CN110669843A - 一种应用数字pcr检测her2基因扩增的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于HER2基因扩增检测试剂技术领域，具体涉及一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒。所述试剂盒包括引物探针预混液，所述引物探针预混液中包括1)检测HER2基因的上下游引物、检测HER2基因的荧光探针；2)检测人FAS基因的上下游引物、检测人FAS基因的荧光探针；3)检测人ACTB基因的上下游引物、检测人ACTB基因的荧光探针。本发明提供的HER2基因扩增检测试剂盒，与实时荧光定量PCR相比，可以进行绝对定量，且检测下限明显低于荧光定量PCR。而且该试剂盒的引物探针组合，特异性高，检测效果更好。

Description

一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒
技术领域
本发明属于HER2基因扩增检测试剂技术领域，具体涉及一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒。
背景技术
人类HER-2/neu基因(Her-2基因)基因定位于染色体17q21，其编码产物为185kD的跨膜精蛋白p185，由1255个氨基酸组成，720—987位属于酪氨酸激酶区。Her-2/neu蛋白是具有酪氨酸蛋白激酶活性跨膜糖蛋白，是EGFR家族成员之一。人表皮生长因子受体2(HER2，ERBB2)的过量表达和许多上皮细胞癌症的恶化程度密切相关。HER2高表达的肿瘤表现出强的转移能力和侵润能力，对化疗的敏感性也较差，且易复发。在正常细胞中HER2的表达水平非常低，但是在胚胎发育期表达量非常高，对发育过程的细胞增殖、分化、迁移等起重要的作用。
寻找有效的治疗手段一直是肿瘤学界研究的方向。现在已知，大约25-30％的乳腺癌有HER2基因扩增。此外，不同比例的卵巢癌，前列腺癌，胃癌及肺癌也可能有HER2过度表达的现象存在。正确检测和评定乳腺癌的HER2基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要。赫赛汀(Herceptin)于1998年首次获批，它作为一种免疫治疗药物，能特异性地抑制具有HER2癌基因扩增的癌细胞的生长，使病人预后大大改善。2012年6月8日，新的乳腺癌药物Perjeta获得FDA的批准，在临床试验中，与现有标准护理相比，Perjeta使癌症的恶化推迟了额外6个月。但与Herceptin相同，此药物也仅适用于HER2扩增阳性的乳腺癌患者。因此可知，癌细胞HER2基因扩增是决定Herceptin和Perjeta是否有效的关键性指标。
现阶段国内外一般采用免疫组织化学(IHC)法检测HER2受体蛋白表达状态和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)法检测HER2基因扩增水平。其中IHC检测结果只能作为前期初步筛查使用，IHC检测具有成本低、技术简单、便于操作等特点，常是临床检测的首选。但IHC容易受到组织影响，缺乏标准化，结果判断存在主观差异，造成不同实验室之间的IHC检测结果可能存在差异。HER2的FISH检测具有较高的准确性、灵敏度和特异性，其结果在不同实验室间一致性较高，目前是检测HER2基因扩增的“金标准”。但是FISH存在仪器价格昂贵、检测周期长、患者收费高、检测者专业知识和实验室条件的限制，检测试剂一直被国内或国外1、2个厂家所垄断，只能在具有资质的大医院进行，造成大量人员不能得到及时的诊断而失去个体化用药的机会，因此急需一种高灵敏度、准确度、易于操作标准化、多样化检测等优势检测方法。目前使用的FISH和IHC的方法，但是FISH存在一起价格昂贵、检测周期长、患者收费高、检测者专业知识和实验室条件的限制，不利于广泛应用。IHC也具有操作繁琐、观察结果不便等缺点，故提出此发明。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本申请的发明目的在于提供一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒。该试剂盒可对肿瘤组织中的HER2基因扩增进行检测，进行绝对定量。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，所述试剂盒包括引物探针预混液，所述引物探针预混液中包括1)检测HER2基因的上下游引物、检测HER2基因的荧光探针；2)检测人FAS基因的上下游引物、检测人FAS基因的荧光探针；3)检测人ACTB基因的上下游引物、检测人ACTB基因的荧光探针；
其中，1)HER2基因的引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-ACTTAATTGGCATTCTACTCCC-3'SEQ ID NO:1；
下游引物：5'-ATTGGAGACACGGCCTC-3'SEQ ID NO:2；
探针：5'-GGCGCAACGCTGAGCAGCTGG-3'SEQ ID NO:3；
2)检测人FAS基因的上下游引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-CGCTTATATAATGGTGCTCGTT-3'SEQ ID NO:4
下游引物：5'-TATCAGGACAAACTAAATCCCC-3'SEQ ID NO:5
探针：5'-AAGCCTGCAGATACAAGGACAC-3'SEQ ID NO:6
3)检测人ACTB基因的上下游引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:7
下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:8
探针：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:9。
优选地，所述试剂盒还包括包括PCR反应预混液，所述PCR反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和扩增增强剂。
进一步优选地，所述扩增强剂包括焦磷酸酶和Triton X-100。
