测装置的不同而有所不同,在使用定量性低的分析法和装置的情况下,优选设定较高的k值,在使用定量性高的分析法和装置的情况下,优选设定较低的k值。P值设定为要检测的靶核酸的存在比率。但是,不知道存在比率的情况下,p值优选使用0.5,更优选设定为所能推断的存在比率。在后述的工序5)中,对有可能适用本发明的检测法和装置、p值和k值的设定进行更详细地阐述。
工序7)是调整扩增反应液或分析反应液中的靶核酸的拷贝数的工序。关于使扩增反应液或分析反应液中的该靶核酸的拷贝数达到利用上述方法确定的值的方法,在下面进行详细阐述,但只要本工序中扩增或分析反应液中的该靶核酸的拷贝数达到用上述方法确定的值就可以,并不限定于下面的详细阐述。
就测定起始靶核酸的拷贝数后的结果而言,若起始靶核酸的拷贝数充分多时,有必要首先稀释起始靶核酸。稀释方法可以是分取一部分起始靶核酸,再在溶剂中混合。作为稀释用的溶剂,只要能溶解核酸片段、并且不影响后面工序中的核酸扩增反应或核酸分析反应,可以使用任何溶剂。另外,起始靶核酸拷贝数小于被确定的靶核酸的拷贝数时,可以使用醇沉淀法等公知的方法浓缩起始靶核酸。
在下面的工序中,扩增核酸时,分取一部分起始靶核酸溶液经上述的稀释或浓缩后的拷贝数调整液,调配核酸扩增试剂,向该调整液中加入稀释或浓缩核酸,以达到由上述方法确定的值。另外,就测定起始靶核酸的拷贝数后的结果而言,若起始靶核酸拷贝数低,可直接调配,则可以分取一部分该靶核酸,在核酸扩增试剂和引物经过调配后的调整液中调配入该靶核酸,以达到利用上述方法确定的值。在起始靶核酸拷贝数不能达到所确定的值时,可以追加试料、或浓缩试料、也可以不用于分析。或者,在分析后附加表示警告的标记或记号。
不进行核酸扩增而直接分析的情况下,分取一部分如上使用起始靶核酸溶液经稀释或浓缩后的拷贝数调整液,加入到分析用反应液中即可,另外,就测定起始靶核酸的拷贝数的结果而言,若起始靶核酸拷贝数低,可直接调整时,可以分取一部分该靶核酸,并该靶核酸调配入分析反应液中,使其达到利用上述方法确定的值。关于分析反应液的组成,只要是能由起始靶核酸进行直接目的分析,则可以使用任何组成。
工序8)是核酸扩增工序。不扩增核酸直接进行分析反应的时,不必进行此工序,而移至工序9)。对于进行核酸扩增的情形,对本工序的核酸扩增将进行详细说明,但只要是能进行核酸扩增,本工序并不限于下面的详细举例。
核酸扩增的方法没有特别限定,例如,包括PCR法、链取代扩增法(SDA法)、恒温基因扩增法(ICAN法)、LAMP法等。在任一种方法中,只要使用引物能同时扩增二种或二种以上具有一个或一种以上不同碱基的碱基序列的靶核酸就可以,但更优选使用PCR法。使用PCR法扩增核酸时,有必要确定循环数。本发明中的循环数只要能确认核酸片段的扩增,可以使用任何循环数,优选20~40左右的循环数。
本发明中使用的核酸扩增试剂没有限定,只要能进行核酸扩增,任何试剂都可以使用。另外,引物是针对检出的核酸序列部位而设计成特异的基因序列。只要能利用核酸扩增法扩增,可以任意设计引物。而且,出于容易检测后述的扩增核酸片段等目的,还可以标记引物。利用在核酸扩增时使用标记后的碱基成分(例如,磷的放射性标记碱基)的方法、或核酸扩增后再标记的方法,可以对核酸片段进行标记。作为标记处理方法,只要检测容易,就没有特别限定,可以举出使用放射性物质、荧光物质、化学发光物质、生物素(用酶标记抗生物素蛋白检测)的标记方法。对于引物,例如,可以使用预先用A.L.F red(Cy5、注册商标)amidite试剂(pharmacia公司生产)荧光标记引物末端而得的物质。另外,作为荧光标记可以使用applied biosystems公司的FAM、TET、HEX、TAMRA、ROX(以上为注册商标)等。使用这些标记物的情况下,可以在引物的5’末端或3’末端的任一端标记都可以,优选标记引物5’末端。
