CN110358813A - 一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法。本方法利用数字PCR检测平台，在一个PCR扩增体系中加入多条待检基因多种结构变异检测的正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物及两条荧光标记的探针。将目标基因组结构变异区段及非结构变异区段同时扩增，并且所扩增的非结构变异区段包含于目标基因组结构变异区段内，即以待检基因自身作为对照，显著减少多引物多扩增所带来的信号干扰，同时无需标准品即可实现转录本拷贝数检测。该方法不仅可以判定基因组结构变异的拷贝数，还可同时检测正常基因的拷贝数以及其基因组结构变异的发生频率，并且使检测结果的精准度较现有技术提高了3倍。

Description

一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学核酸检测技术领域，具体涉及一种自对照介导的基因组结构变异的检测方法。
背景技术
基因组结构变异(Structure Variantions，简称SVs)通常是指基因组上大片段基因序列和位置发生了变化，其变异类型多种多样，包括大片段基因序列的插入或丢失、串联重复、易位等，最终结果是形成新的融合基因。SVs往往给生命体带来重大的影响，例如，一些SVs直接导致出生缺陷、癌症等疾病的发生。目前针对SVs的检测多采用免疫组化(IHC)、荧光原位杂交(FISH)、二代测序(NGS)、RT-PCR等方法对SVs产生的新的融合基因进行鉴定。其中PCR方法以其方便、简单、低成本、结果准确等优点使其应用最为广泛，并且针对SVs的PCR检测方法，目前多使用分别扩增融合基因区域和非融合基因区域及探针杂交以得到融合基因的数量、非融合基因的数量以及融合基因在全部检测目标基因数量中所占的比例等相关数据，但是这种检测方法对检测结果的重复性、稳定性、准确性都会产生不良影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有RT-PCR检测方法对于SVs检测所存在的缺点，寻求设计提供一种基于自对照介导的使用数字PCR仪检测SVs的方法，建立一种新的高稳定性、高准确性的SVs检测方法。本方法无需建立标准曲线以及内参即可实现靶基因结构变异丰度检测，在简单准确判定SVs的同时，还可以检测SVs的拷贝数以及SVs的发生频率。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
本发明提供一种非诊断自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其具体检测方法包括以下主要步骤：
(1)同时扩增目标基因组结构变异区域与自对照基因区域及荧光信号的产生：在PCR扩增体系中加入目标基因组结构变异区域的多条正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物、一条检测自对照基因区域的分子探针、一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针；一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用与自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生单荧光信号一；一条检测目标基因组结构变异的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用分别与基因组结构变异区域及自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生双荧光信号二；
(2)信号检测：使用荧光检测装置对步骤(1)中产生的单荧光信号一、双荧光信号二进行检测；所述的荧光检测装置为实时荧光定量PCR仪或数字PCR仪中的荧光检测装置。
(3)数据分析：将检测到的单荧光信号一和双荧光信号二带入特定的荧光阈值、荧光补偿参数并进行数据分析，由单荧光信号一产生的分析数据为自对照基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据为目标基因组结构变异的数量，由单荧光信号一产生的分析数据减去由双荧光信号二产生的分析数据为正常基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据与单荧光信号一产生的分析数据的比值为目标基因组结构变异发生的频率。
本发明所述的目标基因组结构变异区域的多条正向引物与一条共同反向引物的组合并在一个 PCR扩增反应中同时完成多种目标基因组结构变异类型的检测；
本发明所述的一条共用反向引物为在进行PCR扩增时，扩增目标基因组结构变异区域和扩增自对照基因区域所使用的反向引物为同一条引物；
本发明所述的分子探针的一端标记荧光基团，荧光基团为FAM，HEX，CY5，另一端标记淬灭基团，淬灭基团为BHQ-MGB；所述的一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针需要分别标记不同的荧光基团；
本发明所述的单荧光信号一必然包括双荧光信号二；
本发明所述的单荧光信号一减去双荧光信号二为正常基因的荧光信号；
本发明所述的双荧光信号二与单荧光信号一的比值为基因组结构变异发生的频率；
本发明所述的检测方法可以针对RNA进行反转录过程和基因扩增过程结合的一步法PCR检测。
本发明与现有技术相比，本质上是一个使用双重探针对多目标基因组结构变异进行检验的过程，因此大大提高了检测的特异性、精密度和准确度。本发明首先只需一条共用反向引物与多目标基因组变异区域的正向引物组合就可以实现对多种结构变异的基因组和自对照基因区域同时扩增，并以自对照为参考进行数据分析，替代了现有技术中需要使用不同的引物对正常基因组进行另外扩增来作为内参，从而避免了多引物存在下的相互干扰或者由此引起的不可避免的非特异性扩增所导致的重复性差、背景信号强等问题；其检测过程简单方便、精密度、准确度和特异性高，得以保证检测结果的正确性，并可直接得到结构变异基因组拷贝数、正常基因组拷贝数以及基因组结构变异发生频率等结果。
附图说明
图1为本发明涉及的自对照介导的基因组结构变异检测方法的基本原理示意图。以A基因的四种融合类型为例，当A基因分别与B基因的某些外显子发生融合，则针对多种A+B融合基因类型分别设计正向引物F1、F2、F3、F4，并共用反向引物R1进行扩增，使用分子探针P2(如使用HEX或VIC绿色荧光信号标记)产生荧光信号；所有A基因自对照使用正向引物F0、共用反向引物R1和分子探针P1(如使用FAM蓝色荧光信号标记)产生荧光信号。