更进一步优选地，所述焦磷酸酶的终浓度为0.5-2U，所述Triton X-100的终浓度为0.05％-2％。
优选地，所述PCR反应预混液包括
Figure BDA0002266074550000031
优选地，用于检测HER2、FAS和ACTB基因的上游引物、下游引物和荧光探针的工作浓度均为0.1-1μM。
进一步优选地，用于检测HER2基因、FAS基因和ACTB基因的上游引物、下游引物以及荧光探针的工作浓度为0.1-0.7μM；
更进一步优选地，检测HER2基因，FAS基因和ACTB基因的上游引物、下游引物以及荧光探针的工作浓度为0.1-0.7μM；最优选地，检测HER2基因、FAS基因和ACTB基因的上游引物、下游引物的工作浓度为0.4μM、0.2μM。
优选地，所述HER2基团的荧光报告基团为CY3，荧光淬灭基团为BHQ2；FAS基团的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；ACTB的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为经免疫组化方法和PCR方法证明为HER2扩增阴性的乳腺癌组织DNA；
阳性质控品为经免疫组化方法和PCR方法证明为HER2扩增阳性的乳腺癌组织DNA。
优选地，所述试剂盒对HER2基因扩增进行检测的方法，其包括如下步骤：
S1针对选定的HER2、FAS和ACTB序列，分别设计特异性引物和探针；
S2提取检测样本的DNA；
S3利用数字PCR平台进行扩增反应；
S4对扩增结果进行分析与判读。
所述步骤S2具体操作如下：
S2-1待测样品的准备
本发明适用标本类型为术后肿瘤组织立即冰冻并保存于-20℃的冰冻组织或者按常规处理为石蜡包埋组织；
S2-2 DNA模板的制备
使用石蜡包埋组织，使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit(Cat.No69504)，按照试剂盒说明书进行操作，最后收集到50μL DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
步骤S3中，包括如下操作：
S3-1试剂配制
按照如下配方配制PCR反应预混液：
S3-2配制预混液后，将预混液与引物，探针和模板按如下表中比例混合，进行数字PCR扩增反应；
Figure BDA0002266074550000042
S3-3检测过程
将PCR反应液加载到数字PCR芯片中，按照如下程序进行反应：
Figure BDA0002266074550000043
Figure BDA0002266074550000051
S4对扩增结果进行分析与判读具体包括如下操作：
S4-1 HER2与ACTB基因结果分析：
1)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；
2)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度均在1╳102copies/μL-1╳105copies/μL之间，直接进行如下计算：
M＝HER2基因检测浓度/ACTB内参基因检测浓度，
当M≤0.2时，则结果判读为：无HER2基因扩增；
当M＞0.2时，则结果判读为：HER2基因扩增；
3)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项大于1╳105copies/μL，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。
S4-2 HER2与FAS基因结果分析：
1)如果HER2基因和FAS内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；
2)如果HER2基因和FAS内参基因检测浓度均在1╳102copies/μL-1╳105copies/μL之间，直接进行如下计算：
N＝HER2基因检测浓度/FAS内参基因检测浓度，
当N≤2时，则结果判读为：无HER2基因扩增；
当N＞2时，则结果判读为：HER2基因扩增；
3)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项大于1╳105copies/μL，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。
与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：
(1)本发明提供的HER2基因扩增检测试剂盒，是基于数字PCR检测系统，上样后全自动检测，减少人为操作干扰，结果稳定，准确度高，数据扩增效果好，能够更便捷的用于辅助诊断与临床治疗指导。
与目前同类检测产品相比，具体优势如下：与实时荧光定量PCR相比，可以进行绝对定量，且检测下限明显低于荧光定量PCR。
(2)本试剂盒使用自主设计的引物探针组合，特异性高，检测效果更好。
(3)本试剂盒使用自主优化的反应体系，在保证反应高效准确的前提下极大提高了芯片进孔率，使用热启动的DNA聚合酶，降低反应假阳性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其包括引物探针预混液，所述引物探针预混液中包括1)检测HER2基因的上下游引物、检测HER2基因的荧光探针；2)检测人FAS基因的上下游引物、检测人FAS基因的荧光探针；3)检测人ACTB基因的上下游引物、检测人ACTB基因的荧光探针；
其中，1)HER2基因的引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-ACTTAATTGGCATTCTACTCCC-3'SEQ ID NO:1；
下游引物：5'-ATTGGAGACACGGCCTC-3'SEQ ID NO:2；
探针：5'-GGCGCAACGCTGAGCAGCTGG-3'SEQ ID NO:3；
2)检测人FAS基因的上下游引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-CGCTTATATAATGGTGCTCGTT-3'SEQ ID NO:4
下游引物：5'-TATCAGGACAAACTAAATCCCC-3'SEQ ID NO:5
探针：5'-AAGCCTGCAGATACAAGGACAC-3'SEQ ID NO:6
