JP2006087388A - 核酸増幅分析法および装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ2種類以上の標的核酸試料から、該標的核酸の一部を分取し、分取された核酸試料を検出または分析する方法であって、初期標的核酸試料の核酸濃度から、初期標的核酸試料のコピー数を求める工程、及び上記初期標的核酸試料から所定数以上のコピー数の標的核酸を分取する工程を含む核酸検出または分析方法。
【選択図】図1
Description
a)該標的核酸を含む増幅反応液を用いて核酸増幅を行う工程、
b)核酸増幅量または核酸増幅の経過から増幅反応液中の標的核酸のコピー数および、初期標的核酸のコピー数を推定する工程、
c)推定された初期標的核酸コピー数から、2項分布を用いた統計的手法によりまたは2項分布に近似した式により、増幅反応液中に必要な標的核酸コピー数濃度を決定する工程、
d)決定された必要なコピー数値と推定された増幅反応液中の標的核酸コピー数とを比較する工程、
を含む核酸検出または分析方法を提供するものである。
1)該標的核酸の濃度を測定する。
2)初期標的核酸コピー数を決定する。
3)統計論理式を用いて初期標的核酸から分取し、増幅反応液中に投入する標的核酸コピー数を決定する。
4)該標的核酸を増幅する際の反応液中の該標的核酸コピー数が所定の値にできるように初期標的核酸を希釈または濃縮し、核酸増幅反応液を調整する。
5)核酸増幅を行う。
6)核酸を分析し、低コピー数の試料に警告を意味する表記または記号を付加する。
p:初期標的核酸中のある一種類の標的核酸の割合
n:初期標的核酸から分取するコピー数
b:分取液中に含まれる分析に用いる核酸のコピー数
また、分取する核酸のコピー数をnとし、np>5かつn(1−p)>5を満たす時、これは近似的に平均p、分散p(1−p)/nの正規分布従う。従って、以下のように分取すべき標的核酸コピー数値を統計学的に求めることができる。
n:初期標的核酸から分取するコピー数
T:nが正規分布を取る場合の統計量
R:pの信頼区間(取りうる値の範囲)
また、np>5かつn(1−p)>5を満たさない場合、Rの取りうる区間はt分布の統計量tn−1を用いて(3)式で表すことができるが、より好ましくは2項分布である(1)式を用いて算出するのがよい。
tn−1:nがt分布を取る場合の統計量
(2)及び(3)式より、初期標的核酸が十分大きい時、95%の信頼度でコピー数によるRの取りうる値を%に換算したとき、表1のように示すことができる。
k:分取液中に許される標的核酸比率の信頼区間
また、np>5かつn(1−p)>5を満たさないとき、t分布の統計量tn−1を用いて好ましくは(5)式で示すことができるが、より好ましくは2項分布である(1)式を用いて算出するのがよい。
tn−1:(3)式の定義と同じ
k:(4)式の定義と同じ
また、初期の標的核酸のコピー数が少ない場合、この初期の標的核酸のコピー数をNとすると、(2)および(3)式に有限母集団修正項を乗じて(2)式は(6)式で、(3)式は(7)式で表すことができる。
tn−1:(3)式の定義と同じ
N:初期標的核酸のコピー数
従って、初期標的核酸のコピー数が統計学的に小さい、好ましくは100、000より小さいとき、初期標的核酸のコピー数をNとすると、ある信頼度の信頼区間においてnp>5かつn(1−p)>5を満たすとき、本発明における所定の値nとは、(4)式で示した右辺をXとすると、次に示す(8)式により表すことができる。好ましくは信頼度95%を用いて、統計量T=1.96を与えるのがよく、より好ましくは99%の信頼度を用いて、統計量T=2.58を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Tを求めることもできる。
N:(6)式、(7)式の定義と同じ
また、ある信頼度の信頼区間においてnp>5かつn(1−p)>5を満たさないとき、(5)式で示した右辺をXtとすると、次に示す(9)式により表すことができるが、より好ましくは2項分布である(1)式を用いて算出するのがよい。
N:(6)式、(7)式の定義と同じ
また、標的核酸中における存在比率の小さい標的遺伝子を確実に増幅するための最低コピー数も算出することができる。例えば表1より、100,000以上のコピー数を持つ複数の種類の標的核酸中に10%の割合で存在している、ある1種類の標的遺伝子を増幅する場合、統計学的に、95%の信頼度において、コピー数が35未満では検出できない可能性がある。従って、ある信頼度の信頼区間において、pの割合で含まれている標的核酸を確実に増幅するために分取すべき所定の値nとは、分取液中にbコピー含まれる確率P(b)としたときにPoisson分布より与えられる(10)式より導くのが望ましい。
e:自然対数の底
しかし、(10)式は複雑かつ難解な式となるため、2項分布を正規分布に近似し、ある信頼度の信頼区間においてpの割合で含まれている標的核酸を確実に増幅できる所定の値nとは、統計量Tを用いて(11)式で示すことができる。好ましくは信頼度95%を用いて、統計量T=1.96を与えるのがよく、より好ましくは99%の信頼度を用いて、統計量T=2.58を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Tを求めることもできるが、より好ましくは、Poisson分布を用いる。
