CN109593832A - 一种ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法 - Google Patents

一种ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ARMS‑ddPCR基因点突变的检测方法，针对一个位点的基因突变，引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针，进一步结合ddPCR平台检测出突变位点，并对样品突变位点DNA进行绝对数量。本发明特别适用于血浆游离DNA(cfDNA)等小片段DNA样本的扩增，运用本发明，可以从cfDNA中检测到极低丰度的基因突变，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用ddPCR平台对基因突变位点进行绝对定量检测，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用。

Description

一种ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法
技术领域
本发明涉及一种基因点突变的检测方法，属于分子生物领域，具体涉及一种ARMS-qPCR和ddPCR相结合而形成的ARMS-ddPCR基因突变检测方法。
背景技术
目前常用的基于PCR的基因突变检测方法有ARMS-PCR和数字PCR两种。ARMS-PCR：扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应，而与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物。目前市场上流行的比如肿瘤靶向用药EGFR基因检测，CFDA批准的检测试剂盒，90％以上都是ARMS-PCR，结合TaqMan探针进行检测的方法，从而确定基因突变类型及比率。
微滴数字PCR即Droplet digital PCR(ddPCR)，它通过将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应单元中，在每个反应单元中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度，实现对核酸分子的绝对定量的技术。
这两种方法均存在一定的优点与缺陷。ARMS-PCR引物是从一段序列3’端及其附近人为加入的错配位点组合筛选出能够区分单个位点的等位基因产物，序列固定，仅需要优化上游引物，成本低，优化时间短。通常等位位点之间CT差值可以达到15以上，保证特异性。ARMS-PCR在设计上可以最大限度的缩短目标产物的长度，因而受DNA样品片段化的影响，操作简单，无需产物的后处理，能最大程度的避免扩增产物的污染，时耗短，成本相对较低。ARMS-PCR临床应用的最大局限性在于灵敏度偏低，ARMS-PCR灵敏度一般在1％左右，对于低于1％的突变，尤其是血液样品的检测灵敏度不足，局限了临床医生对靶向药物疗效的判断。为了进一步增加灵敏度，ARMS-PCR常需进一步特殊设计。如厦门艾德的ARMS-plus PCR，引入stem-loop的扩增引物设计，并采用野生型阻涉探针，进一步封闭突变探针对野生型基因的扩增，以提高灵敏度。经过这种设计的试剂盒检测灵敏度报导可达到0.2％(见CN106755388A，一种改进的ARMS引物结构(Super-ARMS)及其使用方法)。
相较于ARMS-PCR，ddPCR的绝对定量技术，尤适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域，其特点是灵敏高、定量精确、费用适中，是一种很有前途的分子定量检测手段。ddPCR尤其适合检测以及定量微量分子标记，如包括ctDNA在内、在肿瘤早期阶段突变丰度仅占0.01％的稀有突变。ddPCR用于等位基因突变检测通常使用一对引物，一对探针，突变位点设计于探针序列中。对等位基因点分型点阵来分析，通过调整等位位点探针序列退火温度Tm值差异尽量消除非特异性扩增。但是ddPCR用于基因突变常需要深度优化探针序列。由于要突出突变型和野生型探针在Tm上的差异，序列设计通常相对较短，一般要采用特殊修饰的探针，比如MGB或者锁核酸(LNA)。而且突变位点在探针序列中位置不固定，需要大量的实验优化，优化时间长，成本高，并且其检测的动态范围要小，容易产生假阳性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供一种用于检测基因点突变的ARMS-ddPCR方法，使得结果准确性更高，以便快速得出具有参考意义的临床结果。
为解决实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，针对一个位点的基因突变，引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针。