图2为非自对照介导的基因组结构变异检测方法的基本原理示意图。以A基因的四种融合类型为例，当A基因分别与B基因的某些外显子发生融合，则针对多种A+B融合基因类型分别设计正向引物F1、 F2、F3、F4，并使用反向引物R1进行扩增，使用分子探针P2(如使用HEX或VIC绿色荧光信号标记) 产生荧光信号；所有A基因非自对照使用正向引物F0、反向引物R0和分子探针P1(如使用FAM蓝色荧光信号标记)产生荧光信号。
图3为本发明涉及的实施例1中ALK融合基因单类型质粒与pUC57-ALK混合后自对照方法检测的荧光信号图。
图4为本发明涉及的实施例1中ALK融合基因单类型质粒与pUC57-ALK-F混合后非自对照方法检测的荧光信号图。
图5为本发明涉及的实施例1中ALK融合基因10种单类型质粒混合后再与pUC57-ALK混合后自对照方法检测的荧光信号图。
图6为本发明涉及的实施例1中ROS1融合基因单类型质粒与pUC57-ROS1混合后自对照方法的检测荧光信号图。
图7为本发明涉及的实施例1中ROS1融合基因单质粒与pUC57-ROS1-F混合后非自对照方法的检测荧光信号图。
图8为本发明涉及的实施例1中ROS1融合基因10种单类型质粒混合后再与pUC57-ROS1混合后自对照方法检测的荧光信号图。
图9为本发明涉及的实施例1中NTRK1融合基因单类型质粒与pUC57-NTRK1混合后自对照方法检测的荧光信号图。
图10为本发明涉及的实施例1中NTRK1融合基因单类型质粒与pUC57-NTRK1-F混合后非自对照方法检测的荧光信号图。
图11为本发明涉及的实施例1中NTRK1融合基因8种单类型质粒混合后再与pUC57-NTRK1混合后自对照方法检测荧光信号图。
图12为本发明涉及的实施例1中BCR-ABL1融合基因单类型质粒与pUC57-ABL1混合后自对照方法检测荧光信号图。
图13为本发明涉及的实施例1中BCR-ABL1融合基因单类型质粒与pUC57-ABL1-F混合后非自对照方法检测荧光信号图。
图14为本发明涉及的实施例1中BCR-ABL1融合基因4种单类型质粒混合后再与pUC57-ABL1 混合后自对照方法检测荧光信号图。
具体实施方式
为了便于更加清晰地解释本发明，下面将通过具体实施方式结合附图对本发明所述的技术方案进行更具体的全面描述。本发明可以应用于多种不同基因检测而不限于本文所描述的实施例，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件所述进行。
实施例1：本申请所述方法的原理正确性、可行性、准确度以及精确度的验证。
本实施例使用目前已发现的融合基因类型，主要包括ALK、ROS1、ETRK1、BCR-ABL1四种基因的多种融合方式，以pUC57质粒为骨架，设计并人工合成目标基因组区域并与pUC57连接制成带有不同目标基因组区域的质粒作为检测的模板，人工合成的片段名称及信息参见表1。同时合成自对照质粒 pUC57-ALK、pUC57-ROS1、pUC57-NTRK1、pUC57-ABL1以及非自对照质粒pUC57-ALK-F、pUC57- ROS1-F、pUC57-NTRK1-F、pUC57-ABL1-F。
表1、人工合成的片段名称及信息列表
根据本发明所述的方法，针对上述基因组结构变异所产生的融合基因区域设计引物及探针，序列参见表2。
表2 根据本发明所述的方法所设计及合成的引物及探针序列
利用本发明所涉及的方法分别对上述四种融合基因进行检测，检测步骤如下：
1、ALK融合基因验证：
(1)将上述表1中10种ALK融合基因质粒的工作液分别使用1×TE进行10倍的稀释，即10μL 质粒加入90μL 1×TE充分混合均匀后，再分别与自对照pUC57-ALK质粒和非自对照pUC57-ALK-F质粒以1：1浓度混合，并记录混合时所加入的体积。按照表3加入上述表2中的ALK引物探针及自对照引物探针配制数字PCR反应液，同时，按照表4加入上述表2中的ALK引物探针及非自对照的引物探针配制数字PCR反应液，配制完成后将PCR反应管涡旋混匀15秒后，快速离心15秒，并使用数字PCR方法对 10种ALK融合基因的质粒分别进行检测。
表3、自对照方法的数字PCR反应液配制表
表4、非自对照方法的数字PCR反应液配制表
(2)取出芯片，轻轻旋转白盖1/4圈并丢弃白盖，移取上述步骤(1)中的25μL反应液加入到芯片孔井中并盖上白色长盖。
(3)将加入25μL数字PCR反应液的芯片放入NaicaTM Geode微滴生成扩增系统中，按表5设置数字PCR反应程序进行数字PCR反应。
表5、数字PCR反应程序
(4)信息采集：数字PCR扩增结束后，将芯片放置于NaicaTM prism3微滴阅读分析系统中，进行荧光信号的检测和判读。
(5)自对照介导的单类型ALK融合基因检测结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，以图 3所示ALK融合基因单类型质粒与pUC57-ALK混合的检测结果为例对自对照方法检测的ALK融合基因荧光信号的检测结果进行详细说明，图3中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，可以将检测信号分为四个象限，位于第I象限的荧光信号是由蓝色单荧光信号(FAM，Blue)和绿色单荧光信号(HEX， Green)所组成，根据本申请所述的方法，其中蓝色单荧光信号(FAM，Blue)代表一部分自对照的信号，如果存在绿色单荧光信号(HEX，Green)就一定伴随着蓝色单荧光信号，所以二者组成后的双荧光信号 (FAM+HEX)，即(Blue+Green)代表了该样本中融合基因的表达量，而单独的绿色单荧光信号(HEX， Green)应该是不存在的，除非存在污染或者非特异性扩增的情况，即表现出位于第II象限的绿色单荧光信号(HEX，Green)；位于第III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；仅位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)为该样本中正常基因的表达量，计算方式为自对照基因表达量(位于第I象限和第IV象限的蓝色单荧光信号总和)减去融合基因的表达量(位于第I象限的双荧光信号)。图3和表6中都显示出位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)和位于第IV象限的单荧光信号(FAM)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与理论值1的相对偏差为(B)＝1.5％。使用自对照方法对10种单类型ALK融合基因质粒分别与pUC57-ALK混合后的数字PCR检测结果见表6。
表6 使用自对照方法对10种单类型ALK融合基因质粒分别与pUC57-ALK混合后的数字PCR 检测结果