工序10)是分析靶核酸、测定二种不同靶核酸的量比的工序。作为检测扩增或分析反应液中的二种或二种以上具有不同序列的核酸的方法,具体可以举出单链DNA构象多态性分析(SSCP法)、二色荧光DNA阵列法、Mass Array法、Invader法、Bamper法等。但是,在本工序中,只要能从含有SNPs和/或二个不同等位基因、多个不同核酸的溶液中检出靶核酸,并不限定于这些具体例子。
所谓单链DNA构象多态性分析(SSCP法)是指对靶核酸中相同的、但含有一个或一个以上不同碱基的序列的部位进行扩增,再使所得的扩增核酸变性,由于碱基序列的不同而使高级结构不同,从而进行分离,通过电泳以两个不同峰的量比进行检测的方法。作为使用此分析法的临床检测法可以举出LOH法、MSI法等。
像这样能够以两个不同的峰的面积比和高度比等的量比进行检测和测定的分析法的情况下,检测和测定的量比与起始核酸一致率高,分析时高定量性也是有必要的。因此,在这样的情况下,通常要求可信区间(上限和下限的差)10%以内的定量性,此时k为0.05。
使用二色荧光DNA阵列法的情况下,由于通过荧光色素变成红或绿的变化来检测DNA的不同,所以原理上讲,难于进行定量性高的检测,通常能进行粗略的检测。作为使用此分析法的检测法可以举出CGH法、各种SNP检测法等。在这样的情况下,通常要求可信区间30%左右的定量性,此时k为0.15。用这些分析法分析靶核酸为杂合体的情况下,起始核酸中的二种不同靶核酸的比例为1∶1。所以,p可以为0.5。
检测并分析扩增的核酸的装置,具体可以举出毛细管电泳仪、凝胶电泳仪、质量分析仪、核酸微阵列等。更具体地可以举出确定核酸碱基序列的genetechanalyzer(ABI公司生产)、能够利用电泳分析金属离子、核酸、蛋白质等各种物质的毛细管电泳系统(Agilent Technologies公司生产)、毛细管与质量分析系统相结合的CE/MS系统(Agilent Technologies公司生产)、用凝胶板确定核酸序列的BaseStation(注册商标)100DNA片段分析仪(MJ Research公司生产)、利用基因多态中碱基的不同引起的质量不同而能够进行分析的microflex(BrukerDaltonics公司生产)、使根据待检测的基因区域的碱基序列合成的探针排列在芯片上,使待检测的核酸与芯片反应的核酸微阵列等,但只要能检测核酸,任何装置都可以,并不限于上述的分析装置。
作为具体的分析方法,阐述了使用16根毛细管电泳仪、利用单链DNA构象多态性分析的杂合性缺失(以下称LOH)的测定法,但在本发明中,只要使用(4)、(5)、(8)、(9)式来确定该规定值,并能确认在该靶核酸的比例中作为目标的可信区间的扩增,并不限定于后述的测定方法。使用该分析方法时,作为扩增核酸的电泳结果,能得到1个或2个峰。在LOH的测定方法中,分别扩增作为标准的靶核酸和作为检查对象的靶核酸,针对各核酸测定2个峰的高度,计算其比率,求出一方的峰的减少率,比较作为标准的靶核酸和作为检查对象的靶核酸的峰比率的差,差值小则判断为阴性,差值大则判断为阳性。另外,差值在判断阈值附近时,认为判断无效。
可以在核酸扩增前测定靶核酸拷贝数,或在扩增过程中或扩增后测定靶核酸拷贝数,下面对低拷贝数下进行分析的情形进行详细阐述,但在本工序最终的测定结果中,并不限定于测定的靶核酸为低拷贝的下面的具体例子。
扩增小于等于统计学理论公式所确定的值的靶核酸,并进行LOH检查的情况下,由测定的起始靶核酸拷贝数和扩增反应液中靶核酸拷贝数以及所得的峰比率,利用(2)、(3)、(6)、(7)式能得出所得峰的可信区间。若所得可信区间达到包含阈值在内的范围,则此时的检查结果由于既可判定为阳性也可判定为阴性,因此,优选此检查结果附加表示低拷贝数解析警告的标记和记号。更优选将此检查结果作为因低拷贝数解析的判断保留或判断无效进行处理。另外,所得可信区间在不含有阈值的范围的情况下,表示阳性或阴性的判定结果。更优选合并起来附加表示在低拷贝数下进行扩增、解析的警告的标记或记号。如上所述使低拷贝数所致的可信区间的扩展反映在测定结果中,能得到精度更高的测定结果。