本申请ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，兼顾了ARMS-qPCR技术和ddPCR技术的优点，灵敏度要高于ARMS-qPCR，特异性高于ddPCR，检测效果比ARMS-qPCR技术和ddPCR技术更好。
为了提高检测的特异性和灵敏性，突变基因检测引物在3’端碱基末2位、3位和4位中单独或同时引入突变，引物长度在18-30碱基之间。
为了进一步提高检测的灵敏性，探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记；野生型检测探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记。
优选，引物扩增长度为80-200bp。
为了进一步提高检测的精准性，优选，结合ddPCR平台检测出突变位点，并对样品突变位点DNA进行绝对定量。
上述方法能够绝对定量基因点突变。
本发明在一轮PCR结束后进行了一次绝对定量，避免了不必要的重复，节省时间、人力和成本。
本发明提供的用于ARMS-ddPCR技术检测基因突变位点引物和探针是根据基因野生型序列和相应突变序列设计的并进行优化，结合ddPCR平台检测出突变位点，并对样品突变位点DNA进行绝对数量。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，特别适用于血浆游离DNA(cfDNA)等小片段DNA样本的扩增，运用本发明，可以从cfDNA中检测到极低丰度的基因突变，具有特异性好、灵敏度高的特点，可应用于ddPCR平台对基因突变位点进行绝对定量检测，对于指导临床治疗、改善患者预后有极为重要的作用；本发明与ARMS-qPCR和ddPCR相比较灵敏高(>0.01％)、定量精确，优化简单，特异性高，成本低。
附图说明
图1为本发明实施例1中ARMS-ddPCR引物筛选实验结果；
图2为本发明实施例1中以筛选到的引物测定T790M阳性样本ARMS-ddPCR液滴二维分布图；
图3为本发明实施例1中ARMS-ddPCR引物检测不同突变检测的1D图谱；
图4为本发明实施例1中ARMS-ddPCR引物突变检测率(在30000拷贝数的前提下可以达到万分之一)。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本实发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库，所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)。
实施例1EGFR基因T790M突变位点的检测
人类EGFR基因主要在四个外显子上产生突变，它们分别是18,19,20和21号外显子，其中18号外显子有5种突变型，19号外显子有34种突变型，20号外显子有9种突变型，21号外显子有3种突变型。本实施例选择最常见的EGFR基因的第20号外显子T790M突变来对比本申请的ARMS-ddPCR法和现有的ARMS-qPCR法和ddPCR法。
构建EGFR基因T790M突变位点质粒标准品
采用Overlap PCR法对T790M位点进行定点突变，并将突变基因构建入质粒。
采用Overlap PCR法的引物为20位外显子引物及T790M位点引物见表1。
表1构建EGFR基因T790M突变位点引物列表
分别将20位外显子引物F和T790M R、20位外显子引物R和T790M F组成两个反应体系，进行PCR扩增。扩增体系表2和条件见表3
表2 PCR扩增体系
表3 PCR反应程序
胶回收两个PCR反应的扩增产物，用1％琼脂糖胶电泳，切胶，采用Tiangen胶回收试剂盒回收PCR产物。将两组回收的产物混合，互为模板，采用如下的PCR反应体系(见表4)及条件(表5)进行第二次扩增。
表4 PCR扩增体系
表5 PCR反应程序
胶回收PCR反应的扩增产物，用1％琼脂糖胶电泳，切胶，采用Tiangen胶回收试剂盒回收PCR产物。将回收产物作为模板，用20位外显子引物F和20位外显子引物R作为模板，根据表2的反应体系和表3的反应条件进行PCR扩增。
胶回收PCR反应的扩增产物，用1％琼脂糖胶电泳，切胶，采用Tiangen胶回收试剂盒回收PCR产物。将突变片断构建入pMD19载体，转化进入DH5α感受态细胞。然后进行测序验证，证明质粒标准品已成功构建。
一、ARMS-qPCR法检测EGFR基因T790M位点基因突变：
本实施例根据EGFR基因的第20号外显子的野生型基因序列和相应突变基因序列，应用Primer软件设计引物及探针，并在EGFR基因上设计引物和探针作为内参(表6)，并按照表7中的体系和表8中的程序进行ARMS-qPCR反应，为以评价样本提取及PCR反应效率。
表6 ARMS-qPCR的引物及探针
表7 ARMS-qPCR反应体系
表8 ARMS-qPCR反应程序
1、灵敏度试验
将构建的质粒标准品进行依次稀释，取1、101、102、103、104、105Copies稀释梯度进行灵敏度试验。每个梯度设计3个重复孔。可最低检测10个Copies。
2、特异性验证及Cut-off△Ct值确定