3)检测人ACTB基因的上下游引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:7
下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:8
探针：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:9。
所述HER2基团的荧光报告基团为CY3，荧光淬灭基团为BHQ2；FAS基团的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；ACTB的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。
还包括阴性质控品、阳性质控品和水，所述阴性质控品为经免疫组化方法和PCR方法证明为HER2扩增阴性的乳腺癌组织DNA；
阳性质控品为经免疫组化方法和PCR方法证明为HER2扩增阳性的乳腺癌组织DNA。
所述试剂盒中PCR反应预混液包括如下各组分(表1)：
表1 PCR反应预混液的组成
Figure BDA0002266074550000071
实施例2
采用如上试剂盒检测HER2基因扩增的方法，其包括如下步骤：
(1)待测样品的准备
本发明适用标本类型为术后肿瘤组织立即冰冻并保存于-20℃的冰冻组织或者按常规处理为石蜡包埋组织；
(2)DNA模板的制备
使用石蜡包埋组织，使用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit(Cat.No69504)，按照试剂盒说明书进行操作，最后收集到50μL DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃。
(3)反应体系的准备
将预混液与引物，探针和模板按如下表中比例混合，进行数字PCR扩增反应。
Figure BDA0002266074550000081
(4)检测过程
按照下表设置热循环温度，选择适用于检测荧光的检测通道(本实验中是FAM，CY3和HEX)。
Figure BDA0002266074550000082
(5)结果判读
HER2与ACTB基因结果分析：
1)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；
2)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度均在1╳102copies/μL-1╳105copies/μL之间，直接进行如下计算：
M＝HER2基因检测浓度/ACTB内参基因检测浓度，
当M≤0.2时，则结果判读为：无HER2基因扩增；
当M＞0.2时，则结果判读为：HER2基因扩增；
3)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项大于1╳105copies/μL，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。
HER2与FAS基因结果分析：
1)如果HER2基因和FAS内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；
2)如果HER2基因和FAS内参基因检测浓度均在1╳102copies/μL-1╳105copies/μL之间，直接进行如下计算：
N＝HER2基因检测浓度/FAS内参基因检测浓度，
当N≤2时，则结果判读为：无HER2基因扩增；
当N＞2时，则结果判读为：HER2基因扩增；
3)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项大于1╳105copies/μL，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。
本实施例中的检测结果为HER2的拷贝数为4650copies，ACTB的拷贝数为15355copies，FAS的拷贝数为1583copies。
结果判读情况为：
M＝HER2/ACTB＝4650/15355＝0.3
N＝HER2/FAS＝4650/1583＝2.94
M>0.2；N>2，由此判定该样本存在HER2基因扩增。
试验例1
1)使用针对HER2设计的引物和探针进行qPCR反应，PCR扩增体系如下：
Figure BDA0002266074550000091
PCR反应热循环条件如下：
取PCR产物进行电泳检测，电泳检测结果显示只有一条扩增条带，且条带大小与扩增产物相符(100-200bp)。
2)取PCR产物，使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒(Cat.No.28004)将PCR产物进行纯化，纯化后的产物与pMD18-T载体(Cat.No 6011,TAKARA)混匀后16℃过夜进行连接，再将连接产物加入到Ecoli JM109感受态细胞中，涂到含有X-gal底物，IPTG诱导物和Amp的固体LB平板上，放入37℃恒温培养箱中培养过夜(12-16h)后，随机挑取30个阳性单克隆进行Sanger一代测序。测序结果用DNAstar进行序列比对，30个单克隆测序结果与引物设计区域完全吻合。说明设计的引物以及探针特异性较好。
试验例2
本试验例对20例乳腺癌石蜡包埋组织样本进行HER2基因的相对定量检测，并与荧光原位杂交(FISH),免疫组化(IHC)的检测结果进行了比较。
本发明样本处理方法参照实施例2中石蜡包埋组织样本处理，引物序列、扩增体系和扩增条件参照实施例2中所述内容，使用自主研发数字PCR平台进行扩增，同时利用FISH对HER2基因相对定量检测方法对扩增结果进行评估。本实验中FISH检测试剂购于雅培Vysis，实验操作参照说明书进行。
下表列出20例石蜡包埋组织样本的HER2与ACTB基因及FAS基因的拷贝数关系以及荧光原位杂交的检测结果，表中可以看出，本发明中HER2基因与两个管家基因的比例与FISH方法的结果完全一致。
Figure BDA0002266074550000101
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物探针预混液，所述引物探针预混液中包括1)检测HER2基因的上下游引物、检测HER2基因的荧光探针；2)检测人FAS基因的上下游引物、检测人FAS基因的荧光探针；3)检测人ACTB基因的上下游引物、检测人ACTB基因的荧光探针；