在本发明中,提供一种程序,该程序用于检测二种或二种以上具有一个或一个以上不同碱基的碱基序列的靶核酸。即,使用二种或二种以上针对一个或一个碱基不同的碱基序列部位的特异性引物或二种或二种以上各自针对不同碱基序列部位的特异性引物,分析二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸时,该程序含有为了使计算机起作用的以下措施:
a)以为了从起始核酸浓度确定拷贝数的靶核酸的长度、或核酸的由来作为起始条件输入的措施、
b)以测定起始核酸浓度的结果为基础,计算起始靶核酸中的拷贝数的措施、
c)由计算出的起始靶核酸拷贝数确定分析反应液中必要的核酸拷贝数的措施、和
d)比较起始靶核酸拷贝数和进行扩增反应所必要的靶核酸拷贝数,不在分析中使用分析反应液中的该靶核酸拷贝数不能调整至大于等于所规定的值的起始靶核酸,或即使进行分析也不使用其数据,或在分析数据中附加表示警告的标记或记号的措施。
另外,作为其他程序的例子,是使用二种或二种以上针对一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位的特异性引物或二种或二种以上各自针对不同的碱基序列部位的特异性引物同时扩增、分析二种或二种以上各自具有一个或一个以上不同碱基的碱基序列的靶核酸时,含有以下措施的程序。
a)以为了从起始核酸浓度确定拷贝数的靶核酸的长度、或核酸的由来作为起始条件输入的措施、
b)以测定的起始核酸浓度的结果为基础,计算起始靶核酸中的拷贝数的措施、
c)由计算的起始靶核酸拷贝数确定分析反应液中必要的核酸拷贝数的措施、和
d)比较起始靶核酸拷贝数和进行扩增反应所必要的靶核酸拷贝数的措施。
进一步,在使用二种或二种以上针对一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位的特异性引物或二种或二种以上各自针对不同的碱基序列部位的特异性引物同时扩增二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸,并分析该靶核酸中靶基因部位的扩增核酸量的比率,比较作为标准试料进行分析的靶核酸和作为检查对象进行分析的靶核酸的存在比率,以预先设定的阈值为基础,判断峰比率的变化是否存在差别的方法中,提供使计算机作为以下手段起作用的程序。
a)以为了从起始核酸浓度确定拷贝数的靶核酸的长度、或核酸的由来作为起始条件输入的手段、
b)用核酸浓度测定装置测定起始核酸浓度,或以从扩增过程及核酸扩增量推测的结果为基础,计算起始靶核酸中的拷贝数的手段、
c)使用二项分布或其近似公式,由分析该靶核酸的存在比率的结果计算此结果的可信区间的手段,和
d)如果存在差别,检查判断的阈值与可信区间的重叠情况,如果阈值与可信区间不重叠则判断有差别,或无差别,如果阈值与可信区间重叠,则判断无效的手段。
另外,进一步提供能记录上述程序并能从计算机读出该程序的记录介质。
(实施例1)使用SSCP解析法的低浓度核酸的杂合体等位基因的存在比率
1.试料的调配与单碱基多态部位的扩增
对于从血液中提取的人核酸中的等位基因的存在比,对于起始靶核酸中的等位基因的相对比率和扩增后的二种不同的等位基因的相对比率,在A)要求2%以内的精度的情况下、B)要求5%以内的精度的情况下、C)要求15%以内的精度的情况下、D)要求40%以内的精度的情况下的必要拷贝数示于图2。针对分注到各拷贝数的四种靶核酸扩增液,分别以表3所示的组成进行调配。即,越是希望高精度的情况下,拷贝数越大。这些调配要进行8次试行。
表2
各起始靶核酸的拷贝数
标记 | A | B | C | D |
拷贝数 | 20000 | 2000 | 200 | 20 |
表3
核酸扩增试剂的组成
试剂 | 终浓度 |
TrisHCl(pH8.3) | 10mM |
KCl | 50mM |
MgCl2 | 1.5mM |
dATP,dTTP,dCTP,dGTP | 各0.2mM |
