CN108504742B

CN108504742B - 一种基于数字pcr技术检测her-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法

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Publication number: CN108504742B
Application number: CN201810658404.8A
Authority: CN
Inventors: 龚建; 冯晓燕; 林挺; 于祥春; 郑祖亮
Original assignee: Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Apexbio Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-25
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2019-07-12
Anticipated expiration: 2038-06-25
Also published as: CN108504742A

Abstract

本发明提供了一种基于数字PCR技术检测HER‑2基因拷贝数变异的试剂盒及方法。试剂盒包括：用于检测HER‑2基因的两组引物对和检测探针以及三个内参基因CEP17、EIF2C1和EFTUD2的引物对和检测探针、数字PCR预混液、荧光素酶、ddH₂O和校准文件。除此之外，本发明还提供了一种基于数字PCR技术检测HER‑2基因拷贝数变异的方法，可排除第17号染色体多体、非整倍体以及着丝粒扩增的现象，用于准确判定HER‑2基因扩增为阳性或者阴性的情况。

Description

一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法，属于生物医学核酸检测技术领域。

背景技术

乳腺癌是排名第一位的女性常见恶性肿瘤。2016年据国家癌症中心统计显示，全国新发乳腺癌病例数达27.24万，每年死亡率已超过7万。根据多年研究结果的显示，大约20％的乳腺癌患者都存在人表皮生长因子受体-2(Human Epidermal growth factorReceptor-2，HER-2)基因或蛋白水平增加的现象。基于患者跟踪调查研究结果的显示，针对HER-2基因扩增的乳腺癌靶向药物曲妥珠单抗(赫赛汀)的临床应用可以显著改善HER-2阳性乳腺癌患者的预后状况，从而改变了乳腺癌的传统治疗模式，是乳腺癌靶向治疗的重要突破。《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》中指出乳腺癌患者HER-2基因拷贝数变异(扩增)检测及判定方法已经成为常规的临床检测指标，目前主要使用免疫组化(IHC)法检测HER-2蛋白的表达水平，应用原位杂交(ISH)法(包括荧光原位杂交FISH法和亮视野ISH法)检测HER-2基因的扩增水平。其中，荧光原位杂交(FISH)技术被认为是目前检测HER-2基因是否存在扩增的“金标准”。目前使用FISH方法进行HER-2基因状态的检测多为同时使用含有HER-2基因序列和该基因所在的第17号染色体着丝粒CEP17基因序列的双探针，双探针检测中加入CEP17探针的目的是为了在检测HER-2基因的同时检测第17号染色体数目，从而将第17号染色体的非整倍体和单纯的HER-2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。之后经过FISH检测并通过特异通道滤光片观察HER-2基因和CEP17基因信号并进行信号计数和比值结果的计算以对检测结果进行判读。《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》中指出乳腺癌患者HER-2基因拷贝数变异(扩增)判定方法为：若HER-2/CEPl7≥2，则HER-2扩增阳性；若HER-2/CEPl7<2，则存在以下三种情况，分别为①平均HER-2拷贝数/细胞≥6，则HER-2扩增阳性；②平均HER-2拷贝数/细胞<4，则HER-2扩增阴性；③4.0≤平均HER-2拷贝数/细胞<6.0，则HER-2扩增不确定。由此可见，对于HER-2/CEPl7比值<2.0，4.0≤平均HER-2拷贝数/细胞<6.0的病例并不能确定HER-2的扩增情况，也因此无法确定治疗方案而使患者贻误病情。造成这种现象出现的主要原因是：①FISH方法存在很大弊端，不仅需要冗长繁琐的染色和切片制备过程，还需要专业的技术培训过程，存在检测成本高、检测耗时长、操作步骤繁琐、实验结果的判读过分依赖于实验人员的现象。据相关报道，FISH检测HER-2基因扩增的错误率在13％左右；②由于第17号染色体存在着丝粒区域内扩增现象；③由于第17号染色体可能出现的多体现象。着丝粒扩增和第17号染色体出现多体现象均使单个细胞内HER-2基因和CEP17基因的拷贝数出现不可控的变化而导致二者比值出现例如HER-2/CEPl7比值<2.0，4.0≤平均HER-2拷贝数/细胞<6.0的比值偏差现象。因此，使用FISH方法并使用着丝粒CEP17基因的表达水平来衡量HER-2基因是否存在阳性扩增是不准确的，对于HER-2基因变异扩增的情况需要更精准的检测以及判定方法，其结果对选择靶向药物的治疗方案非常重要。