其中，1)HER2基因的引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-ACTTAATTGGCATTCTACTCCC-3'SEQ ID NO:1；
下游引物：5'-ATTGGAGACACGGCCTC-3'SEQ ID NO:2；
探针：5'-GGCGCAACGCTGAGCAGCTGG-3'SEQ ID NO:3；
2)检测人FAS基因的上下游引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-CGCTTATATAATGGTGCTCGTT-3'SEQ ID NO:4
下游引物：5'-TATCAGGACAAACTAAATCCCC-3'SEQ ID NO:5
探针：5'-AAGCCTGCAGATACAAGGACAC-3'SEQ ID NO:6
3)检测人ACTB基因的上下游引物、探针包括如下序列：
上游引物：5'-CGCCCTTTCTCACTGGTTC-3'SEQ ID NO:7
下游引物：5'-TAGTACCTACACCCACAACAC-3'SEQ ID NO:8
探针：5'-CTCTTCTGCCGTTTTCCGTAGG-3'SEQ ID NO:9。
2.根据权利要求1所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应预混液,所述PCR反应预混液包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP、镁离子、BSA、热启动Taq酶和扩增增强剂。
3.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述扩增强剂包括焦磷酸酶和Triton X-100。
4.根据权利要求3所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述焦磷酸酶的终浓度为0.5-2U，所述Triton X-100的终浓度为0.05％-2％。
5.根据权利要求2所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应预混液包括
Figure FDA0002266074540000011
Figure FDA0002266074540000021
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，用于检测HER2、FAS和ACTB基因的上游引物、下游引物和荧光探针的工作浓度均为0.1-1μM。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，所述HER2基团的荧光报告基团为CY3，荧光淬灭基团为BHQ2；FAS基团的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；ACTB的荧光报告基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的应用数字PCR检测HER2基因扩增的试剂盒，其特征在于，还包括阴性质控品和阳性质控品,所述阴性质控品为经免疫组化方法和PCR方法证明为HER2扩增阴性的乳腺癌组织DNA；
阳性质控品为经免疫组化方法和PCR方法证明为HER2扩增阳性的乳腺癌组织DNA。
9.采用如权利要求1-8任一项所述的试剂盒对HER2基因扩增进行检测的方法，其包括如下步骤：
S1针对选定的HER2、FAS和ACTB序列，分别设计特异性引物和探针；
S2提取检测样本的DNA；
S3利用数字PCR平台进行扩增反应；
S4对扩增结果进行分析与判读。
10.根据权利要求9所述的方法，其还包括S5对检测结果判读分析，具体如下：
HER2与ACTB基因结果分析：
1)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；
2)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度均在1×102copies/μL-1×105copies/μL之间，直接进行如下计算：
M＝HER2基因检测浓度/ACTB内参基因检测浓度，
当M≤0.2时，则结果判读为：无HER2基因扩增；
当M＞0.2时，则结果判读为：HER2基因扩增；
3)如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项大于1×105copies/μL，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果；HER2与FAS基因结果分析：
1)如果HER2基因和FAS内参基因检测浓度至少一项小于10copies/μL，则检测结果无效，应重新提取样本核酸进行检测；
2)如果HER2基因和FAS内参基因检测浓度均在1×102copies/μL-1×105copies/μL之间，直接进行如下计算：
N＝HER2基因检测浓度/FAS内参基因检测浓度，
当N≤2时，则结果判读为：无HER2基因扩增；
当N＞2时，则结果判读为：HER2基因扩增；
如果HER2基因和ACTB内参基因检测浓度至少一项大于1×105copies/μL，则需要将待检样品稀释至线性范围内重新测定，并根据(2)的标准判断结果。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111850125A (zh) * 2020-08-04 2020-10-30 苏州索真生物技术有限公司 一种检测her2基因扩增的试剂盒及方法
CN112481384A (zh) * 2020-12-29 2021-03-12 杭州求臻医学检验实验室有限公司 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用
CN112553337A (zh) * 2020-12-23 2021-03-26 杭州求臻医学检验实验室有限公司 一种基于数字pcr技术检测erbb2基因扩增的方法及其检测试剂盒
CN112646893A (zh) * 2021-01-08 2021-04-13 北京泛生子基因科技有限公司 一种egfr基因拷贝数检测试剂盒及检测方法