引物正链 | 0.5μM |
引物反链 | 0.5μM |
核酸扩增酶 | 0.75Units |
针对各调整液,以杂合等位基因的单碱基多态部位为靶点,进行PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃2分钟的初次变性后,以95℃30秒、57℃30秒和72℃30秒为1个循环,进行30个循环后,再在72℃延伸7分钟。
2.SSCP解析
上述扩增反应以后,用Klenow片段(KaKaRaBio公司生产)并利用表4的组成,在37℃反应30分钟,进行末端平滑处理。
表4
末端平滑处理试剂组成
试剂 | 体积 |
Klenow片段 | 1.0Unit |
PCR产物 | 原液5μl |
总量 | 6μl |
使用末端平滑处理后的试料和TAMRA Size Standard(ABI公司生产)和Formamid(ABI公司生产)按照表5所示的组成调配SSPC解析用试剂,然后在92℃2分钟热变性后按照表6所示的条件进行SSCP解析。
表5
SSCP解析试剂的组成
试剂 | 体积 |
末端平滑处理试料 | 3.0μl |
TAMRA Size Standard | 1.0μl |
Formamid | 36μl |
总量 | 40μl |
表6
SSCP解析条件
输入电压:20kV |
导入时间:5sec |
电泳电压:15kV |
检测时间:45min |
3.等位基因的相对比率
在SSCP解析中,由色谱中的2个波形能检出杂合体等位基因的扩增量。通过求出这2个波形的相对比率,能检测出原来等量含有的等位基因进行核酸扩增后的变化。在本实验中检查8次试行中的峰比率的变化比例。结果示于表7。
表7
2个等位基因中的1个的存在比率的变化
ALD | A | B | C | D |
1 | 49.9 | 49.6 | 48.7 | 56.7 |
2 | 51.3 | 51.5 | 49.4 | 51.7 |
3 | 50.2 | 50.3 | 50.3 | 58.8 |
4 | 50.5 | 50.0 | 54.8 | 59.4 |
5 | 49.7 | 48.7 | 48.6 | 54.1 |
6 | 49.8 | 49.5 | 46.9 | 38.5 |
7 | 50.4 | 50.2 | 46.2 | - |
8 | 49.9 | 49.8 | 50.3 | - |
Max-Min | 1.6 | 2.7 | 8.6 | 20.9 |
一:未见核酸扩增
在表7的结果中,由于试行次数少,散乱的范围小,但确实随着拷贝数的减少散乱的范围有增大的趋势。根据此结果调节从起始靶核酸中抽取的核酸量,从而能进行要求精度范围内的解析。
(实施例2)使用SSCP解析的LOH检查
1.测定条件的确定
所谓LOH检查,是利用核酸中一个碱基的不同,测定核酸中二个不同等位基因的量比,与标准的靶核酸的该量比进行比较,检测检查对象的该量比的变化。所以,二个不同等位基因的量比,通常在动物基因组核酸为1∶1,检测二个不同等位基因中的1个时,由于该要检测的起始靶核酸的比例为50%,所以p为0.5。与此相对,等位基因的量比是否变化要进行检查的检查对象的该量比由于解析时还不知道,暂且使其与标准相同,p为0.5,解析后补正。另外,由于本解析法需要检出大于等于10%的核酸,由于有必要在95%可信度时抑制可信区间在10%(±5)以内,所以T为1.96、k为0.05。
在本实施例中,从患者的血液中提取的核酸作为标准的起始靶核酸,从患者的癌组织和尿等提取的核酸作为检测对象的起始靶核酸,扩增10种基因检测区域进行检查。
2.起始靶核酸的拷贝数的确定和扩增反应液中的拷贝数的确定将利用酚-氯仿提取法从人血液中提取的膀胱癌患者的人血来源的核酸作为标准的起始靶核酸使用,将按照上述方法从该患者的尿中提取的人尿来源的核酸作为检查对象的起始靶核酸使用。利用紫外吸光测定装置测定这些起始靶核酸,假设每一个细胞的基因组DNA的长度为4.0×106kbp,由此换算的拷贝数示于表8。