选出10份白细胞DNA，浓度范围1-50ng/μL，进行6次重复试验，统计每次出现的非特异性扩增Ct值及样本的内参Ct值，计算出△Ct值，并计算Cut-off△Ct值为8。
收集90份正常人血浆样本，提取DNA，按建立的方法进行检测，以验证特异性，结果均为出现非特异性扩增信号。
3、检测分辨率试验
分别将依次稀释的T790M突变型质粒加入到500copies/μL的Exon 20野生型质粒中，制成依次为10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0％突变率的样本，按建立的方法检测，以验证可检测的最低突变率。
分别将依次稀释的T790M突变型质粒加入到5000copies/μL的Exon 20野生型质粒中，制成依次为10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0％突变率的样本，按建立的方法检测，以验证可检测的最低突变率。
结果为：在500copies/μL的野生型质粒背景下，可检出突变率为1％；在5000copies/μL的野生型质粒背景下，可检出突变率为0.5％。
二、ddPCR法检测EGFR基因T790M位点基因突变：
本检测采用伯乐(Bio-Rad)PrimePCRTMddPCRTMT790M Mutation Detection Assay检测试剂盒进行检测。
表9 PCR反应体系总体系25μL
表10反应程序
ddPCR检测流程如下：
1)配制反应液：将引物、探针、DNA模板、dd PCRsupermix配制成22μL反应液，加入到微滴发生卡上；
2)制备微滴：将微滴发生卡放入微滴生成器内，在2.5分钟内将每个22微升反应液分成20000个液滴；
3)PCR扩增：将微滴转移到96孔板上，于PCR仪上进行扩增；
4)检测微滴：将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器；
5)分析数据：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，软件记录每个样品里阳性微滴的比例；
6)显示结果：软件自动分析数据，并以多种方式显示检测结果。
1、灵敏度试验
将构建的质粒标准品进行依次稀释，取1、101、102、103、104、105Copies稀释梯度进行灵敏度试验。每个梯度设计3个重复孔。可最低检测10个copies。
2、特异性验证
选出10份白细胞DNA，浓度范围1-50ng/μL，进行6次重复试验，统计每次出现的非特异性扩增，非特异性扩增出现次数为0。
收集294份临床人血浆样本，提取DNA，按建立的方法进行检测，与NGS结果进行对比，以验证特异性，特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％，通过对结果进行统计，其特异性为98.1％。
3、检测分辨率试验
将质粒稀释至107、106、105、104、103、102、101copies/μL并混合加入10ng/μL的人DNA(约为3000copies/μL)，发现107、106、105copies/μL质粒由于质粒拷贝数过高，无法检出。而104、103、102、101copies/μL并混合加入10ng/μL的人DNA(约为3000copies/μL)可以正常检出。检测分辨率为0.1％。
将质粒稀释至107、106、105、104、103、102、101copies/μL并混合加入100ng/μL的人DNA(约为30000copies/μL)，发现107、106、105copies/μL质粒由于质粒拷贝数过高，无法检出。而104、103、102、101copies/μL并混合加入100ng/μL的人DNA(约为30000copies/μL)可以正常检出。检测分辨率为0.01％。
三、ARMS-ddPCR法检测EGFR基因T790M位点基因突变
依据突变位点信息，应用Primer软件设计引物及探针，遵循引物及探针设计的重要原则：针对一个位点的基因突变，引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针；突变基因检测引物在3’端碱基末2位、3位和4位中单独或同时引入突变，引物长度在18-30碱基之间；探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记；野生型检测探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记。通过设计的引物和探针(表11)并进行优化筛选。
引物筛选：
1)配置反应液：将引物、探针、ddPCR supermix和DEPC水配制成18μL的反应液(PCR反应液构成见表12)，在PCR反应液中加入样本2μL。将配制好的ddPCR反应液依次加入到液滴生成芯片(Bio-Rad，美国)的反应孔中。
2)制备液滴：将液滴生成芯片放到液滴生成仪器(Bio-Rad，美国)中生成液滴。理论上，每个25μL样本最多可以生成400万个液滴。
3)PCR扩增：将收集所生成液滴转移到96孔板并封口(Bio-Rad，美国)后，置于PCR仪(Bio-Rad，美国)中扩增，PCR条件见表13。