CN113462761A (zh) * 2021-07-30 2021-10-01 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 一种检测her2基因的引物探针组合物及其应用
CN114214417A (zh) * 2021-12-30 2022-03-22 苏州方科生物科技有限公司 一种用于检测人her-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199659A (zh) * 2010-03-25 2011-09-28 中山大学达安基因股份有限公司 Her2基因扩增检测试剂盒
CN105986028A (zh) * 2015-03-23 2016-10-05 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法
CN106591438A (zh) * 2016-11-28 2017-04-26 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用
WO2017210372A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 The Translational Genomics Research Institute Molecular tagging methods and sequencing libraries
CN107739760A (zh) * 2017-11-16 2018-02-27 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种用于her‑2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用
CN108342464A (zh) * 2018-04-04 2018-07-31 良培基因生物科技（武汉）有限公司 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法
CN108504742A (zh) * 2018-06-25 2018-09-07 北京爱普拜生物技术有限公司 一种基于数字pcr技术检测her-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199659A (zh) * 2010-03-25 2011-09-28 中山大学达安基因股份有限公司 Her2基因扩增检测试剂盒
CN105986028A (zh) * 2015-03-23 2016-10-05 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法
WO2017210372A1 (en) * 2016-05-31 2017-12-07 The Translational Genomics Research Institute Molecular tagging methods and sequencing libraries
CN106591438A (zh) * 2016-11-28 2017-04-26 华东医药（杭州）基因科技有限公司 一种用于检测Her2基因的核酸组合、试剂盒及应用
CN107739760A (zh) * 2017-11-16 2018-02-27 杭州迪安医学检验中心有限公司 一种用于her‑2基因拷贝数扩增检测的核酸序列、试剂盒及其应用
CN108342464A (zh) * 2018-04-04 2018-07-31 良培基因生物科技（武汉）有限公司 一步法检测HER2/neu基因表达量的试剂盒及其检测方法
CN108504742A (zh) * 2018-06-25 2018-09-07 北京爱普拜生物技术有限公司 一种基于数字pcr技术检测her-2基因拷贝数变异的试剂盒及方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANCHALEE TANTIWETRUEANGDET等: "Droplet digital PCR using HER2/EIF2C1 ratio for detection of HER2 amplification in breast cancer tissues", 《MED ONCOL》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111850125A (zh) * 2020-08-04 2020-10-30 苏州索真生物技术有限公司 一种检测her2基因扩增的试剂盒及方法
CN112553337A (zh) * 2020-12-23 2021-03-26 杭州求臻医学检验实验室有限公司 一种基于数字pcr技术检测erbb2基因扩增的方法及其检测试剂盒
CN112481384A (zh) * 2020-12-29 2021-03-12 杭州求臻医学检验实验室有限公司 一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用
CN112646893A (zh) * 2021-01-08 2021-04-13 北京泛生子基因科技有限公司 一种egfr基因拷贝数检测试剂盒及检测方法
CN113462761A (zh) * 2021-07-30 2021-10-01 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 一种检测her2基因的引物探针组合物及其应用
CN113462761B (zh) * 2021-07-30 2024-02-09 宁波胤瑞生物医学仪器有限责任公司 一种检测her2基因的引物探针组合物及其应用
CN114214417A (zh) * 2021-12-30 2022-03-22 苏州方科生物科技有限公司 一种用于检测人her-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法
CN114214417B (zh) * 2021-12-30 2023-09-22 苏州方科生物科技有限公司 一种用于检测人her-2基因扩增的试剂盒及其应用和工作方法

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