表8
各起始靶核酸的浓度与拷贝数
基因组DNA | DNA浓度(μg/μl) | 拷贝数浓度(拷贝/μl) | 总拷贝数 |
来源于血液的基因组DNA | 5.0 | 1.05×106 | 5.25×107 |
来源于组织的基因组DNA | 0.1 | 2.1×104 | 2.1×106 |
来源于尿的基因组DNA | 0.0005 | 105 | 1575 |
由于来源于血液和组织的基因组DNA具有大于等于100,000的拷贝数,所以扩增反应液中的靶核酸拷贝数的计算式使用母集团充分大的(4)、(5)式。另外,在本实施例中,由于来源于尿的基因组DNA的起始拷贝数小,起始拷贝数N为1575,利用(8)、(9)式求得。根据以上的条件,给出表8所示的扩增反应液中必要的拷贝数。
表9
各靶核酸扩增时必要的拷贝数
基因组DNA | 拷贝数 |
来源于血液的基因组DNA | 385 |
来源于组织的基因组DNA | 385 |
来源于尿的基因组DNA | 309 |
由于在本检测中有必要扩增10种基因检测区域,所以准备10种反应液。因此,向各反应液中每次加入1μl扩增所必要的拷贝数浓度的起始靶核酸时,至少要准备10μl的起始靶核酸。但是,在基因组DNA的总拷贝数非常少,不能满足分析时的必需量的情况下,就认为不能得到可信的检查结果。此种情况下,在本实施例中进行分析,并在最终结果的判断中附加表示警告的标记或记号。
3.核酸扩增反应液的调配和核酸扩增
反应液中的靶核酸的拷贝数只要是大于等于表9中确定的值的浓度(拷贝/μl),在起始靶核酸拷贝数充分存在的情况下,优选调整至10,000拷贝左右。所以,如表10中稀释来源于血液和组织的基因组DNA,调配10,000拷贝/μl的稀释液,为了稍微提高来源于尿的基因组DNA,用乙醇沉淀法处理总量为15μl的起始靶核酸溶液,浓缩至10μl,使起始靶核酸浓度为157拷贝数/μl。
表10
各靶核酸反应液中的拷贝数
基因组DNA | 拷贝数 |
来源于血液的基因组DNA | 10000 |
来源于组织的基因组DNA | 10000 |
来源于尿的基因组DNA | 157 |
并且在这些实施例中使用PCR法作为核酸扩增法,核酸扩增试剂的组成如表11中所示的组成和浓度,调配10种扩增反应液。
表11
核酸扩增试剂的组成
试剂 | 终浓度 |
TrisHCl(pH8.3) | 10mM |
KCl | 50mM |
MgCl2 | 1.5mM |
dATP,dTTP,dCTP,dGTP | 各0.2mM |
引物正链 | 0.5μM |
引物反链 | 0.5μM |
核酸扩增酶 | 0.75Units |
向这些调整液中加入1.0μl稀释或浓缩的起始靶核酸,除来源于尿的靶核酸以外,扩增反应液中的靶核酸中的拷贝数都大于等于表2所示的值,按照下面的条件进行PCR扩增。PCR扩增的条件是95℃2分钟的初次变性后,以95℃30秒、57℃30秒和72℃30秒为1个循环,30个循环后在72℃延伸7分钟。
4.使用SSCP解析法的峰比率的测定
在调配分析用样品时,按照下面所示的顺序添加试剂和样品,但添加顺序并不限定于这个例子。在分析用微量容器中,向36μl DNA变性剂Formamid中添加1.0μl作为大小标准marker的4nM TAMRA Size Standard(ABI公司生产)、3.0μl DNA扩增产物的原液,调整至总量为40μl。对调整样品,样品导入条件为电压20kV、时间5秒,以电压15kV、时间70分钟为电泳条件进行SSCP电泳。此时,由针对扩增的A~J这10种基因检测区域所得的2个峰,测定二种等位基因中要检测的靶核酸的存在比率,其结果示于表12。
表12
各基因检测区域的峰比率
A | B | C | D | E | F | G | H | I | J | |
来源于血液的核酸比率 | 49 | 48 | 51 | 52 | 47 | 53 | 50 | 49 | 50 | 48 |