目前市场上存在的建立在PCR技术上的HER-2基因变异扩增检测试剂盒主要有两大类，分别是以实时荧光定量PCR或者数字PCR作为检测方法。实时荧光定量PCR技术是一种核酸相对定量技术，在进行基因拷贝数变异检测时，需要结合标准品并通过双标准曲线来对样本中的靶基因进行相对定量，因此，当检测引物的扩增效率较低时，通过标准曲线换算的靶分子浓度值将非常不准确，无法准确检测出靶基因的拷贝数。数字PCR技术是一种核酸绝对定量的新技术，被称为第三代PCR技术，并不依赖于标准品和扩增效率，可直接对核酸中靶分子进行数量统计，从而实现靶分子的绝对定量。《乳腺癌HER-2检测指南(2014版)》中也指出HER-2拷贝数对于HER-2基因扩增的判断更为重要，因此，可以进行绝对定量检测的数字PCR技术在HER-2基因拷贝数变异的检测上有着其他方法无法替代的优势。与此同时，解决CEP17基因着丝粒共同扩增和第17号染色体出现多体现象的问题也是不可忽视的。虽然目前使用数字PCR方法申请的相关专利(公布号CN105986028A)中选择了新的内参基因EFTUD2，但是EFTUD2基因也是存在于第17号染色体上，只是远离着丝粒附近的一个基因，因此新的内参基因EFTUD2也只是解决了着丝粒存在共同扩增的问题，而不能解决第17号染色体是否发生多体现象的问题。此外，已公布发明(公布号CN106591438A)的权利要求中内参基因选择了CEP17和非第17号染色体上的RPPH1基因并在其实施例中采用HER-2-1/RPPH1+HER-2-2/CEP17的计算方式及1.1～1.2的比值范围，但是采用如此接近的比值来判定样本HER-2基因扩增的阴阳性，显然区分能力非常有限，而且该发明未选择EFTUD2基因作为内参基因，因此不能明确去除着丝粒扩增对于HER-2拷贝数变异的影响。

综上所述，本发明使用简单有效的数字PCR检测方法以及判定方法，在检测数据精确的基础上，解决了目前HER-2拷贝数变异检测过程中存在的HER-2/CEPl7<2，4.0≤平均HER-2拷贝数/细胞<6.0，HER-2基因扩增阴阳性不确定的问题。首先，本发明建立在数字PCR技术上可以简单快速地实现靶分子拷贝数的绝对定量，大大消除FISH方法检测成本高、检测耗时长、操作步骤繁琐、实验结果判读过分依赖于实验人员的现象。其次，本发明分别采用了CEP17、EFTUD2、EIF2C1三个基因作为内参基因来增强HER-2基因拷贝数变异检测结果判定的准确性，其中CEP17和EFTUD2基因都位于第17号染色体上，CEP17基因是着丝粒区段内的基因，作为内参基因可以解决第17号染色体出现非整倍体和单纯的HER-2基因扩增，尤其是低水平扩增的问题；EFTUD2基因位于第17号染色体上远离着丝粒区段的基因，因此可以消除着丝粒扩增对于HER-2拷贝数变异的影响；EIF2C1基因位于第1号染色体上，属于单拷贝并且保守性很强不易产生变异的基因，因此检测EIF2C1基因的拷贝数可以消除第17号染色体发生多体现象对于HER-2拷贝数变异的影响。除此之外，本发明在采用数字PCR技术分别检测出HER-2以及CEP17、EFTUD2、EIF2C1三个内参基因拷贝数之后再计算拷贝数的比值进而判读出HER-2拷贝数变异的情况，以及着丝粒是否存在扩增以及第17号染色体是否发生多体现象，即如果分别以H表示HER-2的拷贝数，C表示CEP17的拷贝数，EF表示EFTUD2的拷贝数，EI表示EIF2C1的拷贝数，若H/C≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2，C/EF<2，则HER-2扩增阴性。迄今为止，基于数字PCR技术检测并结合此判定方法对HER-2基因拷贝数变异的检测在国际上还未见报道，因此具有极高的创新性和应用价值。