(6)非自对照介导的单类型ALK融合基因检测结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，以图4所示ALK融合基因单类型质粒与pUC57-ALK-F混合的检测结果为例对非自对照方法检测的ALK融合基因荧光信号的检测结果进行说明，图4中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，检测信号可分为四个象限，位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)，即(Blue+Green)为探针非特异性结合等原因导致的假阳性信号；位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green)代表该样本中融合基因的表达量；位于第 III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)代表该样本中非自对照的表达量，也就是正常基因的表达量与融合基因表达量的总和。在此实施例中因为非自对照介导的方法只存在蓝色或者绿色单荧光信号的检测，所以图4以及表7都显示出位于第II象限的单荧光信号 (HEX，Green)和位于第IV象限的单荧光信号(FAM)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与理论值1 的相对偏差为(B)＝5.71％。使用非自对照方法对10种单类型ALK融合基因质粒分别与pUC57-ALK-F 混合后的数字PCR检测结果见表7。
表7 使用非自对照方法对10种单类型ALK融合基因质粒分别与pUC57-ALK-F混合后的数字 PCR检测结果
(7)将表1中所示的10种单类型ALK融合基因质粒按照1：1：1：1：1：1：1：1：1：1比例进行充分混合后制备成混合融合质粒，再分别加入与上述步骤(1)同样体积的混合融合质粒和自对照 pUC57-ALK质粒、混合融合质粒和非自对照pUC57-ALK-F质粒形成两组混合样本，并按照表3加入上述表2中的ALK引物探针和自对照引物探针配制数字PCR反应液，配制完成后将PCR反应管涡旋混匀15 秒后，快速离心15秒，并使用数字PCR的方法对10种混合后的ALK融合基因质粒进行检测。按照表4 加入上述表2中的ALK引物探针及非自对照的引物和探针配制数字PCR反应液，配制完成后将PCR反应管涡旋混匀15秒后，快速离心15秒，并使用数字PCR的方法按照表5所示程序对两组混合样本分别进行检测。
(8)自对照介导的多类型ALK融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同上述(5)。如图 5及表8所示位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX，Blue+Greeen)和位于第IV象限的单荧光信号(FAM， Blue)拷贝数的比例约为10：1，经统计学计算与理论值10的相对偏差为(B)＝0.57％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为1.55％。使用自对照方法对10种多类型ALK融合基因质粒混合后再与pUC57-ALK 混合后的数字PCR检测结果见表8。
(9)非自对照介导的多类型ALK融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同上述(6)。使用非自对照方法对多类型ALK融合基因10种混合质粒与pUC57-ALK-F混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果见表8，表8中显示单荧光信号(HEX，Green)和单荧光信号(FAM，Blue)拷贝数的比例约为10：1，经统计学计算与与理论值10的相对偏差为(B)＝0.7％，三次重复检测结果的CV 值(变异系数)为5.23％。使用非自对照方法对10种多类型ALK融合基因质粒混合后再与pUC57-ALK-F 混合后的数字PCR检测结果见表8。
表8使用自对照方法及非自对照方法对多类型ALK融合基因10种混合质粒分别与pUC57-ALK pUC57-ALK-F混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果
(10)ALK融合基因的实验结果分析：上述分别使用自对照方法和非自对照方法对于ALK融合基因的检测、验证和数据分析结果显示，自对照方法对于单类型ALK融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为1.5％，对于多类型融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为0.57％，变异系数为 1.55％；而非自对照方法对于单类型ALK融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为5.71％，对于多类型融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为0.7％，变异系数为5.23％。此结果说明对于简单样本以及复杂样本的ALK融合基因的检测，本申请所述的自对照检测方法原理正确、可行性强、并且检测的准确度和精确度都要显著高于非自对照检测方法。
2、ROS1融合基因验证：
(1)操作步骤同1、ALK融合基因验证的(1)至(4)，使用ROS1的相关质粒替换所使用的 ALK相关质粒。
(2)自对照介导的单类型ROS1融合基因检测结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，以图6所示ROS1融合基因单类型质粒与pUC57-ROS1混合的检测结果为例对自对照方法检测的ROS1融合基因荧光信号的检测结果进行说明，图6中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，可以将检测信号分为四个象限，位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)，即(Green+Blue)代表该样本中融合基因的表达量；位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green)为污染等原因导致的假阳性信号；位于第III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)代表该样本中正常基因的表达量，计算方法为自对照基因的表达量减去融合基因的表达量，并且图6以及表9都显示出位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)和位于第IV象限的单荧光信号(FAM)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与理论值1的相对偏差为(B)＝0.6％。使用自对照方法对10种单类型ROS1融合基因质粒分别与 pUC57-ROS1混合后的数字PCR检测结果见表9。
表9使用自对照方法对10种单类型ROS1融合基因质粒分别与pUC57-ROS1混合后的样本进行数字PCR检测结果