来源于组织的核酸比率 | 25 | 21 | 30 | 20 | 22 | 28 | 24 | 45 | 36 | 47 |
来源于尿的核酸比率 | 34 | 43 | 32 | 51 | 45 | 42 | 33 | 40 | 31 | 30 |
5.峰比率的可信区间的再检测与LOH判定
表12的结果和(2)、(6)式表示了各基因检测区域的判定阈值与可推断各基因检测区域中组织和尿的比率的上限值和下限值,再参考这些值进行判断。此种情况下,作为判断的判断方法是,如果比率上限比判定阈值低则判定为阳性,如果比率下限比判定阈值高则判定为阴性,判定阈值在上限和下限之间的情况下则判断为判定无效。结果示于表13。
表13
可信区间的再检测与以判定域值为基础的判断结果
A | B | C | D | E | F | G | H | I | J | |
判定阈值 | 38 | 40 | 40 | 35 | 39 | 35 | 43 | 38 | 45 | 40 |
组织比率上限 | 27 | 23 | 32 | 22 | 24 | 30 | 26 | 47 | 38 | 49 |
组织比率下限 | 23 | 19 | 28 | 18 | 20 | 26 | 22 | 43 | 34 | 45 |
组织判断结果 | + | + | + | + | + | + | + | - | + | - |
尿比率上限 | 41 | 57 | 46 | 66 | 59 | 56 | 47 | 54 | 44 | 43 |
尿比率下限 | 33 | 29 | 18 | 36 | 31 | 28 | 19 | 26 | 18 | 17 |
尿判断结果 | × | × | × | × | × | × | × | × | + | × |
+:阳性 -:阴性 ×:判定无效
这样,以通过检测测定的比率为基础,利用(2)、(3)、(6)、(7)式进行再检测,能得到具有统计学上95%可信区间的检测结果。本实施例是以统计学上95%可信区间为基础进行判断的,但更优选使用99%。
(实施例3)血液中病毒核酸的检测
1.确定测定条件
作为检测血液中含有的微量的病毒核酸的方法,针对从患者血液中提取的起始核酸,可以使用病毒具有的基因序列中的特异性引物,通过基因扩增可以检测出病毒核酸。在本实施例中,进行基因扩增时,对于从该起始核酸中分取一部分核酸加入到扩增试剂中的情况,下面对确定在起始核酸中含量大于等于0.01%的病毒核酸的核酸拷贝数的实施例进行阐述,该核酸拷贝数是能以99%的可信度分取的病毒核酸拷贝数。此时,要检测到大于等于0.01%的病毒核酸,p为0.0001,99%的可信度的统计量T为2.58。
2.起始靶核酸拷贝数的确定和扩增反应液中拷贝数的确定
将利用酚-氯仿提取法从人血液中提取的患者的人血来源的核酸作为标准的起始靶核酸使用,利用紫外吸光测定装置测定这些起始靶核酸,假设每一个细胞的基因组DNA的长度为4.0×106kbp,由此换算的拷贝数示于表14。但是,由于不知道病毒核酸的拷贝数,所以通过基因组核酸的拷贝数确定。
表14
各起始靶核酸的浓度与拷贝数
患者 | DNA浓度(μg/μl) | 拷贝数浓度(拷贝/μl) | 总拷贝数 |
患者A | 5.0 | 1.05×106 | 5.25×107 |
患者B | 0.05 | 1.05×104 | 4.1×104 |
此时,由于来源于血液的基因组核酸的拷贝数大于等于100,000,扩增反应液中靶核酸拷贝数的计算式使用母集团充分大的(11)式。根据以上条件,给出表15所示的扩增反应液中必要的核酸量或拷贝数。
表15
各靶核酸扩增时必要的核酸量或拷贝数
核酸量 | 拷贝数 | |
抽取的靶核酸量 | 0.31μg | 6.65×104 |
该结果是,对于患者A,通过部分稀释起始靶核酸,再分取,可以进行检测。但是,对于患者B,由于基因组核酸的总拷贝数少,未达到分析所必需的量,因而认为不能得到可信的检测结果。此种情况下,或者不用于分析,或者在分析后的最终结果的判定中附加表示警告的标记或记号。