发明内容

本发明旨在提供一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法，以解决现有技术中HER-2基因拷贝数变异判定方法准确度低的技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种用于检测HER-2基因拷贝数的引物对及检测探针1，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，即：5’-GGTAGAACCTTTGCTGTC-3’；其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所述，即5’-GCAGAACCATACTGATGA-3’；检测探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所述，即5’-TGTTCACCACTCTACCTCCAGC-3’，所述检测探针1为FAM荧光基团标记。

进一步地，提供了一种用于检测HER-2基因拷贝数的第二组引物对及检测探针2，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所述，即5’-CTAGCACC TTGCTAAGCA-3’；其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所述，即5’-AGCACCATTCACAGAAA-3’；检测探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所述，即5’-CCAGGAGGCACCATTCACATTG-3’，所述检测探针2为FAM荧光基团标记。

进一步地，提供了一种用于检测CEP17基因拷贝数的引物对及检测探针，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：7所述，即5’-GACGTATGGTTGAGCTTC-3’；其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：8所述，即5’-CTGGCACCTCTGTAAGTA-3’；CEP17基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所述，即5’-TGCCTAATCTACCAATGAACCACCA-3’，所述检测探针3为CY3.3荧光基团标记。

进一步地，提供了一种用于检测EIF2C1基因拷贝数的引物对及检测探针，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：10所述，即5’-GCCATAACATTCCCTTAA-3’；其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：11所述，即5’-GAACCAATCTCTACTAGC-3’；EIF2C1基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所述，即5’-CTACCTTACCTCTGTTGGCACTCA-3’，所述检测探针4为CY3.3荧光基团标记。

进一步地，提供了一种用于检测EFTUD2基因拷贝数的引物对及检测探针，其正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：13所述，即5’-CTTCCTTCTTGCCTATTC-3’；其反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO：14所述，即5’-CTGTCTAGTCTTAGTCTTATG-3’；EFTUD2基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所述，即5’-ATGCCTCCTCTCCAGTGACA-3’，所述检测探针5为CY5.5荧光基团标记。

上述所列引物对及检测探针是采用数字PCR技术经过大量筛选试验和荧光标记检测所获得。

本发明还提供一种检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒，其包含上述的引物对及检测探针。进一步地，试剂盒还包括数字PCR预混液、荧光素酶、ddH₂O和校准文件。

本发明还提供一种用所述试剂盒检测HER-2基因拷贝数变异的方法，该方法是：提取待测样本的DNA作为模板，以上述试剂盒中的引物对及检测探针作为扩增引物，加入数字PCR预混液、荧光素酶、和ddH₂O，进行数字PCR扩增，对扩增产物进行拷贝数统计并将HER-2基因的拷贝数简写为H、CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI、EFTUD2基因的拷贝数简写为EF，若H/C≥2，则判定HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2，C/EF<2，则HER-2扩增阴性。

进一步地，上述方法中，若EF/EI≥2，则第17号染色体存在多体现象，若C/EF≥2，则第17号染色体着丝粒存在扩增现象。

进一步地，所述的试剂盒及方法适用于石蜡组织切片和血液中的HER-2基因拷贝数变异的检测。

进一步地，所述的试剂盒及方法适用于微滴式数字PCR仪和微滴芯片式数字PCR仪。

本发明还提供一种利用所述引物对和检测探针检测HER-2基因拷贝数变异的数字PCR反应体系，其包括：数字PCR预混液终浓度为1×；正向引物和反向引物各0.5μM；检测探针0.25μM；模板DNA10ng；荧光素钠盐0.1μM；余量为水；总反应体系为25μL。

数字PCR预混液终浓度为1×，是指数字PCR缓冲液中各组分在反应体系中的浓度与1×数字PCR缓冲液相同，本发明中数字PCR预混液为反应体系体积1/5的5×数字PCR预混液备用。

具体地，本发明所述对HER-2基因拷贝数变异的检测方法如下：

(1)提取待测样本中的DNA。

(2)以步骤(1)提取到的DNA作为模板，以所述基因的特异性引物对以及检测探针进行扩增，并同时进行阴性和阳性质控品的检测。

(3)扩增结束后，检测荧光信号并使用软件对扩增产物进行拷贝数统计，HER-2基因的拷贝数为HER-2基因的两组引物对扩增后拷贝数的平均值并简写标记为H、CEP17基因的拷贝数简写标记为C、EIF2C1基因的拷贝数简写标记为EI、EFTUD2基因的拷贝数简写标记为EF，分别计算H/C、EF/EI、C/EF、H/EF的比值。