また、np>5かつn(1−p)>5を満たさないとき、t分布の統計量tn−1を用いて好ましくは(12)式で示すことができるが、より好ましくは、Poisson分布を用いる。
また、初期の標的核酸のコピー数が少ない場合、この初期の標的核酸のコピー数をNとし、(11)式で示した右辺をYとすると、次に示す(13)式により表すことができる。
N:(6)式、(7)式の定義と同じ
また、np>5かつn(1−p)>5を満たさないとき、(12)式で示した右辺をYtとすると、次に示す(14)式により表すことができるが、より好ましくは、Poisson分布を用いる。
N:(6)式、(7)式の定義と同じ
好ましくは信頼度95%を用いて、統計量T=1.96を与えるのがよく、より好ましくは99%の信頼度を用いて、統計量T=2.58を用いるのがよい。また、その他の信頼度を設定する場合は正規分布表より統計量Tを求めることもできる。
a)初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、
b)初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
c)算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段、
d)初期標的核酸コピー数と分析反応を行うために必要な標的核酸コピー数を比較し、分析反応液中の該標的核酸コピー数を決定した値以上に調整できない初期標的核酸を分析に用いない、もしくは分析してもデータとして用いない、もしくは分析データに警告を意味する表記または記号を付加する手段。
a)初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、
b)初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
c)算出した初期標的核酸コピー数から、増幅反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段、及び
d)初期標的核酸コピー数と増幅反応を行うために必要な標的核酸コピー数を比較する手段。
a)初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として要求する手段、
b)初期核酸濃度を核酸濃度測定装置を用いて測定、または増幅の経過及び核酸増幅量から推定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
c)該標的核酸の存在比率を分析した結果から、2項分布またその近似式を用いて、この結果の信頼区間を算出する手段、及び
d)差があると判定する閾値と信頼区間の重なりを調べ、閾値と信頼区間が重なっていなければ差がある、又は差がないと判定し、閾値と信頼区間が重なっている場合は判定無効とする手段。
(実施例1)SSCP解析法を用いた低濃度核酸のヘテロ接合体対立遺伝子の存在比率
1.試料の調整と一塩基多型部位の増幅
血液より抽出したヒト由来核酸における対立遺伝子の存在比について、初期標的核酸中の対立遺伝子の相対比率と増幅後の異なる2つの対立遺伝子の相対比率について、A)2%以内の精度を求める場合、B)5%以内の精度を求める場合、C)15%以内の精度を求める場合、D)40%以内の精度を求める場合、において必要なコピー数を表2に示した。それぞれのコピー数に分注した4種類の標的核酸増幅液それぞれに対して、表3に示す組成で調整した。すなわち、高い精度を期待する場合ほどコピー数が大きくなることが明らかである。これらの調整は8回の試行で行われた。
2.SSCP解析
上記の増幅反応後、Klenow Fragment(タカラバイオ社製)を用いて表4の組成により、温度37℃で30分間反応させ、末端平滑処理を行った。
SSCP解析では、ヘテロ接合体である対立遺伝子の増幅量をクロマトグラムにおいて2つの波形で検出できる。これら2つの波形の相対比率を求めることで、本来、等量含まれる対立遺伝子が核酸増幅後における変化を調べることができる。本実験においては8回の試行におけるピーク比率の変化の割合を調べた。この結果を表7に示す。
(実施例2)SSCP解析を用いたLOH検査
1.測定条件の決定
LOH検査とは、核酸中の2つの異なる対立遺伝子の量比を核酸中の一塩基の違いを利用して測定し、標準の所期標的核酸の該量比と比較して検査対象の該量比の変化を調べることである。従って、2つの異なる対立遺伝子の量比は、一般的には動物ゲノム核酸で1:1であり、2つの異なる対立遺伝子の一方を検出するとしたとき、この検出したい初期標的核酸の割合は50%のため、p=0.5が与えられる。これに対して、対立遺伝子の量比に変化があるかどうか検査する検査対象の該量比は、解析するまで、分からないため、仮に、標準と同じp=0.5を与え、解析後に補正する。また、本解析法は10%以上の核酸を検出する必要があることから、95%の信頼度において信頼区間を10%(±5%)以内に抑える必要があるため、T=1.96、k=0.05を与える。
2.初期標的核酸のコピー数決定および、増幅反応液中のコピー数決定
ヒト由来血液より、フェノール・クロロフォルム抽出法により抽出した膀胱癌患者のヒト血液由来核酸を標準の初期標的核酸として用い、該患者の尿より上記方法で抽出したヒト尿由来核酸を検査対象の初期標的核酸として用いた。これらの初期標的核酸の濃度をUV吸光測定装置を用いて測定し、細胞1個あたりのゲノムDNAの長さを4.0×106kbpと仮定して換算したコピー数を表8に示した。