(3)非自对照方法介导的单类型ROS1融合基因检测结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，以图7所示ROS1融合基因单类型质粒与pUC57-ROS1-F混合的检测结果为例对非自对照方法检测的 ROS1融合基因荧光信号的检测结果进行说明，图7中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，检测信号可分为四个象限，位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)，即(Blue+Green)为探针非特异性结合等原因导致的假阳性信号；位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green)代表该样本中融合基因的表达量；位于第III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)代表该样本中非自对照的表达量，并且图7以及表10都显示出位于第II象限的单荧光信号(Green)和位于第IV 象限的单荧光信号(Blue)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与与理论值1的相对偏差为(B)＝5.48％。使用非自对照方法对10种单类型ROS1融合基因质粒分别与pUC57-ROS1-F混合后的数字PCR检测结果见表10。
表10 使用非自对照方法对10种单类型ROS1融合基因质粒分别与pUC57-ROS1-F混合后的数字 PCR检测结果
(4)将表1中10种单类型ROS1融合基因质粒按照1、ALK融合基因验证(7)制备两组混合样本并分别进行检测,使用ROS1的相关质粒替换所使用的ALK相关质粒。
(5)自对照介导的多类型ROS1融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同2、ROS1融合基因验证(2)。如图8及表11所示位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX，Blue+Green)和位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)拷贝数的比例约为10：1，经统计学计算与理论值10的相对偏差(B)为＝0.9％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为2.94％。使用自对照方法对10种多类型ROS1融合基因质粒混合后再与pUC57-ROS1混合后的数字PCR检测结果见表11。
(6)非自对照介导的多类型ROS1融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同2、ROS1融合基因验证(3)。使用非自对照方法对多类型ROS1融合基因10种混合质粒与pUC57-ROS1-F混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果见表11，表11中显示单荧光信号(HEX，Green)和单荧光信号(FAM，Blue)拷贝数的比例约为10：1，经统计学计算与与理论值10的相对偏差为(B)＝1.4％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为5.08％。使用非自对照方法对10种多类型ROS1融合基因质粒混合后再与pUC57-ROS1-F混合后的数字PCR检测结果见表11。
表11 使用自对照方法及非自对照方法对多类型ROS1融合基因10种混合质粒分别与pUC57-ROS 1以及pUC57-ALK-F混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果
(7)ROS1融合基因的实验结果分析：上述分别使用自对照方法和非自对照方法对于ROS1融合基因的检测、验证和数据分析结果显示，自对照方法对于单类型ROS1融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为0.6％，对于多类型融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为0.9％，变异系数为 2.94％；而非自对照方法对于单类型ROS1融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为5.48％，对于多类型融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为1.4％，变异系数为5.08％。此结果说明对于简单样本以及复杂样本的ROS1融合基因的检测，本申请所述的自对照检测方法原理正确、可行性强、并且检测的准确度和精确度都要显著高于非自对照检测方法。
3、NTRK1融合基因验证：
(1)操作步骤同1、ALK融合基因质粒验证(1)至(4)。使用NTRK1的相关质粒替换所使用的ALK相关质粒。
(2)自对照介导的单类型NTRK1融合基因检测结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，以图9所示NTRK1融合基因单类型质粒与pUC57-NTRK1混合的检测结果为例对自对照方法检测的NTRK1 融合基因荧光信号的检测结果进行说明，图9中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，可以将检测信号分为四个象限，位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)，即(Green+Blue)代表该样本中融合基因的表达量；位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green)为污染等原因导致的假阳性信号；位于第III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)代表该样本中正常基因的表达量，计算方法为自对照基因的表达量减去融合基因的表达量，并且图9以及表12都显示出位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)和位于第IV象限的单荧光信号(FAM)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与理论值1的相对偏差为(B)＝-0.63％。使用自对照方法对8种单类型NTRK1融合基因质粒分别与pUC57-NTRK1混合后的数字PCR检测结果见表12。
表12 使用自对照方法对8种单类型NTRK 1融合基因质粒分别与pUC57-NTRK1混合后的数字 PCR检测结果