数值结果的判读方法为：若H/C≥2，则判定HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2，C/EF<2，则HER-2扩增阴性。若EF/EI≥2，则第17号染色体存在多体现象，若C/EF≥2，则第17号染色体着丝粒存在扩增现象。

目前已有的判断HER-2表达状况的方法主要是计算HER-2与内参基因CEP17或EFTUD2之间的比值或者HER-2与内参基因CEP17或RPPH1之间的比值来简单地判定HER-2的阴阳性，显然不能准确检测HER-2基因是否扩增的真实情况。而在本发明中，采用数字PCR技术，通过检测HER-2基因和三个内参基因CEP17、EIF2C1、EFTUD2的拷贝数并对HER-2基因和三个内参的拷贝数进行多向比对的算法，即可准确排除第17号染色体非整倍体或着丝粒扩增的干扰，使HER-2基因扩增阳性还是阴性的准确性极大提高，从而辅助指导乳腺癌患者用药。

附图说明

说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了HER-2-1和CEP17的二维检测图。其中横坐标为HER-2-1基因检测出的荧光强度，纵坐标为CEP17基因检测出的荧光强度，第一象限是HER-2-1基因和CEP17基因检测出的共同阳性微滴，第二象限是CEP17基因检测出的阳性微滴，第三象限是阴性微滴，第四象限是HER-2-1基因检测出的阳性微滴；

图2示出了HER-2-2和EIF的二维检测图。其中横坐标为HER-2-2基因检测出的荧光强度，纵坐标为EIF基因检测出的荧光强度，第一象限是HER-2-2基因和EIF基因检测出的共同阳性微滴，第二象限是EIF基因检测出的的阳性微滴，第三象限是阴性微滴，第四象限是HER-2-2基因检测出的阳性微滴；

图3示出了HER-2-2和EFTUD2的二维检测图，其中横坐标为HER-2-2基因检测出的荧光强度，纵坐标为EFTUD2基因检测出的荧光强度，第一象限是HER-2-2和EFTUD2基因检测出的共同阳性微滴，第二象限是EFTUD2基因检测出的阳性微滴，第三象限是阴性微滴，第四象限是HER-2-2基因检测出的阳性微滴；

图4示出了使用本发明所得到HER-2、CEP17、EFTUD2、EIF2C1基因拷贝数计算比值后的HER-2基因是阴性还是阳性的判定方法。HER-2基因的拷贝数为两组引物对扩增后拷贝数的平均值并简写为H、CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI、EFTUD2基因的拷贝数简写为EF。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例来对本发明做进一步详细说明，但它们仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：用于检测HER-2基因拷贝数变异的特异PCR引物及检测探针序列设计