3.核酸増幅反応液の調整と核酸増幅
反応液中の標的核酸のコピー数は、表9において決定された値以上の濃度(コピー数/μl)であればよく、初期標的核酸コピー数が十分存在する場合において、好ましくは10,000コピー程度に調整すると良い。従って、表10のように血液および組織由来ゲノムDNAを希釈し、10,000コピー/μlの希釈液を調整し、尿由来ゲノムDNAは少しでも濃度を高めるために、総量15μlの初期標的核酸溶液に対してエタノール沈殿法を用いて、総量を10μlに濃縮し、初期標的核酸濃度を157コピー数/μlとした。
4.SSCP解析法を用いたピーク比率測定
分析用サンプルの調整では次に示す順に試薬とサンプルを添加したが、添加する順序はこの例に限定されない。分析用の微量容器にDNAの変性剤であるFormamid 36μlにサイズ標準マーカとなる4nM TAMRA size standard(ABI社)を1.0μl添加し、DNA増幅産物の原液を3.0μl加え、総量40μlに調整した。調整サンプルに対してサンプル導入条件として電圧20kV時間5秒、泳動条件として電圧15kV、時間70分間でSSCP電気泳動を行った。この時、増幅したA〜Jの10種類の遺伝子検査領域に対して得られた2本のピークから、2つの異なる対立遺伝子のうち検出したい標的核酸の存在比率を測定した結果を表12に示す。
表12の結果および(2)、(6)式から、各遺伝子検査領域の持つ判定の閾値と、それぞれの遺伝子検査領域における組織および尿の比率の推定できる上限値と下限値示した、そしてこれらを考慮した判定を行う。この場合、判定の判断方法としては、比率上限が判定閾値よりも下であれば陽性、比率下限が判定閾値よりも上であれば陰性、上限と下限の間に判定閾値が入っている場合は判定無効と判断できる。これらの結果を表13に示す。
(実施例3)血液中のウイルス核酸の検出
1.測定条件の決定
血液中に微量に含まれるウイルス核酸を検出する方法として、患者の血液から抽出した初期核酸に対してウイルスの持つ遺伝子配列に特異的なプライマーを用い、遺伝子増幅を行うことでウイルス核酸を検出できる。本実施例では、遺伝子増幅を行う際に、この初期核酸から一部核酸を分取して増幅試薬中に投入する場合、初期核酸中に0.01%以上存在するウイルス核酸を99%の信頼度で分取できる核酸コピー数を決定する実施例について以下に述べる。このとき、0.01%以上のウイルス核酸を検出したいため、p=0.0001が与えられ、99%の信頼度における統計量T=2.58を与えることができる。
初期標的核酸のコピー数決定および増幅反応液中のコピー数決定
ヒト由来血液より、フェノール・クロロフォルム抽出法により抽出した患者のヒト血液由来核酸を標準の初期標的核酸として用い、初期標的核酸の濃度をUV吸光測定装置を用いて測定し、細胞1個あたりのゲノムDNAの長さを4.0×106kbpと仮定して換算したコピー数を表14に示した。ただし、ウイルス核酸のコピー数は不明のため、ゲノム核酸のコピー数から決定することとする。
Claims (21)
- それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ2種類以上の標的核酸試料から、標的核酸の一部を分取し、分取された核酸試料を検出または分析する方法であって、
初期標的核酸試料の核酸濃度から、初期標的核酸のコピー数を求める工程、及び
上記初期標的核酸試料から所定数以上のコピー数の標的核酸を分取する工程、
を含む核酸検出または分析方法。 - 更に、上記初期標的核酸試料から分取する標的核酸のコピー数が所定数を超えるときは、上記初期標的核酸試料を希釈し、該コピー数が所定数に満たないときは、上記初期標的核酸試料を濃縮する工程を含む、請求項1記載の核酸検出または分析方法。
- 更に、分取する標的核酸コピー数が所定の範囲になるように調整できない核酸試料を、次工程に用いないか、用いてもその結果を用いないか、もしくは結果に警告を表記または記号を付加する工程を含む請求項1記載の核酸検出または分析方法。
- 標的核酸の分取後、次工程として核酸増幅反応もしくは、分析反応を行う請求項1記載の核酸検出または分析方法。
- 前記初期標的核酸試料がゲノムDNAを含むものである請求項1記載の核酸検出または分析方法。
- 分取された核酸試料を核酸分析反応し、所望の手段により標的核酸を検出する工程を含む請求項1記載の核酸検出または分析方法。
- 標的核酸のコピー数から2項分布を用いた統計的手法または2項分布に近似した式により、分取すべき標的核酸のコピー数を決定する工程を含む請求項1記載の核酸検出または分析方法。
- 一塩基以上の異なる塩基配列部位が遺伝子多型であることを特徴とする請求項1に記載の核酸検出または分析方法。
- 一塩基以上の異なる塩基配列部位が一塩基多型であることを特徴とする請求項1に記載の核酸検出または分析方法。
- 一塩基以上の異なる塩基配列部位がマイクロサテライト多型であることを特徴とする請求項1に記載の核酸検出または分析方法。
- それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ2種類以上の標的核酸試料を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な2種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な2種類以上のプライマーを用いて同時に増幅し、該標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析する核酸検出または分析方法であって、