(3)非自对照方法介导的单类型NTRK1融合基因检测结果分析：使用CrystalMiner进行数据分析，以图10所示NTRK1融合基因单类型质粒与pUC57-NTRK1-F混合的检测结果为例对非自对照方法检测的NTRK1融合基因荧光信号的检测结果进行说明，图10中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，检测信号可分为四个象限，位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)，即(Blue+Green)为探针非特异性结合等原因导致的假阳性信号；位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green)代表该样本中融合基因的表达量；位于第III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；位于第IV象限的单荧光信号(FAM，Blue) 代表该样本中非自对照的表达量，并且图10以及表13都显示出位于第II象限的单荧光信号(Green)和位于第IV象限的单荧光信号(Blue)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与与理论值1的相对偏差为(B) ＝3.05％。使用非自对照方法对8种单类型NTRK1融合基因质粒分别与pUC57-NTRK1-F混合后的数字PCR 检测结果见表13。
表13 使用非自对照方法对8种单类型NTRK1融合基因质粒分别与pUC57-NTRK1-F混合后的数字PCR检测结果
(4)将表1中8种单类型NTRK1融合基因质粒按照1、ALK融合基因验证(7)制备两组混合样本并分别进行检测,使用NTRK1的相关质粒替换所使用的ALK相关质粒。
(5)自对照介导的多类型NTRK1融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同3、NTRK1 融合基因验证(2)。如图11及表14所示位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX，Blue+Green)和位于第 IV象限的单荧光信号(FAM，Blue)拷贝数的比例约为8：1，经统计学计算与理论值8的相对偏差(B) 为＝0.36％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为3.07％。使用自对照方法对8种多类型NTRK1融合基因质粒混合后再与pUC57-NTRK1混合后的数字PCR检测结果见表14。
(6)非自对照介导的多类型NTRK1融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同3、NTRK1 融合基因验证(3)。使用非自对照方法对多类型NTRK1融合基因8种混合质粒与pUC57-NTRK1-F混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果见表14，表14中显示单荧光信号(HEX，Green)和单荧光信号(FAM，Blue)拷贝数的比例约为8：1，经统计学计算与与理论值8的相对偏差为(B)＝3.4％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为6.57％。使用非自对照方法对8种多类型NTRK1融合基因质粒混合后再与pUC57-NTRK1-F混合后的数字PCR检测结果见表14。
表14 使用自对照方法和非对照方法介导的多类型NTRK1融合基因8种质粒混合后分别与pUC 57-NTRK1以及pUC57-NTRK1-F混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果
(7)NTRK1融合基因的实验结果分析：上述分别使用自对照方法和非自对照方法对于NTRK1 融合基因的检测、验证和数据分析结果显示，自对照方法对于单类型NTRK1融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为-0.63％，对于多类型融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为0.36％，变异系数为3.07％；而非自对照方法对于单类型NTRK1融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为3.05％，对于多类型融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为3.4％，变异系数为6.57％。此结果说明对于简单样本以及复杂样本的NTRK1融合基因的检测，本申请所述的自对照检测方法原理正确、可行性强、并且检测的准确度和精确度都要显著高于非自对照检测方法。
4、BCR-ABL1融合基因验证：
(1)操作步骤同1、ALK融合基因质粒验证(1)至(4)。使用BCR-ABL1的相关质粒替换所使用的ALK相关质粒。
(2)自对照介导的单类型BCR-ABL1融合基因检测结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，以图12所示BCR-ABL1融合基因单类型质粒与自对照质粒pUC57-ABL1混合的检测结果为例对自对照方法检测的BCR-ABL1融合基因荧光信号的检测结果进行说明。如图12中显示，位于第I象限的FAM+HEX (Blue+Green)双荧光信号代表BCR-ABL1融合基因的荧光信号；位于第II象限的HEX(Green)单荧光信号代表正常基因的荧光信号，即ABL1自对照基因的荧光信号值(Green单荧光信号值的总和)减去 BCR-ABL1融合基因的荧光信号值(Blue+Green双荧光信号值)；位于第III象限无任何荧光信号代表无扩增状态的荧光信号本底值；位于第IV象限的FAM(Blue)单荧光信号代表非特异性扩增或试剂污染所产生的荧光信号，在正常无非特异性扩增及无污染的情况下，该区域应该是没有荧光信号的。并且图12以及表15都显示出位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)和位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green) 拷贝数的比例约为1，经统计学计算与理论值1的相对偏差为(B)＝1.25％。使用自对照方法对4种单类型BCR-ABL1融合基因质粒分别与pUC57-ABL1混合后的数字PCR检测结果见表15。
表15 使用自对照方法对4种单类型BCR-ABL1融合基因质粒分别与pUC57-ABL1混合后的数字 PCR检测结果