1、序列获得：本发明所涉及的HER-2、CEP17、EFTUD2、EIF2C1基因检测位点见表1。

表1、HER-2、CEP17、EFTUD2、EIF2C1基因检测位点

基因	基因位点区域
		HER-2	17q12
CEP17	17p11.2
		EFTUD2	17q21.31
EIF2C1	1p34.3

2、设计方法：根据NCBI数据库公布的HER-2、CEP17、EIF2C1、EFTUD2基因序列，设计特异的引物和检测探针(表2)。

表2、HER-2、CEP17、EIF2C1、EFTUD2引物和检测探针序列表

基因位点	引物及探针名称	序列号	序列(5’-3’)
				HER-2-1F	正向引物1	SEQ ID No.1	GGTAGAACCTTTGCTGTC
HER-2-1R	反向引物1	SEQ ID No.2	GCAGAACCATACTGATGA
				HER-2-1P	检测探针1	SEQ ID No.3	TGTTCACCACTCTACCTCCAGC
HER-2-2F	正向引物2	SEQ ID No.4	CTAGCACCTTGCTAAGCA
				HER-2-2R	反向引物2	SEQ ID No.5	GAGCACCATTCACAGAAA
HER-2-2P	检测探针2	SEQ ID No.6	CCAGGAGGCACCATTCACATTG
				CEP17F	正向引物3	SEQ ID No.7	GACGTATGGTTGAGCTTC
CEP17R	反向引物3	SEQ ID No.8	CTGGCACCTCTGTAAGTA
				CEP17P	检测探针3	SEQ ID No.9	TGCCTAATCTACCAATGAACCACCA
EIF2C1F	正向引物4	SEQ ID No.10	GCCATAACATTCCCTTAA
				EIF2C1R	反向引物4	SEQ ID No.11	GAACCAATCTCTACTAGC
EIF2C1P	检测探针4	SEQ ID No.12	CTACCTTACCTCTGTTGGCACTCA
				EFTUD2F	正向引物5	SEQ ID No.13	CTTCCTTCTTGCCTATTC
EFTUD2R	反向引物5	SEQ ID No.14	CTGTCTAGTCTTAGTCTTATG
				EFTUD2P	检测探针5	SEQ ID No.15	ATGCCTCCTCTCCAGTGACA

3、根据以上得到的特异序列设计引物及检测探针，本发明专利中使用到的引物及检测探针是在美国赛默飞世尔科技公司(上海)合成。

实施例2：应用一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法检测石蜡组织切片样本中的HER-2基因拷贝数的变异情况。

1、材料：18例已经经过IHC或FISH检测鉴定的乳腺癌患者的石蜡切片样本。

2、方法：使用Naica Crystal Digital^TM数字PCR仪(法国STILLA Technologies公司)进行数字PCR检测。

(1)核酸提取：DNA提取推荐使用石蜡切片DNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司，CatNo.56404)。提取步骤按照产品说明书进行，收集到50μL DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。同时进行阴、阳性质控品的检测。

(2)按照表3配制数字PCR反应液，配制完成后将PCR反应管涡旋混匀15秒后，快速离心15秒。

表3、数字PCR反应液配制表

检测的靶基因分别为HER-2、CEP17、EIF2C1、EFTUD2，因此靶基因的正向引物分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13所示核苷酸序列引物，靶基因的反向引物分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14所示核苷酸序列引物，检测探针分别为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列探针，其中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6为标记FAM荧光基团，SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12为标记CY3.3荧光基团，SEQ ID NO：15为标记CY5.5荧光基团。

(3)取出芯片，轻轻旋转白盖1/4圈并丢弃白盖，移取上述步骤(2)中的25μL反应液加入到芯片孔井中并盖上白色长盖。

(4)将加入25μL数字PCR反应液的芯片放入Naica^TM Geode微滴生成扩增系统中，按表4设置数字PCR反应条件。

表4、数字PCR反应条件表

(5)信息采集：数字PCR扩增结束后，将芯片放置于Naica^TM prism3微滴阅读分析系统中，并且导入本发明试剂盒内带有的校准文件，之后进行荧光信号的检测和判读。

(6)结果分析：使用Crystal Miner进行数据分析，HER-2基因拷贝数简写表示为H、CEP17基因拷贝数简写表示为C、EIF2C1基因拷贝数简写表示为EI、EFTUD2基因拷贝数简写表示为EF，后续所有检测各个基因之间的比值计算标识均以简写表示，检测结果参见表5。

表5、18例石蜡切片中HER-2、CEP17、EIF2C1、EFTUD2基因的数字PCR检测结果表

18个石蜡样本的H/C、EF/EI、C/EF、H/EF的比值计算结果见表6所示。

表6、18个石蜡样本的H/C、EF/EI、C/EF、H/EF的比值结果表

注：*在IHC检测结果中，(+++)表示HER-2检测阳性，(++)表示HER-2检测无法确定，(+)表示HER-2检测阴性，(-)表示HER-2检测阴性。

3、比值结果判定方法：若H/C≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2，C/EF<2，则HER-2扩增阴性。若EF/EI≥2，则第17号染色体存在多体现象，若C/EF≥2，则第17号染色体着丝粒存在扩增现象。