a)該標的核酸を含む増幅反応液を用いて核酸増幅を行う工程、
b)核酸増幅量または核酸増幅の経過から増幅反応液中の標的核酸のコピー数および、初期標的核酸のコピー数を推定する工程、
c)推定された初期標的核酸コピー数から、2項分布を用いた統計的手法または2項分布に近似した式により増幅反応液中に必要な標的核酸コピー数濃度を決定する工程、
d)決定された必要なコピー数値と推定された増幅反応液中の標的核酸コピー数とを比較する工程、
を含むことを特徴とする核酸検出または分析方法。 - 2つの異なる核酸の増幅量を定量することにより検出または分析する方法として、一本鎖DNA高次構造多型解析法を用いることを特徴とする請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- 2種類以上の異なる標的核酸に、それぞれ2色の異なる蛍光を標識し、これらの蛍光の発光量の差から標的核酸の増幅量の違いを分析する方法として、2色蛍光核酸マイクロアレイを用いることを特徴とする請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- 上記標的核酸における標的遺伝子部位の増幅核酸量の比率を分析し、標準試料として分析した標的核酸と検査対象として分析した標的核酸の存在比率を比較して、予め設定された閾値を元にピーク比率の変化に差があるかないかを判定する工程を含む請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- 2項分布を用いた統計的手法により、測定した該標的核酸の存在比率の信頼区間を算出する工程を含む請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- 差があると判定する閾値と信頼区間の重なりを調べ、閾値と信頼区間が重なっていなければ差がある、又は差がないと判定し、閾値と信頼区間が重なっている場合は判定無効とする工程を含む請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- それぞれ一塩基以上が異なる塩基配列を持つ2種類以上の標的核酸を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な2種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な2種塁以上のプライマーを用いて、含まれている標的核酸の中で比率の最も少ない標的核酸を増幅する工程を含む請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- 初期標的核酸のコピー数からポアソン分布(Poisson Distribution)を用いた統計的手法により増幅反応液中の標的核酸コピー数を決定する工程を含む請求項11記載の核酸検出または分析方法。
- 増幅または分析反応液中の標的核酸コピー数が所定の値以上になるように、初期標的核酸試料を希釈・濃縮し、増幅または分析反応液を調整する工程、
増幅または分析反応液中の該標的核酸コピー数を上記所定の値以上に調整できない初期標的核酸試料を分析に用いない、もしくは分析してもデータとして用いない、もしくは分析データに警告を意味する表記または記号を付加する工程、
を含む請求項11記載の核酸検出または分析方法。 - 核酸検出または分析装置のコンピュータを、
a)それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ2種類以上の標的核酸試料を、一塩基以上の異なる塩基配列部位に対して特異的な2種類以上のプライマーまたはそれぞれ異なる塩基配列部位に対して特異的な2種類以上のプライマーを用いて検出または分析する際に、初期核酸濃度からコピー数を決定するための標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、
b)初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、
c)算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段、
として機能させるための核酸検出または分析プログラム。 - サンプル分注装置と、試料中の核酸濃度を測定する装置と、入出力装置と、核酸検出部と、それぞれ一塩基以上の異なる塩基配列を持つ2種類以上の初期標的核酸試料を検出する際に、コンピュータを、a)初期核酸濃度からコピー数を決定するための初期標的核酸の長さ、または核酸の由来を初期条件として入力する手段、c)初期核酸濃度を測定した結果を元に、初期標的核酸中のコピー数を算出する手段、b)算出した初期標的核酸コピー数から、分析反応液中に必要な標的核酸のコピー数を決定する手段として機能させるためのプログラムを格納した記憶装置と、該記憶装置のプログラムを読み出し、かつ検出または分析装置を制御するコンピュータと、少なくとも演算結果を表示する表示装置とを有する核酸または分析装置。
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