CN106755467B - 一种检测ffpe样本dna含量及完整性的方法 - Google Patents

一种检测ffpe样本dna含量及完整性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。应用本发明的技术方案，能够精准测定FFPE DNA的有效浓度，并且量化其降解程度。

Description

一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。
背景技术
FFPE为福尔马林固定、石蜡包埋的样本。这类病理样本是珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。而二代测序的不断发展及其在医学上的应用给临床复杂疾病的基因诊断和治疗带来了新的曙光。FFPE样本测序流程主要分为核酸提取、文库构建、上机测序及数据分析、解读四个部分。而提取的核酸的质量对建库的成功与否乃至下机数据的可靠性都起着重要的作用，因此对提取后核酸进行严格的质控就显得尤为重要。
而目前传统的核酸检测方法由于易受到杂质，高级结构等影响从而无法准确的评估FFPE样本的DNA有效浓度及完整性。
目前检测DNA浓度的方法主要为分光光度计法和Qubit荧光剂法。分光光度计是利用核酸分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C一)，能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光；核酸(DNA/RNA)的最大紫外吸收值在260nm处；遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。尽管紫外吸收定量法是最常用的一种DNA定量方法，但其读数并不可靠且不准确。紫外吸光度法能够检测吸光度为260nm的所有物质，包括DNA、RNA、蛋白质、降解核酸和游离核苷酸。因此其无法准确对FFPE样本的有效DNA片段进行定量。另一种常用的DNA定量仪器
Figure BDA0001208223410000011
2.0/3.0荧光计采用专门研制的荧光检测技术，该技术采用只有与DNA结合后才发出荧光的分子染料；这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时，才能发出荧光信号，从而测定DNA浓度。但是其测定的浓度包含所有的DNA片段，包括降解的(如小于100bp)DNA片段。而这部分小片段对于DNA样本的后期建库是无意义的。Qubit荧光计定量受样本杂质的影响也较大。这两种方法检测的DNA浓度受DNA溶液中蛋白质等杂质的影响较大，因此定量不准确。
目前检测DNA完整性/降解程度使用较多的方法为琼脂糖凝胶电泳及安捷伦2100生物分析仪(Aligent Bioanlyzer 2100)。琼脂糖凝胶电泳是利用DNA片段迁移距离与碱基对的对数成反比，通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，得出未知片段的大小，进而对FFPE样本DNA的降解程度进行检测。但是该检测方法受杂质如蛋白质与DNA交联的影响较大，迁移率受到影响，从而无法准确判断其降解程度。而且该方法也不能对FFPE DNA样本的降解程度进行量化。Aligent Bioanlyzer 2100也存在着同样的问题，同时其仪器成本及检测成本也比较高。
为了精确检测FFPE样本DNA的含量及完整性，并且将其成本降至最低，从而为建库提供准确的指导，避免样本、时间、试剂、人力等成本的浪费，亟待开发新的检测FFPE样本DNA的含量及完整性方法和产品。
发明内容
本发明旨在提供一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法，以精确检测FFPE样本DNA的含量及完整性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。
进一步地，M为50～100bp；N为150～300bp。
进一步地，S2中取n个不同降解程度的样本，其中，n不少于200。
进一步地，内参基因为GAPDH基因。
进一步地，M＝74，N＝195，n＝200。
进一步地，Mbp产物的扩增引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；Nbp产物的扩增引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
进一步地，S4确定量化的判定标准为：
Figure BDA0001208223410000021
应用本发明的技术方案，主要针对FFPE的DNA样本，采用qPCR方法对其进行准确的质控，使用内参基因，设计长度不同的两对引物，在本发明中只需绘制较短产物的标准曲线，通过标准曲线计算FFPE DNA的有效浓度，通过两个产物的CT差值判定DNA的降解程度，DNA降解越严重，其CT差值越大。本发明能够精准测定FFPE DNA的有效浓度，并且量化其降解程度；从而为后续的建库、上机、信息分析提供准确的指导。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1中检测FFPE样本DNA含量及完整性的流程示意图；以及