比值结果判定方法说明：在IHC检测结果中，(+++)表示HER-2检测阳性，(++)表示HER-2检测无法确定，(+)表示HER-2检测阴性，(-)表示HER-2检测阴性。参见说明书附图4中所示，此判定方法主要针对IHC检测结果为(++)，即无法确定检测结果的情况，以及FISH检测结果为H/C<2并且无法判定HER-2扩增阴性还是阳性的情况。首先，计算H/C比值，若H/C≥2，则判定HER-2扩增阳性，若H/C<2，则不能简单认定HER-2扩增为阴性，应该比较EF/EI的比值；如果EF/EI≥2，则说明第17号染色体出现多体现象，在这种情况下，此时应再计算C/EF值，若C/EF≥2，则说明在第17号染色体出现多体现象的同时还伴随着着丝粒扩增的现象，此时应再计算H/EF值，若H/EF≥2，判定HER-2扩增阳性；若EF/EI≥2时，C/EF<2，说明在第17号染色体只出现多体现象，因而判定H/C<2为确定的HER-2扩增阴性。如果EF/EI<2，则说明第17号染色体未出现多体现象，此时再计算C/EF值，若C/EF≥2，说明有着丝粒扩增的现象，此时应再计算H/EF值，若H/EF≥2，判定HER-2扩增阳性；若H/EF<2，判定HER-2扩增阴性；若EF/EI<2，C/EF<2，则参考原H/C的比值，因而判定H/C<2为确定的HER-2扩增阴性。

4、实验结果分析：本次实验中18例石蜡切片样本的检测结果与已有临床IHC/FISH的检测结果相比，其中有16例样本与IHC或者FISH的检测结果相符，有2例即编号为M94487和N02006的样本HER-2的IHC检测结果为(++)，即检测结果无法确定的情况下，补充FISH检测结果为HER-2阴性。而按照本发明中的检测结果及比值计算判定为HER-2阳性。本实施例的检测方法及拷贝数比值结果均说明本发明，即一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法在检测HER-2基因扩增水平时是可行的。与FISH检测方法相比，本试剂盒具有操作简便、检测准确、检测时间短，可实现高通量检测的优势，尤其适合于FISH检测中不能确定HER-2扩增情况的时候进行使用。

实施例3：应用一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法检测血液样本中HER-2基因拷贝数的变异情况。

1、材料：随机选取实施例2中18例乳腺癌患者其中5例的血液样本

2、方法：使用Naica Crystal Digital^TM数字PCR仪(法国STILLA Technologies公司)进行检测。

(1)样本采集：血液样本采用静脉穿刺，利用STRECK BCT管或EDTA抗凝管(紫色)收集血液样本10mL；如不能在2小时内进行血浆分离，在全血采集时需要使用含游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管(如Streck BCT管)。

(2)血液样本的保存和运送：STRECK BCT管属于指定温度范围内(6～37℃)运输和短期储存使用的采血管，如不能及时送血液样本，应将装有血液样本的离心管置于冰箱4～8℃保存，检测时间最好不要超过24小时，如果使用EDTA抗凝管(紫色)收集的血液样本，则在登记完成后，于4℃保存并在2小时内分离血浆。

(3)核酸提取：血浆DNA提取试剂推荐使用游离DNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司，Cat NO.55114)。提取步骤按照产品说明书进行，最后收集到50μL DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。

(4)数字PCR检测及结果分析参照实施例2进行，同时进行阴、阳性质控品的检测，检测结果参见表7所示。

表7、血液样本中HER-2、CEP17、EIF2C1、EFTUD2基因的数字PCR检测结果表

(5)血液样本的H/C、EF/EI、C/EF、H/EF比值结果参见表8所示。

表8、血液样本的H/C、EF/EI、C/EF、H/EF比值结果表

3、比值结果判定方法：若H/C≥2，则判定HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2，C/EF<2，则HER-2扩增阴性。若EF/EI≥2，则第17号染色体存在多体现象，若C/EF≥2，则第17号染色体着丝粒存在扩增现象。

4、实验结果分析：按照上述步骤3中的比值结果判定方法可知，本次实验中使用5例血液样本进行数字PCR检测并进行比值的判定结果显示，检测结果与石蜡组织切片数字PCR检测结果相互验证中有1例不同，即M94487石蜡组织切片数字PCR检测结果为HER-2阳性，而本实施例的检测及计算结果为HER-2阴性，这是由于血液作为一种检测样本，是以血液中肿瘤细胞释放出的循环游离DNA作为模板，和组织样本的检测结果有差异属于正常现象。但是也可以说明本发明，即一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法可以用于检测血液中HER-2基因扩增水平并进行判定。