4)液滴检测：PCR反应完成后，将装有液滴的96孔板置于液滴检测仪
(Bio-Rad，美国)中，启动程序开始液滴检测。
5)数据分析。
引物筛选的示例图如图1所示。
表11引物和探针序列
注：下划线标注错配碱基
表12 PCR扩增体系
表13 PCR扩增条件
选取构建的质粒标准品，利用将筛选到的引物，按照如下ARMS-ddPCR检测流程进行试验。
1)配制反应液：将引物、探针、DNA模板、dd PCR supermix配制成22μL反应液，加入到微滴发生卡上；
2)制备微滴：将微滴发生卡放入微滴生成器内，在2.5分钟内将每个22微升反应液分成20000个液滴；
3)PCR扩增：将微滴转移到96孔板上，于PCR仪上进行扩增；
4)检测微滴：将96孔板放入微滴分析仪，顺序吸取每个样品的微滴并随载液流逐一通过双色检测器；
5)分析数据：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，软件记录每个样品里阳性微滴的比例；
6)显示结果：软件自动分析数据，并以多种方式显示检测结果。
质粒标准品的检测结果如图2所示。
1、灵敏度试验
将构建的质粒标准品进行依次稀释，取3、101、102、103、104、105copies稀释梯度进行灵敏度试验。每个梯度设计3个重复孔。可最低检测3个Copies。检测结果如图3所示。
2、特异性验证
选出10份白细胞DNA，浓度范围1-50ng/μL，进行6次重复试验，统计每次出现的非特异性扩增，非特异性扩增次数为0。
收集393份临床人血浆样本，提取DNA，按建立的方法进行检测，与NGS结果进行对比，以验证特异性，特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％，通过对结果进行统计，其特异性为99.5％。
3、检测分辨率试验
将质粒稀释至107、106、105、104、103、102、101copies/μL并混合加入10ng/μL的人DNA(约为3000copies/μL)，发现107、106、105copies/μL质粒由于质粒拷贝数过高，无法检出。而104、103、102、101copies/μL混合加入10ng/μL的人DNA(约为3000copies/μL)可以正常检出。检测分辨率为0.1％。
将质粒稀释至107、106、105、104、103、102、101copies/μL并混合加入100ng/μL的人DNA(约为30000copies/μL)，发现107、106、105copies/μL质粒由于质粒拷贝数过高，无法检出。而104、103、102、101copies/μL混合加入100ng/μL的人DNA(约为30000copies/μL)可以正常检出。检测分辨率为0.01％。检测结果如图4所示。
根据上述三种方法的检测结果可知：从检测灵敏度试验的结果可以看出，ARMS-ddPCR法和常规ddPCR法的检测灵敏度一致，均高于ARMS-qPCR法；从特异性试验的结果可以看出，ARMS-qPCR法，因为其特异性为相对值，与ddPCR法和ARMS-ddPCR法不能进行直接比较，所以只比较统计学理论上的ddPCR法和ARMS-ddPCR法，ddPCR法的特异性为98.1％和ARMS-ddPCR法的特异性为99.5％，ARMS-ddPCR法比ddPCR法的特异性更高；检测分辨率试验结果可知，ARMS-PCR法的检测分辨率最低，ARMS-ddPCR法和ddPCR法检测分辨率相当。因此，通过分析可知，ARMS-ddPCR法相较于ARMS-PCR和ddPCR法检测效果更好。
最后说明的是，以上所述仅为本发明的一种具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，其特征在于：针对一个位点的基因突变，引物包括野生型引物和突变引物，探针包括野生型探针和至少一种突变探针。
2.如权利要求1所述的ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，其特征在于：引物在3’端碱基末2位、3位和4位中单独或同时引入突变，引物长度在18-30碱基之间。
3.如权利要求1或2所述的ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，其特征在于：探针序列的5’端设有FAM荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记；野生型检测探针序列的5’端设有HEX荧光标记，3’端设有MGB或者BHQ荧光标记。
4.如权利要求1或2所述的ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，其特征在于：引物扩增长度为80-200bp。
5.如权利要求1或2所述的ARMS-ddPCR基因点突变的检测方法，其特征在于：结合ddPCR平台检测出突变位点，并对样品突变位点DNA进行绝对定量。
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