(3)非自对照方法介导的单类型BCR-ABL1融合基因检测结果分析：使用CrystalMiner进行数据分析，以图14所示BCR-ABL1融合基因单类型质粒与pUC57-ABL1-F混合的检测结果为例对非自对照方法检测的BCR-ABL1融合基因荧光信号的检测结果进行说明，图13中根据探针种类以及所标记的荧光信号的不同，检测信号可分为四个象限，位于第I象限的双荧光信号(FAM+HEX)，即(Blue+Green)为探针非特异性结合等原因导致的假阳性信号；位于第II象限的单荧光信号(HEX，Green)代表该样本中非自对照的表达量；位于第III象限无荧光信号代表微滴内无核酸的状态；位于第IV象限的单荧光信号 (FAM，Blue)代表该样本中融合基因的表达量，并且图13以及表16都显示出位于第IV象限的单荧光信号(Blue)和位于第II象限的单荧光信号(Green)拷贝数的比例约为1，经统计学计算与与理论值1的相对偏差为(B)＝6.29％。使用非自对照方法对4种单类型BCR-ABL1融合基因质粒分别与pUC57-ABL1-F 混合后的数字PCR检测结果见表16。
表16 使用非自对照方法对4种单类型BCR-ABL1融合基因质粒分别与pUC57-ABL1-F混合后的数字PCR检测结果
(4)将表1中4种单类型BCR-ABL1融合基因质粒按照1、ALK融合基因验证(7)制备两组混合样本并分别进行检测,使用BCR-ABL1的相关质粒替换所使用的ALK相关质粒。
(5)自对照介导的多类型BCR-ABL1融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同4、BCR- ABL1融合基因验证(2)。如图14及表17所示位于第Ⅰ象限的双荧光信号(FAM+HEX，Blue+Green)和位于第Ⅱ象限的单荧光信号(HEX，Green)拷贝数的比例约为4：1，经统计学计算与理论值4的相对偏差(B)为＝0.06％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为1.04％。使用自对照方法对4种多类型BCR-ABL1 融合基因质粒混合后再与pUC57-ABL1混合后的数字PCR检测结果见表17。
(6)非自对照介导的多类型BCR-ABL1融合基因检测结果分析：荧光信号的分析方法同4、BCR- ABL1融合基因验证(3)。使用非自对照方法对多类型BCR-ABL1融合基因4种混合质粒与pUC57-ABL1-F 混合后的样本进行数字PCR检测并重复三次的检测结果见表17，表17中显示单荧光信号(FAM，Blue) 和单荧光信号(HEX，Green)拷贝数的比例约为4：1，经统计学计算与与理论值4的相对偏差为(B) ＝1.43％，三次重复检测结果的CV值(变异系数)为13.52％。使用非自对照方法对4种多类型BCR-ABL1 融合基因质粒混合后再与pUC57-ABL1-F混合后的数字PCR检测结果见表17。
表17 使用自对照方法和非自对照方法对4种多类型BCR-ABL1融合基因质粒混合后分别再与 pUC57-ABL1以及pUC57-ABL1-F混合后的数字PCR检测并重复三次的检测结果
(7)BCR-ABL1融合基因的实验结果分析：上述分别使用自对照方法和非自对照方法对于BCR- ABL1融合基因的检测、验证和数据分析结果显示，自对照方法对于单类型BCR-ABL1融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为1.25％，对于多类型融合基因的融合与正常的比值检测结果的准确度为 0.06％，变异系数为1.04％；而非自对照方法对于单类型BCR-ABL1融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为6.29％，对于多类型融合基因的融合与非自对照的比值检测结果的准确度为1.43％，变异系数为13.52％。此结果说明对于简单样本以及复杂样本的BCR-ABL1融合基因的检测，本申请所述的自对照检测方法原理正确、可行性强、并且检测的准确度和精确度都要显著高于非自对照检测方法。
ALK、ROS1、NTRK1、ABL1四种融合基因检测结果均显示出正常的荧光信号以及融合基因与正常基因的比值，并且经过重复性检测验证显示，本申请所述的自对照介导的基因组变异的检测方法与目前使用的非自对照检测方法相比，在简单方便的基础上，还显示出精确度高、重复性好的优势。说明本申请所述方法具有可行性及正确性，为后期更加复杂的样本检测提供了良好的引物、探针等反应体系。
实施例2：检测在复杂样本的RNA体系环境下，本方法对ALK融合基因的检测能力。
本实施例检测在非小细胞肺癌细胞系的石蜡样本含有总RNA的复杂体系下，鉴定本方法对ALK 融合基因的检测能力。
(1)样品准备：20个非小细胞肺癌细胞系的石蜡样本。
(2)RNA提取：采用RNeasy FFPE Kit(Cat#73504)提取石蜡样本中的总RNA，具体的操作步骤请参见QIAGEN公司的RNeasy FFPE Kit操作指南。
(3)使用One-step数字PCR检测方法，如表18所示配制数字PCR反应液，表18中所示的ALK primer MIX和ALK probe MIX为上述表2中所示的ALK的引物和探针分别混合后制备。
表18 数字PCR反应液体系表
Reagents Volume(μL)
qScript<sup>TM</sup> XLT One-Step RT-qPCR Tough Mix(2x) 12.5
Fluorescein sodium salt 2.5
ALK primer MIX 2
ALK probe MIX 2
RNA 6
Total 25
(4)反应体系配制完成后，将PCR反应管涡旋混匀15秒后，快速离心15秒。
(5)取出Sapphire chip，使用微量移液器将25μL反应液加入到Sapphire chip的孔中，盖上白色长盖。
(6)数字PCR操作流程参照NaicaTM Crystal Digital PCR System用户指南，反应程序包括微滴生成，cDNA生成，预变性，PCR，释放压力，程序设置如表19所示。
表19数字PCR反应程序表
(7)PCR完成后，调用优化的扫描条件、补偿文件以及校准参数，使用NaicaTMprism3微滴阅读分析系统进行信息采集。
(8)在本实施例中，通过数字PCR检测结果的2D图可以直接进行融合基因的数据分析：参考图3，位于第I象限的FAM及HEX双荧光信号代表具有融合基因的荧光信号；位于第II象限的HEX单荧光信号代表非特异扩增所产生的荧光信号，在正常情况下该区域为没有信号；位于第III象限的代表无荧光信号的本底值；位于第IV象限的FAM单荧光信号代表正常基因的荧光信号，即自对照基因的荧光信号(也是FAM单荧光信号的总和)减去融合基因的信号值。综上所述，我们可清晰直观地确定ALK融合基因、 ALK正常基因以及融合基因所占的比例。20个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中融合基因ALK数字PCR 检测结果如表20所示。
表20 20个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中融合基因ALK数字PCR检测结果