图2示出了实施例1中FFPE DNA样本A、B的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法。该方法包括以下步骤：S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；S3，每个样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及S4，根据样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准。
应用本发明的技术方案，主要针对FFPE的DNA样本，采用qPCR方法对其进行准确的质控，使用内参基因，设计长度不同的两对引物，在本发明中只需绘制较短产物的标准曲线，通过标准曲线计算FFPE DNA的有效浓度，通过两个产物的CT差值判定DNA的降解程度，DNA降解越严重，其CT差值越大。本发明能够精准测定FFPE DNA的有效浓度，并且量化其降解程度；从而为后续的建库、上机、信息分析提供准确的指导。
较短的Mbp长度的产物可以很好的反应FFPE DNA内部产物的实际浓度。若DNA完整性越差，降解越严重，Nbp长产物与Mbp短产物的CT差值越大，因此通过CT差值的大小可以精确的反应DNA的降解程度。M的长度应该在50-100bp之间；N的长度应该在150-300bp之间。CT差值要能明确区分不同降解程度的DNA样本。优选的，S2中取n个不同降解程度的样本，其中，选定样本的数量n应不少于200个，选择大量样本可以通过统计学方法获得DNA样本降解程度判定标准的准确数据。
根据本发明一种典型的实施方式，内参基因为GAPDH基因。GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶的编码基因。该酶是糖酵解反应中的一个酶，该酶基因为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达，并且表达量是恒定的。因此使用GAPDH基因进行FFPE DNA样本的有效浓度及完整性的检测。
根据本发明一种典型的实施方式，M＝74，N＝195，n＝200。
优选的，Mbp产物的扩增引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；Nbp产物的扩增引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
采用上述引物，S4确定量化的判定标准为：
Figure BDA0001208223410000041
根据本发明一种典型的实施，主要针对FFPE的DNA样本，采用qPCR方法对其进行准确的质控。使用GAPDH内参基因，设计74bp、195bp两对引物，只需绘制74bp产物的标准曲线，通过标准曲线计算FFPE DNA的有效浓度。通过195bp及74bp两个产物的CT差值判定DNA的降解程度。DNA降解越严重，其CT差值越大。本发明能够精准测定FFPE DNA的有效浓度，并且量化其降解程度；从而为后续的建库、上机、信息分析提供准确的指导。使用本发明的技术方案可以排除低质量样本，提高建库成功率，降低DNA不合格导致后期结果不可信的情况，进而节省公司的成本，避免患者样本的浪费，为患者提供更加准确的检测结果，从而为后续疾病的预防、用药指导等提供更加可靠的指导。
与现有的方法相比，本发明的方法不受FFPE DNA样本中蛋白质等杂质及小片段的影响，可以准确对DNA的有效浓度进行测定，并且可以准确的判断DNA的降解程度。目前也有使用qPCR的方法对DNA样本的有效浓度及降解程度进行检测，主要是通过2-3对引物，绘制2-3个标准曲线，因此一个样本的检测需要的成本较高。本发明主要是通过qPCR方法精确的对FFPE DNA进行质控，并且将质控的成本降至最低。本发明设计2对qPCR引物：通过较短的产物为74bp的引物实现FFPE DNA有效浓度的测定。通过195bp与74bp扩增产物的CT差值对FFPE DNA样本的完整性进行量化。本发明为FFPE DNA样本的后续建库提供了准确的指导，避免样本、时间、试剂、人力等成本的浪费，从而为患者提供快速、可靠的检测结果。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
本实施例中的主要步骤见图1，主要包括FFPF DNA提取，qPCR质控(定量及降解程度检测)，该步骤包括标准品梯度稀释、DNA样本15倍稀释、74bp、159bp mix(混合液)配置，样本或标准品与混合液混合，然后进行上机操作以及下机数据分析。
具体步骤如下：设计GAPDH基因产物长度为74bp、195bp两对引物(简称74bp引物和195bp引物)。选择200个不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，使用人全基因组DNA进行标准曲线的绘制。每个样本分别采用74bp引物、195bp引物进行反应。根据74bp引物的产物浓度确定DNA的有效浓度(即只做74bp引物的标准曲线即可)；根据195bp引物与74bp引物的产物的CT差值(δCT)判断DNA的降解程度。根据200个样本的检测结果及建库、信息分析结果确定量化的判定标准。具体操作方案如下：
⑴定量引物设计