实施例4：应用一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法在不同数字PCR仪上检测HER-2基因拷贝数的变异情况。

1、材料：随机选取实施例2中的18例乳腺癌患者已经经过IHC或FISH检测鉴定的乳腺癌患者的石蜡切片样本中的8例已经提取的DNA作为模板。

2、方法：使用BIORAD QX-100(美国伯乐公司)微滴式数字PCR仪进行检测，BIORADQX-100(美国伯乐公司)属于微滴式的数字PCR仪器。

(1)核酸提取：随机选取实施例2中的18例乳腺癌患者已经经过IHC或FISH检测鉴定的乳腺癌患者的石蜡切片样本中的8例已经提取的DNA作为模板。

(2)配置数字PCR反应液。将引物、探针、加入PCR supermix配置成15.5μL反应液，在PCR反应液中加入样本DNA7.3μL，将配好的数字PCR反应液加入到数字PCR仪的微滴发生板上。

(3)制备微滴。将微滴发生板放入一个8通道微滴制生成器中，在每个孔中加入70μL微滴生成油来形成微滴。

(4)PCR扩増。将样本生成的微滴手动转移到96孔PCR板上。孔板用锡纸热封，然后置于热循环中扩増。检测的热循环模式为：95℃溫育10分钟，然后进行45个周期：95℃15秒，，70℃15秒，60℃1分钟，最后置于4℃中。

(5)检测微滴。PCR反应后，将96孔PCR板置于微滴分析仪值中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。

(6)分析数据，H/C、EF/EI、C/EF、H/EF的比值参见表9所示。

表9、使用BIORAD QX-100(美国伯乐公司)数字PCR仪检测后，H/C、EF/EI、C/EF、H/EF的比值表。

4、实验结果分析：按照本发明中上述结果判定方法可知，本次实验中使用8例石蜡切片样本并使用BIORAD QX-100(美国伯乐公司)进行数字PCR检测，BIORAD QX-100(美国伯乐公司)属于微滴式数字PCR仪。检测结果与实施例2中使用Naica Crystal Digital^TM PCR仪(法国STILLA Technologies公司)检测结果相吻合，本实施例的检测结果充分说明本发明，即一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法可以在微滴式数字PCR仪上使用并检测HER-2基因扩增水平。

序列表

<110> 北京爱普拜生物技术有限公司

<120> 一种基于数字PCR技术检测HER2基因拷贝数变异的试剂盒及方法

<130> 0613

<141> 2018-06-22

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ggtagaacct ttgctgtc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

gcagaaccat actgatga 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

tgttcaccac tctacctcca gc 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

ctagcacctt gctaagca 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gagcaccatt cacagaaa 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

ccaggaggca ccattcacat tg 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

gacgtatggt tgagcttc 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

ctggcacctc tgtaagta 18

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

tgcctaatct accaatgaac cacca 25

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gccataacat tcccttaa 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

gaaccaatct ctactagc 18

<210> 12

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ctaccttacc tctgttggca ctca 24

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

cttccttctt gcctattc 18

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

ctgtctagtc ttagtcttat g 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

atgcctcctc tccagtgaca 20

Claims

1.一种基于数字PCR技术检测HER-2基因拷贝数变异的非诊断方法，其特征在于：提取待测样本的DNA作为模板，以SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5、SEQID NO：7和SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示引物作为扩增引物，并加入SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQID NO：15所示检测探针、数字PCR预混液、荧光素酶和ddH₂O，进行数字PCR扩增，对扩增产物进行拷贝数统计并将HER-2基因的拷贝数简写为H、CEP17基因的拷贝数简写为C、EIF2C1基因的拷贝数简写为EI、EFTUD2基因的拷贝数简写为EF，分别计算H/C、EF/EI、C/EF、H/EF的比值，若H/C≥2，则判定HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI≥2、C/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF≥2，则HER-2扩增阳性；若H/C<2、当EF/EI<2、C/EF≥2、H/EF<2，则HER-2扩增阴性；若H/C<2、当EF/EI<2，C/EF<2，则HER-2扩增阴性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于若EF/EI≥2，则第17号染色体存在多体现象，若C/EF≥2，则第17号染色体着丝粒存在扩增现象。