(9)以FISH为对比方法，使用本申请所述方法使用数字PCR仪对复杂的石蜡样本中ALK融合基因进行检测，检测结果显示20个样本中存在ALK融合基因的有3个(15％)，其中2个融合基因的检测与FISH检测结果相一致，另外1个融合样本在FISH结果中显示为阴性(标注*的18号样本)；17个ALK 正常(85％)样本在FISH检测中同样呈阴性。因此，使用本方法对ALK融合基因的检测灵敏度为100％，特异性为94.44％，两种方法检测结果的一致性为95％(表21)，并且本申请所涉及的方法检测灵敏度更高。
表21 数字PCR与FISH检测非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中融合基因ALK的比较与评价
(10)随机抽取上述20个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中的5个样本，分别采用自对照方法和非自对照方法对ALK融合基因进行重复检测，重复检测结果参见表22和表23。
表22 随机抽取5个样本使用自对照方法进行重复检测的结果
表23 随机抽取5个样本使用非自对照方法进行重复检测的结果
表22和表23的结果显示，在同样样本的重复性检测中，本申请所述的自对照介导的ALK融合基因检测方法的重复性(CV值低)显著优于目前常用的非自对照检测方法的重复性(CV值高)，说明本申请所述的自对照介导的ALK融合基因检测方法的重复性好，精确度高。
实施例3：检测在复杂样本的RNA体系环境下，本方法对融合目的基因ROS1的检测能力。
本实施例是在非小细胞肺癌细胞系的石蜡样本中含有总RNA的复杂体系下，鉴定本方法对ROS1 融合基因的检测能力。
(1)样本准备：6个非小细胞肺癌细胞系的石蜡样本。
(2)RNA提取及数字PCR检测流程同实施例1。
(3)在本实施例中，通过数字PCR检测结果的2D图(请参考图6)可以直接进行融合基因的数据分析：位于第I象限的FAM及HEX双荧光信号代表具有融合基因的荧光信号；位于第II象限的HEX单荧光信号代表非特异扩增所产生的荧光信号，在正常情况下该区域为没有信号；位于第III象限的代表无荧光信号的本底值；位于第IV象限的FAM单荧光信号代表正常基因的荧光信号，即自对照基因的荧光信号 (也是FAM单荧光信号的总和)减去融合基因的信号值。综上所述，我们可清晰直观地确定ROS1融合基因、ROS1正常基因以及融合基因所占的比例。6个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中融合基因ROS1的数字PCR检测结果如表24所示。
表24 6个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中ROS1融合基因的数字PCR检测结果
(4)以FISH为对比方法，使用本申请所述方法使用数字PCR仪对复杂的石蜡样本中ROS1融合基因进行检测，6个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本的数字PCR检测结果表明，6个样本中有1个样本存在ROS1融合基因，5个不存在ROS1融合基因，与FISH检测结果完全一致。与FISH结果相比，使用本方法所涉及到的引物和探针在数字PCR仪上的检测灵敏度为的灵敏度与特异性均为100％(表25)。
表25数字PCR与FISH检测非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中融合基因ROS1的比较与评价
该结果表明，本发明可高灵敏、高特异地准确检测出非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中ROS1融合基因的状况，并且可直接准确得到融合基因所占比例。
随机抽取上述6个非小细胞肺癌细胞系石蜡样本中的5个样本，分别采用自对照方法和非自对照方法对ROS1融合基因进行重复检测，重复检测结果参见表26和表27。
表26 随机抽取5个样本使用自对照方法对ROS1融合基因进行重复检测的结果
表27 随机抽取5个样本使用非自对照方法对ROS1融合基因进行重复检测的结果
表26和表27的结果显示，在同样样本的重复性检测中，本申请所述的自对照介导的ROS1融合基因检测方法的重复性(CV值低)显著优于目前常用的非自对照检测方法的重复性(CV值高)，说明本申请所述的自对照介导的ROS1融合基因检测方法的重复性好，精确度高。
实施例4：检测在复杂样本的RNA体系环境下，本方法对NTRK1融合基因的检测能力。
本实施例是在结直肠癌细胞系的石蜡样本含有总RNA的复杂体系下，鉴定本方法对NTRKs融合基因的检测能力。
(1)样品准备：7个结直肠癌细胞系石蜡样本。
(2)RNA提取及数字PCR检测流程同实施例1。
(3)在本实施例中，通过数字PCR检测结果的2D图(参考图9)可以直接进行融合基因的数据分析：位于第I象限的FAM及HEX双荧光信号代表具有融合基因的荧光信号；位于第II象限的HEX单荧光信号代表非特异扩增所产生的假荧光信号，在正常情况下该区域为没有信号；位于第III象限的代表无荧光信号的本底值；位于第IV象限的FAM单荧光信号代表正常基因的荧光信号，即自对照基因的荧光信号 (也是FAM单荧光信号的总和)减去融合基因的信号值。综上所述，我们可清晰直观地确定NTRK1融合基因、NTRK1正常基因以及融合基因所占的比例。7个结直肠癌细胞系石蜡样本的数字PCR检测结果如表28所示。
表28 7个结直肠癌细胞系石蜡样本数字PCR检测结果
(4)以FISH为对比方法，使用本申请所述方法使用数字PCR仪对复杂的石蜡样本中NTRK1 融合基因进行检测，7个结直肠癌细胞系石蜡样本的数字PCR检测结果表明，6个样本中有1个存在NTRK1 融合基因，6个正常基因，与FISH检测结果完全一致。与FISH结果进行对比，dPCR的灵敏度与特异性均为100％(表29)。
表29 数字PCR与FISH检测FFPE样本NTRK1融合比较与评价
该结果表明，本发明可高灵敏、高特异地检测出石蜡样本中的NTRK1基因的不同融合状态，并且可以直接得出准确的融合所占有的比例。
随机抽取上述7个结直肠癌细胞系石蜡样本中的5个样本，并分别采用自对照方法和非自对照方法对NTRK1融合基因进行重复检测，重复检测结果参见表30和表31。
表30 随机抽取5个样本使用自对照方法对NTRK1融合基因进行重复检测的结果
表31 随机抽取5个样本使用非自对照方法对NTRK1融合基因进行重复检测的结果
表30和表31的结果显示，在同样样本的重复性检测中，本申请所述的自对照介导的NTRK1融合基因检测方法的重复性(CV值低)显著优于目前常用的非自对照检测方法的重复性(CV值高)，说明本申请所述的自对照介导的NTRK1融合基因检测方法的重复性好，精确度高。
实施例5：检测在复杂样本的RNA体系环境下，本方法对融合基因BCR-ABL1的检测能力。
(1)样本准备：8个慢性髓系白血病细胞系样本，应用本发明中涉及的引物、探针组合使用数字 PCR仪对BCR-ABL1融合基因进行检测。