74bp引物：上游引物序列(SEQ ID NO：1)：ATTCCACCCATGGCAAATTC，20bp
下游引物序列(SEQ ID NO：2)：GATGGGATTTCCATTGATGACA，22bp
195bp引物：上游引物序列(SEQ ID NO：3)：ATTCCACCCATGGCAAATTC，20bp
下游引物序列(SEQ ID NO：4)：GGGACAGGACCATATTGAGGG，21bp
⑵使用到的试剂
诺唯赞，VAHTS SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞染料法qPCR预混液)。
Promega，人全基因组DNA标准品(Human Genomic DNA)，200ng/μl
不含核酸酶的水(Nuclease-free water)。
⑶使用到的仪器：Life technology，AB 7500荧光定量PCR仪。
⑷实验操作
标准品的稀释
使用Nuclease-free Water将人全基因组标准品(200ng/μl)按表1进行10倍梯度稀释：
表1
Figure BDA0001208223410000051
每一步稀释需充分振荡混匀，并离心10s将液体收集到管中。(此处离心是指轻微离心将震荡时溅到管盖及管壁上的液体收集到管中)。
待检DNA的稀释
将DNA样品稀释15倍，即3μLDNA+42μL Nuclease-free Water，充分震荡混匀离心。
反应液的配制
反应总体系20μl，每个标准品及样品做2个复孔。反应体系分为扩增产物74bp及195bp 2种：
74bp：标准品及待检DNA样品，用于待检DNA浓度的测定。
195bp：待检DNA样品，通过δCT值(CT195-CT74)判定DNA的降解程度。
每板(96孔)可做4个标准品和22个样品。
①qPCR混合液(Mix)的配制如表2：
表2
Figure BDA0001208223410000061
将配制好的Mix充分混匀离心后，进行分配，每个qPCR管中加入11.2μl配制好的qPCR mix。
②qPCRMix和qPCR标准品及样品的混合
往已加入qPCR Mix的qPCR管中加入配制好的标准品或样品，每孔加入8.8μl。标准品及样品排列方式见表3(STD为梯度稀释好的标准品，A2-A7，B2-B7，C2-C7，D2-D7，E2-E7，F2-F7，G2-G5，H2-H5标注为74bp扩增体系，剩余的为195bp扩增体系：
表3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A STD1 1 1 9 9 17 17 1 1 9 9 19
B STD1 2 2 10 10 18 18 2 2 10 10 19
C STD2 3 3 11 11 19 19 3 3 11 11 20
D STD2 4 4 12 12 20 20 4 4 12 12 20
E STD3 5 5 13 13 21 21 5 5 13 13 21
F STD3 6 6 14 14 22 22 6 6 14 14 21
G STD4 7 7 15 15 17 17 7 7 15 15 22
H STD4 8 8 16 16 18 18 8 8 16 16 22
盖好PCR管盖后振荡混匀一次，简短离心，离心后检查液面是否平齐，是否有气泡，若有气泡再次离心将其去除。
上机操作
按照以下程序在AB7500荧光定量PCR仪上设置：依次设置标准品的浓度；
设置ROX作为参考染料；反应体系20μL；选择SYBR Green Reagents作为荧光染料检测类型；反应程序设置如表4：
表4
Figure BDA0001208223410000071
程序设置完成后，运行程序：打开样品槽，按照设置好的样品位置放好样品，检查样品顺序放置无误后关闭样品槽后点击“Start”，这时软件会询问数据存放的位置，确定好数据存储位置后开始运行程序。
数据处理
①DNA样本浓度＝74bp产物的浓度×稀释倍数，即为该样本的有效浓度。
②DNA样本的降解程度计算公式：δCT＝CT195-CT74
③δCT值法判定标准见表5(根据200例样本结果确定)：
表5
Figure BDA0001208223410000072
下面以2例FFPE DNA样本为例进行说明。FFPE DNA样本A、B，使用Qubit进行浓度的检测，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA降解程度的检测，120V，30min。结果如图2所示。
对以上A、B两个样本采用qPCR方法进行质控。结果如表6所示：
表6
Figure BDA0001208223410000081
根据两种方式的质控结果，对A、B两个样本进行建库。每个样本分别按照Qubit及qPCR定量的浓度取10ng进行建库，并进行上机分析。建库试剂盒为Life technologies IonAmpliSeqTMLibrary Kit 2.0；上机平台为Life technologies Ion Proton测序仪。A样本Qubit、qPCR定量方法构建的文库分别命名为LibA01，LibA02；同理B样本文库命名为LibB01，LibB02。通过qPCR方法对LibA01，LibA02，LibB01，LibB02四个文库进行定量，文库总量分别为12.1、288.5，17.9、504.2pM，使用Qubit定量两个样本所建文库的浓度过低，均不满足上机要求；因此选择文库LibA02，LibB02上机。从DNA样本浓度来看使用Qubit检测，A、B两个样本的浓度均较高，而qPCR定量结果显示两个样本的有效浓度均<0.5ng/μL。结合建库结果可以看出，Qubit对于杂质较多的FFPE样本定量不准确，定量偏差太大，而qPCR方法定量较为准确，可以为后续建库提供更可靠的指导。