Claims (21)
1.一种核酸检测或分析方法,其是从二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料中,分取一部分靶核酸,并对分取的核酸试料进行检测或分析的方法;该方法包括以下工序:
由起始靶核酸试料的核酸浓度,计算出起始靶核酸试料的拷贝数的工序,和从上述起始靶核酸试料中,分取出大于等于规定数目的拷贝数的靶核酸的工序。
2.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其中进一步包括,当从上述起始靶核酸试料中分取的靶核酸拷贝数超过规定数目时,稀释上述起始靶核酸试料,而当该拷贝数未达到规定数目时,浓缩上述起始靶核酸试料的工序。
3.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其中进一步包括,在后面的工序中对分取的靶核酸的拷贝数不能够调整至规定范围的核酸试料不予使用,或者是即便使用也不采用其结果,或者是在结果中附加表示警告的标记或记号的工序。
4.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其中在分取靶核酸后,接着进行如下工序,即,核酸扩增反应或分析反应。
5.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其中所述起始靶核酸试料包含有基因组DNA。
6.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其中包括对分取的核酸试料进行核酸分析反应,并利用所希望的方法检测靶核酸的工序。
7.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其中包括利用采用了二项分布的统计方法或近似二项分布的公式,由靶核酸的拷贝数确定应分取的靶核酸的拷贝数的工序。
8.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其特征在于一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位是基因多态。
9.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其特征在于一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位是单碱基多态。
10.如权利要求1所述的核酸检测或分析方法,其特征在于一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位是微卫星多态。
11.一种核酸检测或分析方法,其特征在于,其是使用二种或二种以上针对一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位的特异性引物,或者二种或二种以上各自针对不同的碱基序列部位的特异性引物,同时扩增二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料,并分析该靶核酸中靶基因部位的扩增核酸量的比率的核酸检测或分析方法;其包括以下工序:
a)使用含有该靶核酸的扩增反应液进行核酸扩增的工序,
b)由核酸扩增量或核酸扩增过程推测出扩增反应液中的靶核酸拷贝数和起始靶核酸拷贝数的工序,
c)利用采用了二项分布的统计方法或近似二项分布的公式,由推测的起始靶核酸拷贝数确定扩增反应液中必要的靶核酸拷贝数浓度的工序,
d)对所确定的必要的拷贝数和所推测的扩增反应液中的靶核酸拷贝数进行比较的工序。
12.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其特征在于使用单链DNA构象多态性分析作为定量两种不同核酸的扩增量的检测或分析方法。