(2)RNA提取：采用Biomiga Blood RNA miniprep kit(Cat#R6411)试剂盒提取样本中的mRNA, 具体的操作参见试剂盒产品说明书。
(3)One-step数字PCR检测，加入表2中BCR-ABL1的引物及探针，如表32所示配制反应体系。
表32 数字PCR反应液体系表
Reagents Volume(μL)
qScript<sup>TM</sup> XLT One-Step RT-qPCR Tough Mix(2×) 12.5
荧光素钠盐 2.5
ABL1primer MIX 2
ABL1probe MIX 2
RNA 6
Total 25
(4)反应体系配制完成后，将PCR反应管涡旋混匀15秒后，快速离心15秒。
(5)取出Sapphire chip，使用微量移液器将25μL反应液加入到Sapphire chip的孔中，盖上白色长盖。
(6)数字PCR操作流程参照NaicaTM Crystal Digital PCR System用户指南，反应程序包括微滴生成，cDNA生成，预变性，PCR，释放压力，程序设置如表33所示。
表33 数字PCR反应程序表
(7)PCR完成后，调用优化的扫描条件、补偿文件以及校准参数，使用NaicaTMprism3微滴阅读分析系统进行信息采集。
(8)数据分析，检测FAM和HEX的荧光信号，得出样本中BCR-ABL1融合基因拷贝数、ABL1 总拷贝数以及融合比例。在本实施例中，可通过2D图(参考图12)直接进行数据分析：位于第I象限的 FAM及HEX双荧光信号代表融合基因的荧光信号；位于第II象限的HEX单荧光信号代表正常基因的荧光信号，即自对照基因的荧光信号值(也是HEX单荧光信号的总和)减去融合基因的荧光信号值；位于第III 象限的无任何荧光信号代表荧光信号本底值；位于第IV象限的FAM单荧光信号代表非特异性扩增或杂交带来的污染所产生的荧光信号，在正常无污染的情况下，该区域是没有荧光信号的。综上所示，我们可清晰直接地确定融合基因、正常基因的含量及融合基因所占的比例。8个样本的数字PCR检测结果如表34 所示。
表34 8个慢性髓系白血病细胞系样本的数字PCR检测结果
随机抽取上述8个慢性髓系白血病细胞系样本中的5个样本，并分别采用自对照方法和非自对照方法对BCR-ABL1融合基因进行重复检测，重复检测结果参见表35和表36。
表35 随机抽取5个样本使用自对照方法对BCR-ABL1融合基因进行重复检测的结果
表36 随机抽取5个样本使用非自对照方法对BCR-ABL融合基因进行重复检测的结果
表35 和表36的结果显示，在同样样本的重复性检测中，本申请所述的自对照介导的BCR-ABL1 融合基因检测方法的重复性(CV值低)显著优于目前常用的非自对照检测方法的重复性(CV值高)，说明本申请所述的自对照方法介导的BCR-ABL1融合基因检测方法的重复性好，精密度提高3倍左右。

Claims (10)

1.一种非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于具体检测方法包括以下主要步骤：
(1)同时扩增目标基因组结构变异区域与自对照基因区域及荧光信号的产生：在PCR扩增体系中加入目标基因组结构变异区域的多条正向引物、一条自对照正向引物、一条共用反向引物、一条检测自对照基因区域的分子探针、一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针；一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用与自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生单荧光信号一；一条检测目标基因组结构变异的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针通过碱基互补配对作用分别与基因组结构变异区域及自对照基因区域进行杂交、扩增、降解过程产生双荧光信号二；
(2)信号检测：使用荧光检测装置对步骤(1)中产生的单荧光信号一、双荧光信号二进行检测；
(3)数据分析：将检测到的单荧光信号一和双荧光信号二带入特定的荧光阈值、荧光补偿参数并进行数据分析，由单荧光信号一产生的分析数据为自对照基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据为目标基因组结构变异的数量，由单荧光信号一产生的分析数据减去由双荧光信号二产生的分析数据为正常基因的数量，由双荧光信号二产生的分析数据与单荧光信号一产生的分析数据的比值为目标基因组结构变异发生的频率。
2.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异检测方法，其特征在于所述的目标基因组结构变异区域的多条正向引物与一条共用反向引物组合并在一个PCR扩增反应中同时完成多种基因组结构变异类型的检测；
3.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于，所述的一条共用反向引物为在进行PCR扩增时，扩增目标基因组结构变异区域和扩增自对照基因区域所使用的反向引物为同一条引物；
4.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于，所述的分子探针的一端标记荧光基团，荧光基团为FAM，HEX，CY5，另一端标记淬灭基团，淬灭基团为BHQ-MGB；所述的一条检测目标基因组结构变异区域的分子探针和一条检测自对照基因区域的分子探针需要分别标记不同的荧光基团；
5.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于，所述的单荧光信号一必然包括双荧光信号二；
6.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于，所述的单荧光信号一减去双荧光信号二为正常基因的荧光信号；
7.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于，所述的双荧光信号二为目标基因组结构变异区域的荧光信号；
8.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异的检测方法，其特征在于，所述的双荧光信号二与单荧光信号一的比值为基因组结构变异发生的频率；
9.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的基因组结构变异检测方法，其特征在于所述的荧光检测装置为实时荧光定量PCR仪或数字PCR仪中的荧光检测装置。
10.根据权利要求1所述的非诊断目的自对照介导的检测基因组结构变异的检测方法，其特征在于所述的非诊断目的自对照介导的检测基因组结构变异的检测方法可以针对RNA进行反转录过程和基因扩增过程结合的一步法PCR检测。
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