信息分析结果表明两个样本均降解严重，各项质控指标均不合格。如表7：
表7
Figure BDA0001208223410000082
标准为该指标正常水平的阈值，“+”表示该指标越高越好，“-”表示该指标越低越好。平均长度：reads的平均长度，即总数据量/总reads；特异性扩增：表示覆盖目标区域的reads占总reads的百分比；测序均一性：表示测序深度低于平均测序深度20％的靶向位点占总靶向位点的百分比；3000X区域覆盖率：表示测序深度高于3000X的靶向位点占总靶向位点的百分比。
从表7可以看到A、B两个样本的各项指标均低于标准值，表明两个样本均降解严重，测序结果不可信。而从琼脂糖凝胶电泳结果来看，其降解程度为可接受，而qPCR表明两个样本降解严重，无法建库、上机。qPCR对于FFPE DNA样本降解程度的判定更加准确。以上2个实例表明qPCR方法可以对FFPE样本DNA的含量及完整性进行精确的检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001208223410000101
Figure BDA0001208223410000111
。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津诺禾医学检验所有限公司
<120> 一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法
<130> PN60171NHZY
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> artifical
<220>
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attccaccca tggcaaattc 20
<210> 2
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<212> DNA
<213> artifical
<220>
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<400> 2
gatgggattt ccattgatga ca 22
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<213> artifical
<220>
<223> 引物
<400> 3
attccaccca tggcaaattc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artifical
<220>
<223> 引物
<400> 4
gggacaggac catattgagg g 21

Claims (6)

1.一种检测FFPE样本DNA含量及完整性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，根据FFPE样本的内参基因设计产物长度为Mbp和Nbp的两对引物，其中，M<N；
S2，取不同降解程度的样本，使用qPCR方法进行定量，并使用人全基因组DNA标准品采用扩增Mbp产物的扩增引物进行标准曲线的绘制；
S3，每个所述样本分别采用上述两对引物进行扩增，根据Mbp产物的浓度确定DNA的有效浓度，根据Mbp产物与Nbp产物的CT差值判断DNA的降解程度；以及
S4，根据所述样本的检测结果及建库信息分析结果确定量化的判定标准；所述S2中取n个不同降解程度的样本，其中， n不少于200。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，M为50~100bp；N为150~300bp。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内参基因为GAPDH基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述M=74，N=195，n=200。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述Mbp产物的扩增引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述Nbp产物的扩增引物为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述S4确定量化的判定标准为：
判定等级 CT差值 说明 B CT<4.5 DNA完整性较好，可建库 C 4.5≤CT<6.5 降解可接受，可建库 D CT≥6.5 不建议建库
。
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