13.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其特征在于对二种或二种以上不同靶核酸,分别标记二种不同颜色的荧光,并使用二色荧光核酸微阵列作为由这些荧光的发光量的差分析靶核酸的扩增量的差异的方法。
14.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其中包括分析上述靶核酸中靶基因部位的扩增核酸量的比率,并比较作为标准试料进行了分析的靶核酸和作为检查对象进行了分析的靶核酸的存在比率,以预先设定的阈值为基础,判断峰比率的变化是否存在差别的工序。
15.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其中包括利用采用了二项分布的统计方法,计算出所测定的该靶核酸的存在比率的可信区间的工序。
16.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其中包括如下工序,即,当判定为存在差别时,检查阈值与可信区间重合情况,如果阈值与可信区间不重合,则认为存在差别;或判定为没有差别时,在阈值与可信区间重合的情况下,则认为判定无效。
17.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其中包括使用二种或二种以上针对一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位的特异性引物,或者二种或二种以上各自针对不同碱基序列部位的特异性引物,在二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸中扩增所含靶核酸中比率最少的靶核酸的工序。
18.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其中包括利用采用了泊松分布(Poisson Distribution)的统计方法由起始靶核酸拷贝数确定扩增反应液中的靶核酸拷贝数的工序。
19.如权利要求11所述的核酸检测或分析方法,其中包括为了使扩增或分析反应液中的靶核酸拷贝数大于等于所规定的值,稀释、浓缩起始靶核酸试料,调整扩增或分析反应液的工序;对扩增或分析反应液中的该靶核酸拷贝数不能调整至大于等于上述所规定的值的起始靶核酸试料在分析中不予使用,或者是即便进行分析也不使用其数据,或在分析数据中附加表示警告的标记或记号的工序。
20.核酸检测或分析程序,该程序能使核酸检测或分析装置的计算机具有以下功能:
a)在使用二种或二种以上针对一个或一个以上碱基不同的碱基序列部位的特异性引物或二种或二种以上各自针对不同碱基序列部位的特异性引物,检测或分析二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的靶核酸试料时,作为以供于由起始核酸浓度确定拷贝数的靶核酸的长度或核酸的来源作为起始条件进行输入的手段,
b)作为以测定的起始核酸浓度结果为基础,计算出起始靶核酸中的拷贝数的手段,
c)作为由计算出的起始靶核酸拷贝数确定分析反应液中必要的靶核酸拷贝数的手段。
21.核酸检测或分析装置,其包括以下部分:样品分注装置,测定试料中核酸浓度的装置,输入输出装置,核酸检测部,存储程序的记忆装置,以及读取上述记忆装置的程序并控制检测或分析装置的计算机,和至少显示演算结果的显示装置;在检测二种或二种以上各自具有一个或一个以上碱基不同的碱基序列的起始靶核酸试料时,上述程序使电子计算机作为a)以供于由起始核酸浓度确定拷贝数的靶核酸的长度或核酸的来源作为起始条件进行输入的手段,b)作为以测定的起始核酸浓度结果为基础,计算出起始靶核酸中的拷贝数的手段,c)由计算出的起始靶核酸拷贝数确定分析反应液中必要的靶核酸拷贝数的手段发挥作用。
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